Visualisierung und Quantifizierung der intermolekularen RNA-Basenpaarung in in vitro RNA-Clustern mit gespaltenen Brokkoli-RNA-Reportern

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen visuellen Test mit gespaltenen Brokkoli-RNA-Reportern, um intermolekulare Basenpaarungen in vitro in RNA-Clustern zu erkennen und zu quantifizieren.

Abstract

RNA-Clustering, ausgelöst durch multivalente intermolekulare RNA–RNA-Interaktionen, kann in vitro ohne Proteine auftreten. Während chemische Sondierungen und computergestützte Simulationen zur Vorhersage dieser Wechselwirkungen verwendet wurden, bleiben Methoden zur direkten Bewertung der intermolekularen Basenpaarung in RNA-Clustern begrenzt. Diese Studie präsentiert einen visuellen Assay basierend auf gespaltenen Brokkoli-RNA-Reportern, die zu fluoreszenzmarkierten RNAs von Interesse konjugiert sind. Der Test ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung intermolekularer Basenpaarungen in RNA-Clustern. Das Split-Brokkoli-System enthält komplementäre Reportersequenzen, die dimerisieren und das Brokkoli-RNA-Aptämer bilden. Die resultierende dimerisierte RNA-Struktur bindet an DFHBI-1T, ein Fluorophor, das bei der Bindung grüne Fluoreszenz abgibt. Beim RNA-Clustering meldet das Auftreten von grüner Fluoreszenz Basenpaarung, die durch die komplementären Reportersequenzen zwischen den interessierenden RNAs vermittelt wird. Die Messung der DFHBI-1T-Fluoreszenz ermöglicht eine quantitative Bewertung, wie in vitro RNA-Clusteringbedingungen die intermolekulare Basenpaarung zwischen diesen Reportersequenzen beeinflussen.

Introduction

In vitro transkribierte RNAs können sich durch Zugabe von Salzen und molekularen Crowding-Reagenzien 1,2,3,4,5 selbst zu sichtbaren Clustern zusammensetzen. Bemerkenswert ist, dass sich diese RNA-Cluster ohne andere zelluläre Komponenten, einschließlich Proteine, bilden können, was darauf hindeutet, dass unter bestimmten Bedingungen intermolekulare RNA–RNA-Interaktionen ausreichen, um die RNA-Kondensation in vitro anzutreiben.

Unter den verschiedenen Arten intermolekularer RNA–RNA-Interaktionen hat die intermolekulare Basenpaarung im Kondensatbereich^erhebliche Aufmerksamkeit ^erhalten. Diese Interaktionen können durch freiliegende komplementäre Sequenzen ("Postleitzahlen") zwischen den Transkripten angetrieben werden, wie durch das Ko-Clustern von BNI1- und SPA2-mRNAs im filamentösen Pilz Ashbya gossypii² oder die Oligomerisierung von Oskar-mRNA in Drosophila melanogaster ^6,7 demonstriert wird . Alternativ kann die intermolekulare Basenpaarung durch das Remodellieren von RNA-Sekundärstrukturen gefördert werden, wobei komplementäre Sequenzen freigelegt werden, die sonst strukturell eingebettet sind. Dieser Mechanismus wurde in wiederholten RNAs in Silico⁹ und Guanidin-Riboswitches in vitro¹⁰ beobachtet. Sowohl freiliegende komplementäre Sequenzen als auch RNA-Strukturremodellierung können mit chemischer Sonde^11,12 oder Simulationsansätzen ^4,9,13,14 gemessen werden. Methoden, die die intermolekulare Basenpaarung in in vitro RNA-Clustering-Assays direkt visualisieren, bleiben jedoch begrenzt.

RNA-Pull-down-Assays mit Basenpaarungs-Crosslinkern ^15,16,17 und Gelelektrophorese ^4,6,7 werden häufig verwendet, um intermolekulare RNA-Basenpaarungen in vitro zu untersuchen. Diese Methoden verfügen jedoch nicht über die räumliche Auflösung, um Basenpaarungen innerhalb von Clustern von denen außerhalb zu unterscheiden. Darüber hinaus ist die Isolierung von RNA-Clustern für die nachgelagerte Analyse technisch herausfordernd, da sie die Stabilität des Clusters erhält und gleichzeitig die Pufferkompatibilität mit nachfolgenden Assays gewährleistet.

Ein visueller Assay basierend auf gespaltenen Brokkoli-RNA-Reportern¹⁸ , die zu fluoreszenzmarkierten RNAs von Interesse konjugiert sind, wurde zuvor eingesetzt, um den direkten Nachweis der intermolekularen Basenpaarung während RNA-Kondensation in vitro⁴ zu ermöglichen. In diesem Zusammenhang berichtet das Split-Brokkoli-System über die Wahrscheinlichkeit intermolekularer Interaktionen zwischen Reportern oder zwischen RNAs, die diese unter definierten in-vitro-Clustering-Bedingungen tragen. So untersucht der Assay, wie Sequenzkontext und Umweltfaktoren die Neigung zu intermolekularen Basenpaarungen innerhalb einer RNA-clusterähnlichen Umgebung beeinflussen.

Das geteilte Brokkoli-System besteht aus zwei komplementären RNA-Sequenzen, oben und unten, die dimerisieren, um den Brokkoli-RNA-Aptämer wiederherzustellen (Abbildungen 1A–C)¹⁸. Bei der Dimerisierung bindet der Aptamer an das Fluorophor DFHBI-1T, was zu grüner Fluoreszenz führt (Abbildungen 1A–C)¹⁸. Mit diesem System wird gezeigt, dass das Ausmaß der intermolekularen Basenpaarung zwischen komplementären Berichtersequenzen innerhalb von RNA-Clustern von der RNA-Faltung abhängt. Durch den Vergleich des Verhältnisses von DFHBI-1T-Fluoreszenz zu RNA-Niveaus unter verschiedenen experimentellen Bedingungen kann der Einfluss von In-vitro-Bedingungen auf die berichtervermittelte intermolekulare Basenpaarung innerhalb von RNA-Clustern quantitativ bewertet werden.

Dieser Test ergänzt RNA-Pulldown- und Gelelektrophorese-Ansätze zur Untersuchung intermolekularer Basenpaarung in RNA-Clustern. Allerdings kann eine robuste Signalerkennung molekulare Crowding-Reagenzien erfordern, und die Empfindlichkeit ist durch die Effizienz der Dimerisierung und Faltung der gespaltenen Brokkoli-oberen und unteren RNAs begrenzt.

