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Alle Experimente mit Caenorhabditis elegans wurden gemäß den institutionellen Richtlinien für die Pflege und Anwendung von Labororganismen an der Beijing Normal University durchgeführt.
Abbildung 1: Überblick über CRISPR/Cas9-vermittelte endogene fluoreszierende Markierung bei C. elegans. Schematischer Workflow, der die Hauptstadien der endogenen fluoreszierenden Knock-in-Generierung und -Validierung darstellt. In der Design- und Bauphase werden ein mit Keimbahn angereichertes Zielgen und eine Einfügungsstelle ausgewählt, pDD162 wird als CRISPR/Cas9-Plasmid für die Expression von Cas9 und Guide-RNA verwendet, und pPD95.75 dient als Spender-Rückgrat, in das das fluoreszierende Tag (z. B. GFP) sowie die linken und rechten Homologiearme subklont werden. In der Mikroinjektionsphase wird die CRISPR/Cas9-Injektionsmischung (einschließlich des gRNA/Cas9-Plasmids, der Spendervorlage und der Co-Injektionsmarker) in die Gonade junger Hermaphroditen abgegeben, gefolgt von der Wiedergewinnung auf besaaten Platten. In der Validierungsphase werden marker-positive Nachkommen für die nachgelagerte Genotypisierung ausgewählt, einschließlich PCR-basierter Identifikation von Knock-in-Ereignissen und Bestätigung durch DNA-Sequenzierung, und erfolgreiche Knock-in-Linien werden anschließend mit Fluoreszenzmikroskopie untersucht, um die Keimbahnexpression und subzelluläre Lokalisierung des markierten Proteins zu bewerten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
1. Wählen Sie ein mit Keimbahn angereichertes Zielgen aus
- Identifizieren Sie Kandidatengene mit vorherrschender Expression in der Gonade oder Keimzellen mithilfe öffentlicher Datenbanken und veröffentlichter Literatur.
- Wählen Sie einen geeigneten Tagging-Ort basierend auf den Proteinmerkmalen. Erfassen Sie die ausgewählte Isoform und die Position der Tag-Insertion für das Design der nachgeschalteten Führungs-RNA und der Spendervorlage (Abbildung 1).
2. Entwurf der Leit-RNA und der Spendervorlage
- Identifizieren Sie eine 20-nt-Leit-RNA (gRNA)-Sequenz stromaufwärts eines Protospacer-angrenzenden Motivs (PAM; NGG), der für die Cas9-Erkennung erforderlichen Sequenz und positioniere sie so nah wie möglich am vorgesehenen Tag-Einfügeort.
- Bewerten Sie Kandidaten-gRNAs mit einem Online-Designtool (z. B. dem IDT CRISPR-Designtool) mit ausgewähltem C. elegans-Genom. Wählen Sie einen Leitfaden mit einer starken prognostizierten Schnitteffizienz und ohne risikoreiche Off-Target-Standorte.
- Klonen Sie die gRNA-Sequenz in den Bereich zwischen dem U6-Promotor und dem gRNA-Gerüst im CRISPR-Expressionsplasmid-Rückgrat.
HINWEIS: Designprimer, die die gRNA-Sequenz als Überhänge integrieren. Durchführung einer PCR-Amplifikation gefolgt von homologer rekombinationsbasierter Assemblierung, einer ligationsunabhängigen Klonmethode, die die Verdauung von Restriktionsenzymen eliminiert und ein einstufiges Klonen direkt in den Expressionsvektor15 ermöglicht.
- Korrektes Einfügen durch Sanger-Sequenzierung bestätigen.
- Konstruiert das Donorplasmid mit einem fluoreszierenden Tag, flankiert von etwa 1.000 BP linken und 1.000 bp rechten Homologiearmen, die vom Ziellokus abgeleitet sind.
