Dieses Protokoll bietet einen effizienten Arbeitsablauf für die mikroskopische Mikroskopieabbildung isolierter Arabidopsis-Kerne durch optimierte Isolierung, Fixierung und Markierung, um eine zuverlässige nanoskalige Visualisierung von Chromatin und RNA-Polymerase II zu erreichen. Dieser Ansatz kann leicht an andere chromatinassoziierte Proteine oder Histonmodifikationen für hochauflösende Bildgebung angepasst werden.
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Methodenartikel
Ein stromlinienförmiges Protokoll für Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie in Arabidopsis-Kernen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Obwohl die konfokale Fluoreszenzmikroskopie wertvolle Einblicke in die Chromatinorganisation in Pflanzenkernen geliefert hat, beschränkt ihre beugungsbegrenzte Auflösung die Untersuchung der Chromatinarchitektur und motiviert den Einsatz von Superauflösungstechniken wie der Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM). Unter diesen Ansätzen bietet die direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) eine nanoskalige Auflösung in einzelnen Zellen, was eine präzise Visualisierung von Chromatinbereichen, Histonmodifikationen und nuklearer Organisation ermöglicht. Obwohl solche Methoden zunehmend in Säugetiersystemen angewandt werden, bleibt ihre Anwendung in der Pflanzenbiologie begrenzt, hauptsächlich aufgrund technischer Herausforderungen bei der Probenvorbereitung.
Hier präsentieren wir einen optimierten und reproduzierbaren Arbeitsablauf für die SMLM-Bildgebung von Kernen, die aus Arabidopsis thaliana isoliert wurden. Dieses Protokoll beginnt mit der Setzlingsfixierung zur Erhaltung der Kernmorphologie, gefolgt von sanftem Gewebehacken und Zentrifugation zur Anreicherung intakter Zellkerne. Isolierte Kerne werden anschließend mit Fluorophoren in flüssigem Medium markiert und auf niedrig schmelzenden Agarosepads immobilisiert, eine Strategie, die die Stabilität während längerer Einzelmolekül-Bildgebungssitzungen erhöht. Diese Schritte minimieren gemeinsam die Hintergrundfluoreszenz, verbessern die Konsistenz der Markierung und erhöhen die Reproduzierbarkeit zwischen biologischen Replikaten.
Die resultierenden Präparate bieten eine verbesserte Klarheit bei der Visualisierung von Chromatinmodifikationen und nuklearer Architektur in Anlagen. Durch die Absenkung der technischen Hürden für die Implementierung der SMLM-Bildgebung in Arabidopsis bietet dieses Protokoll ein vielseitiges Mittel, um epigenetische Regulation, Chromatinorganisation und nukleare topologische Variationen im Nanobereich zu untersuchen. Diese Arbeit legt eine methodische Grundlage für die Anwendung von SMLM auf Pflanzen, überbrückt die Lücke zur Zellbiologie von Säugetieren und eröffnet neue Möglichkeiten, zu untersuchen, wie die nukleare Architektur zur Genomregulation als Reaktion auf Entwicklungs- und Umweltsignale in Pflanzensystemen beiträgt.
Einleitung
Die Mikroskopie ist seit langem ein Grundpfeiler für die Untersuchung der Chromatinorganisation und der Kernarchitektur und zeigt auf, wie DNA und histonassoziierte Proteine im 3D-Kernraum arrangieren und die Genregulationbeeinflussen 1,2. Die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie hat wertvolle Erkenntnisse in großräumige Chromatindomänen wie Chromosomenterritorien, Chromozentren und Kernkörpergeliefert, die in situ möglich sind, insbesondere in Wurzelgewebe für Pflanzen 3,5,6. Diese Techniken sind jedoch grundlegend durch die Beugungsbarriere des Lichts begrenzt, die die räumliche Auflösung auf etwa 200 nm lateral und 500 nm axial7 begrenzt. Diese Einschränkung verschleiert nanoskalige Details der Chromatinfaltung, Histonmodifikationsmuster und transkriptionaler Kompartimentierung, die der epigenetischen Regulation zugrunde liegen. Um diese Hürde zu überwinden, wurden Super-Auflösungsmikroskopie-(SRM)-Ansätze wie strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM)8, stimulierte Emissionsdepletion (STED)9,10 und Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM)11,12 entwickelt, um Auflösungen von 100 nm bis zu wenigen nm13 zu erreichen.
