Ein stromlinienförmiges Protokoll für Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie in Arabidopsis-Kernen

Summary

Dieses Protokoll bietet einen effizienten Arbeitsablauf für die mikroskopische Mikroskopieabbildung isolierter Arabidopsis-Kerne durch optimierte Isolierung, Fixierung und Markierung, um eine zuverlässige nanoskalige Visualisierung von Chromatin und RNA-Polymerase II zu erreichen. Dieser Ansatz kann leicht an andere chromatinassoziierte Proteine oder Histonmodifikationen für hochauflösende Bildgebung angepasst werden.

Abstract

Obwohl die konfokale Fluoreszenzmikroskopie wertvolle Einblicke in die Chromatinorganisation in Pflanzenkernen geliefert hat, beschränkt ihre beugungsbegrenzte Auflösung die Untersuchung der Chromatinarchitektur und motiviert den Einsatz von Superauflösungstechniken wie der Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM). Unter diesen Ansätzen bietet die direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) eine nanoskalige Auflösung in einzelnen Zellen, was eine präzise Visualisierung von Chromatinbereichen, Histonmodifikationen und nuklearer Organisation ermöglicht. Obwohl solche Methoden zunehmend in Säugetiersystemen angewandt werden, bleibt ihre Anwendung in der Pflanzenbiologie begrenzt, hauptsächlich aufgrund technischer Herausforderungen bei der Probenvorbereitung.

Hier präsentieren wir einen optimierten und reproduzierbaren Arbeitsablauf für die SMLM-Bildgebung von Kernen, die aus Arabidopsis thaliana isoliert wurden. Dieses Protokoll beginnt mit der Setzlingsfixierung zur Erhaltung der Kernmorphologie, gefolgt von sanftem Gewebehacken und Zentrifugation zur Anreicherung intakter Zellkerne. Isolierte Kerne werden anschließend mit Fluorophoren in flüssigem Medium markiert und auf niedrig schmelzenden Agarosepads immobilisiert, eine Strategie, die die Stabilität während längerer Einzelmolekül-Bildgebungssitzungen erhöht. Diese Schritte minimieren gemeinsam die Hintergrundfluoreszenz, verbessern die Konsistenz der Markierung und erhöhen die Reproduzierbarkeit zwischen biologischen Replikaten.

Die resultierenden Präparate bieten eine verbesserte Klarheit bei der Visualisierung von Chromatinmodifikationen und nuklearer Architektur in Anlagen. Durch die Absenkung der technischen Hürden für die Implementierung der SMLM-Bildgebung in Arabidopsis bietet dieses Protokoll ein vielseitiges Mittel, um epigenetische Regulation, Chromatinorganisation und nukleare topologische Variationen im Nanobereich zu untersuchen. Diese Arbeit legt eine methodische Grundlage für die Anwendung von SMLM auf Pflanzen, überbrückt die Lücke zur Zellbiologie von Säugetieren und eröffnet neue Möglichkeiten, zu untersuchen, wie die nukleare Architektur zur Genomregulation als Reaktion auf Entwicklungs- und Umweltsignale in Pflanzensystemen beiträgt.

Introduction

Die Mikroskopie ist seit langem ein Grundpfeiler für die Untersuchung der Chromatinorganisation und der Kernarchitektur und zeigt auf, wie DNA und histonassoziierte Proteine im 3D-Kernraum arrangieren und die Genregulation^{beeinflussen 1,2}. Die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie hat wertvolle Erkenntnisse in großräumige Chromatindomänen wie Chromosomenterritorien, Chromozentren und Kernkörper^{geliefert, die} in situ möglich sind, insbesondere in Wurzelgewebe für Pflanzen ^3,5,6

Protocol

HINWEIS: Die detaillierten Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Instrumenten sind in der Materialtabelle verfügbar. Sofern nicht anders angegeben, werden die Puffer bei apyrogenen 0,2-μm-Filtern freigegeben. Doppeldestilliertes ultrareines H₂O (ddH₂O) wird während dieses Protokolls verwendet. Zentrifugationsschritte werden in 1,5-mL-Mikroröhren mit einem Rotor mit festem Winkel durchgeführt.

1. Fixierung und Freisetzung von Kerne durch Setzlinge

1. Setzen Sie eine 6-Well-Kulturplatte auf Eis unter die Abzugshaub....

Results

Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht die Herstellung hochwertiger Arabidopsis-thaliana-Kerne , die für SMLM geeignet sind. Mehrere Optimierungsrunden wurden durchgeführt, um die Kernintegrität zu verbessern und zytoplasmatische sowie zelluläre Ablagerungen zu reduzieren, die die Bildqualität beeinträchtigen. Nach jedem Optimierungsschritt wurde die Qualität der nuklearen Präparaten durch konfokale Bildgebung mit einem Olympus IX81 Spinning-Disc-Mikroskop bewertet, bevor zu.......

