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Forschungsartikel

Auswirkungen der regulierenden SPRY2- und miR-590-5p-Expression auf Autophagie in humanen Arthrosemodell-Chondrozyten

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DOI:

10.3791/70883

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31. Juli 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, 2Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Entzündlicher Stress in einem IL-1β-induzierten C28/I2-Chondrozytenmodell erhöhte miR-590-5p und verringerte die SPRY2-Expression. Die Modulation dieser Achse veränderte die Expression von Beclin-1, LC3-II und Bcl-2, was auf einen mutmaßlichen miR-590-5p/SPRY2-Regulationsweg hindeutet, der autophagieassoziierte Reaktionen und das Überleben der Chondrozyten bei Arthrose beeinflussen könnte.

Zusammenfassung

Arthrose (OA) ist eine häufige degenerative Gelenkerkrankung, die durch fortschreitende Knorpelabbau und Verlust der Chondrozytenhomöostase gekennzeichnet ist. Obwohl dysregulierte Autophagie zur OA-Pathogenese beiträgt, sind die molekularen Mechanismen, die autophagieassoziierte Antworten in Chondrozyten steuern, weiterhin unvollständig verstanden. Diese Studie untersuchte die Rolle der miR-590-5p/SPRY2-Regulationsachse in einer entzündlichen OA-Mikroumgebung unter Verwendung von IL-1β-induzierten humanen C28/I2-Chondrozyten. Ein in-vitro-OA-Modell wurde durch die Behandlung von C28/I2-Zellen mit IL-1β entwickelt. Die Expression von miR-590-5p und SPRY2 wurde mittels quantitativer PCR und Western-Blotting untersucht. Gewinn- und Funktionsverlust-Ansätze wurden eingesetzt, um die Auswirkungen von SPRY2 und miR-590-5p auf die autophagieassoziierten Marker Beclin-1 und LC3-II sowie auf das überlebensbezogene Protein Bcl-2 zu bewerten. Bioinformatische Analysen und Rettungsexperimente wurden verwendet, um die regulatorische Beziehung zwischen miR-590-5p und SPRY2 zu untersuchen. Die Behandlung mit IL-1β erhöhte signifikant die Expression von miR-590-5p und reduzierte die SPRY2-mRNA- und Proteinspiegel (P < 0,05). Die Überexpression von SPRY2 verringerte die Beclin-1- und LC3-II-Expression deutlich mit Reduktionen von etwa 65 % bzw. 77 % (P < 0,05). Im Gegensatz dazu erhöhte die Überexpression von miR-590-5p die Expression von Beclin-1, LC3-II und Bcl-2, während die Hemmung von miR-590-5p diese Effekte umkehrte und die SPRY2-Expression wiederherstellte. Funktionale Analysen unterstützten SPRY2 als mutmaßliches nachgelagertes regulatorisches Ziel von miR-590-5p. Diese Ergebnisse identifizieren die miR-590-5p/SPRY2-Achse als wichtigen Regulator der autophagieassoziierten Markerexpression und des Chondrozytenüberlebens unter entzündlichen Bedingungen und deuten auf ihre potenzielle Relevanz als therapeutisches Ziel bei OA hin.

Einleitung

Als weltweit am häufigsten verbreitete Form der Arthritis ist Arthrose (OA) eine der Hauptursachen für Schmerzen, Mobilitätseinschränkungen und körperliche Behinderungen und stellt eine erhebliche Belastung für Gesundheitssysteme und die Gesellschaftdar. Pathologisch ist OA durch fortschreitende Degeneration des Gelenkknorpels, Synovialentzündung und pathologische Umstrukturierung des subchondralenKnochens 1 gekennzeichnet. Epidemiologische Schätzungen zeigen, dass weltweit etwa 303 Millionen Menschen von OA betroffen sind, und diese Zahl wird voraussichtlich mit der Alterung der Bevölkerung und steigenden Fettleibigkeitsraten steigen2. In China wird die Prävalenz der symptomatischen Knie-OA auf 8,1 % geschätzt, mit einer überproportional höheren Prävalenz bei Frauen und ländlichen Bevölkerungen3. Trotz seiner hohen Prävalenz bleiben die aktuellen Behandlungsoptionen weitgehend auf die Symptombehandlung durch nichtsteroidale Antirheumatika (NSAIDs) und chirurgische Eingriffe bei fortgeschrittenen Erkrankungenbeschränkt 4. Das Fehlen krankheitsmodifizierender Arthrosemedikamente (DMOADs) spiegelt ein unvollständiges Verständnis der molekularen Mechanismen wider, die die Homöostase und das Überleben der Chondrozyten regulieren.