Unter den SRM-Techniken bietet SMLM – einschließlich PhotoActivated Localization Microscopy (PALM)13 und Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) – eine außergewöhnliche räumliche Auflösung in Kombination mit molekularer Spezifität14. Durch die Erkennung der Positionen einzelner Fluorophore über die Zeit rekonstruiert SMLM hochpräzise nanoskalige Bilder von Chromatindomänen, Histonmarkierungen und Kernstrukturen in einzelnen Zellen 15,16. Diese Fähigkeit hat die Chromatinforschung in Säugetiersystemen grundlegend verändert, wo SMLM eingesetzt wurde, um Nukleosomenclustering, Chromatinverdichtung und Histonmodifikationsmuster mit beispielloser Detailgenauigkeitzu visualisieren. Im Gegensatz dazu bleibt die Anwendung von SMLM auf Pflanzenkerne begrenzt, hauptsächlich aufgrund technischer Herausforderungen im Zusammenhang mit Pflanzengewebeeigenschaften – wie hohe Autofluoreszenz, Zellwandsteifigkeit und das Vorhandensein von Lichtstreustoffen wie Stärke undChlorophyll-18. Darüber hinaus erfordert die empfindliche Natur der Kerne während der Isolierung und Markierung optimierte Arbeitsabläufe, um die strukturelle Integrität zu erhalten und die Hintergrundfluoreszenz bei längeren Bildaufnahmesitzungen zu minimieren.
Das hier beschriebene Protokoll wurde ursprünglich von Elizabeth Kracik-Dyer und Célia Baroux für die stimulierte Emissionsdepletionsmikroskopie (STED)19 entwickelt. Anschließend wurde es optimiert und angepasst, um die spezifischen Anforderungen der STORM-Bildgebung zu erfüllen, wobei das Wissen aus veröffentlichten mikrobiologischen Anwendungen 20,21,22 integriert wurde. Das übergeordnete Ziel ist es, einen schlanken und reproduzierbaren Arbeitsablauf für die SMLM-Bildgebung isolierter Arabidopsis-thaliana-Kerne bereitzustellen. Durch die Integration optimierter Fixierung, sanfter mechanischer Störung und Fluorophor-Markierung in Suspension erhält diese Methode die Kernmorphologie und entfernt gleichzeitig zytoplasmatische Schadstoffe, die oft die Bildgebungsqualität beeinträchtigen, effizient. Die Immobilisierung markierter Kerne auf niedrigschmelzenden Agarosepads gewährleistet mechanische Stabilität während der Aufnahme, was eine langfristige Einzelmolekül-Bildgebung mit nanoskaliger Präzision ermöglicht. Im Vergleich zu zuvor beschriebenen SRM-Protokollen für Pflanzenkerne – insbesondere solche, die auf STED-Mikroskopie19,23 basieren – verwendet dieser Workflow fotoschaltbare Fluorophore (z. B. AF647, JF549) und reduziert die Hintergrundfluoreszenz durch Waschschritte, die Chlorophyll und Gewebereste entfernen, und verbessert die Markierungshomogenität, indem die Markierungsmoleküle direkt zu den fixierten und permeabilisierten Kernen hinzugefügt werden. Folglich ermöglicht es eine konsistente Visualisierung von Chromatinmodifikationen, Kernkompartimenten und epigenetischen Mustern in einzelnen Kernen. Durch die Verringerung der technischen Hürden für die Implementierung von SMLM in Pflanzen erweitert diese Methode die Zugänglichkeit der nanoskaligen Bildgebung und bietet eine Grundlage für die Untersuchung, wie Chromatinorganisation und Kernarchitektur zur Genregulation als Reaktion auf Entwicklungs- und Umweltsignale beitragen.