Protocol

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Implementierung dieses Tests und behandelt dessen Anwendungen. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von DNA-Vorlagen für die In-vitro-RNA-Transkription

1. Fügen Sie eine T7-Promotorsequenz an das 5′-Ende jeder DNA-Vorlage an, die die geteilten Brokkoli-Aptämersequenzen für die In-vitro-RNA-Transkription enthält. Verwenden Sie allein die geteilten Brokkoli-Aptämersequenzen (oben und unten) oder setzen Sie sie an jeder Position stromabwärts des T7-Promotors ein, mit oder ohne eine zusätzliche RNA-Sequenz von Interesse.
   HINWEIS: Die Sequenzen für den T7-Promotor, die geteilten Brokkoli-Reporter und die Primer, die zur Amplifizierung der DNA-Vorlagen verwendet werden, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
   HINWEIS: Die T7-RNA-Polymerase bevorzugt stark die Initiierung der Transkription mit einem "G" an der +1-Position. Das Vorhandensein zusätzlicher Gs unmittelbar stromabwärts an den +2- und +3-Positionen kann die Transkriptionsausbeute¹⁹ erhöhen. Wenn jedoch die nachgelagerte Sequenz mit G beginnt, wie bei den oberen und unteren Konstrukten, die mit zwei G beginnen, kann die Transkription an unterschiedlichen Positionen²⁰ beginnen. Daher können Transkripte am 5′-Ende ein, zwei oder drei G tragen (z. B. GATCC, GGATCC oder GGGATCC), was die Interpretation der Basenpaarung in den entworfenen Konstrukten beeinflussen kann.
2. Verwenden Sie kommerziell synthetisierte Genblöcke, Plasmide oder DNA-Fragmente als Vorlagen für PCR. Wenn die ursprüngliche Schablone keinen T7-Promoter enthält, verwenden Sie einen vorderen Primer mit einem 5′ T7-Promoter-Überhang zusammen mit dem entsprechenden Reverse-Primer.
3. Bereite eine 50 μL PCR-Reaktion in einem 200 μL PCR-Röhrchen vor, das jeweils 2,5 μL von 10 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimern, 20 ng DNA-Schablone, 25 μL 2× hochpräzisem Master-Mix und nukleasefreiem Wasser enthält. Gründlich mischen, indem man auf und ab pipettiert, und bei 2.000 g × g 2 Sekunden zentrifugieren.
4. Die PCR-Reaktion wird in einem thermischen Zyklus mit folgendem Programm durchgeführt: 98 °C für 30 Sekunden (1 Zyklus); 98 °C für 10 s, optimierte Glühtemperatur für 30 s und 72 °C für 30 s pro Kilobase (35 Zyklen); 72 °C für 2 Minuten (1 Zyklus).
   HINWEIS: Bestimmen Sie die optimierte Glühtemperatur mit einem Online-Tool wie einem TM-Rechner. PCR-Produkte können nach Abschluss bei 4 °C gelagert werden.
5. Mischen Sie 2 μL PCR-Produkte mit 8 μL nukleasefreiem Wasser und 2 μL 6× Ladefarbe. Fülle die Mischung auf ein 1%-Agarose-Gel zur Elektrophorese.
   HINWEIS: Das PCR-Produkt sollte als Einzelband erscheinen. Wenn mehrere Bänder beobachtet werden, entfernen Sie das richtige Band und reinigen Sie es mit einem Gelextraktionsset, bevor Sie fortfahren.
6. Reinigen Sie das PCR-Produkt oder gel-extrahierte DNA mit einem DNA-Reinigungskit und elutieren Sie in 20–30 μL nukleasefreiem Wasser in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
7. Misse die DNA-Konzentration und -Reinheit mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer. Stellen Sie sicher, dass A260/A280 ungefähr 1,8 und A260/A230 größer als 2,0 sind.
   HINWEIS: Wenn A260/A230 unter 2,0 liegt, führen Sie einen zusätzlichen Reinigungsschritt durch.
8. Lagere die DNA-Schablone bis zur Anwendung bei −20 °C.

2. Vorbereitung einer in-vitro RNA-Transkriptionsreaktion

1. Wischen Sie die Arbeitsfläche, die Röhrenracks und Pipetten mit einer RNase-Dekontaminationslösung ab. Verwenden Sie RNase-freie, gefilterte Tipps.
2. Taureaktionspuffer und Nukleotidlösungen (ATP, CTP, GTP, UTP), geliefert mit dem T7-Transkriptionskit zusammen mit UTP-Cy5, auf Eis. Zentrifugieren Sie alle Röhren mit 2.000 × g für 2 Sekunden vor der Nutzung.
   HINWEIS: Schütze UTP-Cy5 vor Licht.
3. Berechnen Sie die Anzahl der Thyminbasen in der DNA-Vorlage (ohne den T7-Promotor) und bestimmen Sie die erforderlichen Volumina von UTP und UTP-Cy5 für eine 20-μL-Transkriptionsreaktion. Halten Sie eine konsistente Markierungsdichte über alle RNA-Arten hinweg.
   HINWEIS: Um beispielsweise eine RNA mit 100 Uracilbasen und etwa drei Cy5-markierten Uracils zu kennzeichnen, fügen Sie 4,5 μL 1 mM UTP-Cy5 und 1,9 μL 75 mM UTP hinzu.
4. Bereite eine 20 μL Transkriptionsreaktion vor, indem jeweils 2 μL von ATP, CTP und GTP, berechnete Volumina UTP (alle im Kit geliefert) und UTP-Cy5, 2 μL 10× Reaktionspuffer, 2 μL Enzymmischung, 200 ng DNA-Vorlage und nukleasefreies Wasser kombiniert werden. Gründlich mischen, indem man auf und ab pipettieren, und bei 2.000 g × g für 2 Sekunden zentrifugieren.
5. Die Reaktion bei 37 °C 6 Stunden inkubieren.
6. Fügen Sie 1 μL DNase hinzu, die mit dem Bausatz geliefert wird. Gründlich mischen, indem man auf und ab pipettiert, und bei 2.000 × g für 2 Sekunden zentrifugieren.
7. Inkubieren Sie bei 37 °C für weitere 15 Minuten.
8. Übertragen Sie die Reaktion (~20 μL) auf eine 1,5-mL-Röhre. Fügen Sie 115 μL nukleasefreies Wasser und 15 μL Ammoniumacetat-Stopplösung hinzu, die mit dem Kit geliefert wird. Gründlich mischen, indem man auf und ab pipettiert, und mit 2.000 × g für 2 Sekunden zentrifugieren.
   HINWEIS: Ein kommerzielles RNA-Reinigungskit kann anstelle der Schritte 2.9–3.7 verwendet werden.
9. Fügen Sie 150 μL Phenol/Chloroform hinzu und mischen Sie vorsichtig.
   VORSICHT: Handhabe Phenol/Chloroform in einer chemischen Abzugshaube.
10. Zentrifugiere bei 16.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C.
11. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Rohr.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Interphase zu stören; Die untere Schicht kann aufgrund des nicht eingearbeiteten Farbstoffs blau erscheinen.
12. Gib eine gleiche Menge Chloroform hinzu und vermische gründlich.
    VORSICHT: Chloroform in einer chemischen Abzugshaube handhaben.
13. Zentrifugiere bei 16.000 × g für 2 Minuten bei 4 °C.
14. Wiederholen Sie die Schritte 2.11–2.13.
15. Übertragen Sie die wässrige Schicht (~100–150 μL) in ein neues Rohr. Gib 900 μL Isopropanol hinzu und vermische gründlich.
16. Aliquot in drei gleich große Volumina in separaten Röhren.
    HINWEIS: Jeder Aliquot ist für mehrere RNA-Clustering-Reaktionen ausreichend.
17. Lagern Sie über Nacht oder bis zu einem Monat bei −20 °C.

