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Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskulatur und Knochenmark mittels Größenausschlusschromatographie

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DOI:

10.3791/70894

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23. Juni 2026

 ,  ,  , 
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2McGill Group for Suicide Studies, Douglas Mental Health University Institute, 3Center for Applied Nanomedicine, Research Institute of the McGill University Health Center, 4Department of Psychiatry, McGill University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskeln und Knochenmark mittels enzymatischer Verdauung und Größenausschlusschromatographie, wodurch reproproduzierbare Rückgewinnung von vesikelangereicherten Fraktionen aus strukturell komplexen, leistungsarmen Geweben für die nachgelagerte molekulare Analyse ermöglicht wird.

Zusammenfassung

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) sind nanosizede, lipidgebundene Partikel, die die interzelluläre Kommunikation durch den Transfer von Proteinen, Lipiden und Ribonukleinsäuren (RNAs) vermitteln. Die Isolierung von sEVs aus festen Geweben wie Skelettmuskulatur (SkM) und Knochenmark (BM) bleibt aufgrund geringer Ausbeute und Kontamination durch nicht-vesikulare Komponenten weiterhin schwierig. Dieses Protokoll beschreibt einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Isolierung von sEVs aus Maus-SkM und BM. SkM wird enzymatisch verdaut, während BM direkt verarbeitet und anschließend einer differentiellen Zentrifugation und Größenausschlusschromatographie (SEC) unterzogen wird. Für SkM wird das Hohlraumvolumen (~2,5 mL) verworfen, und die anschließenden ~1,6 mL werden als EV-angereicherte Fraktionen gesammelt, typischerweise unterteilt in 400 μL sequentielle Fraktionen (F1–F4). Für BM wird ein 700 μL Void-Volumen verworfen, gefolgt von der Sammlung eines ~850 μL EV-angereicherten Anteils, der in ~170 μL sequentielle Fraktionen (F1–F5) unterteilt und basierend auf EV-Marker-Anreicherung zusammengefasst werden kann. Mit diesem Ansatz können sEVs aus kleinen Gewebevolumina isoliert werden (etwa 500 μL aus einem einzelnen Quadrizeps und 150 μL aus dem gepoolten Oberschenkelknochen und der Tibia-BM), was ~108 Partikel ·mL−1·mg−1 Gewebe mit Partikeldurchmessern überwiegend <200 nm ergibt. Die Integrität und Reinheit der Vesikel werden mittels Transmissionselektronenmikroskopie, Nanopartikel-Tracking-Analyse und Western-Blotting für kanonische EV-Marker validiert, mit zusätzlicher Charakterisierung durch Einzelteilchen-Interferometrie zur Quantifizierung tetraspanin-definierter Vesikelsubpopulationen. Diese Methode ermöglicht eine reproduzierbare Isolierung hochreiner sEVs aus strukturell komplexen Geweben mit minimalem Inputmaterial und unterstützt stromabwärts molekulare und funktionelle Analysen von gewebeabgeleiteten Vesikeln.

Einleitung

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) sind nanosizede, lipidgebundene Partikel, die die interzelluläre Kommunikation durch den Transfer von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren vermitteln1. Sie werden von allen Zelltypen freigesetzt und sind in nahezu allen biologischen Flüssigkeiten vorhanden, wo sie als Schlüsselträger bioaktiver Fracht fungieren, einschließlich Peptiden und Mikro-Ribonukleinsäuren (RNAs)2. Ihre Ladung wird selektiv sortiert, was eine präzise Übertragung spezifischer Signaleermöglicht, und ihre vesikuläre Struktur ermöglicht es ihnen, die typischen Gradienten- und Verdünnungsbeschränkungen frei abgeschiedener Faktoren zu umgehen, indem sie konzentrierte molekulare Nutzlasten über große Entfernungen liefern4. Obwohl EVs aus Biofluiden (z. B. Plasma, Serum und Speichel) einen praktischen Überblick über systemische Signalübertragungen bieten, stellen sie eine stark gemischte Population dar, die aus vielen Gewebenstammt 5. Dies macht es schwierig zu bestimmen, welches Organ ein bestimmtes biologisches Signal erzeugt oder wie die EV-Kommunikation auf Gewebeebene reguliert wird. Da zirkulierende Elektrofahrzeuge zusammengelegt werden, können gewebespezifische Veränderungen verdünnt oder überdeckt werden, was die Fähigkeit einschränkt, die wahre Quelle derSignale 6 zu identifizieren.

