Auswirkungen der regulierenden SPRY2- und miR-590-5p-Expression auf Autophagie in humanen Arthrosemodell-Chondrozyten

Zusammenfassung

Entzündlicher Stress in einem IL-1β-induzierten C28/I2-Chondrozytenmodell erhöhte miR-590-5p und verringerte die SPRY2-Expression. Die Modulation dieser Achse veränderte die Expression von Beclin-1, LC3-II und Bcl-2, was auf einen mutmaßlichen miR-590-5p/SPRY2-Regulationsweg hindeutet, der autophagieassoziierte Reaktionen und das Überleben der Chondrozyten bei Arthrose beeinflussen könnte.

Zusammenfassung

Arthrose (OA) ist eine häufige degenerative Gelenkerkrankung, die durch fortschreitende Knorpelabbau und Verlust der Chondrozytenhomöostase gekennzeichnet ist. Obwohl dysregulierte Autophagie zur OA-Pathogenese beiträgt, sind die molekularen Mechanismen, die autophagieassoziierte Antworten in Chondrozyten steuern, weiterhin unvollständig verstanden. Diese Studie untersuchte die Rolle der miR-590-5p/SPRY2-Regulationsachse in einer entzündlichen OA-Mikroumgebung unter Verwendung von IL-1β-induzierten humanen C28/I2-Chondrozyten. Ein in-vitro-OA-Modell wurde durch die Behandlung von C28/I2-Zellen mit IL-1β entwickelt. Die Expression von miR-590-5p und SPRY2 wurde mittels quantitativer PCR und Western-Blotting untersucht. Gewinn- und Funktionsverlust-Ansätze wurden eingesetzt, um die Auswirkungen von SPRY2 und miR-590-5p auf die autophagieassoziierten Marker Beclin-1 und LC3-II sowie auf das überlebensbezogene Protein Bcl-2 zu bewerten. Bioinformatische Analysen und Rettungsexperimente wurden verwendet, um die regulatorische Beziehung zwischen miR-590-5p und SPRY2 zu untersuchen. Die Behandlung mit IL-1β erhöhte signifikant die Expression von miR-590-5p und reduzierte die SPRY2-mRNA- und Proteinspiegel (P < 0,05). Die Überexpression von SPRY2 verringerte die Beclin-1- und LC3-II-Expression deutlich mit Reduktionen von etwa 65 % bzw. 77 % (P < 0,05). Im Gegensatz dazu erhöhte die Überexpression von miR-590-5p die Expression von Beclin-1, LC3-II und Bcl-2, während die Hemmung von miR-590-5p diese Effekte umkehrte und die SPRY2-Expression wiederherstellte. Funktionale Analysen unterstützten SPRY2 als mutmaßliches nachgelagertes regulatorisches Ziel von miR-590-5p. Diese Ergebnisse identifizieren die miR-590-5p/SPRY2-Achse als wichtigen Regulator der autophagieassoziierten Markerexpression und des Chondrozytenüberlebens unter entzündlichen Bedingungen und deuten auf ihre potenzielle Relevanz als therapeutisches Ziel bei OA hin.

Einleitung

Als weltweit am häufigsten verbreitete Form der Arthritis ist Arthrose (OA) eine der Hauptursachen für Schmerzen, Mobilitätseinschränkungen und körperliche Behinderungen und stellt eine erhebliche Belastung für Gesundheitssysteme und die Gesellschaft^dar. Pathologisch ist OA durch fortschreitende Degeneration des Gelenkknorpels, Synovialentzündung und pathologische Umstrukturierung des subchondralen^{Knochens 1} gekennzeichnet. Epidemiologische Schätzungen zeigen, dass weltweit etwa 303 Millionen Menschen von OA betroffen sind, und diese Zahl wird voraussichtlich mit der Alterung der Bevölkerung und steigenden Fettleibigkeitsraten steigen². In China wird die Prävalenz der symptomatischen Knie-OA auf 8,1 % geschätzt, mit einer überproportional höheren Prävalenz bei Frauen und ländlichen Bevölkerungen³. Trotz seiner hohen Prävalenz bleiben die aktuellen Behandlungsoptionen weitgehend auf die Symptombehandlung durch nichtsteroidale Antirheumatika (NSAIDs) und chirurgische Eingriffe bei fortgeschrittenen Erkrankungen^{beschränkt 4}. Das Fehlen krankheitsmodifizierender Arthrosemedikamente (DMOADs) spiegelt ein unvollständiges Verständnis der molekularen Mechanismen wider, die die Homöostase und das Überleben der Chondrozyten regulieren^.