3. Reinigung von in vitro transkribierter RNA

1. Zentrifugieren Sie die RNA-Probe in Isopropanol bei 16.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C.
2. Entfernen Sie das Isopropanol vorsichtig, ohne das RNA-Pellet zu stören.
3. Fügen Sie 1 ml 70 % Ethanol in nukleasefreiem Wasser hinzu.
4. Zentrifugiere bei 16.000 × g für 2 Minuten bei 4 °C.
5. Entfernen Sie das Ethanol und wiederholen Sie die Schritte 3.3–3.4.
6. Während der abschließenden Ethanolwaschung wird der Großteil des Ethanols mit einer 1000-μL-Pipette entfernt. Zentrifugieren Sie kurzzeitig mit 2.000 × g für 2 Sekunden in einer Minizentrifuge auf der Werkbank und entfernen Sie den restlichen Ethanol mit einer 20-μL-Pipett.
7. Das RNA-Pellet 1–2 Minuten bei Raumtemperatur (RT) an der Luft trocknen.
8. Setzen Sie das RNA-Pellet in 20 μL nukleasefreiem Wasser wieder auf. Bewahren Sie die Probe auf Eis und schützen Sie sie vor Licht.
9. Missen Sie die RNA-Konzentration und -Reinheit mit einem Mikrovolumenspektrophotometer. Stellen Sie sicher, dass A260/A280 ungefähr 2,0 ist und A260/A230 größer als 2,0.

4. Vorbereitung einer in-vitro-RNA-Clustering-Reaktion

HINWEIS: In diesem Protokoll erfordert die Induktion von RNA-Clustering Spermin und PEG 8000, basierend auf früheren Studien ^2,4,5. Konkret wurde eine 100 mM große Spermin-Tetrahydrochlorid-Lagerlösung, die in nukleasefreiem Wasser hergestellt wurde, in mehrere 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhren aliquotiert und bei −20 °C gelagert.

1. Taue eine Tube mit 100 mM Spermienlösung und 50% PEG 8000 auf Eis.
   HINWEIS: Nach der Öffnung sollte 50 % PEG 8000 nicht länger als zwei Monate verwendet werden, da der Verfall möglich ist.
2. Um 500 μL frisch hergestellten 10× RNA-Refold-Puffer herzustellen, kombinieren Sie 50 μL 2M KCl, 50 μL 1M MgCl₂, 50 μL 1M Tris (pH 7,0) und 350 μL nukleasefreies Wasser. Gründlich mischen, indem man auf und ab pipettiert. Zentrifugiere mit 2.000 × g für 2 Sekunden in einer Minizentrifuge auf der Werkbank.
   HINWEIS: Der Refold-Puffer sollte am Tag des RNA-Clustering-Experiments vorbereitet werden.
   HINWEIS: Die Schritte 4.3-4.4 hängen von den experimentellen Bedingungen ab und können bei Bedarf angepasst werden. Zwei Beispielbedingungen für RNA-Clustering, die in dieser Studie verwendet wurden, werden unten beschrieben. Die Co-Faltungsbedingung ist von einer Methode adaptiert, die verwendet wird, um Antisense-Oligonukleotide auf RNA² zu annealisieren. Bei dieser Methode werden RNAs in einem Salzpuffer gemischt und zusammen erhitzt, um die intermolekulare Basenpaarung zwischen RNAs mit komplementären Sequenzen zu fördern. Im Gegensatz dazu wird bei der separaten Faltungsbedingung jede RNA vor der Mischung einzeln gefaltet. Dieser Zustand soll ein zelluläres Szenario approximieren, in dem RNAs vor der Wechselwirkung gefaltet werden.
3. Co-Folding
   HINWEIS: Dieser Zustand fördert die intermolekulare Basenpaarung zwischen RNAs, die die obere und untere Sequenz enthalten. Es dient als positive Kontrolle für die berichtergesteuerte intermolekulare Basenpaarung unter der RNA-Clustering-Bedingung.
   1. In einer 200-μL-PCR-Röhre werden 16 pmol jeder in vitro transkribierten RNA mit entweder oberer oder unterer Sequenz, 2 μL 10× Refolding-RNA-Puffer und nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 14 μL kombiniert. Gründlich durch Pipettieren auf und ab vermischen. Zentrifugiere mit 2.000 × g für 2 Sekunden in einer Minizentrifuge auf der Werkbank.
      HINWEIS: Um die RNA-Masse entsprechend 16 pmol zu berechnen.
   2. Erhitze die RNA-Probe bei 90 °C für 2 Minuten.
   3. Übertragen Sie die Probe sofort auf RT und schützen Sie sie vor Licht. Inkubiere die Reaktion bei RT 1 Stunde lang.
4. Separates Falten
   1. Erhitze die RNA-Probe bei 90 °C für 2 Minuten und lege sie dann sofort mindestens 15 Minuten auf Eis.
   2. In einem 200-μL-PCR-Röhrchen werden 16 pmol in vitro transkribierte RNA mit entweder oberer oder unterer Sequenz, 1 μL 10× Refolding-RNA-Puffer und nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 7 μL kombiniert.
      HINWEIS: Um die RNA-Masse entsprechend 16 pmol zu berechnen.
   3. Inkubiere die Reaktion bei RT 30 Minuten, geschützt vor Licht.
   4. Kombinieren Sie die RNA-Proben mit den oberen und unteren Sequenzen zu einer einzigen PCR-Röhre. Gründlich mischen, indem man auf und ab pipettiert. Zentrifugiere mit 2.000 × g für 2 Sekunden in einer Minizentrifuge auf der Werkbank. Inkubiere bei RT für 30 Minuten.
5. Fügen Sie 6 μL eines 1:2 (v/v) Premix aus 100 mM Spermin und 50% PEG 8000 hinzu. Gründlich mischen, indem man auf und ab pipettiert. Zentrifugiere mit 2.000 × g für 2 Sekunden in einer Tisch-Minizentrifuge.
   HINWEIS: 50 % PEG 8000 ist sehr viskos. Pipette langsam und vorsichtig.
6. Fügen Sie der Reaktion 2 μL von 1 mM DFHBI-1T hinzu. Gründlich mischen, indem man auf und ab pipettiert. Zentrifugiere mit 2.000 × g für 2 Sekunden in einer Tisch-Minizentrifuge. Die Reaktion sollte gelb-grün erscheinen.
   HINWEIS: Um eine 20 mM DFHBI-1T-Serienlösung aus 1 mg DFHBI-1T (MW: 320,21) lyophilisiertem Farbstoff herzustellen, fügen Sie 156 μL molekularbiologisch-fähiges wasserfreies DMSO hinzu. Aliquot den Bestand in kleinen Mengen in mehreren Mikrozentrifugenröhren und bei -20 °C lagern. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen für die Farbstoffe. Bereiten Sie eine frisch verdünnte 1 mM DFHBI-1T-Arbeitslösung vor, indem Sie den 20 mM Vorrat in nukleasefreiem Wasser verdünnen und auf Eis lagern.
7. Lade die Reaktion in ein Glaskammer-Deckglas.
8. Inkubiere die Kammer bei RT 4 Stunden im Dunkeln mit der Abdeckung drauf, um die Verdunstung zu minimieren.