Skelettmuskulatur (SkM) und Knochenmark (BM) sind wichtige metabolisch und funktionell aktive Gewebe mit unterschiedlichen zellulären Zusammensetzungen und Signalfunktionen 7,8. Beide Gewebe können EV-Populationen freisetzen, die mit einzigartiger, gewebespezifischer Fracht angereichert sind; diese Signale können jedoch im Plasma leicht von EVs aus Geweben mit hohem Umsatz wie Immunzellen 8,9 überschattet werden. Die direkte Isolierung von EVs von Muskeln oder Stuhlgang erhöht die Empfindlichkeit und ermöglicht die Erkennung subtiler, gewebespezifischer Anpassungen, die im Zirkul möglicherweise nicht sichtbar sind. Gewebeabgeleitete EVs liefern daher wesentliche ergänzende Informationen, die zeigen, wann ein bestimmtes Organ EVs freisetzt, wie lange diese Signale anhalten und welche Anpassungen akut versus chronisch sind. Trotz zunehmendes Interesses an EVs wurden die meisten etablierten Isolationsmethoden für Biofluide (z. B. Plasma und Serum) oder für Zellkultursysteme entwickelt. In diesen Kontexten können Elektrofahrzeuge mit relativ hoher Ausbeute und minimaler struktureller Störung erworben werden. Die direkte Isolierung von Elektrofahrzeugen aus festen Geweben wie SkM und BM stellt jedoch erhebliche technische Herausforderungen dar. Diese Gewebe sind strukturell komplex und heterogen und erfordern mechanische oder enzymatische Dissoziationsschritte, die Artefakte einführen können, darunter hohe Mengen löslicher Proteine, Organellenfragmente und nicht-vesikuläre Nanopartikel, was es erschwert, hochreine EV-Präparate zu erreichen.

Eine weitere große Herausforderung bei der gewebebasierten EV-Isolierung ist das Fehlen standardisierter Arbeitsabläufe für Fraktionsdefinition und -trennung10. Allein die differenzielle Zentrifugation führt häufig zur Ko-Isolierung von Proteinaggregaten und großen Vesikeln, während ultrazentrifugationsbasierte Methoden, obwohl weit verbreitet, je nach Rotortyp und experimentellen Bedingungen zu Vesikelaggregation, Deformation und variabler Rückgewinnung führen können. Dichtegradienten-Ansätze verbessern die Reinheit, sind aber zeitintensiv, niedrigdurchsatzfähig und schwer zwischen Laboren zu standardisieren11. Daher gibt es derzeit keine weit verbreitete, reproduzierbare Methode, die zur Isolierung kleiner Elektrofahrzeuge aus festen Geweben mit hoher Reinheit und konstantemErtrag von 10 optimiert ist.

Die Größenausschlusschromatographie (SEC) hat sich als vielversprechende Alternative zur EV-Isolierung erwiesen, da sie Partikel nach Größe trennt, ohne Vesikel hohen Zentrifugalkräften auszusetzen. SEC ermöglicht eine effiziente Trennung kleiner Elektrotransporter von löslichen Proteinen und niedrigmolekularen Schadstoffen bei gleichzeitiger Erhaltung der Vesikelintegrität und der biologischen Funktion. Wichtig ist, dass die SEC eine klare Definition der Elutionsfraktionen ermöglicht, was eine reproduzierbare Identifikation von EV-angereicherten Fraktionen und eine verbesserte Konsistenz zwischen den Experimenten12 ermöglicht. Allerdings erfordern SEC-Arbeitsabläufe eine sorgfältige Optimierung für gewebebasierte Proben, insbesondere im Hinblick auf die Upstream-Gewebeverarbeitung, die Entfernung von Schmutz und die Fraktionssammlung. Um diese Einschränkungen zu beheben, entwickelten wir ein reproduzierbares und standardisiertes Protokoll zur Isolierung von sEVs aus SkM und BM. Diese Methode integriert kontrollierte enzymatische Verdauung von faserigen Geweben, differenzielle Zentrifugation zur Entfernung von Müll und SEC-basierte Reinigung zur Isolierung hochreiner Vesikel. Der Arbeitsablauf ist gezielt optimiert, um Kontaminationen durch intrazelluläre Komponenten zu minimieren, während die Integrität der Vesikel erhalten bleibt und eine konsistente Rückgewinnung aus Geweben mit geringer Ertragsrate möglich ist.