Die strukturelle und funktionelle Integrität des Gelenkknorpels hängt von residenten Chondrozyten ab, die den Umsatz der extrazellulären Matrix (ECM) durch ein Gleichgewicht zwischen anabolen und katabolen Aktivitätenaufrechterhalten 6. Während des OA-Fortschreitens sind Chondrozyten abnormalem mechanischem Stress und proinflammatorischen Mediatoren ausgesetzt, insbesondere Interleukin-1β (IL-1β) und Tumornekrose-Faktor-α (TNF-α), die einen Wechsel von der Matrixsynthese hin zur Matrix-Degradation6 fördern. IL-1trägt β zur Knorpelzerstörung bei, indem es die Produktion von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und Aggrekanasen stimuliert und gleichzeitig die Synthese von Typ-II-Kollagen und Proteoglykanenunterdrückt. Darüber hinaus induziert IL-1β oxidativen Stress und mitochondriale Dysfunktionen, was zu Chondrozytenapoptose und Seneszenz8 führt. Daher bleibt die Identifizierung intrazellulärer Signalwege, die das Überleben von Chondrozyten unter entzündlichen Bedingungen regulieren, eine Priorität in der OA-Forschung.

Autophagie ist ein evolutionär konservierter lysosomaler Abbauweg, der die zelluläre Homöostase durch die Entfernung und Wiederverwendung beschädigter Organellen undProteinaggregate aufrechterhält. Die basale Autophagie ist für das Überleben der Zellen und das Energiegleichgewicht unerlässlich; Allerdings kann dysregulierte Autophagie zum Krankheitsverlaufbeitragen 9. Bei OA gilt Autophagie allgemein als eine Schutzreaktion, die Chondrozyten hilft, sich an zellulären Stress anzupassen und Apoptose10 zu widerstehen. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die autophagische Aktivität während des Progressions der OA, insbesondere bei fortgeschrittenen Erkrankungen, abnimmt, was zu einer beeinträchtigten zellulären Qualitätskontrolle und einem erhöhten Chondrozytenverlustführt. Mehrere Proteine werden häufig als Indikatoren für autophagieassoziierte Aktivität verwendet. Beclin-1 beteiligt sich an der Autophagosominitiierung, während die Umwandlung des mikrotubuliassoziierten Proteins 1 der leichten Kette 3 (LC3-I zu LC3-II) weit verbreitet als Marker für die Autophagosomenbildung12 verwendet wird. Im Gegensatz dazu hemmt das B-Zell-Lymphom 2 (Bcl-2) die Beclin-1-abhängige Autophagie und übt gleichzeitig anti-apoptotische Effekteaus. Dennoch erfordert die Interpretation autophagieassoziierter Marker Vorsicht, da statische Messungen von LC3-II und Beclin-1 die verstärkte Autophasosomenbildung nicht unabhängig voneinander von einer beeinträchtigten lysosomalen Degradation unterscheiden können. Trotz dieser Einschränkungen bleibt die Modulation autophagiebezogener Signalwege eine vielversprechende therapeutische Strategie für OA.