HINWEIS: Homologiearme aus N2-genomischer DNA, die als Wurmlysat mittels Proteinase-K-Verdauung hergestellt wird, amplizieren. Designprimer mit 15–20 bp überlappen sich mit dem linearisierten Vektor- und Fluoreszenztag. Setze die Homologiearme zusammen und tag sie durch homologe Rekombination in einer einzigen Reaktion in das Rückgrat. Fügen Sie das fluoreszierende Tag unmittelbar nach dem ATG-Startcodon für das N-terminale Tagging oder vor dem Stop-Codon für das C-terminale Tagging ein. Fügen Sie eine Verbindungssequenz zwischen dem Zielgen und dem fluoreszierenden Tag ein, um eine ordnungsgemäße Proteinfaltung und -funktion aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie den Linker, um sterische Interferenz zwischen den Fusionspartnern zu reduzieren, und stellen Sie sicher, dass sowohl Linker als auch Tag im Bild mit der Codierungssequenz eingefügt sind. Wählen Sie die Einsatzstelle sorgfältig aus, um bekannte oder vorhergesagte funktionelle Domänen, Signalpeptide oder transmembrane Regionen nicht zu stören (Supplementary File 1).
- Stille Substitutionen in die donator-homologe Template-Sequenz einführen, um die PAM- oder Guide-Bindungssequenz zu stören, ohne die Proteinsequenz zu verändern, und ein erneutes Cas9-Schneiden nach der Integration zu verhindern.
HINWEIS: Integrieren Sie synonyme Punktmutationen in Primer, die für die Homologiearm-Amplifikation verwendet werden und Codons innerhalb der PAM-Region anvisieren.
- Bestätigen Sie die Integrität der Donorsequenz sowohl über Homologiearme als auch an Tag-Übergängen durch Sanger-Sequenzierung.
HINWEIS: Bewahren Sie verifizierte Plasmide bei −20 °C für Kurzzeitspeicherung oder −80 °C für Langzeitlagerung auf.
3. Bereite die Injektionsmischung vor
- Setzen Sie die Injektionsmischung zusammen, indem Sie das CRISPR-Expressionsplasmid, das Spenderplasmid (konstruiert auf Basis von pPD95.75) und Co-Injektionsmarker in sterilem ddH₂O zu einem Endvolumen von 10 μL bei den in Tabelle 1 aufgeführten Konzentrationen kombinieren.
HINWEIS: Konzentrationen empirisch optimieren, um die Lesbarkeit des Markers, die Wiedergewinnung des Kandidaten und das Überleben nach der Injektion auszubalancieren.
- Zentrifugieren Sie das Injektionsgemisch bei 10.000 × g für 10–20 Minuten, um das Partikelmaterial zu pelletieren und eine Verstopfung der Mikroinjektionskapillare zu verhindern.
| Komponente | Funktion | Arbeitskonzentration (ng/μL) |
| pDD162 | CRISPR/Cas9-Plasmid (Cas9- und gRNA-Expression) | 50-100 |
| Spenderplasmid (pPD95,75 Rückgrat) | HDR-Spendervorlage mit fluoreszierendem Tag, flankiert von ~1 kb Homologiearmen | 50-100 |
| pRF4 | Co-Injektionsmarker (Roller-Phänotyp) | 50-100 |
| pPD122.11 | Ko-Injektionsmarker (GFP-Expression) | 5-10 |
| Sterile ddH2O | Bring zum letzten Band | – |
Tabelle 1: Zusammensetzung der Injektionsmischung und Plasmidfunktionen. Die Injektionsmischung enthält CRISPR-Expressionsplasmid, Spenderplasmid, pRF4 und pPD122.11 bei den angegebenen Konzentrationen, mit einem Gesamtvolumen von 10 μL.
4. Laden und bereiten Sie die Injektionsnadel vor
- Ziehen Sie Glaskapillaren in Mikroinjektionsnadeln mit einem Nadelzieher, der so konfiguriert ist, dass eine lange Spitze mit einer scharfen Spitze erzeugt wird, die für die Gonadalinjektion geeignet ist.