Die strukturelle und funktionelle Integrität des Gelenkknorpels hängt von residenten Chondrozyten ab, die den Umsatz der extrazellulären Matrix (ECM) durch ein Gleichgewicht zwischen anabolen und katabolen Aktivitäten^{aufrechterhalten 6}. Während des OA-Fortschreitens sind Chondrozyten abnormalem mechanischem Stress und proinflammatorischen Mediatoren ausgesetzt, insbesondere Interleukin-1β (IL-1β) und Tumornekrose-Faktor-α (TNF-α), die einen Wechsel von der Matrixsynthese hin zur Matrix-Degradation⁶ fördern. IL-1trägt β zur Knorpelzerstörung bei, indem es die Produktion von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und Aggrekanasen stimuliert und gleichzeitig die Synthese von Typ-II-Kollagen und Proteoglykanen^unterdrückt. Darüber hinaus induziert IL-1β oxidativen Stress und mitochondriale Dysfunktionen, was zu Chondrozytenapoptose und Seneszenz⁸ führt. Daher bleibt die Identifizierung intrazellulärer Signalwege, die das Überleben von Chondrozyten unter entzündlichen Bedingungen regulieren, eine Priorität in der OA-Forschung.

Autophagie ist ein evolutionär konservierter lysosomaler Abbauweg, der die zelluläre Homöostase durch die Entfernung und Wiederverwendung beschädigter Organellen und^{Proteinaggregate} aufrechterhält. Die basale Autophagie ist für das Überleben der Zellen und das Energiegleichgewicht unerlässlich; Allerdings kann dysregulierte Autophagie zum Krankheitsverlauf^{beitragen 9}. Bei OA gilt Autophagie allgemein als eine Schutzreaktion, die Chondrozyten hilft, sich an zellulären Stress anzupassen und Apoptose¹⁰ zu widerstehen. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die autophagische Aktivität während des Progressions der OA, insbesondere bei fortgeschrittenen Erkrankungen, abnimmt, was zu einer beeinträchtigten zellulären Qualitätskontrolle und einem erhöhten Chondrozytenverlust^führt. Mehrere Proteine werden häufig als Indikatoren für autophagieassoziierte Aktivität verwendet. Beclin-1 beteiligt sich an der Autophagosominitiierung, während die Umwandlung des mikrotubuliassoziierten Proteins 1 der leichten Kette 3 (LC3-I zu LC3-II) weit verbreitet als Marker für die Autophagosomenbildung¹² verwendet wird. Im Gegensatz dazu hemmt das B-Zell-Lymphom 2 (Bcl-2) die Beclin-1-abhängige Autophagie und übt gleichzeitig anti-apoptotische Effekte^aus. Dennoch erfordert die Interpretation autophagieassoziierter Marker Vorsicht, da statische Messungen von LC3-II und Beclin-1 die verstärkte Autophasosomenbildung nicht unabhängig voneinander von einer beeinträchtigten lysosomalen Degradation unterscheiden können. Trotz dieser Einschränkungen bleibt die Modulation autophagiebezogener Signalwege eine vielversprechende therapeutische Strategie für OA.

MikroRNAs (miRNAs) sind kurze nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression posttranskriptionell regulieren, indem sie an komplementäre Sequenzen innerhalb der 3′-untranslierten Regionen (3′-UTRs) der Zielboten-RNAs binden, was zu mRNA-Abbau oder translationaler Repression¹⁴ führt. Aberrante miRNA-Expression wurde durch Effekte auf Entzündung, Apoptose und ECM-Remodellierungⁱⁿ die OA-Pathogenese in Verbindung gebracht. Unter diesen Molekülen hat miR-590-5p wegen seiner regulatorischen Rolle im Knochenstoffwechsel und anderen pathologischen Prozessen Aufmerksamkeit erregt. Frühere Studien haben gezeigt, dass miR-590-5p die osteogene Differenzierung fördert und die Adipogenese in mesenchymalen Stammzellen¹⁶ unterdrückt. In Krebsmodellen zeigt miR-590-5p kontextabhängige Funktionen als entweder onkogener oder tumorsuppressiver Regulator¹⁷. Darüber hinaus wurden veränderte MikroRNA-Expressionsprofile, darunter Mitglieder der miR-590-Familie, an der pathologischen Remodellierung von Gelenkgeweben während OA¹⁸ beteiligt. Allerdings können die aus Stammzell- oder Krebsmodellen gewonnenen Belege nicht direkt auf reife Artikularchondrozyten extrapoliert werden. Daher ist die Rolle von miR-590-5p bei der Regulierung der Chondrozytenantworten innerhalb der entzündlichen OA-Mikroumgebung noch unvollständig verstanden.

Um mögliche nachgelagerte Mechanismen von miR-590-5p in OA zu untersuchen, wurden in silico-Zielvorhersageanalysen durchgeführt, bei denen Sprouty2 (SPRY2) als vermutetes nachgelagertes Ziel identifiziert wurde. SPRY2 gehört zur Sprouty-Familie von Proteinen, die die Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Signalübertragung negativ regulieren und die Aktivierung des RAS/MAPK/ERK-Weges¹⁹ unterdrücken. Da die MAPK-Signalübertragung die Differenzierung der Chondrozyten, entzündlichen Antworten und Autophagie beeinflusst, könnte SPRY2 einen wichtigen regulatorischen Knoten in der OA-Pathophysiologie^darstellen. Frühere Studien deuten darauf hin, dass SPRY2 entzündliche Reaktionen in rheumatoiden Arthritis-Modellen²¹ unterdrücken kann, an apoptose-bezogener Regulation in Epithelsystemen^{teilnimmt 22} und mit autophagiebedingten Reaktionen in ischämischen Verletzungsmodellen²³ assoziiert ist. Obwohl diese Beobachtungen darauf hindeuten, dass SPRY2 sowohl an der Regulation der Apoptose als auch der Autophagie beteiligt ist, ist seine Rolle in den Gelenkchondrozyten weiterhin schlecht charakterisiert. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass miR-590-5p und SPRY2 eine regulatorische Achse bilden, die das Überleben der Chondrozyten unter entzündlichem Stress beeinflusst.