MikroRNAs (miRNAs) sind kurze nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression posttranskriptionell regulieren, indem sie an komplementäre Sequenzen innerhalb der 3′-untranslierten Regionen (3′-UTRs) der Zielboten-RNAs binden, was zu mRNA-Abbau oder translationaler Repression14 führt. Aberrante miRNA-Expression wurde durch Effekte auf Entzündung, Apoptose und ECM-Remodellierungin die OA-Pathogenese in Verbindung gebracht. Unter diesen Molekülen hat miR-590-5p wegen seiner regulatorischen Rolle im Knochenstoffwechsel und anderen pathologischen Prozessen Aufmerksamkeit erregt. Frühere Studien haben gezeigt, dass miR-590-5p die osteogene Differenzierung fördert und die Adipogenese in mesenchymalen Stammzellen16 unterdrückt. In Krebsmodellen zeigt miR-590-5p kontextabhängige Funktionen als entweder onkogener oder tumorsuppressiver Regulator17. Darüber hinaus wurden veränderte MikroRNA-Expressionsprofile, darunter Mitglieder der miR-590-Familie, an der pathologischen Remodellierung von Gelenkgeweben während OA18 beteiligt. Allerdings können die aus Stammzell- oder Krebsmodellen gewonnenen Belege nicht direkt auf reife Artikularchondrozyten extrapoliert werden. Daher ist die Rolle von miR-590-5p bei der Regulierung der Chondrozytenantworten innerhalb der entzündlichen OA-Mikroumgebung noch unvollständig verstanden.

Um mögliche nachgelagerte Mechanismen von miR-590-5p in OA zu untersuchen, wurden in silico-Zielvorhersageanalysen durchgeführt, bei denen Sprouty2 (SPRY2) als vermutetes nachgelagertes Ziel identifiziert wurde. SPRY2 gehört zur Sprouty-Familie von Proteinen, die die Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Signalübertragung negativ regulieren und die Aktivierung des RAS/MAPK/ERK-Weges19 unterdrücken. Da die MAPK-Signalübertragung die Differenzierung der Chondrozyten, entzündlichen Antworten und Autophagie beeinflusst, könnte SPRY2 einen wichtigen regulatorischen Knoten in der OA-Pathophysiologiedarstellen. Frühere Studien deuten darauf hin, dass SPRY2 entzündliche Reaktionen in rheumatoiden Arthritis-Modellen21 unterdrücken kann, an apoptose-bezogener Regulation in Epithelsystementeilnimmt 22 und mit autophagiebedingten Reaktionen in ischämischen Verletzungsmodellen23 assoziiert ist. Obwohl diese Beobachtungen darauf hindeuten, dass SPRY2 sowohl an der Regulation der Apoptose als auch der Autophagie beteiligt ist, ist seine Rolle in den Gelenkchondrozyten weiterhin schlecht charakterisiert. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass miR-590-5p und SPRY2 eine regulatorische Achse bilden, die das Überleben der Chondrozyten unter entzündlichem Stress beeinflusst.

Basierend auf diesen Beobachtungen wurde vorgeschlagen, dass miR-590-5p autophagieassoziierte Antworten in Chondrozyten durch Regulierung der SPRY2-Expression moduliert. Obwohl miR-590-5p und SPRY2 jeweils einzeln in anderen biologischen Kontexten untersucht wurden, ist ihre funktionelle Beziehung in OA-Chondrozyten noch nicht belegt. In der vorliegenden Studie wurde ein IL-1β-induziertes OA-Modell in C28/I2-menschlichen Chondrozyten verwendet, um die Expressionsmuster von miR-590-5p und SPRY2 zu untersuchen und deren Auswirkungen auf die Expression von Beclin-1, LC3-II und Bcl-2 zu bewerten. Durch die Untersuchung der miR-590-5p/SPRY2-Regulationsachse liefert diese Studie Einblicke in die epigenetischen Mechanismen, die dem Überleben der Chondrozyten zugrunde liegen, und identifiziert ein potenzielles therapeutisches Ziel für OA.

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Protokoll

Diese Studie wurde ausschließlich mit der kommerziell erhältlichen humanen Chondrozytenzelllinie C28/I2 durchgeführt. An dieser Forschung waren keine menschlichen Teilnehmer, menschliche Gewebeproben, von Patienten gewonnene Materialien oder lebende Tiere beteiligt. Daher waren gemäß institutionellen und nationalen Richtlinien keine Genehmigung durch das Institutional Review Board (IRB) und das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) erforderlich. Die Werkzeuge, Chemikalien, Bausätze und Reagenzien, die im Protokoll verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellkultur und OA-Modellkonstruktion

Die humane Chondrozytenzelllinie C28/I2 (Details in der Materialtabelle) wurde von einem kommerziellen Lieferanten bezogen. Um die experimentelle Reproduzierbarkeit sicherzustellen, wurden die Zellen mittels Short Tandem Repeat (STR)-Profilierung authentifiziert und routinemäßig getestet, um das Fehlen einer Mycoplasma-Kontamination zu bestätigen. Zellen zwischen den Durchgängen 3 und 8 wurden für alle Experimente verwendet. Die Zellen wurden in DMEM mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (alle Kulturreagenzien sind in der Materialtabelle dargestellt) bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 %CO2 erhalten.