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Protokoll
HINWEIS: Die detaillierten Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Instrumenten sind in der Materialtabelle verfügbar. Sofern nicht anders angegeben, werden die Puffer bei apyrogenen 0,2-μm-Filtern freigegeben. Doppeldestilliertes ultrareines H2O (ddH2O) wird während dieses Protokolls verwendet. Zentrifugationsschritte werden in 1,5-mL-Mikroröhren mit einem Rotor mit festem Winkel durchgeführt.
1. Fixierung und Freisetzung von Kerne durch Setzlinge
- Setzen Sie eine 6-Well-Kulturplatte auf Eis unter die Abzugshaube und geben Sie dann zu jedem Brunnen etwa 4 ml eiskalter Fixierungslösung, die spontan unter einer Abzughaube hergestellt wird (4 % (v/v) methanolstabilisiertes Formaldehyd, 0,1 % Triton X-100 in 1× phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS]).
- Entfernen Sie mit sauberer Pinzette die Setzlinge (zwischen 8 und 15 Tagen nach Keimung), die auf festen (0,8 % Agar) halbstarken Murashige- und Skoog Medium 2,2 g/L MS-Salzen, 1 % Saccharose (w/v), pH 5,7, wie bei MS-Setzlingen in Referenz24 beschrieben, gezogen wurden und tauchen Sie sie sofort in die Fixierungslösung. Verwenden Sie einen Brunnen für etwa 20 Setzlinge (3 Brunnen waren notwendig, um ausreichend Material pro Probe zu erhalten).
- Die Platte wird in die mit Eis gefüllte Vakuumkammer gelegt und 15 Minuten lang mit Druck zwischen 0,2 bar und 0,8 bar Vakuum angewendet, um die eingeschlossene Luft zu entfernen und ein tiefes Eindringen des Fixativs in das Pflanzengewebezu ermöglichen. Lassen Sie das Vakuum langsam los, rühren Sie die Probe um und wenden Sie das Vakuum dann weitere 15 Minuten an.
- Unter der Dampfhaube entferne ich die Fixierungslösung mit einer Pipette und wasche jeden Brunnen dreimal für 10 Minuten unter sanftem Rühren mit 5 ml eiskaltem PBS.
- Entfernen Sie PBS und verwenden Sie eine Pinzette, um das fixierte Gewebe auf eine 120 mm × 120 mm Petrischale zu übertragen. Fügen Sie den fixierten Setzlingen 50 μL Nuclei Isolation Buffer (NIB) hinzu, hergestellt wie von Kracik-Dyer und Baroux beschrieben (45 mM MgCl2, 20 mM MOPS, 30 mM Natriumcitrat, 0,3 % Triton X-100). Auf pH-Wert 7 mit 1 N HCl)19 eingestellt. Chip mit einer Klinge.
HINWEIS: Microtome-Klingen erwiesen sich für diese Aufgabe als effizienter als herkömmliche Rasierklingen. - Kratze gehacktes Gewebe mit derselben Klinge an eine Kante der Petrischüssel und gib 600 μL NIB hinzu, wobei du auch das an der Klinge haftende Gewebe abwaschen.
- Gewebeschlamm in das 2-mL Dounce-Homogenisatorrohr übertragen und mit dem kleineren Stößel 5–10 Mal abstreichen, dann mit dem größeren Stößel, bis er sich im Rohr gleichmäßig bewegt (es sind wiederum meist 5–10 Schläge erforderlich).
- Filtern Sie die resultierende homogenisierte Probe durch einen 30-μm-Mesh-Filter in eine 1,5-mL-Mikroröhre.
- Zentrifugieren Sie die Aufhängung für 10 Minuten bei 800 × g mit der niedrigsten Rampe sowohl für Beschleunigung als auch für Verzögerung. Eine kleine weiße Kugel ist zwischen den grünen Geweberesten sichtbar.
- Verwerfen Sie das Überdachungsmittel und suspendieren Sie das Pellet in 150 μL NIB erneut.