Dieses Protokoll schließt eine kritische methodologische Lücke, indem es einen praktischen und skalierbaren Ansatz zur Isolierung gewebeabgeleiteter sEVs mit definierter Fraktionierung und validierter Reinheit bietet, erreicht durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), Western Blotting kanonischer EV-Marker, Elektronenmikroskopie zur morphologischen Bewertung und Einzelteilchen-EV-Analyse mittels Antikörperaufnahme, interferometrischer Größenmessung und Multikanal-Fluoreszenzbildgebung. Sie eignet sich besonders gut für Studien, die gewebespezifische EV-Analysen erfordern, bei denen biofluid-abgeleitete Vesikel nicht ausreichen, um den zellulären Ursprung der Signale zu erkennen. Forscher sollten diese Methode verwenden, wenn das Ziel ist, hochreine sEVs aus festen Geweben mit minimaler Kontamination und Erhalt der Vesikelintegrität zu gewinnen. Im Gegensatz dazu können ultrazentrifugationsbasierte Methoden für Hochleistungsanwendungen bevorzugt werden, bei denen die Reinheit weniger kritisch ist, und Dichtegradientenansätze können bei der Isolierung spezifischer EV-Subpopulationen trotz geringerem Durchsatz bevorzugt werden. Zusammen bietet dieses Protokoll einen standardisierten Rahmen für die Isolierung und Charakterisierung gewebebasierter sEVs, der reproduzierbare nachgelagerte molekulare, biochemische und funktionelle Analysen ermöglicht.

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Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom McGill University Animal Care Committee (DOUG10029) genehmigt und gemäß den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt.

