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Forschungsartikel
Olivenölbasierte Lipidemulsionen mildern durch Immuncheckpoint-Inhibitoren induzierte Myokarditis, indem sie den NF-κB/NLRP3/IL-1β-Weg anvisieren und ihr Potenzial zur Unterdrückung entzündlicher Kaskaden demonstrieren. Diese Ergebnisse unterstreichen ihr Potenzial als ergänzende Therapie bei immunbedingten Herzschädigungen.
Die vorliegende Studie zielte darauf ab, die therapeutische Wirksamkeit und den zugrundeliegenden Mechanismus von Olivenöl-basierten Lipidemulsionen (OOLE) bei der Abschwächung von durch Ipilimumab (IPI) und Nivolumab (NIVO) ausgelösten Myokarditis durch Immuncheckpoint-Inhibitoren (ICI) zu untersuchen. Ein in-vitro-Modell entzündlicher Kardiomyozyten wurde durch Kokultivierung von HL-1-Zellen mit CD4⁺/CD8⁺-T-Zellen, die aus ICI-behandelten Mäusen isoliert wurden, entwickelt. Die Zellen wurden mit 10 % OOLE behandelt, gefolgt von Durchflusszytometrie für Apoptose, ELISA für Zytokinprofilierung (TNF-α, IL-1β, IL-6) und Western Blot/qPCR für die Weganalyse (NF-κB, NLRP3, IL-1β). In vivo wurde Myokarditis bei Mäusen durch IPI/NIVO-Verabreichung ausgelöst. Die Herzfunktion wurde mittels Echokardiographie bewertet, und Entzündungsmarker wurden im Serum- und Myokardgewebe untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass OOLE die durch T-Zellen induzierte Apoptose signifikant reduzierte und die entzündliche Zytokinproduktion in HL-1-Zellen unterdrückte, während die Expression von NF-κB, NLRP3 und IL-1β herunterreguliert war. In vivo verbesserte OOLE die funktionellen Parameter des linken Ventrikels und schwächte die systemische Entzündung ab. Molekulare Analysen bestätigten, dass diese schützenden Effekte durch die Hemmung der Signalachse NF-κB/NLRP3/IL-1β vermittelt wurden. Zusammenfassend mildert OOLE die akute ICI-induzierte Myokarditis, indem es den NF-κB/NLRP3/IL-1β-Weg anvisiert, was sein Potenzial zur Unterdrückung früher entzündlicher Kaskaden und zur schnellen Kardioprotektion demonstriert. Diese Ergebnisse unterstreichen ihr Potenzial als ergänzende Therapie bei immunbedingten Herzschädigungen.
Immuncheckpoint-Inhibitoren (ICIs), wie solche, die auf programmierten Zelltod-1 (PD-1) abzielen, und zytotoxisches T-lymphozytenassoziiertes Protein 4 (CTLA-4), haben die Behandlungslandschaft für verschiedene Malignitäten revolutioniert. Die weitverbreitete klinische Anwendung von ICIs wird jedoch häufig durch immunbezogene unerwünschte Ereignisse (irAEs) erschwert. Unter diesen ist die durch ICI induzierte Myokarditis eine seltene, aber potenziell tödliche Komplikation, gekennzeichnet durch einen schnellen klinischen Verlauf und hohe Sterblichkeitsraten von 25 % bis 50 %. Trotz ihrer Schwere bleiben die aktuellen therapeutischen Optionen für durch ICI induzierte Myokarditis weitgehend auf hochdosierte Kortikosteroide und unspezifische Immunsuppressivabeschränkt 3,4. Diese traditionellen Interventionen führen oft zu suboptimalen Reaktionen und können die antitumorale Wirksamkeit von ICIs1 beeinträchtigen, wodurch eine kritische Wissenslücke bei der Suche nach sichereren und gezielteren kardioprotektiven Strategien entsteht, die Herzentzündungen ohne systemische Immunsuppression mildern können.