- Zentrifugiere erneut für 10 Minuten bei 800 × g und entferne das Überstandsmittel. Wenn sichtbare grüne Ablagerungen vorhanden sind, waschen Sie sie ein zweites Mal. Je nach Größe des Pellets wird in 50 μL bis 150 μL NIB aufgehängt.
- Die resultierende isolierte Kernsuspension wird maximal eine Woche bei 4 °C gelagert, bevor die Färbung durchgeführt wird. Es wird jedoch empfohlen, sofort vorzugehen.
2. (Immun-)Färbung
HINWEIS: In den folgenden Schritten wird das Protokoll auf ein Volumen von 50 μL Kernsuspension angewendet, was typischerweise 20 Setzlingen entspricht. Sofern nicht angegeben, werden die folgenden Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt.
- Zentrifugiere die Lösung für 10 Minuten bei 800 × g und entsorge den Überstandsmittel. Sei vorsichtig, das Pellet nicht zu berühren.
- Die Kerne werden durch sanftes Pipettern in 50 μL Blockpuffer (143 mM NaCl, 4 % BSA in PBS, bei 4 °C) wieder suspendiert. Inkubiere 30 Minuten unter sanfter Bewegung.
- Zentrifugieren Sie die Lösung für 10 Minuten bei 800 × g und entsorgen Sie den Überstandsmittel, ohne den Kernpellet zu berühren.
- Die Kerne werden durch sanftes Pipettern in 50 μL 1× PBS wieder suspendiert. Zentrifugiere erneut für 10 Minuten bei 800 × g. Entsorge das Supernatant wie oben.
- Suspendieren Sie die Kerne in 50 μL primärer Antikörperlösung, hergestellt in einem Immunfärbungspuffer, bestehend aus 143 mM NaCl, 1 % BSA, 0,05 % Tween 20 in PBS (Antikörper- und Arbeitsverdünnungen sind in der Materialtabelle dargestellt). Inkubiere die Proben 60 Minuten lang unter sanftem Rühren.
- Fahren Sie mit 2 Waschgängen fort (wiederholen Sie Schritte 2.3 und 2.4).
- Die Kerne in 50 μL des Ziegen-Antikaninchen-Sekundärantikörpers AF647 bei 1/200 Verdünnung26 wieder suspendieren. Wickeln Sie die Schläuche in Alufolie, um das Fluorophor vor Licht zu schützen. Inkubiere die Schläuche 60 Minuten lang unter sanftem Rühren.
- Fahren Sie mit 2 Waschgängen fort (wiederholen Sie Schritte 2.3 und 2.4).
- Das Pellet in 50 μL NIB wieder suspendieren. Lagern Sie die Federung in 1,5-ml-Mikroröhren, die in Alufolie umwickelt sind. Die Etikettierung ist mehrere Wochen bei 4 °C stabil.
3. Montage
- Für die STORM-Bildgebung bereiten Sie eine niedrigschmelzende Agaroselösung (LMA 1,5 % W/V) vor, indem Sie das Pulver in 1,25 × Puffer B auflösen, bestehend aus 50 mM Tris pH 8, 10 mM NaCl, 10 % Glukose. Bereite 1,25 × Brühlösung vor und lagere bei 4 °C.
- Erhitze bei 90 °C für 1 Minute, um das Pulver aufzulösen und eine klare Lösung zu erhalten. Kühlen Sie ab und halten Sie die geschmolzene LMA-Lösung bei 37 °C, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, um eine Wärmedenaturierung des Glucose-Oxidase-(GLOX)-Puffers zu vermeiden (bereiten Sie 10-fache Lagerlösung vor, gelagert bei -20°C, bestehend aus 100 mM Tris pH 7,5, 25 mM KCl, 1 mM TCEP pH 7,0, 5 mg/mL Glukoseoxidase, 0,4 mg/mL Catalase), 50 % v/v Glycerol).
- Nachdem die LMA-Lösung 37 °C erreicht hat, bereitet man den STORM-Puffer vor, indem man 100 mM Mercaptoethylamin (MEA) und GLOX zur warmen LMA-Lösung hinzufügt, um eine Endkonzentration von 1× zu erreichen. Lagern Sie die MEA 1 M Grundlösung bis zu einem Monat bei 4 °C, aber die Verwendung einer frisch zubereiteten Lösung wird empfohlen. Mische vorsichtig.
