Ein CRISPR/Cas9-Mikroinjektions-Workflow für endogene fluoreszierende Markierung in der Keimlinie Caenorhabditis elegans , um homozygote Knock-in-Linien für die In-vivo-Proteinlokalisationsanalyse zu erhalten.
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Methodenartikel
CRISPR/Cas9-vermittelte endogene fluoreszierende Markierung keimbahnspezifischer Gene in Caenorhabditis elegans
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Proteinlokalisierung in der Keimlinie Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist zentral für die Interpretation der Genfunktion während der Gametogenese, doch konventionelle Transgen-Ansätze führen oft zu variabler Expression und können in Keimzellen zum Schweigen gebracht werden. Hier wird ein praktischer CRISPR/Cas9-Workflow beschrieben, bei dem ein fluoreszierendes Tag in einen endogenen Locus eingefügt wird, der die Erzeugung stabiler Knock-in-Allele ermöglicht, die die Proteinverteilung unter nativer Regulation melden. Das Protokoll umfasst die wichtigsten Phasen des Verfahrens: die Auswahl einer für das Zielprotein geeigneten Tagging-Strategie, die Abgabe von CRISPR-Reagenzien durch gonadale Mikroinjektion in junge erwachsene Hermaphroditen sowie die Bergung injizierter Tiere für das Screening. Knock-in-Kandidaten werden durch PCR-basierte Genotypisierung über zwei Generationen hinweg identifiziert, um homozygote Würmer zu isolieren und das bearbeitete Allel zu verifizieren. Schließlich wird die konfokale Mikroskopie verwendet, um die Keimbahnfluoreszenz zu überprüfen und die subzelluläre Lokalisierung in vivo zu beurteilen. Der Arbeitsablauf ist so konzipiert, dass er reproduzierbar und breit anwendbar auf mit Keimbahn angereicherte Gene ist und einen einfachen Weg bietet, homozygot markierte Stämme für Entwicklungs- und zellbiologische Analysen zu etablieren.
Einleitung
Caenorhabditis elegans (C. elegans) ist ein gut etabliertes Modell zur Untersuchung der Fortpflanzungsentwicklung und Gametogenese, bedingt durch seinen kurzen Lebenszyklus, den transparenten Körper und die hohe genetische Behandlungsfähigkeit1. C. elegans existiert hauptsächlich als selbstbefruchtende Hermaphroditen, deren Gonade zunächst die Spermatogenese durchläuft und dann zur Oogenese wechselt. Dieser Fortpflanzungsmodus vereinfacht die Dehnungsaufrechterhaltung und macht es einfach, homozygote Linien2 zu erhalten. Jüngste räumliche Transkriptomik hat die Liste der in der Gonade angereicherten Gene erheblich erweitert und ausgeprägte geschlechtsspezifische Expressionsmuster im gesamten Fortpflanzungssystem bei C. elegans3 offenbart. In jüngerer Zeit hat die Einzelzell-RNA-Sequenzierung die Rekonstruktion der Keimzellentwicklungsbahnen und die Inferenz von Genregulationsnetzwerken ermöglicht, die die Spermatogenesezu steuern. Zusammen erzeugen diese Datensätze reichhaltige Kandidatenlisten, aber die funktionale Interpretation erfordert oft das Beobachten des Proteinverhaltens in vivo – insbesondere die Definition wann und wo die entsprechenden Proteine lokalisieren und wie sich ihre Muster während der Keimbahnentwicklung verändern.