Discussion

Die Herstellung von Arabidopsis thaliana-Kerne für die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) erfordert mehrere kritische Schritte, die die Qualität der Endproben stark beeinflussen. Wie bereits^{beschrieben 19,35}, ist gründliches und konsequentes Gewebehacken unerlässlich, um die Wiederherstellung intakter Kerne zu maximieren. Die Verwendung von Mikrotom-Klingen anstelle von herkömmlichen Rasierklingen führt zu ein.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-RNA-Polymerase II CTD-Wiederholung YSPTSPS (Phospho S2) Antikörper	Abcam	ab5095	Primärer Antikörper, der bei 1/200 Verdünnung im Immunfärbungspuffer verwendet wird, um die aktive Form der Polymerase zu visualisieren (polyklonaler Antikörper, der im Kaninchen aufgezogen wird).
Beschaffungssoftware	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Rinderserum-Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Zertifizierte niedrigschmelzende Agarose	Bio-Rad	1613111
Deckschichten Dicke 1,5H Runde	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-Glukose, wasserfrei, 99 %	Thermowissenschaftlich	A16828-36
Dichroischer Spiegel	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Dichroischer Spiegel zur Trennung von Anregung/Emission
Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung 10 & akut;	BioWest	X0515 - 500	Arbeit unter sterilen Bedingungen
Epredia Ultra Einweg-Mikrotom-Klingen	FisherScientific	12191830	Niedriges Profil, Einmalverwendung
Falcon 6-Well Clear Flat Bottom, TC-behandelte Mehrwell-Zellkulturplatte mit Deckel	Falcon	353046
Formaldehydlösung 37 %	Carl Roth	7398	Arbeiten unter der Abzugshaube
Glukoseoxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Glycerol	VWR	24388.295
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Stark kreuzadsorbierter sekundärer Antikörper, Alexa Fluor Plus 647	Thermowissenschaftlich	A32733TR	Verwendet bei 1/200 als sekundärer Antikörper gekoppelt an AF647
Lösung Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	94403	Bei 1/500 verwendet, um die DNA zu kontern, die dem Agarose-Pad hinzugefügt wurde, zu kontrastieren
Salzsäurelösung	Chem-Lab	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Lavis-Labor und Open Chemistry Team (Janelia)	JF549-Hoechst	Verwendet zur Gegenfärbung der DNA, mit einer Endkonzentration von 1,5 nM zum Agarosepad hinzugefügt
KIMBLE Dounce Taschentuchschleifer-Set	Sigma-Aldrich	D8938	2-ml-Röhre mit sowohl großen (0,0030–0,0050 Zoll) als auch kleinen (0,0005–0,0025 Zoll) Freifahrtstößeln
Lasereinheit	Oxxius	L6Cc	Ausgestattet mit sechs Lasern: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW und 730 nm - 30 mW
Magnesiumchloridhexahydrat	Carl Roth	HN03
Mercaptoethylamin (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
MOPS-Natriumsalz 98 %	Fisher Scientific SAS	352590010
Multiband-Emissionsfilter	Semrock	FF01-446/523/600/677	Multiband-Emissionsfiltration zur Blockierung von Laserstreulicht
Nanodiamante	Adamas Nanotechnologien	NDNV100nmHiWGA2ml	Original 1 mg/mL
ORCA-Fusion Digital CMOS Kamera	Hamamatsu	C14440-20UP
Petrischale, 100/20 mm, PS, klar, mit Entlüftungen, steril	Greiner Bio-One	664161	Früher wurden Pflanzen auf 1/2 MS Medium gezogen
Petrischale, quadratisch, PS, klar, 120/120/17 mm, steril	Greiner Bio-One	688161	Verwendet beim Hacken der Pflanzensetzlinge
pluriStrainer Mini-Zellsieb	pluriSelect	43-10030-50	Netzgröße 30 & Mikro; Geeignet für 1,5 mL Eppendorf-Röhre, geeignet
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P9333
Einband-Emissionsfilter	Semrock	FF01-698/70	Spezifischer Emissionsfilter für AF647-Kanal
Einband-Emissionsfilter	Chroma	ET600/50m	Spezifischer Emissionsfilter für JF549-Kanal
Natriumchlorid (99,5 %)	Euromedex	1112-A
Star-Frost-Rutschen 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Sterile Spritzenfilter & Oslash; 33 mm Porosität 0,2 & Mikro; m Luer-Schleusenkegel	ClearLine	146560
Superauflösungssystem	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 ausgestattet mit 100x NA1.5 Ölimmersionsobjektiv
Tri-Natriumcitrat 2H2O Gen-Apex Biomol	Prolabo	PRO-33615.268
Tris Base Molekularbiologie Stufe	Promega	H5135
Tris(2-Carboxyethyl)Phosphinhydrochlorid (TCEP)	Thermowissenschaftlich	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Tween 20	Euromedex	2001-B
Twinsil-Geschwindigkeit	Picodent	13001002	Silikondichtmittel
UVOCS-Ofen zum UVOCS-Reinigungssystem für ultraviolettes Ozon	UVOCS Inc.	T10X10	20 Minuten Belichtung für die Reinigung von Deckrutschen
Vakuumpumpe	Vacuubrand	VP 100C
Heraeus Megafuge 16R Zentrifuge	Thermowissenschaftlich		Rotor TX-400 75003629. Die Zentrifugation erfolgte mit Eppendorf-Röhren.