HINWEIS: Für die optionale DNA-Markierung fügen Sie 1,5 nM (Endkonzentration, 1 mM Lagerlösung in DMSO) des JF549-konjugierten Hoechst hinzu. Halten Sie die Federung bis zur Nutzung bei 37 °C. - Mischen Sie die Kernsuspension vorsichtig mit Nanodiamanten bei 1/1500 Verdünnung. Inkubiere sie mit der Probe für 5 Minuten.
HINWEIS: Nanodiamanten dienen als treuhänderische Marker zur Korrektur der Probendrift. - Bringen Sie 10 μL der Mischung auf einen ozonbehandelten 1,5-Stunden-Deckschicht (20 Minuten im Ultraviolett-Ozon-Reinigungssystem) ab und warten Sie 3 Minuten, bis sich die Kerne auf dem Deckmantel ablagern können.
- Entferne die überschüssige Flüssigkeit, warte 2 Minuten. Fügen Sie 10 μL des in Schritt 3.3 vorbereiteten LMA auf den Deckzettel hinzu und decken Sie sofort mit einem Objektträger ab.
- Versiegeln Sie den Deckglied mit Silikondichtmittel. Mische gleiche Mengen Lösung A und B in einer kleinen Petrischale mit einer Mikropipettenspitze. Tragen Sie die Mischung über die Ränder des Deckzettels auf, um die Probe zu versiegeln. Silikondichtmittel härt innerhalb von 5 Minuten aus.
- Nach der Montage sollte die Bildgebung der Objektträger unverzüglich durchgeführt werden, letztlich in den folgenden 4–5 Stunden, um den Verlust der sauerstoffabsorbierenden Eigenschaften des Montagepads zu vermeiden.
4. Bildgebung
HINWEIS: Bildgebende Parameter müssen sorgfältig entsprechend der Art der Probe, den fotophysikalischen Eigenschaften der Fluorophore und der optischen Konfiguration des Mikroskops optimiert werden. Es ist entscheidend, für jedes Fluorophor ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis sicherzustellen und dabei die spektrale Durchblendung und Kreuzanregung zwischen fluoreszierenden Kanälen zu minimieren. Die Proben wurden mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop beobachtet, das mit einem Objektiv mit hoher NA-100x Ölimmersionsmessung, einer Fokussierungseinheit und einer weißen LED für Hellfeldaufnahmen ausgestattet war. Die fluoreszierenden Markierungen AlexaFluor647 (AF647) wurden bei 640 nm angeregt und JF549-Hoechst bei 561 nm. Das emittierte Licht wurde mit einem kompatiblen dichroischen Spiegel und Bandpassfiltern gefiltert, und schließlich wurden die Bilder mit einer wissenschaftlichen Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (sCMOS)-Kamera aufgenommen.
- Montiere die Proben-Folie und finde den Fokus. Aktiviere ein fokussierendes Modul, falls das System eines hat (sehr empfohlen für lange Akquisitionen).
- Finde und konzentriere dich auf einen Kern. Es ist besser, einen oder wenige Nanodiamanten in der Nähe des interessanten Kerns zu haben, um die Drift während der Rekonstruktion effizienter zu korrigieren.
- (Optional) Beugungsbegrenzte Schnappschüsse des hellen Feldes und jedes fluoreszierenden Kanals bei niedriger Laserleistung aufnehmen.
- Bei der Zweifarbabbildung beginnt man mit der Aufnahme des längeren Wellenkanals und wechselt dann zum kürzeren Kanal (d. h. den AF647-Kanal vor JF549 erfassen).