1. SkM-abgeleitetes sEV (SkM-sEV) Isolationsprotokoll

  1. Probenentnahme und Gewebedissoziation
    1. Gewebeentnahme und -konservierung
      1. Schnellfrieren Sie SkM-Gewebe unmittelbar nach der Exzision durch Eintauchen in vorgekühltes Methylbutan.
        HINWEIS: Um vorgekühltes Methylbutan herzustellen, stellen Sie einen Behälter mit Methylbutan in ein Trockeneisbad und geben Sie nach und nach kleine Trockeneisstücke direkt in die Flüssigkeit. Lassen Sie die Lösung abkühlen, liegt die Temperatur typischerweise im Bereich von −70°C bis −80°C. Behalten Sie das Methylbutan während der Anwendung im Trockeneisbad, um die Temperatur zu erhalten. Tauchen Sie das Gewebe etwa 3–4 Sekunden lang ein, bis es vollständig gefroren ist, was durch vollständige Gewebeverhärtung und Verlust der Flexibilität angezeigt wird.
      2. Übertragen Sie das Gewebe in Kryovialen.
      3. Legen Sie die Proben auf Trockeneis.
        HINWEIS: Lagern Sie die Proben bei −80°C bis zur weiteren Verarbeitung. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen. Schnelles Einfrieren erhält Elektrofahrzeuge effektiv, wenn die Proben ordnungsgemäß versiegelt sind. Dehydrierung oder Vesikelschäden können auftreten, wenn Gewebe freigelegt bleibt oder mehrere Gefrier-Tau-Zyklendurchläuft 13.
    2. Gewebedissoziation
      HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einem Biosicherheitsschrank mit sterilen Instrumenten und Handschuhen durch, um eine Kontamination zu verhindern, die sonst die Reinheit von Elektrofahrzeugen beeinträchtigen könnte.
      1. Gewebe wiegen
        1. Sterilisieren Sie die Pinzetten mit 70 % Ethanol und lassen Sie sie an der Luft trocknen.
        2. Übertragen Sie das gefrorene Gewebe auf eine vorgewogene Suspensionskulturschale.
        3. Wiegen Sie das Gewebe mit einer Milligrammbilanz (typischerweise ~80–120 mg pro Probe, abhängig von Mausalder und -geschlecht).
          HINWEIS: Das Protokoll ist für eingehende Gewebemassen von ~80–120 mg validiert. Für Proben innerhalb dieses Bereichs verwenden Sie die in den Schritten 1.2.3.1, 1.3.1.3 und 1.3.2.1 angegebenen Reagenzvolumina ohne Änderung. Für Proben außerhalb dieses Bereichs skalieren Sie alle Reagenzienvolumen proportional zur Gewebemasse, wobei das validierte Verhältnis von RPMI-1640, Kollagenase D und DNase I (1000:40:4 μL pro 100 mg Gewebe) beibehalten wird. Dies entspricht ungefähr 10 μL RPMI-1640, 0,4 μL Kollagenase D (100 mg/mL Bestand) und 0,04 μL DNase I (20.000 U/mL Bestand) pro mg Gewebe. Halten Sie diese Proportionen bei, um die finalen Enzymkonzentrationen der Reaktion zu erhalten. Verdauungseffizienz und EV-Ausbeute sollten empirisch überprüft werden, wenn man wesentlich außerhalb des 80–120 mg-Bereichs arbeitet.
        4. Stecken Sie die Probe in ein vorgekühltes Rohr zurück und legen Sie sie auf Eis.
      2. Enzyme bereiten
        1. Tau-Aliquoten von Kollagene D (100 mg/mL Lager) und DNase I (20.000 U/mL Bestand) auf Eis (siehe Supplementary File 1, Step 1.4 zur Enzymzubereitung). Diese Enzyme werden in Schritt 1.3.2.1 hinzugefügt, um endgültige Inreaktionskonzentrationen von 3,8 mg/mL Collagenase D und 77 U/mL DNase I zu erreichen. Das endgültige Verdautungsvolumen beträgt 1,044 ml.
        2. Mische DNase I sanft durch Inversion. Nicht vortexen.
      3. Gewebevorbereitung für die Verdauung
        1. Fügen Sie 800 μL RPMI-1640 in eine sterile Aufhängungskulturschale hinzu, die auf Eis gestellt wird.
        2. Übertragen Sie das Gewebe in die Schale.