Die konventionelle Transgenese bei C. elegans basiert oft auf gonadaler Mikroinjektion von Plasmid-DNA, die leicht mehrfache extrachromosomale Arrayserzeugt. In der Keimbahn sind diese Arrays jedoch oft robust zum Schweigen gebracht, ein Mechanismus, von dem angenommen wird, dass er die Keimbahn-Integrität aufrechterhält, indem er die Expression aus repetitiver DNA einschränkt und so die Keimbahnfunktion und die Stabilität genetischer Informationen über Generationen 6,7 hinweg bewahrt. Daher können Transgene-Expressionskonstrukte, die in somatischen Geweben leicht exprimiert werden, schwach oder inkonsistent in der Keimbahn sein. Selbst wenn die Expression nachweisbar ist, können Effekte der Kopienzahl und technisch entwickelte regulatorische Elemente die Proteindosierung und -timing verschieben, was potenziell zu Schlussfolgerungen über native Lokalisierung und Dynamik führen kann. Um diese Einschränkungen zu beheben, werden Mikropartikelbombardement und Mos1-vermittelte Single Copy Insertion (MosSCI) weit verbreitet eingesetzt, um niedrige/einzelne Kopien integrierte transgene Linien 8,9,10 zu erzeugen. Diese Ansätze können die Expression in der Keimbahn verbessern, unterscheiden sich jedoch in Kosten, Durchsatz und wie gut sie endogene Regulation reproduzieren. Die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung bietet einen direkteren Weg, indem ein fluoreszierender Tag am endogenen Locus mittels homologiegesteuerter Reparatur eingesetzt wird, wodurch stabile Knock-in-Allele erzeugt werden, die unter nativer regulatorischer Kontrolle Proteinlokalisierung und -dynamik berichten 11,12,13,14.
Hier wird ein praktischer Arbeitsablauf für CRISPR/Cas9-vermittelte endogene fluoreszierende Markierung in C. elegans beschrieben, der auf Gene angewendet wird, die auf Basis berichteter von Keimbahn-angereicherten Expressionsmustern ausgewählt werden. Das Protokoll beschreibt Zielauswahl, das Design von Spendervorlagen und Guide-RNAs, gonadale Mikroinjektion und nachgelagertes Screening zur Isolierung homozygoter Knock-in-Linien, gefolgt von der Validierung mittels Genotypisierung. Dieser Ansatz ist weitgehend auf Keimbahn-exprimierte Gene über Entwicklungsstadien hinweg anwendbar und ermöglicht quantitative Analysen der Proteinlokalisierung und -dynamik in vivo. Dieser Workflow bietet eine praktische Strategie zur Markierung von Gene, die in der Keimlinie exprimiert werden, sowie zur Analyse der Proteinlokalisierung und -dynamik in vivo unter nativer regulatorischer Kontrolle.
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Protokoll
Alle Experimente mit Caenorhabditis elegans wurden gemäß den institutionellen Richtlinien für die Pflege und Anwendung von Labororganismen an der Beijing Normal University durchgeführt.
Abbildung 1: Überblick über CRISPR/Cas9-vermittelte endogene fluoreszierende Markierung bei C. elegans. Schematischer Workflow, der die Hauptstadien der endogenen fluoreszierenden Knock-in-Generierung und -Validierung darstellt. In der Design- und Bauphase werden ein mit Keimbahn angereichertes Zielgen und eine Einfügungsstelle ausgewählt, pDD162 wird als CRISPR/Cas9-Plasmid für die Expression von Cas9 und Guide-RNA verwendet, und pPD95.75 dient als Spender-Rückgrat, in das das fluoreszierende Tag (z. B. GFP) sowie die linken und rechten Homologiearme subklont werden. In der Mikroinjektionsphase wird die CRISPR/Cas9-Injektionsmischung (einschließlich des gRNA/Cas9-Plasmids, der Spendervorlage und der Co-Injektionsmarker) in die Gonade junger Hermaphroditen abgegeben, gefolgt von der Wiedergewinnung auf besaaten Platten. In der Validierungsphase werden marker-positive Nachkommen für die nachgelagerte Genotypisierung ausgewählt, einschließlich PCR-basierter Identifikation von Knock-in-Ereignissen und Bestätigung durch DNA-Sequenzierung, und erfolgreiche Knock-in-Linien werden anschließend mit Fluoreszenzmikroskopie untersucht, um die Keimbahnexpression und subzelluläre Lokalisierung des markierten Proteins zu bewerten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
1. Wählen Sie ein mit Keimbahn angereichertes Zielgen aus
- Identifizieren Sie Kandidatengene mit vorherrschender Expression in der Gonade oder Keimzellen mithilfe öffentlicher Datenbanken und veröffentlichter Literatur.