HINWEIS: Beispiel für in diesem Werk verwendete Erwerbsparameter:
Kanal A – Epitope-Kennzeichnung – AF647
Belichtungszeit: 20 ms
Laserintensität: 640 nm – 2,2 kW/cm2
Anregungsmodus: HiLo27
Kanal B – DNA-Markierung – JF549-Hoechst
Belichtungszeit: 50 ms
Laserintensität: 561 nm – 1 kW/cm2
Anregungsmodus: Epi
Anzahl der aufgenommenen Bilder: 10.000–30.000 pro Kanal, was sicherstellt, dass die Dichte der Fluorophore pro Bild dünn genug bleibt, um eine genaue Einzelmoleküllokalisierung zu ermöglichen, während die kumulative Anzahl der Lokalisierungen empirisch mittels Super-Resolution QUantitative Image Rating and Reporting of Error Locations (SQUIRREL)28 bestimmt wurde, was auch die ausreichende Anzahl von Frames angibt.
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Ergebnisse
Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht die Herstellung hochwertiger Arabidopsis-thaliana-Kerne , die für SMLM geeignet sind. Mehrere Optimierungsrunden wurden durchgeführt, um die Kernintegrität zu verbessern und zytoplasmatische sowie zelluläre Ablagerungen zu reduzieren, die die Bildqualität beeinträchtigen. Nach jedem Optimierungsschritt wurde die Qualität der nuklearen Präparaten durch konfokale Bildgebung mit einem Olympus IX81 Spinning-Disc-Mikroskop bewertet, bevor zu...
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Diskussion
Die Herstellung von Arabidopsis thaliana-Kerne für die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) erfordert mehrere kritische Schritte, die die Qualität der Endproben stark beeinflussen. Wie bereitsbeschrieben 19,35, ist gründliches und konsequentes Gewebehacken unerlässlich, um die Wiederherstellung intakter Kerne zu maximieren. Die Verwendung von Mikrotom-Klingen anstelle von herkömmlichen Rasierklingen führt zu ein...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Danksagungen
Wir danken dem Lavis Lab und dem Open Chemistry Team bei Janelia für die großzügige Bereitstellung der JF- und JFX-Farbstoffe. Wir sind auch Elizabeth Kracik-Dyer und Célia Baroux dankbar, die ihr Protokoll freundlich geteilt haben, sowie Aline Probst und Guillermo Orsi für aufschlussreiche Ratschläge. Die optische Bildgebung wurde auf der M4D-Bildgebungsplattform des Grenoble Instruct-ERIC Centers (ISBG; UAR 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) innerhalb der Grenoble Partnership for Structural Biology, unterstützt von der französischen Infrastructure for Integrated Structural Biology (ANR-10-INBS-0005-02) und der Grenoble Alliance for Integrated Structural & Cell Biology Labex, einem Projekt der Graduiertenschule der Universität Grenoble Alpes (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). Wir erkennen Tip ten Brink für das AnalyzeFRC Python-Paket an, das am Department of Imaging Physics (ImPhys), Fakultät für Angewandte Wissenschaften, TU Delft, entwickelt wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody | Abcam | ab5095 | Primärantikörper, der in 1/200 Verdünnung in Immunfärbungspuffer verwendet wird, um die aktive Form der Polymerase zu visualisieren (Polyklonaler Antikörper, der in Kaninchen erzeugt wurde ) |
| Acquisition software | Abbelight | NEO LiveImaging v2.18 | |
| Bovines Serumalbumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Zertifizierte Low Melting Agarose | Bio-Rad | 1613111 | |
| Deckgläser Dicke 1.5H rund | Marienfeld | 117640 | Ø: 24 mm |
| D-(+)-Glucose, wasserfrei, 99% | Thermo Scientific | A16828-36 | |
| Dichroitischer Spiegel | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t1 | Dichroitischer Spiegel für Anregungs-/Emissionstrennung |