Das NOD-ähnliche Rezeptorprotein 3 (NLRP3)-Inflammasom, das über den NF-κB-Signalweg aktiviert wird, ist als zentraler Treiber des Zytokinsturms bei ICI-induzierter Myokarditis 5,6 hervorgegangen. Eine übermäßige Produktion proinflammatorischer Zytokine, insbesondere IL-1β und IL-6, führt zu schwerwiegenden Kardiomyozytenschäden und Herzinsuffizienz7. Obwohl mehrere lipidbasierte Interventionen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen untersucht wurden, bleibt das Potenzial von Olivenöl-basierten Lipidemulsionen (OOLE) in diesem speziellen Kontext noch unerforscht. OOLE ist reich an Oleinsäure, einer einfach ungesättigten Fettsäure, die für ihre einzigartige Fähigkeit bekannt ist, die Membranflüssigkeit zu modulieren und entzündliche Kaskadenzu unterdrücken 8,9. Ob OOLE jedoch den hyperinflammatorischen Zustand, der für eine ICI-induzierte Myokarditis charakteristisch ist, speziell mildern kann, ist nicht geklärt.
In dieser Studie wollen wir diese Lücke schließen, indem wir das therapeutische Potenzial von OOLE untersuchen. Wir vermuten, dass OOLE eine starke kardioprotektive Wirkung ausübt, indem es die Signalachse NF-κB/NLRP3/IL-1β hemmt, wodurch der Entzündungsschub unterdrückt und die Herzfunktion erhalten bleibt. Durch die Kombination eines in-vitro-Kokulturmodells von HL-1-Kardiomyozyten und T-Zellen mit einem in vivo Mausmodell der ICI-induzierten Myokarditis zeigen wir, dass die OOLE-Intervention eine schnelle funktionelle Genesung ermöglicht und eine Myokardinschaden mildert. Diese Studie liefert den ersten Beleg für OOLE als neuartigen, gezielten ernährungsphysiologischen Ansatz zur Behandlung von ICI-bedingter Kardiotoxizität.
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Alle Verfahren wurden vom Tierethikkomitee der Guangzhou Miles Biotechnology Co., Ltd. mit der Zulassungsnummer IACUC-MIS2023076 genehmigt. Das erwähnte Unternehmen ist ein Tierversuchszentrum; Unsere Tierversuche werden hier durchgeführt und unterliegen daher der Überprüfung durch den Ethikausschuss des Zentrums.
Tiere und Versuchsdesign
Dreißig BALB/c-Mäuse (männlich, 8 Wochen alt, 22 ± 2 g) wurden kommerziell gekauft. Modellinduktions- und Validierungskriterien: Ein von Immuncheckpoint-Inhibitor (ICI) induziertes Myokarditis-Modell wurde durch intravenöse Injektion von Ipilimumab (5 mg/kg) und Nivolumab (10 mg/kg) für zwei aufeinanderfolgende Wochen etabliert. Die Dosierung erfolgte alle 3 Tage über eine Gesamtmodellierungsdauer von 2 Wochen. Dieses Protokoll hat zuvor gezeigt, dass es eine signifikante immunvermittelte Herzverletzung10 induziert. 24 Stunden nach der letzten Injektion wurden Blutproben über den retro-orbitalen Plexus entnommen und bei 300 x g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, um das Serum zu isolieren; anschließend wurden die serum-cTnT-Werte mit einem spezifischen ELISA-Kit quantifiziert, das aufeinanderfolgende Schritte der Probenbelastung, HRP-konjugierte Antikörperinkubation, automatisiertes Waschen und TMB-Chromogenreaktion umfasste, wobei die optische Dichte bei 450 nm gemessen wurde, um Konzentrationen auf Basis einer vier-Parameter-Logistikkurve zu berechnen, und eine cTnT-Konzentration ≥10 ng/mL wurde als erfolgreiche Modellierung angesehen.