Basierend auf diesen Beobachtungen wurde vorgeschlagen, dass miR-590-5p autophagieassoziierte Antworten in Chondrozyten durch Regulierung der SPRY2-Expression moduliert. Obwohl miR-590-5p und SPRY2 jeweils einzeln in anderen biologischen Kontexten untersucht wurden, ist ihre funktionelle Beziehung in OA-Chondrozyten noch nicht belegt. In der vorliegenden Studie wurde ein IL-1β-induziertes OA-Modell in C28/I2-menschlichen Chondrozyten verwendet, um die Expressionsmuster von miR-590-5p und SPRY2 zu untersuchen und deren Auswirkungen auf die Expression von Beclin-1, LC3-II und Bcl-2 zu bewerten. Durch die Untersuchung der miR-590-5p/SPRY2-Regulationsachse liefert diese Studie Einblicke in die epigenetischen Mechanismen, die dem Überleben der Chondrozyten zugrunde liegen, und identifiziert ein potenzielles therapeutisches Ziel für OA.

Protokoll

Diese Studie wurde ausschließlich mit der kommerziell erhältlichen humanen Chondrozytenzelllinie C28/I2 durchgeführt. An dieser Forschung waren keine menschlichen Teilnehmer, menschliche Gewebeproben, von Patienten gewonnene Materialien oder lebende Tiere beteiligt. Daher waren gemäß institutionellen und nationalen Richtlinien keine Genehmigung durch das Institutional Review Board (IRB) und das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) erforderlich. Die Werkzeuge, Chemikalien, Bausätze und Reagenzien, die im Protokoll verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellkultur und OA-Modellkonstruktion

Die humane Chondrozytenzelllinie C28/I2 (Details in der Materialtabelle) wurde von einem kommerziellen Lieferanten bezogen. Um die experimentelle Reproduzierbarkeit sicherzustellen, wurden die Zellen mittels Short Tandem Repeat (STR)-Profilierung authentifiziert und routinemäßig getestet, um das Fehlen einer Mycoplasma-Kontamination zu bestätigen. Zellen zwischen den Durchgängen 3 und 8 wurden für alle Experimente verwendet. Die Zellen wurden in DMEM mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (alle Kulturreagenzien sind in der Materialtabelle dargestellt) bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 %_CO2 erhalten.

Um das in-vitro-Arthrose (OA)-Modell zu etablieren, wurden C28/I2-Zellen mit rekombinantem humanem IL-1β stimuliert. Basierend auf der etablierten Literatur ^6,7, vorläufige Dosis-Wirkungs-Optimierungsexperimente, die darauf ausgelegt waren, einen robusten katabolischen Zustand ohne übermäßige unmittelbare Zytotoxizität zu induzieren, wurden die Zellen 24 Stunden lang mit 20 ng/mL IL-1β behandelt.

2. Experimentelle Gruppierung und Transfektion

Um die mechanistischen Signalwege zu erläutern, wurde die Studie in drei Hauptexperimentelle Module unterteilt, von denen jedes mindestens drei unabhängige biologische Replikate enthält:

1. SPRY2 Gewinn/Funktionsverlust:
   Zellen wurden dem Kontroll-, OA-Modell, OA + leerer Vektor (NC), OA + SPRY2-Überexpressionsplasmid (OE-SPRY2) und entsprechenden kleinen interferierenden RNA-Gruppen (si-NC und drei spezifische si-SPRY2-Konstrukte: si-695, si-800, si-896) zugeordnet, um auf Interferenzeffizienz zu testen.
2. miR-590-5p-Modulation:
   Die Zellen wurden in Kontrollgruppen, OA-Modell, OA + Mimic NC, OA + miR-590-5p-Mimic, OA + Inhibitor-NC und OA + miR-590-5p-Inhibitorgruppen unterteilt.
3. Funktionale Validierung der regulatorischen Beziehung zwischen miR-590-5p und SPRY2:
   Um die vorgeschlagene regulatorische Beziehung zwischen miR-590-5p und SPRY2 weiter zu bewerten, wurden Zellen miR-590-5p-Mimik- und Inhibitorbedingungen unterzogen, um zu bestimmen, ob die miR-590-5p-Modulation die SPRY2-Expression im OA-Modell verändert.
   Für die Transfektion wurden C28/I2-Zellen in 6-Well-Platten mit 2 × 10^5-Zellen pro Well-Bohrloch ausgesaat. Nach Erreichen der Konfluenz von 70 % bis 80 % wurden Transfektionen mit einem kommerziellen lipidbasierten Transfektionsreagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt und etablierte Verfahren für die Lieferung kleiner RNA in Chondrozyten²⁴. Kurz gesagt: Plasmide (OE-SPRY2 und NC; 2 μg/Well) und Oligonukleotide (miR-590-5p-Mimik/Inhibitor und siRNAs; 50 nM) wurden in reduziertem Serummedium verdünnt. Die Lipid-DNA/RNA-Komplexe wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie tropfenweise den Zellen in serumfreiem DMEM zugesetzt wurden. 6 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium durch vollständiges DMEM mit 10 % FBS ersetzt, und die Zellen wurden weitere 48 Stunden vor RNA- und Proteinextraktion kultiviert.