        3. Schneiden Sie das Gewebe in 6–8 Stücke von etwa gleichmäßiger Größe (2–3 mm pro Seite) mit einem sterilen Einwegskalpell. Stabilisieren Sie das Gewebe während des Schneidens mit steriler Pinzette, um eine gleichmäßige Fragmentierung zu gewährleisten. Erledigen Sie diesen Schritt innerhalb von 1 Minute pro Probe, um die Konsistenz zwischen den Proben zu gewährleisten.
        4. Lassen Sie das Gericht während des gesamten Eingriffs auf Eis stehen, um den Verfall zu minimieren.
    3. Gewebetransfer und enzymatische Verdauung
      1. Gewebetransfer
        1. Schneiden Sie das Ende einer sterilen P1000-Pipettenspitze mit einer sterilen Klinge ab, um eine Öffnung von 2–3 mm Durchmesser zu erzeugen, ausreichend für den freien Durchgang der in Schritt 1.2.3.3 erzeugten Gewebefragmente.
          HINWEIS: Alternativ verwenden Sie kommerziell erhältliche Breitbohr- (Breitöffnungs-)1-mL-Pipettenspitzen, die eine standardisierte Öffnung bieten (typischerweise ~2–3 mm Innendurchmesser) und die Variabilität durch manuelles Trimmen eliminieren.
        2. Übertragen der Gewebefragmente und das RPMI-1640-Medium mit einer P1000-Pipette mit der modifizierten Spitze in voretikettierte 1,5-ml-Röhren. Führen Sie 2–3 aufeinanderfolgende Aspirationen durch, um Restfragmente und Medium zurückzugewinnen. Untersuchen Sie die Schale und die Pipettenspitze nach dem Transfer visuell und verwenden Sie sterile Pinzetten, um eventuelle verbleibende Fragmente zu übertragen, damit kein sichtbares Gewebe zurückbleibt.
        3. Fügen Sie 200 μL RPMI-1640 pro Röhre hinzu.
      2. Enzymatische Verdauung
        1. Fügen Sie 40 μL Kollagenase-D-Fond (100 mg/mL) und 4 μL DNase-I-Lager (20.000 U/mL) zu jedem Röhrchen aus auf Eis aufgetauten Aliquoten hinzu. Dies ergibt endgültige Inreaktionskonzentrationen von 3,8 mg/mL Collagenase D und 77 U/mL DNase I. Für Proben außerhalb des 80–120 mg Gewebebereichs werden die Enzymvolumina proportional angepasst, wie im NOTE nach Schritt 1.2.1.3 beschrieben.
          HINWEIS: Diese Volumina sind für Gewebemassen im typischen Bereich von 80–120 mg kalibriert. Für Gewebemassen außerhalb dieses Bereichs skalieren Sie alle Reagenzienvolumen proportional, wie im NOTE nach Schritt 1.2.1.3 beschrieben (0,4 μL Kollagenase D-Stamm und 0,04 μL DNase-I-Bestand pro Gewebe), wobei die endgültigen Inreaktionsenzymkonzentrationen unabhängig von der Gewebemasse erhalten bleiben.
        2. Fügen Sie die Enzyme gleichzeitig allen Proben hinzu, wenn Sie mehrere Proben verarbeiten.
        3. Lassen Sie die Schläuche während der Enzymzugabe auf Eis.
        4. Wenden Sie die Röhren sanft um, um zu mischen. Nicht vortexen.
        5. Inkubieren Sie die Röhren bei 37°C für 30 Minuten auf einem Nutationsmischer (24 U/min, 20° Neigungswinkel; siehe Materialtabelle). Sorgen Sie für gleichmäßiges Mischen während der Inkubation.
          HINWEIS: Jede Probe wird in einem Gesamtvolumen von 1,044 ml verdauet (1000 μL RPMI-1640, 40 μL Kollagenase D und 4 μL DNase I pro Probe; entspricht einem Puffer-zu-Kollagenase-Verhältnis von ~25:1).
    4. Entfernung von Trümmern
      HINWEIS: Starten Sie die SEC-Säulengleichstellung zu Beginn der ersten Zentrifugation (Schritt 1.4.1.1). Die SEC-Spalte benötigt 20–25 Minuten für das Spülen und Gleichgewicht. Der Beginn der Gleichgewichtsanpassung an diesem Punkt stellt sicher, dass die Säule unmittelbar nach Abschluss des Filtrationsschritts bereit für das Probenladen bereit ist (Schritt 1.4.3).
      1. Erste Zentrifugation