5. Vorbereitung auf Bildgebung

1. Dreidimensionale Bilder werden mit einem strukturierten Beleuchtungs- oder Konfokalmikroskop aufgenommen, das mit geeigneten Lasern und Zielen ausgestattet ist.
   HINWEIS: Konfokalmikroskopie ist erforderlich, um unscharfes Licht zu minimieren.
2. Konfigurieren Sie das Mikroskop so, dass jede Region von Interesse (ROI) zuerst mit dem Cy5-Kanal an jeder Z-Ebene abbildet, gefolgt von der Abbildung derselben ROI mit dem GFP-Kanal.
3. Stellen Sie die Belichtungszeit für alle Kanäle auf 500 ms ein. Stelle die Laserleistung für GFP auf 80 % und 40 % für Cy5 ein.
4. Stellen Sie sich eine Deckungsregion außerhalb des Reaktionstropfens bei RT mit einer Z-Schrittgröße von 150 nm vor.

6. Quantifizierung der intermolekularen Basenpaarung

1. Bilder in die Bildanalysesoftware importieren²¹. Identifizieren Sie GFP (DFHBI-1T) und Cy5 (RNA) Kanäle.
2. Zeichnen Sie eine ROI von 5 × 5 Pixel innerhalb eines RNA-Clusters und messen Sie die integrierte Dichte beider Kanäle auf derselben Z-Ebene. Wählen Sie in jedem Bild 5–8 ROIs aus verschiedenen RNA-Clustern aus.
   HINWEIS: Passe die ROI-Größe je nach Kamera-Setup an, aber halte die Konsistenz über die Experimente hinweg.
3. Wählen Sie 5–8 ROIs außerhalb des Reaktionstropfens für die Hintergrundmessung aus und berechnen Sie die durchschnittliche integrierte Dichte für beide Kanäle.
4. Berechnen Sie die normalisierte DFHBI-1T-Intensität für jeden ROI mit:
   

7. Häufige Probleme und Fehlerbehebung

1. Wenn nach der Zentrifugation kein RNA-Pellet beobachtet wird, betrachten Sie RNA-Abbau, unzureichende Transkriptionszeit, inaktive Polymerase, Restsalze oder niedrige RNA-Konzentration. Verwenden Sie RNase-freie Reagenzien, verlängern Sie die Transkriptionszeit, verwenden Sie frische Enzyme und reinigen Sie Vorlagen.
2. Wenn keine Cy5-markierten RNA-Cluster beobachtet werden, betrachtet man RNA-Abbau oder degradierte PEG 8000 oder UTP-Cy5. Verwenden Sie frische Reagenzien und RNase-freie Bedingungen.
3. Wenn unter Kofaltungsbedingungen kein DFHBI-1T-Signal beobachtet wird, betrachtet man schlechte Farbstoffqualität, fehlende Brokkolistrukturbildung oder abgeschnittene Transkripte. Verwenden Sie frische Farbstoffe, sorgen Sie für die richtige Pufferzusammensetzung und überprüfen Sie die Transkriptgröße durch eine Gelanalyse.
4. Wenn das Fluoreszenzsignal bleicht, reduzieren Sie die Laserleistung und Belichtungszeit, minimieren Sie Bildgebungsschritte und schützen Sie die Proben während der Inkubation vor Licht.

Results

In diesem Demonstrationsexperiment wurde zunächst die Fähigkeit der oberen und unteren RNA-Reporter, Basenpaarungen zu bilden und die Brokkolistruktur zu bilden, zunächst mit dem zuvor beschriebenen in vitro RNA-Clustering-Protokoll⁴ untersucht. Die Basenpaarung zwischen oben und unten erzeugt zwei Brokkoli-Arme, die jeweils in der Lage sind, ein DFHBI-1T-Molekül einzufügen (Abbildungen 1A–C)^18,22.

Bei der Induktion der RNA-Clusterbildung mit Spermin und PEG 8000 bildeten beide RNAs Cluster, entweder einzeln oder gemeinsam (Abbildungen 1D–Eii). Wenn obere oder untere RNAs isoliert untersucht wurden, war die DFHBI-1T-Fluoreszenz innerhalb der RNA-Cluster deutlich niedriger als im Co-Folding-Zustand, bei dem die beiden RNAs vor Wärmedenaturierung und -refolding kombiniert wurden (Abbildung 1F). Im Kofaltungszustand wurde das molare Verhältnis von DFHBI-1T (0,1 mM) zu oben (0,8 μM) und unten (0,8 μM) auf 125:1:1 geschätzt. Dies entspricht einem etwa 62,5-fachen Überschuss an DFHBI-1T im Verhältnis zur maximalen Anzahl potenzieller Brokkolistrukturen.

Das niedrige, aber nicht nullliegende DFHBI-1T-Signal, das allein für oben und unten beobachtet wurde, stimmt mit früheren Berichten überein, die eine minimale DFHBI-1T-Fluoreszenz zeigen, wenn jeder Reporter individuell¹⁸ ausdrückt. DFHBI-1T zeigte außerdem eine sehr geringe, aber nachweisbare Hintergrundfluoreszenz in Abwesenheit von RNA (Abbildung 1F). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass DFHBI-1T mit dem in-vitro-RNA-Clustering-Assay kompatibel ist und dass Co-Folding die intermolekulare Basenpaarung zwischen oberen und unteren RNAs verbessert.

Nach der Normalisierung auf RNA-Intensität erreichte die normalisierte DFHBI-1T-Fluoreszenzintensität im Co-Folding-Zustand 1,03, was signifikant höher war als die von oben und unten allein (0,054 bzw. 0,023) (Abbildung 1D, Abbildung 1Ei und Abbildung 1F). RNA-Cluster, die durch das Mischen von oberen und unteren RNAs, die vor der Clusterbildung separat gefaltet wurden, gebildet wurden, wurden anschließend untersucht (Abbildung 1D, Abbildung 1EII und Abbildung 1F). In dieser separaten Faltungsbedingung betrug das normalisierte DFHBI-1T-Signal 0,031, vergleichbar mit den Basisniveaus, die in den negativen Kontrollen (oben oder unten allein) beobachtet wurden (Abbildung 1F). Diese Ergebnisse zeigen, dass Kofaltung die intermolekulare Basenpaarung zwischen oberen und unteren RNAs fördert, während getrennte Faltung solche Interaktionen einschränkt.