- Wählen Sie einen geeigneten Tagging-Ort basierend auf den Proteinmerkmalen. Erfassen Sie die ausgewählte Isoform und die Position der Tag-Insertion für das Design der nachgeschalteten Führungs-RNA und der Spendervorlage (Abbildung 1).
2. Entwurf der Leit-RNA und der Spendervorlage
- Identifizieren Sie eine 20-nt-Leit-RNA (gRNA)-Sequenz stromaufwärts eines Protospacer-angrenzenden Motivs (PAM; NGG), der für die Cas9-Erkennung erforderlichen Sequenz und positioniere sie so nah wie möglich am vorgesehenen Tag-Einfügeort.
- Bewerten Sie Kandidaten-gRNAs mit einem Online-Designtool (z. B. dem IDT CRISPR-Designtool) mit ausgewähltem C. elegans-Genom. Wählen Sie einen Leitfaden mit einer starken prognostizierten Schnitteffizienz und ohne risikoreiche Off-Target-Standorte.
- Klonen Sie die gRNA-Sequenz in den Bereich zwischen dem U6-Promotor und dem gRNA-Gerüst im CRISPR-Expressionsplasmid-Rückgrat.
HINWEIS: Designprimer, die die gRNA-Sequenz als Überhänge integrieren. Durchführung einer PCR-Amplifikation gefolgt von homologer rekombinationsbasierter Assemblierung, einer ligationsunabhängigen Klonmethode, die die Verdauung von Restriktionsenzymen eliminiert und ein einstufiges Klonen direkt in den Expressionsvektor15 ermöglicht. - Korrektes Einfügen durch Sanger-Sequenzierung bestätigen.
- Konstruiert das Donorplasmid mit einem fluoreszierenden Tag, flankiert von etwa 1.000 BP linken und 1.000 bp rechten Homologiearmen, die vom Ziellokus abgeleitet sind.
HINWEIS: Homologiearme aus N2-genomischer DNA, die als Wurmlysat mittels Proteinase-K-Verdauung hergestellt wird, amplizieren. Designprimer mit 15–20 bp überlappen sich mit dem linearisierten Vektor- und Fluoreszenztag. Setze die Homologiearme zusammen und tag sie durch homologe Rekombination in einer einzigen Reaktion in das Rückgrat. Fügen Sie das fluoreszierende Tag unmittelbar nach dem ATG-Startcodon für das N-terminale Tagging oder vor dem Stop-Codon für das C-terminale Tagging ein. Fügen Sie eine Verbindungssequenz zwischen dem Zielgen und dem fluoreszierenden Tag ein, um eine ordnungsgemäße Proteinfaltung und -funktion aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie den Linker, um sterische Interferenz zwischen den Fusionspartnern zu reduzieren, und stellen Sie sicher, dass sowohl Linker als auch Tag im Bild mit der Codierungssequenz eingefügt sind. Wählen Sie die Einsatzstelle sorgfältig aus, um bekannte oder vorhergesagte funktionelle Domänen, Signalpeptide oder transmembrane Regionen nicht zu stören (Supplementary File 1). - Stille Substitutionen in die donator-homologe Template-Sequenz einführen, um die PAM- oder Guide-Bindungssequenz zu stören, ohne die Proteinsequenz zu verändern, und ein erneutes Cas9-Schneiden nach der Integration zu verhindern.
HINWEIS: Integrieren Sie synonyme Punktmutationen in Primer, die für die Homologiearm-Amplifikation verwendet werden und Codons innerhalb der PAM-Region anvisieren. - Bestätigen Sie die Integrität der Donorsequenz sowohl über Homologiearme als auch an Tag-Übergängen durch Sanger-Sequenzierung.