        1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um unverdautes Material, intakte Zellen und verbleibende Gewebefragmente zu pelletieren.
        2. Übertragen Sie das Supernatant vorsichtig auf neue, sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren, ohne das Pellet zu stören.
      2. Zweite Zentrifugation
        1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C, um große Trümmer, abgestorbene Zellen, apoptotische Körper und große Vesikel zu pelletieren.
        2. Übertragen Sie das Supernatant vorsichtig auf neue, sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren, ohne das Pellet zu stören.
          HINWEIS: Die zweite Zentrifugation ist optional und sollte berücksichtigt werden, wenn zusätzliche Müllentfernung erforderlich ist. Führen Sie diesen Schritt aus, wenn der Überstandsstoff nach der ersten Zentrifugation sichtbar trüb erscheint oder Restpartikel enthält. Dieser Schritt wird auch empfohlen, wenn vorherige Präparate eine Kontamination durch intrazelluläre Marker (z. B. Calnexin oder BiP) in EV-angereicherten SEC-Fraktionen oder das Vorhandensein nichtvesikulärer Partikel mittels Transmissionselektronenmikroskopie gezeigt haben. Der Bedarf an diesem Schritt sollte bei der initialen Protokolloptimierung für jeden Gewebetyp validiert werden.
      3. Filtration
        1. Vorfeuchte sterile 30-μm-Zellsiere, indem sie mit RPMI-1640 abgespült werden, um die Membran auszugleichen und den Probenverlust zu minimieren. Entsorgen Sie die Spülung.
        2. Filtern Sie jede Probe durch das vorbenetzte 30-μm-Zellsieb in sterile, proteinarme 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren, um verbleibende Zellreste und große Partikel vor der SEC zu entfernen.
        3. Lassen Sie die Proben durch die Schwerkraft durch den Filter gehen.
        4. Für die Filtration werden 10–15 Minuten pro Probe eingeplant.
          HINWEIS: Die Filtration ist abgeschlossen, wenn keine sichtbare Flüssigkeit mehr über der Filtermembran verbleibt und das Filtratvolumen im Sammelrohr stabilisiert ist. Ist die Filtration langsamer oder stockt, kann dies auf Verstopfungen durch Restreste hindeuten; In solchen Fällen sollten Sie in Erwägung ziehen, den Klärungsschritt zu wiederholen oder die Probenbelastung zu reduzieren.
        5. Sammeln Sie 550–600 μL gefiltertes Überlagerungsmittel zur späteren Ladung auf die SEC-Säule. Für Konsistenz über Proben hinweg normalisieren Sie das Ladevolumen auf 500 μL pro Spalte (siehe Schritt 2.2.1), unabhängig vom insgesamt gewonnenen Volumen.
  2. Größenausschlusschromatographie (SEC)
    1. Gleichgewichts-SEC-Spalte
      HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt möglichst während der Zentrifugation durch.
      1. Spülen Sie die SEC-Säule mit 17 ml 1× PBS (0,22 μm-Filterung).
      2. Lassen Sie das gesamte Volumen durch die Schwerkraft mit einer erwarteten Durchflussrate von 0,75 mL/min (insgesamt 20–25 Minuten für das 17 mL Spülvolumen) durch die Säule fließen. Schnellere oder langsamere Durchflussraten können auf eine unsachgemäße Säulenausgleichung oder Verstopfung hinweisen.
      3. Halten Sie die Säule und PBS während der Gleichgewichtsphase bei Raumtemperatur (RT, 21 °C ± 2 °C), um eine konstante Durchflussrate und optimale Säulenleistung zu gewährleisten.
      4. Bereite 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhren mit niedriger Proteinbindung für die Sammlung aller Fraktionen vor.
      5. Bereiten Sie bei Bedarf ein zusätzliches Rohr zur Aufnahme des Hohlraumvolumens vor.
    2. Probenladung und Elution