Um das in-vitro-Arthrose (OA)-Modell zu etablieren, wurden C28/I2-Zellen mit rekombinantem humanem IL-1β stimuliert. Basierend auf der etablierten Literatur 6,7, vorläufige Dosis-Wirkungs-Optimierungsexperimente, die darauf ausgelegt waren, einen robusten katabolischen Zustand ohne übermäßige unmittelbare Zytotoxizität zu induzieren, wurden die Zellen 24 Stunden lang mit 20 ng/mL IL-1β behandelt.

2. Experimentelle Gruppierung und Transfektion

Um die mechanistischen Signalwege zu erläutern, wurde die Studie in drei Hauptexperimentelle Module unterteilt, von denen jedes mindestens drei unabhängige biologische Replikate enthält:

  1. SPRY2 Gewinn/Funktionsverlust:
    Zellen wurden dem Kontroll-, OA-Modell, OA + leerer Vektor (NC), OA + SPRY2-Überexpressionsplasmid (OE-SPRY2) und entsprechenden kleinen interferierenden RNA-Gruppen (si-NC und drei spezifische si-SPRY2-Konstrukte: si-695, si-800, si-896) zugeordnet, um auf Interferenzeffizienz zu testen.
  2. miR-590-5p-Modulation:
    Die Zellen wurden in Kontrollgruppen, OA-Modell, OA + Mimic NC, OA + miR-590-5p-Mimic, OA + Inhibitor-NC und OA + miR-590-5p-Inhibitorgruppen unterteilt.
  3. Funktionale Validierung der regulatorischen Beziehung zwischen miR-590-5p und SPRY2:
    Um die vorgeschlagene regulatorische Beziehung zwischen miR-590-5p und SPRY2 weiter zu bewerten, wurden Zellen miR-590-5p-Mimik- und Inhibitorbedingungen unterzogen, um zu bestimmen, ob die miR-590-5p-Modulation die SPRY2-Expression im OA-Modell verändert.
    Für die Transfektion wurden C28/I2-Zellen in 6-Well-Platten mit 2 × 105-Zellen pro Well-Bohrloch ausgesaat. Nach Erreichen der Konfluenz von 70 % bis 80 % wurden Transfektionen mit einem kommerziellen lipidbasierten Transfektionsreagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt und etablierte Verfahren für die Lieferung kleiner RNA in Chondrozyten24. Kurz gesagt: Plasmide (OE-SPRY2 und NC; 2 μg/Well) und Oligonukleotide (miR-590-5p-Mimik/Inhibitor und siRNAs; 50 nM) wurden in reduziertem Serummedium verdünnt. Die Lipid-DNA/RNA-Komplexe wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie tropfenweise den Zellen in serumfreiem DMEM zugesetzt wurden. 6 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium durch vollständiges DMEM mit 10 % FBS ersetzt, und die Zellen wurden weitere 48 Stunden vor RNA- und Proteinextraktion kultiviert.

3. qPCR-Erkennung

Gesamt-RNA und miRNA wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers mit einem speziellen miRNA-Extraktions-Set isoliert. RNA-Reinheit und -Konzentration wurden mit einem UV-Vis-Spektrophotometer bewertet, und Proben mit A260/A280-Verhältnissen von 1,8–2,0 wurden für nachgelagerte Analysen verwendet. Kommerzielle Reverse-Transkriptionsreagenzien wurden zur Synthese von cDNA verwendet. Das qPCR-Zyklusverfahren war wie folgt: 95 °C für 10 Minuten; 40 Zyklen mit 95 °C für 10 s, 58 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse zur Überprüfung der Primer-Spezifität und des Fehlens von Primer-Dimeren. β-Aktin und U6 dienten als interne Kontrollmechanismen für mRNA bzw. miRNA. Die relative Genexpression wurde mit der 2-ΔΔCt-Methode 25 berechnet. Alle Primer-Sequenzen, einschließlich der für Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p und Referenzgene, sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Name des Primers Vordere Zündhütte (5′-3′)Rückwärts-Zündhütte (5′-3′)
U6ATTGGAACGATACAGAGAAGATTGGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5pGCGTAAGGCACGCGGGTGAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-actinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA
SPRY2TAAGCCACTGAGCAAGGAAGATTGGAAGGTAACCACAACAAGG
Bcl-2TGGGATTCCTGCGGATTGACTCAGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
Beclin-1TCCCGTGGAATGGAATGAGAGTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTG
LC3-IICATCCAACCAAAATCCCGGTGAGCTGTAAGCGCCTTCTAA