HINWEIS: Bewahren Sie verifizierte Plasmide bei −20 °C für Kurzzeitspeicherung oder −80 °C für Langzeitlagerung auf.
3. Bereite die Injektionsmischung vor
- Setzen Sie die Injektionsmischung zusammen, indem Sie das CRISPR-Expressionsplasmid, das Spenderplasmid (konstruiert auf Basis von pPD95.75) und Co-Injektionsmarker in sterilem ddH₂O zu einem Endvolumen von 10 μL bei den in Tabelle 1 aufgeführten Konzentrationen kombinieren.
HINWEIS: Konzentrationen empirisch optimieren, um die Lesbarkeit des Markers, die Wiedergewinnung des Kandidaten und das Überleben nach der Injektion auszubalancieren. - Zentrifugieren Sie das Injektionsgemisch bei 10.000 × g für 10–20 Minuten, um das Partikelmaterial zu pelletieren und eine Verstopfung der Mikroinjektionskapillare zu verhindern.
| Komponente | Funktion | Arbeitskonzentration (ng/μL) |
| pDD162 | CRISPR/Cas9-Plasmid (Cas9- und gRNA-Expression) | 50-100 |
| Spenderplasmid (pPD95,75 Rückgrat) | HDR-Spendervorlage mit fluoreszierendem Tag, flankiert von ~1 kb Homologiearmen | 50-100 |
| pRF4 | Co-Injektionsmarker (Roller-Phänotyp) | 50-100 |
| pPD122.11 | Ko-Injektionsmarker (GFP-Expression) | 5-10 |
| Sterile ddH2O | Bring zum letzten Band | – |
Tabelle 1: Zusammensetzung der Injektionsmischung und Plasmidfunktionen. Die Injektionsmischung enthält CRISPR-Expressionsplasmid, Spenderplasmid, pRF4 und pPD122.11 bei den angegebenen Konzentrationen, mit einem Gesamtvolumen von 10 μL.
4. Laden und bereiten Sie die Injektionsnadel vor
- Ziehen Sie Glaskapillaren in Mikroinjektionsnadeln mit einem Nadelzieher, der so konfiguriert ist, dass eine lange Spitze mit einer scharfen Spitze erzeugt wird, die für die Gonadalinjektion geeignet ist.
HINWEIS: Zieherparameter empirisch optimieren. Beispielanfangsparameter: Wärme = 540, Zug = 20, Geschwindigkeit = 100.
VORSICHT: Führen Sie gezogene Nadeln vorsichtig, um Einstichverletzungen zu vermeiden. Verwenden Sie eine Pinzette beim Umgang mit Nadeln und entsorgen Sie gebrauchte Nadeln in einem Behälter für scharfe Gegenstände. - Erhitze eine Mikrokapillarpipette und knipse sie in zwei Teile, um ein Ladewerkzeug zu schaffen.
HINWEIS: Kommerzielle Ladespitzen können als Alternative verwendet werden. - Befestigen Sie eine Gummi-Aspiratorbulbe am breiten Ende der verkürzten Mikrokapillarpipelette.
- Aspiratieren Sie etwa 1 μL geklärtes Injektionsmisch-Supernatant in den Ladebehälter.
HINWEIS: Das genaue Volumen ist nicht entscheidend. Stellen Sie sicher, dass die Lösung die Nadelspitze füllt. - Stecken Sie den Ladegerät in das hintere Ende der Injektionsnadel und geben Sie die Injektionsmischung vorsichtig ab.
- Legen Sie die belastete Nadel 10 Minuten horizontal ein, damit die Lösung zur Spitze hin absinken kann, und bestätigen Sie eine durchgehende Säule.
- Die Nadel auf das Injektionsmikroskop montieren und die Spitze mit Hellfeldoptik in den Fokus bringen.