      1. Laden Sie 500 μL gefiltertes Supernatant auf die SEC-Säule.
      2. Lassen Sie die Probe vollständig in das Harz eindringen. Der Endpunkt wird erreicht, wenn der flüssige Meniskus die Oberfläche des Harzbetts erreicht, ohne dass über dem Harz sichtbare Flüssigkeit verbleibt, während das Harz sichtbar feucht bleibt.
      3. Lassen Sie nicht zu, dass der Meniskus unter die Harzoberfläche fällt oder die Säule austrocknet, da dies Luft in das Harzbett einführt und die Eluation stört. Wenn der flüssige Meniskus die Harzoberfläche erreicht (wie in Schritt 2.2.2 definiert), fahren Sie sofort mit Schritt 2.2.4 fort.
      4. Fügen Sie sofort 2 ml PBS hinzu, um die Elution einzuleiten.
      5. Sammeln Sie das Vakuumvolumen (~2,5 mL).
      6. Entsorge das leere Volumen oder behalte es als nicht-EV-Fraktion.
      7. Beginnen Sie sofort mit dem Sammeln des EV-angereicherten Anteils, nachdem das 2,5-ml-Hohlraumvolumen eluiert ist.
      8. Sammeln Sie insgesamt 1,6 ml EV-angereichertes Eluat nach dem Hohlraumvolumen, entweder als einzelne kontinuierliche Fraktion in einem Rohr oder als sequentielle Fraktionen, die anschließend zusammengelegt werden.
      9. Alternativ werden sequentielle Fraktionen von 0,4 mL gesammelt, um Reinheit im Vergleich zum Ertrag zu optimieren. Kleinere Volumina werden empfohlen, wenn eine höhere Reinheit erforderlich ist (z. B. bei proteomischen Analysen oder sensiblen nachgelagerten Anwendungen), während größere Teile verwendet werden können, um die Gesamtausbeute des EV zu maximieren.
      10. Bewerten Sie Fraktionen für EV-Anreicherung mit Charakterisierungsmethoden (z. B. Western Blot für EV-Marker und -Schadstoffe sowie NTA) und sammeln Sie EV-angereicherte Fraktionen wie im Charakterisierungsabschnitt definiert.
        HINWEIS: Halten Sie die Spalte kontinuierlich am Laufen. Während eine Fraktion fertig wird, fügen Sie PBS hinzu, um eine konstante Flüssigkeit über dem Harzbett zu halten und zu verhindern, dass die Säule austrocknet. Verwenden Sie für die Entnahme proteinarme, nukleasefreie Röhrchen.
    3. Schwerpunkt
      1. Konzentrieren Sie EV-Proben mit Zentrifugalfiltern (100 kDa Molekulargewichts-Cutoff [MWCO]) für nachgelagerte Anwendungen (z. B. RNA-Sequenzierung, Proteomik oder Western Blot).
      2. Spülen Sie die Filter vor der Anwendung mit PBS vor.
      3. Zentrifugiere die Proben bei 4.000 × g bei 4°C und prüfe alle 2–3 Minuten, bis das gewünschte Endvolumen (typischerweise 50–100 μL) erreicht ist. Verwenden Sie niedrigere Endvolumina (z. B. ~50 μL) für Anwendungen mit höherer Konzentration und höheren Volumina (z. B. ~100 μL), bei denen die maximale Rückgewinnung bevorzugt wird.
        VORSICHT: Vermeiden Sie Überkonzentration, indem Sie die Zentrifugation stoppen, sobald das Zielvolumen erreicht ist.
      4. Holen Sie das Retentat durch sanftes Pipettern wieder.
      5. Erfassen Sie bei Bedarf Vor- und Nachkonzentrationsprobenvolumen, um die Rückgewinnung abzuschätzen. NTA kann zur Bestimmung der Partikelkonzentration vor und nach der Konzentration verwendet werden, sofern verfügbar.
    4. Lagerung
      1. Bewahren Sie EV-angereicherte Fraktionen auf Eis oder bei 4°C für sofortige Assays (z. B. NTA und Transmissionselektronenmikroskopie [TEM]) und verarbeiten Sie sie innerhalb von 24 Stunden für TEM und innerhalb von 48 Stunden für NTA.
      2. Aliquot EV-Proben in proteinarme Bindungsröhren zur Speicherung.
      3. Lagern Sie Proben bei −80°C für den Langzeitgebrauch.
      4. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.