Die oberen und unteren Sequenzen wurden anschließend in den 3′ untranslaterten Bereich (UTR) von Drosophila melanogaster Shutdown (shu), einer Keimgranulat-mRNA ^4,23,24, und deren Antisense-Gegenstück (shu^anti) eingesetzt. Der Shu 3′ UTR wurde ausgewählt, weil frühere Arbeiten gezeigt haben, dass diese RNA überwiegend als Monomer in Drosophila melanogaster existiert und selbst bei hohen molaren Konzentrationen in RNA-Gel-Assays ^4,24 nicht dimerisiert. Außerdem bilden Shu-Top und Shu-Bottom keine Homodimere in RNA-Gelen⁴, was eine direktere Bewertung intermolekularer Interaktionen zwischen Top und Bottom sowie des Einflusses flankierender Sequenzen aus Shu ermöglicht.
Die DNA-Vorlagen für shu-top, shu-bottom, shu^anti-top und shu^anti-bottom sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die oberen und unteren Sequenzen wurden in die Mitte des Shu- oder Shu-Anti-3′-UTR eingefügt, was eine strukturelle Umstrukturierung erforderte, um die Interaktion zu erleichtern und physiologische RNA–RNA-Interaktionen besser nachzuahmen, bei denen wechselwirkende Regionen typischerweise in Transkripte⁴ eingebettet sind.

Bei der Induktion der RNA-Clusterbildung zeigten Shu-Top, Shu-Bottom, Shu^Anti-Top und Shu^Anti-Bottom jeweils minimale DFHBI-1T-Fluoreszenz, ähnlich wie Top und Bottom allein (Abbildungen 2A und 2B). Konsistent erzeugte das Co-Folding von Shu-Top mit Shu-Bottom oder Shu^Anti-Top mit Shu^Anti-Bottom ein höheres DFHBI-1T-Signal als separate Folding (Abbildungen 2Ci und Cii). Nach der Normalisierung auf RNA-Intensität und negative Kontrollen (definiert als das durchschnittliche normalisierte DFHBI-1T-Signal jeder RNA allein) führte die Ko-Faltung von Shu-Top und Shu-Bottom zu einer 5,63-fachen Erhöhung der normalisierten DFHBI-1T-Fluoreszenz (Abbildungen 2Di und 2Dii). Im Gegensatz dazu zeigte die separate Faltung nur eine 1,04-fache Zunahme, vergleichbar mit den Basisniveaus, die jeweils für Shu-Top und Shu-Bottom beobachtet wurden. Ähnliche Trends wurden für Shu^Anti-Top und Shu^Anti-Bottom unter Kofaltungs- und getrennten Faltungsbedingungen beobachtet (Abbildungen 2Di und 2Dii). Diese Ergebnisse zeigen, dass separate Faltung die intermolekulare Basenpaarung zwischen shu-oben und shu-unten oder shu^anti-oben und shu^anti-unten nicht fördert, während die Kofaltung diese Interaktionen verstärkt, wahrscheinlich aufgrund der eingefügten Reportersequenzen.

Um zu testen, ob Shu und Shu Anti-Can-Basispaaren sind, wurde Shu-Top mit Shu^Anti-Bottom gemischt, und Shu^Anti-Top mit Shu-Bottom. Beide Kombinationen zeigten eine höhere DFHBI-1T-Fluoreszenz sowohl unter Co-Faltung als auch bei separaten Faltungsbedingungen im Vergleich zu Shu-Top mit Shu-Bottom oder Shu^Anti-Top mit Shu^Anti-Bottom (Abbildungen 2Ci und 2Cii). Nach der Normalisierung führte das Kofolding von shu-top mit shu^anti-bottom und shu^anti-top mit shu-bottom zu 61,86- bzw. 82,60-fachen Zuwächsen der DFHBI-1T-Fluoreszenz (Abbildung 2Di und 2Dii). Im Gegensatz dazu führte separate Faltung nur zu 2,69- bzw. 4,94-fachen Zuwächsen (Abbildungen 2Di und 2Dii). Obwohl deutlich niedriger als unter Co-Folding-Bedingungen, waren diese Werte höher als die für shu-top mit shu-bottom oder shu^anti-top mit shu^anti-bottom (1,04 bzw. 1,16).

Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass Reporter mit zusätzlichen komplementären Sequenzen eine größere Fähigkeit zum Basenpaaren haben als solche ohne solche Sequenzen. Dieser Effekt wird unter der Kofaltungsbedingung weiter verstärkt, was intermolekulare Wechselwirkungen fördert.