3. qPCR-Erkennung

Gesamt-RNA und miRNA wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers mit einem speziellen miRNA-Extraktions-Set isoliert. RNA-Reinheit und -Konzentration wurden mit einem UV-Vis-Spektrophotometer bewertet, und Proben mit A260/A280-Verhältnissen von 1,8–2,0 wurden für nachgelagerte Analysen verwendet. Kommerzielle Reverse-Transkriptionsreagenzien wurden zur Synthese von cDNA verwendet. Das qPCR-Zyklusverfahren war wie folgt: 95 °C für 10 Minuten; 40 Zyklen mit 95 °C für 10 s, 58 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse zur Überprüfung der Primer-Spezifität und des Fehlens von Primer-Dimeren. β-Aktin und U6 dienten als interne Kontrollmechanismen für mRNA bzw. miRNA. Die relative Genexpression wurde mit der ^{2-ΔΔCt-Methode 25} berechnet. Alle Primer-Sequenzen, einschließlich der für Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p und Referenzgene, sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Name des Primers	Vordere Zündhütte (5′-3′)	Rückwärts-Zündhütte (5′-3′)
U6	ATTGGAACGATACAGAGAAGATT	GGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5p	GCGTAAGGCACGCGGGTG	AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-actin	TGGCACCCAGCACAATGAA	CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA
SPRY2	TAAGCCACTGAGCAAGGAAGAT	TGGAAGGTAACCACAACAAGG
Bcl-2	TGGGATTCCTGCGGATTGAC	TCAGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
Beclin-1	TCCCGTGGAATGGAATGAGA	GTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTG
LC3-II	CATCCAACCAAAATCCCGGT	GAGCTGTAAGCGCCTTCTAA

Tabelle 1: Primer-Sequenzen, die für quantitative PCR-(qPCR)-Analysen verwendet werden. Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen werden zur Amplifikation und Quantifizierung von Zieltranskripten und internen Referenzkontrollen mittels qPCR verwendet.

Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Die statistische Signifikanz wurde mittels Einweg-ANOVA bestimmt, gefolgt vom S-N-K-Post-hoc-Test. Symbole zeigen: *P < 0,05 vs. Kontrolle; #P < 0,05 im Vergleich zum angezeigten Modell oder der negativen Kontrollgruppe; &P < 0,05 vs. OA+Inhibitor-NC.

4. Western-Blot-Erkennung

Die Zellen wurden entnommen und mit RIPA-Puffer gespaltet, ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitor-Cocktails, nach etablierten Proteinextraktions- und Immunoblotting-Verfahren. Nach der Zentrifugation bei 14.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C zur Entfernung von Zellresten wurde das Supernatant gesammelt und die Proteinkonzentrationen mit einem BCA-Protein-Testkit quantifiziert. Gleiche Mengen an Proteinlysat (30 μg) wurden denaturiert, durch SDS-PAGE für 1,5 Stunden aufgelöst und für 1,5 Stunden²⁶ auf PVDF-Membranen bei 300 mA übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettarmer Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (TBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert, gefolgt von einer Inkubation bei 4 °C für 16 Stunden mit spezifischen primären Antikörpern (z. B. Anti-SPRY2, 1:1000 Verdünnung). Nach drei Waschen in TBST wurden die Membranen mit geeigneten, HRP-konjugierten Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Die Proteinbänder wurden mit einem ECL-Detektionssystem visualisiert und mit der ImageJ-Software quantifiziert.

5. Statistische Analyse

Die Daten wurden mit einer statistischen Analysesoftware analysiert. Alle Experimente wurden mit mindestens drei unabhängigen biologischen Replikaten (n ≥ 3) durchgeführt, und quantitative Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Vor parametrischen Tests wurde die Normalität der Daten mit dem Shapiro-Wilk-Test bewertet und die Varianzhomogenität bewertet. Die statistische Signifikanz zwischen mehreren Gruppen wurde mittels einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) bewertet, gefolgt vom Student-Newman-Keuls (S-N-K) Post-hoc-Test für mehrere Vergleiche. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Etablierung des in-vitro-Chondrozyten-Entzündungsmodells

Um die molekularen Mechanismen der Arthrosepathologie zu untersuchen, wurde ein in-vitro-Entzündungsmodell entwickelt, das C28/I2 humane Chondrozyten mit IL-1β stimuliert verwendet. Die Validität dieses Modells wurde durch die Bewertung der Expression der Kollagen-Typ-II-Alpha-1-Kette (Col-II) bestätigt, einer Hauptkomponente der extrazellulären Matrix des hyalinen Knorpels und einem Markenzeichen gesunder Chondrozyten. Quantitative Analysen zeigten, dass die Exposition gegenüber IL-1β zu einer statistisch signifikanten Reduktion der Col-II-mRNA-Expression im Vergleich zur Kontrollgruppe führte. Diese phänotypische Veränderung weist auf eine anfängliche Verschiebung hin zu einem katabolen Zustand hin, der der osteoarthritischen Mikroumgebung ähnelt, und liefert damit ein grundlegendes Modell für spätere mechanistische Studien (Abbildung 1).