Sechs Modellmäuse mit dem nächstgelegenen Körpergewicht und der cTnT-Konzentration wurden zufällig in zwei Gruppen eingeteilt: eine Kontrollgruppe und eine Behandlungsgruppe (n=3 für beide, biologische Replikation). Die Kontrollgruppe erhielt täglich intravenöse Injektionen von normaler Kochsalzlösung in einer Dosis von 5 mL/kg. Die Behandlungsgruppe erhielt täglich intravenöse Injektionen mit 5 % Olivenöl-basierter Lipidemulsion (OOLE) in einer Dosis von 5 mL/kg über die Schwanzvene für 6 Tage (dies entspricht der Dosierung, die wir für die klinische Behandlung in unserer Einrichtung verwenden; sie wurde für die Anwendung bei Mäusen anhand des Körperoberflächenverhältnisses extrapoliert). Die folgenden Tests wurden in einem 6-tägigen Beobachtungsfenster durchgeführt: Die Herzfunktion wurde zu Beginn (Tag 0) und nach der Behandlung (Tag 6) mittels eines ultraschall-photoakustischen Bildgebungssystems bewertet. Am 6. Tag wurde Blut über die retroorbitale Vene entnommen, und Serumzytokine wurden durch ELISA quantifiziert. Nach der Euthanasie der Tiere mit einer Überdosis Narkose wurde das Herzgewebe für eine Proteinanalyse schnell eingefroren.
T-Zell-Isolation
Die Mäuse der Kontrollgruppe wurden mit einer Überdosis Narkose eingeschläfert. Die Milzen wurden nach einer 5-minütigen Oberflächensterilisation in 75 % Ethanol aseptisch entfernt, und alle Bindegewebe wurden entfernt. Die Milzen wurden mechanisch mit einem 70-μm-Zellsieb mit PBS und 2 % FBS dissoziiert, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Diese Suspension wurde dann bei 300 x g, 4 °C für 5 Minuten zentrifugiert, und die Erythrozyten wurden mit 1 ml ACK Lysing Buffer für 2 Minuten bei Raumtemperatur lysiert. Der Lysierungsprozess wurde durch das Waschen mit PBS beendet. T-Zellen wurden negativ angereichert, um eine Aktivierung mit einem Maus-T-Zell-Isolationskit zu verhindern. Auf 10 Millionen Zellen wurden 50 μL Selektionscocktail hinzugefügt und bei Zimmertemperatur 10 Minuten inkubiert. Darauf folgte die Zugabe von 75 μL Streptavidin-Magnetperlen pro 10 Millionen Zellen, mit einer 5-minütigen Inkubation. Perlengebundene Zellen wurden mit einem Magneten 3 Minuten zurückgehalten, und die angereicherten T-Zellen (mit über 94 % Reinheit) wurden aus dem Supernatant entnommen. Für die Sortierung der CD4⁺- und CD8⁺-Untergruppen wurden die angereicherten Zellen 15 Minuten lang im Dunkeln mit Anti-CD3ε-PE, Anti-CD4-APC und Anti-CD8-FITC-Antikörpern gefärbt und anschließend dreimal mit vorgekühltem PBS gewaschen. Die Sortierung erfolgte mit einem Durchflusszytometer mit folgender Gating-Strategie: Lymphozyten (FSC/SSC), dann CD3⁺, dann CD4⁺ oder CD8⁺-Teilmengen. Die Zellen wurden im Reinheitsmodus in Sammelröhrchen sortiert, die mit 200 μL PBS vorgefüllt waren, was Zieluntergruppen mit einer Reinheit von über 98 % ergab.
Aufbau und Behandlung des Myokarditis-Zellmodells
Die HL-1-Zellen wurden in DMEM/F12-Medium kultiviert, das unter Standardbedingungen (37 °C, 5% CO₂) mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin (PS) ergänzt wurde. Die Zellen wurden in drei Gruppen unterteilt: Kontrollgruppe (unbehandelt), Modellgruppe (HL-1-Zellen, behandelt mit CD4+/CD8+ T-Zellen für 24 Stunden) und OOLE-Gruppe (Modellgruppe kobehandelt mit 10 % OOLE für 24 Stunden).