Abbildung 1: Vorhergesagte Sekundärstrukturen von oberen und unteren RNAs sowie Quantifizierung ihrer intermolekularen Basenpaarung in in vitro RNA-Clustern. (A–B) Beispiele für sekundäre Strukturen von oben (A) und unten (B), die einzeln gefaltet sind, wie von RNAfold²⁵ vorhergesagt. Wenn sie getrennt gefaltet werden, rekonstituieren oben und unten das Brokkoli-Aptämer nicht, und DFHBI-1T (grauer Stern) erzeugt minimale Fluoreszenz. (C) Beispiel für die Sekundärstruktur von basengepaarten oberen und unteren RNAs, wie von RNAcofold²⁵ vorhergesagt. Die intermolekulare Basenpaarung zwischen den beiden RNAs stellt zwei Brokkoliarme¹⁸ wieder zusammen, was die DFHBI-1T-Bindung ermöglicht und zu starker grüner Fluoreszenz (grüne Sterne) führt. (D) Bilder von DFHBI-1T allein (nur Farbstoffkontrolle) und in vitro RNA-Clustern (Magenta), die von oberen und unteren RNAs in Anwesenheit von DFHBI-1T (grün) gebildet werden. (Ei, ii) In vitro RNA-Cluster (Magenta), die von oberen und unteren RNAs unter Co-Folding (i) und separaten Faltungsbedingungen (ii) in Gegenwart von DFHBI-1T (grün) gebildet werden. Für die Panels D und E wurden RNAs mit Cy5 markiert, sodass im Durchschnitt etwa ein Drittel der RNAs ein einziges Cy5-markiertes Uracil enthalten, während die übrigen zwei Drittel unmarkiert sind. Die Bilder stellen durchschnittliche Z-Projektionen von 27 Schnitten dar, die mit einer Schrittlänge von 150 nm aufgenommen wurden, wobei für jeden Kanal unter allen Bedingungen dieselbe Belichtung und Laserleistung verwendet werden. Die DFHBI-1T-Fluoreszenz wurde unter verschiedenen Bedingungen auf denselben Intensitätsbereich normiert. Skalenbalken: 2 μm. (F) Die DFHBI-1T-Intensität wurde auf RNA-Häufigkeit normalisiert, gemessen durch Cy5-Fluoreszenz. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. P-Werte für den zweiseitigen T-Test (**** vs. Co-Folding): 1,0 × 10⁻²² (nur Farbstoff), 2,3 × 10⁻²² (oben), 4,9 × 10⁻²³ (unten) und 7,0 × 10⁻²³ (separates Falten). n = 30 Regionen für die reine Farbstoffbedingung und 30–31 RNA-Cluster für alle anderen Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Repräsentative Bilder und Quantifizierung der intermolekularen Basenpaarung für Shu- und ^{Shu-Anti-Träger-Top}- und Bottom-Reporter. (A) Bilder von DFHBI-1T allein (nur Farbstoffkontrolle) und in vitro RNA-Clustern (Magenta), die durch shu-top, shu-bottom, shu^anti-top und shu^anti-bottom RNAs in Anwesenheit von DFHBI-1T (grün) gebildet werden. RNAs wurden mit Cy5 markiert, sodass im Durchschnitt während der in-vitro-Transkription drei UTP-Cy5-Uracile eingebaut wurden. Die Bilder stellen durchschnittliche Z-Projektionen von 27 Schnitten dar, die mit einer Schrittlänge von 150 nm aufgenommen wurden, wobei für jeden Kanal unter allen Bedingungen dieselbe Belichtung und Laserleistung verwendet werden. Die DFHBI-1T-Fluoreszenz wurde unter verschiedenen Bedingungen auf denselben Intensitätsbereich normiert. Skalenbalken: 2 μm. (B) Die DFHBI-1T-Intensität wurde auf RNA-Häufigkeit normalisiert, gemessen durch Cy5-Fluoreszenz. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM. n.s. dargestellt, nicht signifikant. P-Werte für den zweiseitigen T-Test (vs. nur Farbstoff): 3,1 × 10⁻³ (**; Shu-Top), 1,7 × 10⁻¹ (N.S.; shu-bottom), 2,9 × 10⁻³⁵ (***; shu Anti-Top), und 2,2 × 10⁻² (; shu Anti-Bottom). n = 30 Regionen für die reine Farbstoffbedingung und 30–32 RNA-Cluster für alle anderen Bedingungen. (Ci, ii) Bilder von in vitro RNA-Clustern (Magenta), die durch Vermischung von Shu-Top mit Shu-Bottom, Shu^Anti-Top mit Shu^Anti-Bottom, Shu-Top mit Shu^Anti-Bottom und Shu^Anti-Top mit Shu-Bottom in Anwesenheit von DFHBI-1T (grün) unter Co-Folding (i) und separatem Falten ( ii) Bedingungen. Die Bilder stellen durchschnittliche Z-Projektionen von 27 Schnitten dar, die mit einer Schrittlänge von 150 nm aufgenommen wurden, wobei für jeden Kanal unter allen Bedingungen dieselbe Belichtung und Laserleistung verwendet werden. Für den niedrigen Bereich wurde die DFHBI-1T-Fluoreszenz auf den gleichen Intensitätsbereich wie Abbildung 1D–Eii und Abbildung 2A normalisiert. Für den hohen Bereich wurde die DFHBI-1T-Fluoreszenz in den Panels Ci und Cii auf einen höheren, aber konstanten Intensitätsbereich unter allen Bedingungen normalisiert. Skalenbalken: 2 μm. (Di, ii) Die DFHBI-1T-Intensität wurde zunächst auf RNA-Intensität und dann auf negative Kontrollgruppen normalisiert, definiert als das durchschnittliche normalisierte DFHBI-1T-Signal von jeder RNA allein. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM. n.s. dargestellt, nicht signifikant. (i) P-Werte für den zweiseitigen t-Test (**** vs. shu-oben + shu-unter): 1,1 × 10⁻³¹ (shu^anti-oben + shu^anti-unten), 1,1 × 10⁻²² (shu-oben + shu^anti-unten) und 4,3 × 10⁻²⁷ (shu^anti-oben + shu-unter). (ii) P-Werte für den zweiseitigen t-Test (vs. shu-oben + shu-unter): 2,2 × 10⁻¹ (n.s.; shu Anti-Top + Shu Anti-Bottom), 1,9 × 10⁻9 (; shu-top + shu^anti-bottom), und 1,3 × 10⁻¹⁵ (; Shu Anti-Top + Shu-Bottom). n = 29–32 RNA-Cluster für alle Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Name	Sequenzen (5′-3′)
T7-Veranstalter	TAATACGACTCACTATAG
Top	GGATGATGGAGAGAGGGTCGGGTC CAGGATCATTCATGGCAAGAGAC GGTCGGGTCCAGATGATGATGCGGAT
Unteres	GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAG AGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCACATACTCTGAT GATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGC TCCATCATCC
Top-T7-Stürmer	TAATACGACTCACTATAG GGATGATGGAGAGACGGTCG
top-Reverse	ATCCGCATCATCTGGACCC
Stürmer im unteren T7	TAATACGACTCACTATAGG GATCCGCATCATCTGTCGA
Unten – Rückseite	GGATGATGGAGCCCACACT
Die vorderen Primer enthalten einen Überhang der T7-Promotorsequenz (fett gedruckt), gefolgt von Sequenzen, die auf das 5′-Ende der RNA abzielen.

Tabelle 1: Sequenzen des T7-Promotors, geteilter Brokkoli-Reporter und Primer, die zur Amplifisierung von DNA-Vorlagen für die T7-Transkription verwendet werden. Die aufgeführten Primer wurden verwendet, um DNA-Vorlagen für die In-vitro-Transkription der oberen und unteren RNAs zu erzeugen, die anschließend in den in dieser Studie beschriebenen RNA-Clustering-Assays verwendet wurden.

Name	Sequenzen (5′-3′)
shu-top	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTTCATATCTTACTCAAAAAGGATGATGGAG ACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGAGAGGGTCGGGTCCAGATGATGATGCGGA TAAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAATTTAGTTCCAAGTTTTCTAGAAGAGAGCAGTATCATT AGTTATTTCGATATTAGCAACATGAATATCGTAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTGT TATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTTTTAAAAAACCAATAAAAAGTAATGCACGGCAGCCTACAT
shu-bottom	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTTCATATCTCTCAAAAAGGATCCGCATCATC TGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTGTGTGTGGGTCAACCCACATACTCTGATG ATCCTGTCGAGTAGAGTGGGCTCCATCATCCAAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAAT TTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATTAGTTATTTCGATATTAGCAACATGAATATCG TAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTGTTATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGGTGTTAA AAACCACAATAAAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
ShuAnti-Top	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTTTTTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTAA ATAACAAAAAAACGTTAACATTCGTCTGGGCTTACGATGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATAAC TAATGATACTGCTCTCTTCTAGAACTTGGAACTAAAATTACCTTCATGTTTGGTATGTTTTTTTTTTTGGA TGATGGAGACGGTCGGGTCCAGGATCATGGCAAGAGAGAGGTCGGGTCGGGTCCAGATGAT GCGGATTTTTTGAGTAAGATATGAAATGAAATGAAATGGGGGGCTCTTAGTAAGC
ShuAnti-Bottom	ATGTAGCTGCCGTGCATTACTTTTATTGTGGTTTTTAACACAACTTAAGGTCTACGTTGGCTCTA AATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTGGGCTTACGATATTCATGTGTTGCTAATATCGAAATA ACTAATGATACTGCTCTCTCTAGAACTTGGAACTAAAATTACCTTCATGTTTTTGGTATGTTTTTTTT GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTGGCCCATGTGTATGTGGGTCAAC CCACATACTCTGATGATGATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCCTTTTTGAGTAA GATATGAAATATGAAATACTGGGGGGCTTTAGTAAGC
shu-oben oder shu-bottom-T7 vorwärts	TAATACGACTCACTATAGGGCTTACTAAGAAGCCCCAGT
shu-oben oder shu-bottom-Rückwärts	ATGTAGCTGCCGTGCATTAC
ShuAnti-Top oder Shu Anti-Bottom-T7 Vorwärts	TAATACGACTCACTATAGGGATGTAGCTGCCGTGCATTA
ShuAnti-Top oderShu Anti-Bottom-Rückwärts	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTA
Die vorderen Primer enthalten einen Überhang der T7-Promotorsequenz (fett gedruckt), gefolgt von Sequenzen, die auf das 5′-Ende der RNA abzielen. Ein oder zwei zusätzliche Gs wurden zwischen dem T7-Promoter und shu-top bzw. shu-bottom oder shuanti-top bzw. shu anti-bottom bzw. shuanti-bottom eingebaut. Dies liegt daran, dass Gs an den +2- und +3-Positionen die Transkriptionsrate19 deutlich erhöhen können. Diese zusätzlichen Gs können jedoch potenziell die Interpretation der Basenpaarung in den entworfenen Konstrukten beeinflussen. Siehe Anmerkung in Schritt 1.1.