| Dulbecco’s Phosphat-Pufferlösung 10´ | biowest | X0515 - 500 | Arbeiten unter sterilen Bedingungen |
| Epredia Ultra Einweg-Mikrotomklingen | FisherScientific | 12191830 | Niedriges Profil, einmalige Verwendung |
| Falcon 6-Well Clear Flat Bottom TC-behandelte Multiwell-Zellkulturplatte mit Deckel | Falcon | 353046 | |
| Formaldehydlösung 37% | Carl Roth | 7398 | Arbeiten unter dem Abzug |
| Glukoseoxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Glycerol | VWR | 24388.295 | |
| Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) hochgradig gekreuzt adsorbiertes sekundäres Antikörper, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Scientific | A32733TR | Verwendet bei 1/200 als sekundärer Antikörper, gekoppelt an AF647 |
| Hoechst 33258-Lösung | Sigma-Aldrich | 94403 | Verwendet bei 1/500 zur Gegenfärbung der DNA, hinzugefügt zum Agarose-Pad |
| Salzsäurelösung | Chem-Lab | CL05.0311.1000 | |
| JF549-Hoechst | Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia) | JF549-Hoechst | Verwendet zur Gegenfärbung der DNA, hinzugefügt zum Agarose-Pad bei einer Endkonzentration von 1,5 nM |
| KIMBLE Dounce Gewebezerdrücker-Set | Sigma-Aldrich | D8938 | 2-ml-Röhrchen mit großen (0,0030–0,0050 Zoll) und kleinen (0,0005–0,0025 Zoll) Freiräumen für Stößel |
| Lasereinheit | Oxxius | L6Cc | Ausgestattet mit sechs Lasern: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW und 730 nm - 30 mW |
| Magnesiumchlorid-Hexahydrat | Carl Roth | HN03 | |
| Mercaptoethylamin (MEA) | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| MOPS-Natriumsalz 98% | Fisher Scientific SAS | 352590010 | |
| Multiband-Emissionsfilter | Semrock | FF01-446/523/600/677 | Multiband-Emissionsfilterung zur Blockierung von Laserstreulicht |
| Nanodiamanten | Adamas Nanotechnologies | NDNV100nmHiWGA2ml | Vorrat 1 mg/mL |
| ORCA-Fusion Digital CMOS-Kamera | Hamamatsu | C14440-20UP | |
| Petrischale, 100/20 mm, PS, klar, mit Lüftungsöffnungen, steril | Greiner Bio-One | 664161 | Verwendet zum Anbau von Pflanzen auf 1/2 MS-Medium |
| Petrischale, quadratisch, PS, klar, 120/120/17 mm, steril | Greiner Bio-One | 688161 | Verwendet beim Zerkleinern der Pflanzenkeimlinge |
| pluriStrainer Mini Zellsieb | pluriSelect | 43-10030-50 | Maschengröße 30 µm, geeignet für 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen |
| Kaliumchlorid | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Einzelband-Emissionsfilter | Semrock | FF01-698/70 | Spezifischer Emissionsfilter für AF647-Kanal |
| Einzelband-Emissionsfilter | Chroma | ET600/50m | Spezifischer Emissionsfilter für JF549-Kanal |
| Natriumchlorid (99,5%) | Euromedex | 1112-A | |
| Star-Frost Objektträger 76 x 26 mm | Knittel | VS112711FKB.01 | |
| Sterile Spritzenfilterø 33 mm Porosität 0,2 µm Luer Lock Kegel | ClearLine | 146560 | |
| Superauflösungssystem | Abbelight | SAFe360 | Olympus IX83 ausgestattet mit 100x NA1.5 Öl-Immersionsobjektiv |
| Tri-Natriumcitrat 2H2O Gen-Apex Biomole | Prolabo | PRO-33615.268 | |
| Tris-Base Molekularbiologie-Qualität | Promega | H5135 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Triton X-100 | Euromedex | 2000-B | |
| Tween 20 | Euromedex | 2001-B | |
| Twinsil Speed | Picodent | 13001002 | Silikondichtmittel |
| Ultraviolett-Ozonreinigungssystem UVOCS-Ofen | UVOCS Inc. | T10X10 | 20 min Belichtung zur Reinigung von Deckgläsern |
| Vakuumpumpe | Vacuubrand | VP 100C | |
| Heraeus Megafuge 16R Zentrifuge | Thermo Scientific | Rotor TX-400 75003629. Zentrifugation durchgeführt mit Eppendorf-Röhrchen. |
Referenzen
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