- Öffnen Sie die Nadelspitze, indem Sie sie vorsichtig mit dem Rand eines Überdecks in Halocarbonöl berühren und den Fluss testen.
HINWEIS: Stellen Sie den Einspritzdruck (30–80 psi) an, um innerhalb von 1 s16 eine Blase zu erzeugen, die ungefähr dem Durchmesser der Gonaden entspricht.
5. Würmer zur Injektion vorbereiten
HINWEIS: Bereiten Sie Nematodenwachstumsmedium (NGM)-Platten und M9-Puffer wie zuvor beschriebenvor. Würmer auf Platten mit Escherichia coli OP50 (im Folgenden OP50) aufbewahren und Injektionen im N2-Hintergrund durchführen.
- Wählen Sie L4-Hermaphroditen von einer gesunden Platte aus und brüten Sie bei 20 °C 10 Stunden lang aus, um junge Erwachsene mit gut entwickelten Keimlinien zu erhalten.
- Übertragen Sie die Würmer auf eine unbesaitete Platte, um den bakteriellen Überschuss zu reduzieren.
- Bereiten Sie ein trockenes 2%-Agarose-Pad auf einem Glasobjektträger vor und tragen Sie einen Tropfen Halokarbonöl auf.
- Übertragen Sie einen Wurm mit einem Wimpernpicker auf das Agarose-Pad.
- Den Wurm immobilisieren und die Gonade zur Injektion ausrichten.
VORSICHT: Vollständige Injektionen innerhalb von 20–30 Minuten, um Austrocknung zu verhindern.
6. Gonadale Mikroinjektion durchführen
Abbildung 2: Lokalisierung des distalen Gonadensynzytiums zur Mikroinjektion bei jungen erwachsenen C. elegans-Hermaphroditen. (A) Lichtfeldbild mit geringer Vergrößerung eines montierten jungen Hermaphroditen. Beide Gonadenarme sind sichtbar; Die Injektionsstelle ist für einen Arm (Pfeil) als repräsentatives Beispiel angegeben. Der geboxte Bereich markiert den Bereich mit höherer Vergrößerung im Panel B. (B) DIC-Ansicht mit höherer Vergrößerung der distalen Gonade, die dem geboxten Bereich in Panel A entspricht. Der Pfeil zeigt die Injektionsposition im distalen gonadalen Synzytium an, wo das Injektionsgemisch abgegeben wird. Skalenbalken: 100 μm (A) und 20 μm (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
- Lokalisieren Sie einen immobilisierten Wurm und identifizieren Sie die Gonade mit einem Objektiv mit niedriger Vergrößerung.
- Positioniere die Nadel mit Mikromanipulatorsteuerungen.
- Orientiere den Wurm in einem Winkel von 20–40° relativ zur Nadel.
- Konzentrieren Sie sich auf die distale Keimlinie mit höherer Vergrößerung.
- Führe den Wurm zur Nadel und positioniere die Spitze im gonadalen Syncytium (Abbildung 2).
- Injizieren Sie die Lösung und bestätigen Sie die Verabreichung durch sichtbare Schwellung der Gonaden.
HINWEIS: Optimieren Sie den Einspritzdruck (30–80 psi), den Kompensationsdruck (0,1–0,5 psi) und die Einspritzdauer (0,1–0,3 s).
VORSICHT: Übermäßiger Druck oder zu viel Volumen kann einen Wurmriss verursachen. - Ziehen Sie die Nadel heraus und positionieren Sie sie für weitere Injektionen.
HINWEIS: Führen Sie eine einseitige Injektion durch, um das Überleben zu maximieren, oder eine beidseitige Injektion, um die Bearbeitungseffizienz zu erhöhen. - Füge M9-Puffer hinzu, um Würmer freizusetzen, und übertrage jeden Wurm auf eine individuelle Erholungsplatte.
- Wiederholte Injektionen für 20–25 Würmer.