Tabelle 2: Sequenzen von shu-top, shu-bottom, shu anti-top, shu^anti-bottom und Primern, die zur Amplifizierung von DNA-Templates für die T7-Transkription verwendet werden. Die aufgeführten Primer wurden verwendet, um DNA-Vorlagen für die In-vitro-Transkription von Shu- und Shu-Anti-RNAs mit den oberen und unteren Reportern zu erzeugen, die anschließend in RNA-Cluster-Assays in dieser Studie beschrieben wurden.

Discussion

In dieser Studie wurde das geteilte Brokkoli-Aptamersystem¹⁸ für die direkte Visualisierung und Quantifizierung der intermolekularen Basenpaarung unter in vitro RNA-Clusterbedingungen angepasst. Dieser Ansatz ermöglicht die Bewertung intermolekularer Basenpaarungen unter verschiedenen in-vitro-Bedingungen und ergänzt nachgelagerte biochemische Assays, wie RNA-Pull-down-Experimente mit Basenpaarungs-Crosslinkern 15,16,17 und Gelelektrophorese ^4,6,7. Im Gegensatz zu diesen biochemischen Methoden, denen die räumliche Auflösung fehlt, um Basenpaarungen innerhalb von RNA-Clustern von denen außerhalb zu unterscheiden, ermöglicht dieser Ansatz eine direkte räumliche Visualisierung dieser Interaktionen innerhalb von Clustern. Konkret ermöglicht sie die Überwachung der Basenpaarung zwischen oberen und unteren RNAs, also RNAs, die diese Reporter tragen, unter definierten RNA-Clustering-Bedingungen. Zusätzlich liefert es eine Echtzeit-quantitative Auslesung der Basenpaarung zwischen Reporter-RNAs ohne Quervernetzung oder RNA-Extraktion, wodurch Probenverlust und Pufferinkompatibilität minimiert werden.

Mit Fluoreszenzmikroskopie wurde die intermolekulare Basenpaarung zwischen den geteilten Brokkoli-Aptamersequenzen quantitativ mittels DFHBI-1T-Signal gemessen, was die Kompatibilität von DFHBI-1T mit dem in vitro RNA-Clustering-Protokoll demonstrierte. Das Ausmaß der intermolekularen Basenpaarung variierte je nach RNA-Faltungsbedingungen, wie unter Ko-Faltung und separaten Faltungsbedingungen beobachtet wurde (Abbildung 1F und Abbildung 2Di–2Dii). Diese Ergebnisse zeigen, dass RNA-Faltungsbedingungen die intermolekularen RNA-Interaktionen entscheidend beeinflussen und bei der Interpretation experimenteller Ergebnisse sorgfältig berücksichtigt werden sollten.

Dieser Test bietet auch eine Plattform zur Bewertung, ob Sequenzen an den oberen und unteren Reportern die intermolekulare Basenpaarung verbessern, wie mit Shu gezeigt wurde. Die DFHBI-1T-Fluoreszenz war höher für shu-top mit shu^anti-bottom und shu^anti-top mit shu-bottom als für shu-top mit shu-bottom oder shu^anti-top mit shu^anti-bottom, was darauf hinweist, dass intermolekulare Wechselwirkungen zwischen shu und ^{shu anti} das Brokkoli-Signal weiter zu verstärken. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das DFHBI-1T-Fluoreszenzsignal, das allein durch das Kofalten der oberen und unteren Reporter erhalten wird, nicht die obere Grenze des Tests darstellt.

Die in diesen Experimenten gemessene DFHBI-1T-Fluoreszenz umfasste einen breiten dynamischen Bereich, von einer 1,04-fachen Erhöhung (Shu-Top mit Shu-Bottom unter separater Faltung) bis zu einer 82,60-fachen Erhöhung (Shu^Anti-Top mit Shu-Bottom unter Kofaltungsbedingungen). Dieser dynamische Bereich ermöglicht die Erkennung von Unterschieden in intermolekularen RNA-Interaktionen zwischen RNAs, die diese Reporter tragen.

Mehrere Schritte in diesem Protokoll sind entscheidend für den erfolgreichen Nachweis der intermolekularen RNA-Basenpaarung zwischen gespaltenen Brokkoli-oberen und unteren RNAs in RNA-Clustern. Frische Aliquoten von PEG 8000 sollten verwendet werden, um RNA-Clustering zuverlässig zu induzieren, und wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen sollten aufgrund der Reagenzinstabilität minimiert werden. DFHBI-1T sollte aliquotiert und bei −20 °C gelagert werden, um die Fluoreszenzeigenschaften zu erhalten. In-vitro-Transkriptionsprodukte sollten vor dem Clustering auf einem denaturierenden RNA-Gel analysiert werden, um die korrekte Transkriptgröße zu bestätigen. Darüber hinaus ist die Aufrechterhaltung von RNase-freien Bedingungen, einschließlich einer sauberen Arbeitsumgebung und einer Bildgebungskammer, unerlässlich, da RNA-Tröpfchen vor der Bildgebung über längere Zeit bei Raumtemperatur inkubiert werden.

Eine Einschränkung dieses Tests besteht darin, dass DFHBI-1T speziell intermolekulare Basenpaarung berichtet, die durch die oberen und unteren Sequenzen vermittelt wird. Andere intermolekulare Basenpaarungsereignisse, die in verschiedenen RNA-Regionen auftreten, können nicht nachgewiesen werden. Darüber hinaus ist die durch Basenpaarung zwischen den oberen und unteren Strängen gebildete Brokkolistruktur thermodynamisch stabil²⁶ und spiegelt möglicherweise nicht vollständig schwächere oder vorübergehende Wechselwirkungen wider, wie sie durch gestreute, oberflächenfreiliegende Basen entstehen, wie sie in Drosophila-Keimgranula-mRNA-Clustern⁴ beobachtet werden.