ELISA zur Serumdetektion von myokardial-verletzungsbedingten Proteinen
Inkubieren Sie 50 μL Serumprobe 30 Minuten lang in den vorbeschichteten, antikörperreichen Mikroplattenbohrungen des Kits, dann dreimal mit PBST waschen, um ungebundene Komponenten zu entfernen. Gib die vorbereitete Meerrettichperoxidase (HRP)-gekennzeichnete Avidin-Lösung für eine zweite Inkubation hinzu. Noch einmal dreimal mit PBST waschen, 100 μL 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)-Substrat hinzufügen, um die kolorimetrische Reaktion einzuleiten, und die Reaktion mit 100 μL Stoplösung innerhalb von 30–45 Minuten nach Beginn beenden. Messen Sie die Absorption (OD) bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser und quantifizieren Sie die Konzentration des Zielanalyts mit einer Standardkurve, die mit bekannten Referenzstandards dargestellt wird.
Westlicher Blot
Herzgewebe wurde mit einem Gewebehomogenisator mit flüssigem Stickstoff pulverisiert. Anschließend wurden sowohl Gewebe- als auch Zellproben in 200 μL RIPA-Puffer auf Eis für 30 Minuten lysiert. Die Lysate wurden bei 12.000 x g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, um Protein-Supernatanten zu sammeln. Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem BCA-Protein-Assay-Kit bestimmt. Nach Anpassung der Proteinkonzentration auf 5 μg/μL wurden die Proben mit einem 5× Ladepuffer gemischt und durch Erhitzen bei 95 °C für 10 Minuten denaturiert. Die Proteine wurden auf 10%igen SDS-PAGE-Gelen (90 Minuten bei 100 V betrieben) getrennt und anschließend durch halbtrockenes Elektroblotting bei 15 V für 30 Minuten auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern (darunter IL-1β, NLRP3, MyD88, NF-κB p65 und Tubulin; 1:1.000 Verdünnung) untersucht. Nach dreimaliger Reinigung der Membranen für jeweils 10 Minuten mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,1 % Tween 20 (TBST) enthält, wurden sie mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern (1:10.000 Verdünnung) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proteinbänder wurden durch Anwendung eines verstärkten Chemilumineszenz-(ECL)-Substrats visualisiert, und die Signale wurden mit einem chemilumineszenzbildenden Bildgebungssystem erfasst. Schließlich wurden die relativen Expressionsniveaus quantitativ analysiert, indem die densitometrischen Werte der Zielproteinbänder mit der Tubulin-internen Kontrolle mittels der ImageJ-Software normalisiert wurden.
Zellapoptose-Test mittels Durchflusszytometrie
Die HL-1-Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Für die Zelldissoziation wurde 1 ml Trypsin hinzugefügt und 1 Minuten inkubiert, gefolgt von einer Neutralisierung mit 2 ml Komplettkulturmedium. Die Zellsuspension wurde dann bei 250 x g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, und der Supernatant wurde entsorgt. Das gesammelte Zellpellet wurde zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und in einem 1x-Bindungspuffer neu suspendiert, um eine Zelldichte von 1 x 106 Zellen /ml zu erreichen. Ein 100 μL Aliquot dieser Zellsuspension wurde in ein Durchflusszytometrierohr übertragen, gefolgt von der Zugabe von 5 μL FITC-Annexin V und 5 μL Propidiumiodid (PI). Nach sanftem Vortexen wurde die Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur (25 °C) im Dunkeln inkubiert. Abschließend wurden 400 μL 1 Bindungspuffer pro Röhre hinzugefügt, und die Zellapoptose wurde anschließend mit einem Durchflusszytometer analysiert. Für die Gating-Strategie wurden Ereignisse zunächst auf Forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) gegartet, um subzelluläre Trümmer auszuschließen und die intakte HL-1-Zellpopulation zu isolieren. Innerhalb dieses primären Tores wurden apoptotische Zellen mittels Quadrantenanalyse quantifiziert, wobei frühe apoptotische Zellen als FITC-Annexin V⁺/PI⁻ und späte apoptotische Zellen als FITC-Annexin V⁺/PI⁺ definiert wurden.