HINWEIS: Ersetzen Sie die Nadel, wenn sie verstopft oder beschädigt wird. - Inkubieren Sie injizierte Würmer bei 20 °C für 2–3 Tage, um die Erholung zu ermöglichen.
7. Screenen Sie F1-Kandidaten, um Knock-in-positive Linien zu identifizieren
- Screenen Sie F1-Nachkommen auf Co-Injektionsmarker und wählen Sie markerpositive Tiere aus.
HINWEIS: Beispiele für alternative fluoreszierende Ko-Injektionsmarker mit unterschiedlicher Gewebespezifität und spektralen Eigenschaften sind in ergänzender Tabelle 1 aufgeführt.
HINWEIS: Wählen Sie Tiere aus, die beide Marker ausdrücken, um eine höhere Zuverlässigkeit zu erreichen. Priorisieren Sie Brüten mit hoher Markierungshäufigkeit ("Jackpot-Brüten"). - Jeder F1-Wurm wird auf einen einzelnen Teller übertragen und die Eiablage 1–2 Tage zugelassen.
- Lyse jeden F1-Wurm im Proteinase-K-Puffer, um PCR-Vorlagen vorzubereiten.
HINWEIS: Bewahren Sie Lysate bei −80 °C auf, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden. - Führen Sie eine Junction-PCR mit einem genomischen Primer außerhalb des Homologiearms und einem internen Tag-Primer durch.
HINWEIS: Berücksichtigen Sie entsprechende Platten von PCR-positiven F1-Tieren.
8. Screenen Sie F2-Nachkommen, um homozygote Knock-in-Linien zu isolieren und die Integration zu bestätigen
- Isolieren Sie F2-Nachkommen aus PCR-positiven F1-Linien auf einzelne Platten.
- Erlaube F2-Würmern, Nachkommen zu produzieren und erwachsene Würmer für die Genotypisierung zu lysieren.
HINWEIS: Bewahren Sie Lysate bei −20 °C auf, falls nötig. - Führen Sie PCR mit Primern an den Homologiearmen durch, um Wildtyp- und Knock-in-Allele nach Produktgröße zu unterscheiden.
- Bestätigen Sie die korrekte Integration durch Sanger-Sequenzierung über beide Einfügungen.
- Überprüfen Sie die Expression und Lokalisierung der Keimbahnfluoreszenz-Expression und -Lokalisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie.
- Erweitern Sie bestätigte homozygote Linien und halten Sie die Bestände aufrecht.
HINWEIS: Kryopreservierte Leitungen für Langzeitlagerung.
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Ergebnisse
Nach dem Protokoll wurden junge erwachsene Hermaphroditen gonadal mikroinjiziert mit einem CRISPR/Cas9-Plasmid (pDD162), einem Plasmidspender mit einem GFP-Knock-in-Tag, flankiert von etwa 1 kb Homologiearmen (pPD95.75), sowie Ko-Injektionsmarkern (pRF4 und pPD122.11). Ein mit Keimbahn angereichertes Zielgen wurde als repräsentatives Beispiel verwendet, um ein stabiles, homozygotes Knock-in-Allel zu erzeugen, das Proteinlokalisierung unter nativer regulatorischer Kontrolle meldet.