Abbildung 1: Etablierung des in-vitro Arthrose (OA)-Modells in humanen C28/I2-Chondrozyten. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit 20 ng/mL IL-1β behandelt. Die relative mRNA-Expression von Col-II wurde durch qPCR bestimmt, wobei β-Actin als Normalisierungskontrolle diente. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von drei unabhängigen biologischen Replikaten präsentiert (n = 3). Die statistische Analyse wurde mit Einweg-ANOVA durchgeführt. *P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Validierung der SPRY2-Überexpressionseffizienz in C28/I2-Cellen

Bevor die funktionelle Rolle von Sprouty2 (SPRY2) in diesem Modell bewertet wurde, wurde die Transfektionseffizienz des SPRY2-Überexpressionsvektors überprüft. Chondrozyten wurden entweder mit dem Überexpressionsplasmid (OE) oder einem negativen Kontrollleervektor (NC) transfektiert. Sowohl qPCR- als auch Western-Blot-Analysen zeigten eine robuste Hochregulation von SPRY2 auf mRNA- und Proteinniveaus in der OE-Gruppe im Vergleich zu den NC- und unbehandelten Kontrollgruppen. Diese in Abbildung 2 dargestellten Daten bestätigen, dass das experimentelle System erhöhte SPRY2-Werte aufrechterhielt, was die Untersuchung seiner spezifischen biologischen Effekte ermöglicht.

Abbildung 2: Validierung der SPRY2-Überexpression in C28/I2-Chondrozyten. Die Zellen wurden entweder mit einem leeren Vektor (NC) oder einem SPRY2-Überexpressionsplasmid (OE) transfektiert. Die relativen mRNA- und Proteinwerte von SPRY2 wurden jeweils mittels qPCR und Western Blot bewertet. β-Actin wurde als interne Belastungssteuerung eingesetzt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) angegeben. *P < 0,05 im Vergleich zur NC-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Die Überexpression von SPRY2 schwächt die Autophagie ab und moduliert Apoptosemarker unter entzündlichen Bedingungen

Nachfolgende Experimente versuchten herauszufinden, ob SPRY2 als Regulator der Autophagie und Apoptose im entzündlichen Kontext fungiert. Nach der Einführung des OA-Modells führte die Behandlung mit IL-1β allein zu einem deutlichen Anstieg der Autophagiemarker Beclin-1 und LC3-II, was auf eine kompensatorische autophagische Reaktion auf entzündlichen Stress hindeutet. Gleichzeitig war die Bcl-2-Expression in der Modellgruppe erhöht. Die Einführung des SPRY2-Überexpressionsvektors veränderte dieses Profil jedoch erheblich. Wie in Abbildung 3 dargestellt, zeigte die Model+OE-SPRY2-Gruppe eine signifikante Reduktion sowohl der Beclin-1- als auch der LC3-II-mRNA-Spiegel im Vergleich zu den Model- und Model+NC-Gruppen. Darüber hinaus schwächte die Überexpression von SPRY2 die entzündungsinduzierte Erhöhung von Bcl-2 ab. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SPRY2 die Expression autophagieassoziierter Marker in entzündlichen Chondrozyten negativ reguliert.

Abbildung 3: Die Überexpression von SPRY2 schwächt die Autophagie ab und moduliert Apoptosemarker unter IL-1β-induzierten Entzündungszuständen. Die relativen mRNA-Expressionsniveaus von SPRY2, Bcl-2, Beclin-1 und LC3-II wurden in den Gruppen qPCR quantifiziert, das Modell (IL-1β-behandelt), Model+NC und das Modell+OE-SPRY2. β-actin diente als interne Kontrolle. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde durch eine Einweg-ANOVA bestimmt, gefolgt vom S-N-K-Post-hoc-Test. *P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe; #P < 0,05 im Vergleich zur Model+NC-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

miR-590-5p reguliert autophagieassoziierte Marker hoch und fördert das Überleben der Chondrozyten

Anschließend wurde die funktionelle Wirkung von miR-590-5p auf autophagieassoziierte und überlebensbezogene Marker untersucht. Wie in Abbildung 4 dargestellt, erhöhte die Transfektion mit einem miR-590-5p-Mimik im OA-Modell die Expression von Bcl-2, Beclin-1 und LC3-II signifikant, im Gegensatz zu den hemmenden Effekten, die nach SPRY2-Überexpression beobachtet wurden. Umgekehrt reduzierte die Hemmung von miR-590-5p deutlich die Expression von Bcl-2 und Beclin-1, während die Reduktion von LC3-II keine statistische Signifikanz erreichte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass miR-590-5p die Expression autophagieassoziierter Marker und überlebensbezogener Bcl-2 in Chondrozyten erhöht, was weitere Untersuchungen zu möglichen nachgelagerten regulatorischen Zielen rechtfertigt.