HINWEIS: Zieherparameter empirisch optimieren. Beispielanfangsparameter: Wärme = 540, Zug = 20, Geschwindigkeit = 100.
VORSICHT: Führen Sie gezogene Nadeln vorsichtig, um Einstichverletzungen zu vermeiden. Verwenden Sie eine Pinzette beim Umgang mit Nadeln und entsorgen Sie gebrauchte Nadeln in einem Behälter für scharfe Gegenstände.
- Erhitze eine Mikrokapillarpipette und knipse sie in zwei Teile, um ein Ladewerkzeug zu schaffen.
HINWEIS: Kommerzielle Ladespitzen können als Alternative verwendet werden.
- Befestigen Sie eine Gummi-Aspiratorbulbe am breiten Ende der verkürzten Mikrokapillarpipelette.
- Aspiratieren Sie etwa 1 μL geklärtes Injektionsmisch-Supernatant in den Ladebehälter.
HINWEIS: Das genaue Volumen ist nicht entscheidend. Stellen Sie sicher, dass die Lösung die Nadelspitze füllt.
- Stecken Sie den Ladegerät in das hintere Ende der Injektionsnadel und geben Sie die Injektionsmischung vorsichtig ab.
- Legen Sie die belastete Nadel 10 Minuten horizontal ein, damit die Lösung zur Spitze hin absinken kann, und bestätigen Sie eine durchgehende Säule.
- Die Nadel auf das Injektionsmikroskop montieren und die Spitze mit Hellfeldoptik in den Fokus bringen.
- Öffnen Sie die Nadelspitze, indem Sie sie vorsichtig mit dem Rand eines Überdecks in Halocarbonöl berühren und den Fluss testen.
HINWEIS: Stellen Sie den Einspritzdruck (30–80 psi) an, um innerhalb von 1 s16 eine Blase zu erzeugen, die ungefähr dem Durchmesser der Gonaden entspricht.
5. Würmer zur Injektion vorbereiten
HINWEIS: Bereiten Sie Nematodenwachstumsmedium (NGM)-Platten und M9-Puffer wie zuvor beschriebenvor. Würmer auf Platten mit Escherichia coli OP50 (im Folgenden OP50) aufbewahren und Injektionen im N2-Hintergrund durchführen.
- Wählen Sie L4-Hermaphroditen von einer gesunden Platte aus und brüten Sie bei 20 °C 10 Stunden lang aus, um junge Erwachsene mit gut entwickelten Keimlinien zu erhalten.
- Übertragen Sie die Würmer auf eine unbesaitete Platte, um den bakteriellen Überschuss zu reduzieren.
- Bereiten Sie ein trockenes 2%-Agarose-Pad auf einem Glasobjektträger vor und tragen Sie einen Tropfen Halokarbonöl auf.
- Übertragen Sie einen Wurm mit einem Wimpernpicker auf das Agarose-Pad.
- Den Wurm immobilisieren und die Gonade zur Injektion ausrichten.
VORSICHT: Vollständige Injektionen innerhalb von 20–30 Minuten, um Austrocknung zu verhindern.
6. Gonadale Mikroinjektion durchführen
Abbildung 2: Lokalisierung des distalen Gonadensynzytiums zur Mikroinjektion bei jungen erwachsenen C. elegans-Hermaphroditen. (A) Lichtfeldbild mit geringer Vergrößerung eines montierten jungen Hermaphroditen. Beide Gonadenarme sind sichtbar; Die Injektionsstelle ist für einen Arm (Pfeil) als repräsentatives Beispiel angegeben. Der geboxte Bereich markiert den Bereich mit höherer Vergrößerung im Panel B. (B) DIC-Ansicht mit höherer Vergrößerung der distalen Gonade, die dem geboxten Bereich in Panel A entspricht. Der Pfeil zeigt die Injektionsposition im distalen gonadalen Synzytium an, wo das Injektionsgemisch abgegeben wird. Skalenbalken: 100 μm (A) und 20 μm (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
- Lokalisieren Sie einen immobilisierten Wurm und identifizieren Sie die Gonade mit einem Objektiv mit niedriger Vergrößerung.