Darüber hinaus können intermolekulare RNA–RNA-Interaktionen promiskuitiv und unspezifisch sein, und Sequenzen, die die oberen und unteren Reporter flankieren, können die DFHBI-1T-Fluoreszenz beeinflussen. Diese flankierenden Regionen können direkt mit den Reporter-Sequenzen interagieren, wodurch die Brokkolibildung hemmt oder die RNA-Struktur verändert wird, wodurch die Interaktionen zwischen den RNAs, die die Reporter tragen, beeinflusst werden. Dementsprechend spiegelt der Test die kombinierten Effekte von RNA-Struktur, Top-Bottom-Basenpaarung, Interaktionen zwischen Flankensequenzen und Interaktionen zwischen Flankensequenzen und Reportern wider.

Dieser Test bietet Möglichkeiten für zukünftige Untersuchungen. Beispielsweise können die Veränderung von RNA-Sequenzen, die die Reporter flankieren, das Einführen von RNA-Helikasten oder Chaperonen oder die Modifikation von Salzbedingungen die intermolekulare Basenpaarung in RNA-Clustern beeinflussen. Solche Effekte können bewertet werden, indem das DFHBI-1T-Signal unter Kofaltungs- und separaten Faltungsbedingungen gemessen wird. Da ähnliche RNA-Aptamere in Zellen, Bakterien und Hefen 26,27,28,29,30 verwendet wurden, kann dieser Ansatz auf Zellulosysteme oder Modellorganismen ausgeweitet werden, um intermolekulare Basenpaarungen in mRNA-Clustern zu untersuchen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M MgCl2	Millipore Sigma	M1028	Verwendet zur Vorbereitung von 10&-mal; RNA-Umfaltungspuffer.
2M KCl	Thermo Fisher Scientific	AM9640G	Verwendet zur Vorbereitung von 10&-mal; RNA-Umfaltungspuffer.
50% PEG 8000	NEB	M0204S	Komponente des T4-RNA-Ligase-Kits; als molekulares Crowding-Reagenz zur Induzierung von RNA-Clustering verwendet.
Absolutes Ethanol, 200 Proof	Thermo Fisher Scientific	T038181000CS	Verwendet zur Herstellung eines RNA-Waschpuffers.
Säurephenol: Chloroform, pH 4,5 (mit IAA, 125:24:1)	Thermo Fisher Scientific	AM9722	Zur RNA-Reinigung verwendet.
Aminoallyl-UTP-Cy5	Jena Bioscience	NU-821-CY5	Verwendet zur RNA-Markierung während der In-vitro-Transkription.
Kammerabdeckglas	Thermo Fisher Scientific	155409PK	Bildgebungskammer für RNA-Clustering-Reaktionen.
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	C298-500	Zur RNA-Reinigung verwendet.
DFHBI-1T	Lucerna	410	Verwendet als Fluorophor zum Nachweis von Brokkoli-RNA-Aptamer.
DMSO	Thermo Fisher Scientific	D12345	Wasserfrei; Molekularbiologie-Note; verwendet für die DFHBI-1T-Vorbereitung.
DNA Clean & Konzentrator-Kit	Zymo	D4014	Wird zur Bereinigung von DNA-Produkten vor der T7-Transkription verwendet.
DNA-Gel-Extraktionsset	NEB	T1020L	Wird zur Gel-Extraktion verwendet.
Trockenbad	Benchmark Scientific	BSH1001	Verwendet zum Erhitzen von RNA-Proben in Mikrozentrifugenröhren.
FIJI/ImageJ	NIH (National Institutes of Health)	N/A	Open-Source-Bildanalysesoftware; zur Quantifizierung der Fluoreszenzintensität und ROI-Analyse verwendet.
Gel-Elektrophorese-System	Thermo Fisher Scientific	B2-BP	Verwendet zur Durchführung der DNA-Gel-Elektrophorese.
Gel-Ladefarbe, lila (6& mal;)	NEB	B7024S	Wird als Ladefarbe für die DNA-Gel-Elektrophorese verwendet.
Sofortiges strukturiertes Beleuchtungsmikroskop	VisiTech international	VT-iSIM	Ein konfokales Mikroskop, das in der Lage ist, GFP und Cy5-Fluoreszenz abzubilden.
Isopropanol	Thermo Fisher Scientific	327272500	Zur RNA-Reinigung verwendet.
MEGAscript T7 Transkriptionsset	Thermo Fisher Scientific	AM1334	Verwendet für die In-vitro-Transkription von T7. Das Kit enthält Nukleotidlösungen (ATP, CTP, GTP, UTP) und DNase.
Mikrozentrifugenröhren	Genesee Scientific	22-284	1,5-mL-Röhre; zur Speicherung von DNA-Vorlagen für in vitro-Transkription, RNA-Produkte und Aliquoten von Spermin und DFHBI-1T.  verwendet;
Mini-Zentrifuge	Benchmark Scientific	Z763845	Wird für kurze Zentrifugation verwendet.
Nanodrop-Eins-Spektrophotometer	Thermo Fisher Scientific	13-400-518	Mikrovolumen-Spektrophotometer zur Messung der DNA- und RNA-Konzentration und -Qualität.
Nukleasefreies Wasser	Thermo Fisher Scientific	AM9937	Verwendet zur Resuspension von RNA-Pellets, zur Herstellung von RNA-Wasch- und Faltpuffern sowie zur Verdünnung von Spermin und DFHBI-1T.
Online-Molmassenrechner	New England Biolabs (NEB)	N/A	Online-Tool zur Berechnung der RNA-Masse aus molaren Größen (z. B. pmol).
Polypropylen-PCR-Röhren	Corning	3745	200 & mu; L-PCR-Röhrchen, die für PCR, In-vitro-Transkription und RNA-Clustering-Reaktionen verwendet werden
PowerPac Grundstromversorgung	Bio-Rad	1645050	Verwendet zur Durchführung der DNA-Gel-Elektrophorese.
Proflex PCR-Wärmezyklus	Thermo Fisher Scientific	44-840-73	Verwendet für PCR, in-vitro-Transkription und das Erhitzen von RNA-Proben in PCR-Röhrchen.
F5 High-Fidelity 2& Mal; Master Mix	NEB	M0492S	Verwendet als 2&-mal; High-Fidelity-Mastermix.
Gekühlte Zentrifuge	Eppendorf	5424R	Verwendet zur RNA-Reinigung und Pelletierung.
RNase-Dekontaminationslösung	Thermo Fisher Scientific	AM9782	Wird zur Reinigung von Laborbänken und Oberflächen verwendet, um eine RNase-Kontamination zu minimieren.
Spermin  Tetrahydrochlorid	Sigma-Aldrich	S1141-1G	Verwendet zur Induzierung von RNA-Clustering.
Tris Base	Millipore Sigma	T1503-1KG	Verwendet zur Herstellung des Tris-Puffers (pH 7,0).
Ultrareine Agarose	Thermo Fisher Scientific	16500500	Verwendet für DNA-Gel-Elektrophorese.