Abbildung 4: miR-590-5p erhöht die autophagieassoziierte Markerexpression und die überlebensbezogene Bcl-2-Expression. Die relativen mRNA-Expressionsniveaus von Bcl-2, Beclin-1 und LC3-II wurden im OA-Modell nach Transfektion mit einem miR-590-5p-Mimiker, Inhibitor oder deren jeweiligen negativen Kontrollgruppen (NC) mittels qPCR gemessen. β-Actin diente als Normalisierungskontrolle. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt (n = 3). *P < 0,05 im Vergleich zur Model+Mimic-NC-Gruppe; #P < 0,05 im Vergleich zur Model+Inhibitor-NC-Gruppe (für Bcl-2 und Beclin-1). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

IL-1β moduliert die miR-590-5p/SPRY2-Achse und die autophagieassoziierte Markerexpression

Um die upstream-regulatorischen Mechanismen, die SPRY2 steuern, und dessen Beziehung zu miR-590-5p zu klären, wurden deren Expressionsprofile unter entzündlichen Bedingungen untersucht. Nach morphologischer Beobachtung des IL-1β-induzierten C28/I2-Zellmodells (Abbildung 5A) wurden die Transfektionseffizienzen für die SPRY2-Genmanipulation überprüft. Sowohl qPCR- als auch Western-Blot-Analysen bestätigten eine robuste SPRY2-Hochregulierung in der Überexpressionsgruppe (OE) und einen erfolgreichen Knockdown über die kleinen interferierenden RNA-(siRNA)-Gruppen im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollgruppen (Abbildung 5B und 5C). Umgekehrt wurden die miR-590-5p-Spiegel nach der Behandlung mit IL-1β signifikant hochreguliert.

Abbildung 5: Morphologische Beobachtung und Validierung der SPRY2-Transfektionseffizienz. (A) Morphologische Beobachtung von C28/I2-Zellen nach IL-1β-Behandlung (20×, Phasenkontrastmikroskop). (B) Relative mRNA- und Proteinexpressionsniveaus von SPRY2 in Control-, NC- und SPRY2-Überexpressionsgruppen (OE). (C) Repräsentative West-Blot-Bilder, die die SPRY2-Überexpression (links) und den SPRY2-Knockdown durch spezifische siRNAs (si-896, si-800, si-695) im Vergleich zu Kontrollen (rechts) bestätigen. β-Actin diente als interne Ladekontrolle. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) angegeben. *P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Um festzustellen, ob dieses inverse Expressionsmuster eine potenzielle regulatorische Beziehung widerspiegelt, wurde TargetScan Human 7.1 verwendet, um eine 8mer-vermutete Bindungsstelle für has-miR-590-5p innerhalb des 3′-UTR des humanen SPRY2 (Nukleotide 236–243) zu identifizieren. Die Sequenzausrichtung in Abbildung 6 veranschaulicht die vorhergesagte Komplementarität zwischen Samen und Region. Anschließend wurden Rettungsexperimente durchgeführt, um funktional zu untersuchen, ob die miR-590-5p-Modulation die SPRY2-Expression im OA-Modell veränderte. Nach Bestätigung der Transfektionseffizienz des miR-590-5p-Mimiks und -Inhibitors (Abbildungen 7A, B) zeigten Notfall-Assays, dass die miR-590-5p-Hemmung die OA-assoziierte Suppression der SPRY2-mRNA-Expression rückgängig machte (Abbildung 7C). Die miR-590-5p-Mimik reduzierte die SPRY2-Expression nicht weiter über die durch IL-1β induzierte deutliche Suppression, während die miR-590-5p-Hemmung die SPRY2-Expression im Vergleich zur negativen Kontrolle signifikant erhöhte. Diese Ergebnisse stützen eine inverse, mutmaßliche regulatorische Beziehung zwischen miR-590-5p und SPRY2 in entzündlichen Chondrozyten.