Statistische Analyse
Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt, und die statistische Analyse erfolgte mit statistischer Software. Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden mit dem unabhängigen Stichproben-t-Test analysiert; Unterschiede zwischen drei oder mehr Gruppen wurden mittels Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt vom Bonferroni-Post-hoc-Test. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler (SEM) angegeben. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
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Die Kombination Ipilimumab und Novolumab induziert eine ICI-induzierte Myokarditis in einem Tiermodell
Um ein ICI-induziertes Myokarditismodell zu etablieren, wurden BALB/c-Mäusen intravenöse Injektionen von Ipilimumab (5 mg/kg) und Nivolumab (10 mg/kg) über die Schwanzvene verabreicht. Die Serumwerte von kardialem Troponin-T (cTnT) wurden anschließend mittels eines enzymgebundenen Immunsorbent-Tests (ELISA) gemessen. Ein cTnT-Level ≥ 10 ng/mL wurde als Schwelle für e...
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In dieser Studie zeigten wir zum ersten Mal, dass Olivenöl-basierte Lipidemulsionen (OOLE) die durch Immuncheckpoint-Inhibitoren (ICI)-induzierte Myokarditis effektiv abschwächen, indem sie den IL-1β/NLRP3/NF-κB-Signalweg unterdrücken. Unsere Ergebnisse liefern sowohl mechanistische als auch funktionelle Belege dafür, dass OOLE nicht nur die Herzfunktion verbessert, sondern auch Myokardentzündungen sowohl in vivo als auch in vitro lindert. Modelle der ICI-induzierten My...
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Diese Arbeit wurde vom Guangzhou Science and Technology Plan Project (Fondsnummer: 202201020040) und der International Science Foundation of Guangzhou Fuda Cancer Hospital (Fondsnummer: Y2023-ZD-05) unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,22 μm PVDF-Membranen | Millipore | ISEQ00010 | |
| 4 % Paraformaldehyd | Guangzhou Jadeite Biotechnology Co., Ltd. | BL539A | |
| BALB/c-Mäuse | Guangdong Zhiyuan Biomedicine Technology Co., Ltd. | ||
| BCA-Testkit | Dingguo Biotech | BCA02 | |
| Hellfeldmikroskopie | MSHOT | ML31 | |
| cTnT elisa-Kit | lunchangshuobiotech | ED-28107 | |
| Elektrophoreseapparat | WIX | miniPro4 | |
| Vollautomatisches Chemilumineszenz-Bildanalysesystem | FUJIFILM | LAS-3000 | |
| Hämatoxylin-Eosin Kit&NBSP; | Guangzhou Jadeite Biotechnology Co., Ltd. | BL2236A | |
| IFN-γ ELISA-Bausätze | Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China). | ED-10284 | |
| IL-1β Antikörper | Affinität | BF8021 | |
| IL-1β ELISA-Bausätze | Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China). | ED-10351 | |
| IL-6 ELISA-Bausätze | Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China). | ED-10377 | |
| ImageJ 1.54 Software | NIH | ||
| Ipilimumab | MCE | CAS: 477202-00-9 | |
| MyD88-Antikörper | Affinität | AF5195 | |
| NF-κ B-p65-Antikörper | Affinität | BF8005 | |
| Nivolumab | MCE | CAS: 946414-94-4 | |
| NLRP3-Antikörper | Affinität | BF8029 | |
| Olivenölbasierte Lipidemulsion | die Ernährungsabteilung des Guangzhou Fuda Krebskrankenhauses | ||
| Schnelles halbtrockenes Rotationsfilmgerät | Bio-Rad | 788BR04132 | |
| Echtzeit-Fluoreszenz-qPCR-quantitatives System | YARUI | MA-6000 | |
| RIPA-Lysepuffer | Beyotime | P0013B | |
| Rotationsmikrotom | Leica | RM2235 | |
| SDS-PAGE-Gels | Beyotime | P0052A, P0053A | |
| Das Annexin V-FITC/PI Apoptose-Detektionskit | Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd. | MA0220-1 | |
| das EasySep Mouse CD4+ T-Zell-Isolationsset | Stemcell | 19765 | |
| Die HL-1-Ratten-Kardiomyozytenzelllinie | Guangzhou All-perfect Biotechnology Co., Ltd. | TCM-C783 | |
| TNF-α ELISA-Bausätze | Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, China). | ED-11776 | |
| Ultraschall-photoakustisches Bildgebungssystem | Fujifilm VisualSonics | VEvo3100 | |
| Urodynamisches Testsystem | Techman | BL-420 |
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