Tabelle 1: Primer-Sequenzen, die für quantitative PCR-(qPCR)-Analysen verwendet werden. Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen werden zur Amplifikation und Quantifizierung von Zieltranskripten und internen Referenzkontrollen mittels qPCR verwendet.

Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Die statistische Signifikanz wurde mittels Einweg-ANOVA bestimmt, gefolgt vom S-N-K-Post-hoc-Test. Symbole zeigen: *P < 0,05 vs. Kontrolle; #P < 0,05 im Vergleich zum angezeigten Modell oder der negativen Kontrollgruppe; &P < 0,05 vs. OA+Inhibitor-NC.

4. Western-Blot-Erkennung

Die Zellen wurden entnommen und mit RIPA-Puffer gespaltet, ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitor-Cocktails, nach etablierten Proteinextraktions- und Immunoblotting-Verfahren. Nach der Zentrifugation bei 14.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C zur Entfernung von Zellresten wurde das Supernatant gesammelt und die Proteinkonzentrationen mit einem BCA-Protein-Testkit quantifiziert. Gleiche Mengen an Proteinlysat (30 μg) wurden denaturiert, durch SDS-PAGE für 1,5 Stunden aufgelöst und für 1,5 Stunden26 auf PVDF-Membranen bei 300 mA übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettarmer Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (TBST) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert, gefolgt von einer Inkubation bei 4 °C für 16 Stunden mit spezifischen primären Antikörpern (z. B. Anti-SPRY2, 1:1000 Verdünnung). Nach drei Waschen in TBST wurden die Membranen mit geeigneten, HRP-konjugierten Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Die Proteinbänder wurden mit einem ECL-Detektionssystem visualisiert und mit der ImageJ-Software quantifiziert.

5. Statistische Analyse

Die Daten wurden mit einer statistischen Analysesoftware analysiert. Alle Experimente wurden mit mindestens drei unabhängigen biologischen Replikaten (n ≥ 3) durchgeführt, und quantitative Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Vor parametrischen Tests wurde die Normalität der Daten mit dem Shapiro-Wilk-Test bewertet und die Varianzhomogenität bewertet. Die statistische Signifikanz zwischen mehreren Gruppen wurde mittels einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) bewertet, gefolgt vom Student-Newman-Keuls (S-N-K) Post-hoc-Test für mehrere Vergleiche. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

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Ergebnisse

Etablierung des in-vitro-Chondrozyten-Entzündungsmodells

Um die molekularen Mechanismen der Arthrosepathologie zu untersuchen, wurde ein in-vitro-Entzündungsmodell entwickelt, das C28/I2 humane Chondrozyten mit IL-1β stimuliert verwendet. Die Validität dieses Modells wurde durch die Bewertung der Expression der Kollagen-Typ-II-Alpha-1-Kette (Col-II) bestätigt, einer Hauptkomponente der extrazellulären Matrix des hyalinen Knorpels und ...

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Diskussion

Frühere Studien haben gezeigt, dass miRNAs die Autophagie in mehreren Stadien regulieren, einschließlich Initiation, Vesikelverlängerung undReifung 27. Die Beteiligung von miRNA an der OA-Pathogenese wurde zunehmend dokumentiert, insbesondere durch Effekte auf Entzündung, Apoptose, extrazelluläre Matrix-Remodellierung und autophagiebezogene Wege. miR-590-5p wurde mit zellulärer Homöostase und krebsassoziierten Prozessen 28,29,30 in Verbindung gebracht.