Abbildung 6: In silico Vorhersage der mutmaßlichen regulatorischen Interaktion miR-590-5p/SPRY2. Bioinformatische Analysen wurden mit TargetScan Human 7.1^31,32 durchgeführt, um mutmaßliche miRNA-Bindungsstellen zu identifizieren. Das Schema zeigt die vorhergesagte Sequenzausrichtung und die Komplementarität zwischen Has-miR-590-5p und dem 3′-UTR des menschlichen SPRY2 (Nukleotide 236–243). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Auswirkungen der miR-590-5p-Modulation auf die SPRY2-Expression in Chondrozyten. Transfektionseffizienzen wurden durch qPCR für den miR-590-5p-Mimik (A) und Inhibitor (B) im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollgruppen bestätigt. (C) Die relative SPRY2-mRNA-Expression wurde über die angezeigten experimentellen Gruppen nach miR-590-5p-Modulation im OA-Modell gemessen. U6 und β-Aktin wurden als interne Kontrollmechanismen für die Quantifizierung von miRNA bzw. mRNA verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt. *P < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe; #P < 0,05 im Vergleich zur jeweiligen Mimic-NC- oder Inhibitor-NC-Gruppe; &P < 0,05 im Vergleich zur OA+Inhibitor-NC-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Im Einklang mit den Ergebnissen in Abbildung 4 spiegelten Veränderungen der autophagieassoziierten Marker die erwarteten Effekte einer reduzierten SPRY2-Expression wider, was darauf hindeutet, dass miR-590-5p deren Expression durch die Aufhebung der SPRY2-vermittelten Hemmung verstärken könnte. Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse eine vermutete Signalachse, bei der IL-1β miR-590-5p hochreguliert, miR-590-5p die SPRY2-Expression unterdrückt und eine reduzierte SPRY2-Expression mit einer erhöhten Beclin-1- und LC3-II-Markerexpression assoziiert ist.

DATENVERFÜGBARKEIT:

Die Daten für diese Studie sind in Supplementary File 1 bereitgestellt.

Ergänzende Datei 1: Die für diese Studie verwendeten Datensätze, darunter qPCR-Quelldaten, Western-Blot-Quellbilder und statistische Analyseergebnisse.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Frühere Studien haben gezeigt, dass miRNAs die Autophagie in mehreren Stadien regulieren, einschließlich Initiation, Vesikelverlängerung und^{Reifung 27}. Die Beteiligung von miRNA an der OA-Pathogenese wurde zunehmend dokumentiert, insbesondere durch Effekte auf Entzündung, Apoptose, extrazelluläre Matrix-Remodellierung und autophagiebezogene Wege. miR-590-5p wurde mit zellulärer Homöostase und krebsassoziierten Prozessen 28,29,30 in Verbindung gebracht. In skelettalen und knorpelbezogenen Kontexten wurde berichtet, dass miR-590-5p die chondrogene Differenzierung menschlicher mesenchymaler Stammzellen 16 fördert, während es in OA-Chondrozytenmodellen Proliferation, Apoptose und Entzündungsreaktionen regulieren kann, indem es FGF^18,24 anvisiert. Es bleibt jedoch unklar, ob miR-590-5p autophagiebezogene Antworten in OA-Chondrozyten beeinflusst.

Daher wurden RNAInter und TargetScan verwendet, um potenzielle nachgelagerte Mediatoren zu erforschen, und beide Analysen deuteten auf SPRY2 als mutmaßliches miR-590-5p-assoziiertes Ziel hin. TargetScan Human 7.1^31,32 identifizierte eine vorhergesagte 8mer-Bindungsstelle der Samenregion an den Nukleotiden 236–243 des SPRY2 3′-UTR (Abbildung 6). SPRY2 ist ein negativer Regulator der Rezeptor-Tyrosinkinase/MAPK-Signalübertragung und wird in mehreren Geweben^exprimiert. Der intraartikuläre SPRY2-Gentransfer wurde berichtet, dass er adjuvant-induzierte Arthritis bei Ratten abschwächt²¹. Die Überexpression von SPRY2 kann das wachstum, die Invasion, Migration und die Zytokinese von HGF/SF vermittelten Zellen^hemmen, während der Verlust der Spry2-Funktion mit einer Hyperaktivierung von MAPK-ERK und erhöhter B-Zellproliferation³⁴ assoziiert ist. SPRY2 wurde auch in apoptose-bezogene Regulation²², miRNA-assoziierte Migrationskontrolle³⁵ und autophagiebezogene Reaktionen in ischämischen Modellen²³ in Verbindung gebracht. Zusammen unterstützen diese Studien SPRY2 als regulatorischen Knoten, der entzündliche Signale, überlebensbezogene Signalwege und autophagieassoziierte Antworten verknüpft.

Angesichts der bisher nicht berichteten Beziehung zwischen miR-590-5p und SPRY2 in OA-Chondrozyten führte die bioinformatische Vorhersage ihrer potenziellen Wechselwirkung zu weiteren experimentellen Untersuchungen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigten, dass SPRY2 signifikant herunterreguliert war, während miR-590-5p in IL-1β-stimulierten C28/I2-Chondrozyten hochreguliert war, was diese Achse in entzündliche Chondrozytenantworten einbindet. Funktional verringerte die SPRY2-Überexpression die Expression von Beclin-1 und LC3-II, was einen hemmenden Effekt auf die autophagieassoziierte Markerexpression unterstützte. Umgekehrt reduzierte die Hemmung von miR-590-5p die Expression von Beclin-1 und Bcl-2 und stellte die Expression von SPRY2 wieder her, was mit einer vermuteten inversen regulatorischen Beziehung übereinstimmt. Da Bcl-2 die Beclin-1-abhängige Autophagie hemmen und gleichzeitig anti-apoptotische Effekte ausüben kann, sollte die gleichzeitige Erhöhung von Bcl-2 mit Beclin-1 und LC3-II kontextspezifisch interpretiert werden. In diesem entzündlichen OA-Modell könnte die Bcl-2-Hochregulation in erster Linie eine überlebensbezogene antiapoptotische Reaktion widerspiegeln, während eine erhöhte Beclin-1- und LC3-II-Expression auf Linderung der SPRY2-assoziierten Suppression hinweisen könnte. Diese Ergebnisse deuten auf ein Modell hin, in dem miR-590-5p die überlebensbezogene Signalübertragung der Chondrozyten und die Expression von Autophagiemarkern durch Unterdrückung von SPRY2 unter entzündlichem Stress koordiniert.