- Positioniere die Nadel mit Mikromanipulatorsteuerungen.
- Orientiere den Wurm in einem Winkel von 20–40° relativ zur Nadel.
- Konzentrieren Sie sich auf die distale Keimlinie mit höherer Vergrößerung.
- Führe den Wurm zur Nadel und positioniere die Spitze im gonadalen Syncytium (Abbildung 2).
- Injizieren Sie die Lösung und bestätigen Sie die Verabreichung durch sichtbare Schwellung der Gonaden.
HINWEIS: Optimieren Sie den Einspritzdruck (30–80 psi), den Kompensationsdruck (0,1–0,5 psi) und die Einspritzdauer (0,1–0,3 s).
VORSICHT: Übermäßiger Druck oder zu viel Volumen kann einen Wurmriss verursachen.
- Ziehen Sie die Nadel heraus und positionieren Sie sie für weitere Injektionen.
HINWEIS: Führen Sie eine einseitige Injektion durch, um das Überleben zu maximieren, oder eine beidseitige Injektion, um die Bearbeitungseffizienz zu erhöhen.
- Füge M9-Puffer hinzu, um Würmer freizusetzen, und übertrage jeden Wurm auf eine individuelle Erholungsplatte.
- Wiederholte Injektionen für 20–25 Würmer.
HINWEIS: Ersetzen Sie die Nadel, wenn sie verstopft oder beschädigt wird.
- Inkubieren Sie injizierte Würmer bei 20 °C für 2–3 Tage, um die Erholung zu ermöglichen.
7. Screenen Sie F1-Kandidaten, um Knock-in-positive Linien zu identifizieren
- Screenen Sie F1-Nachkommen auf Co-Injektionsmarker und wählen Sie markerpositive Tiere aus.
HINWEIS: Beispiele für alternative fluoreszierende Ko-Injektionsmarker mit unterschiedlicher Gewebespezifität und spektralen Eigenschaften sind in ergänzender Tabelle 1 aufgeführt.
HINWEIS: Wählen Sie Tiere aus, die beide Marker ausdrücken, um eine höhere Zuverlässigkeit zu erreichen. Priorisieren Sie Brüten mit hoher Markierungshäufigkeit ("Jackpot-Brüten").
- Jeder F1-Wurm wird auf einen einzelnen Teller übertragen und die Eiablage 1–2 Tage zugelassen.
- Lyse jeden F1-Wurm im Proteinase-K-Puffer, um PCR-Vorlagen vorzubereiten.
HINWEIS: Bewahren Sie Lysate bei −80 °C auf, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden.
- Führen Sie eine Junction-PCR mit einem genomischen Primer außerhalb des Homologiearms und einem internen Tag-Primer durch.
HINWEIS: Berücksichtigen Sie entsprechende Platten von PCR-positiven F1-Tieren.
8. Screenen Sie F2-Nachkommen, um homozygote Knock-in-Linien zu isolieren und die Integration zu bestätigen
- Isolieren Sie F2-Nachkommen aus PCR-positiven F1-Linien auf einzelne Platten.
- Erlaube F2-Würmern, Nachkommen zu produzieren und erwachsene Würmer für die Genotypisierung zu lysieren.
HINWEIS: Bewahren Sie Lysate bei −20 °C auf, falls nötig.
- Führen Sie PCR mit Primern an den Homologiearmen durch, um Wildtyp- und Knock-in-Allele nach Produktgröße zu unterscheiden.
- Bestätigen Sie die korrekte Integration durch Sanger-Sequenzierung über beide Einfügungen.
- Überprüfen Sie die Expression und Lokalisierung der Keimbahnfluoreszenz-Expression und -Lokalisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie.
- Erweitern Sie bestätigte homozygote Linien und halten Sie die Bestände aufrecht.
HINWEIS: Kryopreservierte Leitungen für Langzeitlagerung.