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Die Autoren danken der Abteilung für Geriatrie am Ruikang-Krankenhaus der Guangxi-Universität für Chinesische Medizin für die Bereitstellung experimenteller Einrichtungen und technischer Unterstützung für diese Studie. Die Autoren danken auch dem Laborpersonal und den Kollegen für ihre Unterstützung bei der Datenerhebung und -analyse. Diese Arbeit wurde vom Naturwissenschaftlichen Forschungsprojekt der Guangxi Universität für Chinesische Medizin unterstützt (Förderzuschuss Nr. 2022MS039; LncRNA-GAS5 vermittelt die SPRY2-Expression zur Hemmung der Autophagie in Mausknie-OA-Chondrozyten: Mechanismusstudie und Frühinterventionseffekt von Huayu Qushi Prescription) und der National Natural Science Foundation of China (Regional Foundation) (Förderung Nr. 82160912; Mechanismusdiskussion über Skp2-Ubiquitination, Abbau von FoxO1, Hemmung der Knieartrose, Chondrozytenautophagie und Frühinterventionseffekt von Huayu Qushi Rezept.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-β-actin antibodyProteintech66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938Interner Lastkontroll für Western Blot-Analyse
Anti-SPRY2 antibodyProteintech11383-1-AP ; RRID: AB_2196324Nachweis der SPRY2-Proteinexpression
BCA Protein-Assay-KitThermo Fisher Scientific23225Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration
C28/I2 humane Chondrozyten-ZellliniePunocelCP-H107In-vitro-Chondrozytenmodell für Osteoarthrosestudien
Completes DMEMKeyGen BiotecKGM12800SBasismedium für die Routine-Zellkultur
CWBIO Ultrapure miRNA-Extraktions-KitCWBIOCW0627SIsolierung von Gesamt-RNA und miRNA
ECL-DetektionssystemThermo Fisher Scientific32106Chemilumineszente Visualisierung von Proteinbändern
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco1891605Zellkulturwachstumssupplement
GraphPad Prism Version 9.0GraphPad SoftwareN/AStatistische Analyse und Generierung von Grafiken
HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-01Reverse Transkription von mRNA in cDNA
ImageJ-SoftwareNational Institutes of HealthN/AQuantifizierung der Intensität von Western-Blot-Bändern
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015Transfektion von Plasmiden und Oligonukleotiden
miR-590-5p-Mimic, Inhibitor und NCsRiboBioKundenspezifisch synthetisiertModulation der miR-590-5p-Expression
miRNA 1st Strand cDNA Synthese-KitVazymeMR101-02Reverse Transkription von miRNA in cDNA
Opti-MEM-MediumGibco31985-062Vorbereitung von Transfektionskomplexen
Penicillin-StreptomycinGibco15140122Verhinderung bakterieller Kontamination in der Zellkultur
Protease- und Phosphatase-InhibitorcocktailsMedChemExpressHY-K0010Schutz von Proteinen während der Extraktion
PVDF-MembranenMillipore SigmaISEQ00010Proteintransfermembran für Immunoblotting
Rekombinantes humanes IL-1βMedChemExpressHY-P78459Induktion OA-ähnlicher Entzündungsbedingungen
RIPA-PufferBeyotimeP0013BZelllyse und Proteinextraktion
si-SPRY2-Konstrukte und si-NCGenePharmaKundenspezifisch synthetisiertKnockdown der SPRY2-Expression
SPRY2-Überexpressionsplasmid (OE) und leerer Vektor (NC)GeneChemKundenspezifisch konstruiertEvaluierung der SPRY2-Überexpressionseffekte
UV-VIS-Spektrophotometer (NanoDrop 2000)Thermo Fisher ScientificND-2000Messung der RNA-Konzentration und -Reinheit