Obwohl diese Studie wertvolle mechanistische Einblicke in die miR-590-5p/SPRY2-Achse liefert, sollten mehrere Einschränkungen anerkannt werden. Erstens wurden alle Experimente in einem 2D-In-vitro-System unter Verwendung der unsterblichen C28/I2-Zelllinie durchgeführt. Dieses vereinfachte Modell kann den biomechanischen Stress, die mehrzelligen Interaktionen und die entzündliche Mikroumgebung des Gelenkknorpels in vivo nicht vollständig wiedergeben, was die unmittelbare translationale Anwendbarkeit der Ergebnisse einschränkt. Zweitens, obwohl bioinformatische Vorhersagen und Rettungsassays eine vermutete regulatorische Beziehung zwischen miR-590-5p und SPRY2 stützen, verhindert das Fehlen eines dual-luciferase-Reporter-Assays eine endgültige Bestätigung der direkten physikalischen Bindung zwischen miR-590-5p und dem SPRY2 3′-UTR. Drittens können statische Messungen von Beclin-1 und LC3-II keine erhöhte Autophagosomenbildung von einer beeinträchtigten autolysosomalen Degradation unterscheiden; daher sollten zukünftige Studien den autophagischen Fluss mit Methoden wie der Bafilomycin-A1-Behandlung oder Tandem-Fluoreszenz-Reporter-Assays bewerten. Zukünftige Arbeiten sollten auch ein breiteres Spektrum von OA-phänotypischen Markern (z. B. MMP13 und ADAMTS5), primäre humane Chondrozyten, 3D-Knorpelexplantationsmodelle und in vivo OA-Modelle wie die Destabilisierung des medialen Meniskus umfassen, um die Langzeiteffekte der miR-590-5p- und SPRY2-Modulation zu bewerten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-β-actin antibody	Proteintech	66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938	Interner Lastkontroll für Western Blot-Analyse
Anti-SPRY2 antibody	Proteintech	11383-1-AP ; RRID: AB_2196324	Nachweis der SPRY2-Proteinexpression
BCA Protein-Assay-Kit	Thermo Fisher Scientific	23225	Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration
C28/I2 humane Chondrozyten-Zelllinie	Punocel	CP-H107	In-vitro-Chondrozytenmodell für Osteoarthrosestudien
Completes DMEM	KeyGen Biotec	KGM12800S	Basismedium für die Routine-Zellkultur
CWBIO Ultrapure miRNA-Extraktions-Kit	CWBIO	CW0627S	Isolierung von Gesamt-RNA und miRNA
ECL-Detektionssystem	Thermo Fisher Scientific	32106	Chemilumineszente Visualisierung von Proteinbändern
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	1891605	Zellkulturwachstumssupplement
GraphPad Prism Version 9.0	GraphPad Software	N/A	Statistische Analyse und Generierung von Grafiken
HiScript II Q RT SuperMix	Vazyme	R223-01	Reverse Transkription von mRNA in cDNA
ImageJ-Software	National Institutes of Health	N/A	Quantifizierung der Intensität von Western-Blot-Bändern
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000015	Transfektion von Plasmiden und Oligonukleotiden
miR-590-5p-Mimic, Inhibitor und NCs	RiboBio	Kundenspezifisch synthetisiert	Modulation der miR-590-5p-Expression
miRNA 1st Strand cDNA Synthese-Kit	Vazyme	MR101-02	Reverse Transkription von miRNA in cDNA
Opti-MEM-Medium	Gibco	31985-062	Vorbereitung von Transfektionskomplexen
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Verhinderung bakterieller Kontamination in der Zellkultur
Protease- und Phosphatase-Inhibitorcocktails	MedChemExpress	HY-K0010	Schutz von Proteinen während der Extraktion
PVDF-Membranen	Millipore Sigma	ISEQ00010	Proteintransfermembran für Immunoblotting
Rekombinantes humanes IL-1β	MedChemExpress	HY-P78459	Induktion OA-ähnlicher Entzündungsbedingungen
RIPA-Puffer	Beyotime	P0013B	Zelllyse und Proteinextraktion
si-SPRY2-Konstrukte und si-NC	GenePharma	Kundenspezifisch synthetisiert	Knockdown der SPRY2-Expression
SPRY2-Überexpressionsplasmid (OE) und leerer Vektor (NC)	GeneChem	Kundenspezifisch konstruiert	Evaluierung der SPRY2-Überexpressionseffekte
UV-VIS-Spektrophotometer (NanoDrop 2000)	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	Messung der RNA-Konzentration und -Reinheit