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Diskussion
Dieser Workflow ist darauf ausgelegt, stabile, homozygote Knock-in-Linien zu erzeugen, in die ein fluoreszierendes Tag am endogenen Locus eingefügt wird, um die Proteinlokalisierung unter native regulatorischer Kontrolle 5,6,7,8,9,10 zu melden. In der Praxis wird der Erfolg am besten durch e...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel des National Key Research and Development Program Chinas (2023YFA1801100 an L.M.), der Natural Science Foundation of China (32400698 zu P.W., 32270774 zu L.M.) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agar | Beijing Lablead Biotech Co., Ltd. | QZ02 | Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten |
| Agarose | NOVON | ZZ14011 | Herstellung von 2% Agarose-Pflaster |
| Caenorhabditis elegans Stamm N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Injektions-Hintergrundstamm | |
| Zentrifuge | Eppendorf | 5425 | Klärung der Injektionsmischung |
| Cholesterol | Beijing Chemical Reagents Company | 57-88-5 | Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten |
| Co-Injektionsmarker-Plasmid rol-6 (su1006) (pRF4) | Guangshuo Ou Lab | Roller-Marker zur Anreicherung von Kandidaten | |
| Konfokalmikroskop | ZEISS | LSM880 + Airyscan | Validierung der GFP-Expression/-Lokalisierung |
| Di-Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7758-11-4 | Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten |
| Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7558-79-4 | Komponente zur Herstellung von M9-Puffer |
| DNA-Leiter | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF288-01 | Größenreferenz für Agarose-Gels |
| Donor-Plasmid-Backbone (pPD95.75) | Addgene | 1494 | Backbone für HDR-Donor-Konstruktion |
| Elektrophorese System | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | 112-0630 | Trennung von PCR-Amplikomen auf Agarose-Gelen für die Überprüfung der Junction und die Genotypisierung der Zygosität |
| Escherichia coli OP50 Stamm | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Nahrungsquelle für Würmer | |
| Fluoreszierendes Co-Injektionsmarker-Plasmid (pPD122.11) | Fire Lab | GFP-Co-Marker zur Anreicherung von Kandidaten | |
| Fluoreszierendes Stereomikroskop | SOPTOP | SZX12-HT | Screening lebender Würmer auf fluoreszierende Co-Injektionsmarker |
| GelRed Nukleinsäure-Gel-Färbemittel | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF079-plus-01 | Visualisierung von DNA-Banden |
| Glaskarotten | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Verwendet mit Nadelzieher zum Herstellen von Injektionsnadeln |
| Halocarbonöl 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | Verhinderung der Austrocknung während der Injektion |
| Inkubator | Wuhan Ruihua Instrument & Equipment Co., Ltd. | HP400S | Erhaltung der Würmer bei Standardtemperatur |
| Magnesiumsulfat (MgSO4) | Sinapharm | CAS: 7487-88-9 | Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten und M9-Puffer |
| Mikrokapillarpipetten | KIMBLE | 71900-50 | Erhitzt und gebrochen, um ein Beladewerkzeug herzustellen |
| Mikroinjektoreinheit | Eppendorf | FemtoJet 4i | Übertragen von kontrollierten Druckimpulsen der Injektionsmischung in die distale Gonaden über eine Mikroinjektionsnadel (fußpedalgesteuert) |
| Mikroskop-Deckgläser | Fisherbrand | 12545A 22×30-1 | Herstellung von 2% Agarose-Pflaster für das Montieren und Immobilisieren von Würmern während der Mikroinjektion; Offene Injektionsnadelspitzen gegen den Deckglasrand |
| Mikroskop für Mikroinjektion | ZEISS | Axio Observer.A1 | Injektionsmikroskop |
| Nadelzieher | Sutter Instrument Company | Modell P97 | Ziehen von Glaskarotetten in Injektionsnadeln |
| PCR-Thermocycler | Bio-Rad | C1000 Touch Thermal Cycler | PCR-Amplifikation |
| pDD162 (Peft-3::Cas9 + leeres sgRNA) | Addgene | 47549 | Cas9 + sgRNA-Expression |
| Pepton | Gibco | 308723 | Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten |
| Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) | Sinapharm | CAS: 7778-77-0 | Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten und M9-Puffer |
| Natriumchlorid (NaCl) | Sinapharm | CAS: 7647-14-5 | Komponente zur Herstellung von NGM-Agarplatten und M9-Puffer |
| Stereomikroskop | Motic | K400L | Aufheben und Montieren von Würmern auf Agarose-Pflastern und Durchführung der Nachbehandlungsschritte nach der Injektion |
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