Referenzen

  1. Hunter DJ, Bierma-Zeinstra S. Osteoarthritis. Lancet. 2019;393:1745-59.
  2. GBD 2019 Diseases and Injuries Collaborators. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 2020;396:1204-22.
  3. Tang X, et al. The prevalence of symptomatic knee osteoarthritis in China: Results from the China Health and Retirement Longitudinal Study. Arthritis Rheumatol. 2016;68:648-53.
  4. Latourte A, Kloppenburg M, Richette P. Emerging pharmaceutical therapies for osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2020;16:673-88.
  5. Glyn-Jones S, et al. Osteoarthritis. Lancet. 2015;386:376-87.
  6. Kapoor M, et al. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:33-42.
  7. Goldring MB, Otero M. Inflammation in osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol. 2011;23:471-8.
  8. Lepetsos P, Papavassiliou AG. ROS/oxidative stress signaling in osteoarthritis. Biochim Biophys Acta. 2016;1862:576-91.
  9. Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: Renovation of cells and tissues. Cell. 2011;147:728-41.
  10. Caramés B, Olmer M, Kiosses WB, Lotz MK. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis Rheumatol. 2015;67:1568-76.
  11. Lotz MK, Caramés B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:579-87.
  12. Kabeya Y, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 2000;19:5720-8.
  13. Pattingre S, et al. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy. Cell. 2005;122:927-39.
  14. Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004;116:281-97.
  15. Miyaki S, Asahara H. Macro view of microRNA function in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2012;8:543-52.
  16. Wu Z, Lin Y, Zhang Z, Pan Y. Melatonin-mediated miR-526b-3p and miR-590-5p upregulation promotes chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Pineal Res. 2018;65:e12483.
  17. Chen M, Wang S, Chen Y. miR-590-5p suppresses hepatocellular carcinoma chemoresistance by targeting YAP1 expression. EBioMedicine. 2018;35:142-54.
  18. Endisha H, Rockel J, Jurisica I, Kapoor M. The complex landscape of microRNAs in articular cartilage: biology, pathology, and therapeutic targets. JCI Insight. 2018;3:e98630.
  19. Guy GR, Jackson RA, Yusoff P, Chow SY. Sprouty proteins: Modified modulators, matchmakers or missing links? J Endocrinol. 2009;203:191-202.
  20. Loeser RF. Integrins and chondrocyte-matrix interactions in articular cartilage. Matrix Biol. 2014;39:11-6.
  21. Zhang W, Chen L, Xiong Y. Intraarticular gene transfer of SPRY2 suppresses adjuvant-induced arthritis in rats. Appl Microbiol Biotechnol. 2015;99:6727-35.
  22. Liu Y, et al. MicroRNA-124 facilitates lens epithelial cell apoptosis by inhibiting SPRY2 and MMP-2. Mol Med Rep. 2021;23:381.
  23. Wu Y, Gao Z, Zhang J. Transcription factor E2F1 aggravates neurological injury in ischemic stroke via microRNA-122-targeted Sprouty2. Neuropsychiatr Dis Treat. 2020;16:2633-47.
  24. Jiang P, Zheng Z, Tang Y. miR-590-5p affects chondrocyte proliferation, apoptosis, and inflammation by targeting FGF18 in osteoarthritis. Am J Transl Res. 2021;13:8728-41.
  25. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 2001;25:402-8.
  26. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:4350-4.
  27. Panagopoulos PK, Lambrou GI. The involvement of microRNAs in osteoarthritis and recent developments: A narrative review. Mediterr J Rheumatol. 2018;29:67-79.
  28. Barwal TS, Sharma P. miR-590-5p: A double-edged sword in the oncogenesis process. Cancer Treat Res Commun. 2022;32:100593.
  29. Mou K, Chen M. miR-590-5p inhibits tumor growth in malignant melanoma by suppressing YAP1 expression. Oncol Rep. 2018;40:2056-66.
  30. D'Adamo S, et al. Autophagy in osteoarthritis: a target for new therapies. Curr Rheumatol Rep. 2020;22:37.
  31. Agarwal V, Bell GW, Nam JW, Bartel DP. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 2015;4:e05005.
  32. Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 2009;19:92-105.
  33. Lee CC, et al. Overexpression of sprouty 2 inhibits HGF/SF-mediated cell growth, invasion, migration, and cytokinesis. Oncogene. 2004;23:5193-202.
  34. Frank MJ, et al. Expression of sprouty2 inhibits B-cell proliferation and is epigenetically silenced in mouse and human B-cell lymphomas. Blood. 2009;113:2478-87.
  35. Cui S, et al. Hsa-miR-22-3p inhibits liver cancer cell EMT and cell migration/invasion by indirectly regulating SPRY2. PLoS One. 2023;18:e0281536.

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