2. BM-abgeleitetes sEV (BM-sEV) Isolationsprotokoll

  1. Probenentnahme und Gewebedissoziation
    1. Gewebeentnahme und -konservierung
      1. Knochen werden nicht sofort nach der Exzision mit Snap-Freeze eingesetzt, da dies das Knochenmark verhärtet und die Extraktion mit der Steckröhrenmethode erschwert. Stattdessen werden die Knochen während kurzer Handhabungsphasen vor der Verarbeitung oder dem Einfrieren wie in Schritt 3.1.1.4 beschrieben (Lagerung auf Trockeneis vor −80°C) auf Eis oder bei 4 °C aufbewahrt.
      2. Entfernen Sie umliegende Muskeln und Bindegewebe von den dissektionierten Knochen.
      3. Übertragen Sie die Knochen in Kryovialen.
      4. Legen Sie die Proben auf Trockeneis.
        HINWEIS: Lagern Sie die Proben bei −80°C bis zur weiteren Verarbeitung.
    2. BM-Verarbeitung
      HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einem Biosicherheitsschrank mit sterilen Instrumenten und Handschuhen durch, um eine Kontamination zu verhindern, die sonst die Reinheit von Elektrofahrzeugen beeinträchtigen könnte.
      1. Vorwiegen und beschriften Sie 1,5 mL Zentrifugenröhren, bevor Sie Material hinzufügen. Berechnen Sie die BM-Masse, indem Sie die Rohrgewichte vor und nach der Extraktion vergleichen.
      2. Bereiten Sie das Steckrohr-Setup vor, indem Sie ein 0,2 mL PCR-Rohr (Kappe intakt) in ein 1,5 mL Zentrifugenrohr mit fester Passform einsetzen. Durchstiche den Boden des 0,2-ml-Rohrs einmal mit einer sterilen 16-G-Nadel, die senkrecht zur Basis gehalten wird, wodurch eine einheitliche Perforation von ~1,6 mm Durchmesser entsteht. Bereite pro Bein und Maus ein Setup vor.
      3. Legen Sie das Bein, gereinigt von allen Muskeln und dem umliegenden Gewebe, in eine sterile Petrischale.
      4. Trennen Sie Oberschenkelknochen und Tibia, indem Sie durch den Gelenkraum schneiden.
      5. Schneide beide Enden des Oberschenkelknochens und des Schienbeins ab, um das rote Mark freizulegen. Setzen Sie die Knochen in das durchbohrte PCR-Rohr, das sich im 1,5-mL-Rohr befindet, und versiegeln Sie die Baugruppe mit Parafilm, um während der Zentrifugation einen sicheren Aufbau zu gewährleisten.
      6. Zentrifugieren Sie die Proben für 10 Sekunden in einer Tisch-Mikrozentrifuge bei etwa 8.000 × g, also der am nächsten erreichbaren Einstellung des verwendeten Geräts, bei Raumtemperatur.
      7. Überprüfen Sie eine erfolgreiche Knochenmarkextraktion anhand von drei Kriterien: (i) Die Knochen erscheinen sichtbar weiß ohne Restreste von rotem Mark, (ii) das Pellet im unteren Rohr erscheint dunkelrot und kompakt und füllt typischerweise die konische Spitze des 1,5-mL-Rohrs, und (iii) die gemessene Knochenmarkmasse (Schritt 3.1.2.9) liegt im erwarteten Bereich von ~15–30 mg pro Maus.
      8. Die Knochen neu positionieren oder neu schneiden und den kurzen Dreh wiederholen, wenn sichtbares rotes Mark im Knochen verbleibt.
      9. Wiegen Sie die Röhrchen erneut, um die Masse des entnommenen Knochens zu bestimmen (typischerweise ~15–30 mg pro Probe, abhängig von Mausalter, Geschlecht und Extraktionseffizienz).
        HINWEIS: Das Protokoll wird auf Markerträge von ~15–30 mg pro Probe validiert. Da das RPMI-1640-Resuspensionsvolumen unabhängig von der Markmasse konstant bei 250 μL gehalten wird (Schritt 3.1.2.10), wird die EV-Ausbeute während der nachgelagerten Analyse (Partikel·mL−1·mg−1 Gewebe) auf die gemessene Ausgangsmarkmasse normalisiert. Bei Proben, die deutlich unter 15 mg liegen, wird vor der Resuspension das Mark von abgestimmten Mäusen (gleiches Alter, Geschlecht und Knochen) gepoolt, um ausreichend Input für die nachgelagerte Charakterisierung zu erhalten. Bei Proben, die deutlich über 30 mg liegen, wird entweder das Knochenmark auf zwei separate Resuspensionen mit jeweils 250 μL aufgeteilt oder das RPMI-1640-Volumen proportional (~12,5 μL pro mg Mark) skaliert, um eine unvollständige Resuspension zu verhindern; In beiden Fällen wird während der Analyse dieselbe pro-Massen-Normalisierung angewendet.
      10. Fügen Sie jedem Rohr 250 μL RPMI-1640 hinzu. Halten Sie ein konstantes Volumen über die Proben hinweg, unabhängig von der Markmasse, um die Normalisierung des EV-Ertrags auf die Ausgangsmarkmasse zu ermöglichen. Lass die Proben auf Eis.
      11. Setzen Sie das Mark wieder auf, indem Sie vorsichtig 10–15 Mal mit einer P1000-Pipette auf und ab pipettieren, bis die Suspension visuell homogen erscheint, ohne sichtbare Klumpen oder intakte Gewebefragmente übrig zu bleiben. Vermeiden Sie ein kraftvolles Pipettern oder Blasenbildung, da dies die Integrität der Vesikel beeinträchtigen kann.
  2. Entfernung von Trümmern
    1. Erste Zentrifugation
      1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um unverdautes Material, intakte Zellen und verbleibende Gewebefragmente zu pelletieren.
      2. Übertragen Sie das Supernatant vorsichtig auf neue, sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren, ohne das Pellet zu stören.
    2. Zweite Zentrifugation
      1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C, um große Trümmer zu entfernen.
      2. Übertragen Sie das Supernatant vorsichtig auf neue, sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren, ohne das Pellet zu stören.
    3. Dritte Zentrifugation
      1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 × g für 30 Minuten bei 4 °C, um apoptotische Körper und große Vesikel zu entfernen.
      2. Übertragen Sie das Supernatant vorsichtig auf neue, sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren, ohne das Pellet zu stören.
      3. Stellen Sie sicher, dass ein Endvolumen von 200 μL Supernatant erreicht wird.
  3. Größenausschlusschromatographie (SEC)
    1. Säulenvorbereitung
      1. Gleiche die SEC-Säule aus, indem du mit 6 mL 1× PBS (0,22 μm gefiltert) spülst.
        HINWEIS: Das Gleichgewichtsvolumen ist spaltenspezifisch und sollte dem in der Materialtabelle aufgeführten Spaltentyp entsprechen. Diese Spalte benötigt ein Gleichgewichtsvolumen von 6 mL, was sich von der für SkM-Proben verwendeten Spalte unterscheidet.
      2. Lass das gesamte Volumen durch die Schwerkraft durchströmen.
      3. Halten Sie die Säule und das PBS während der Gleichgewichtsphase auf RT, um eine optimale Durchflussrate und Säulenleistung zu gewährleisten.
    2. Probenladung und Elution
      1. Laden Sie 150 μL gefiltertes Supernatant auf die SEC-Säule.
      2. Lassen Sie die Probe vollständig in das Harz eindringen. Der Endpunkt wird erreicht, wenn der flüssige Meniskus die Oberfläche des Harzbetts erreicht, ohne dass über dem Harz sichtbare Flüssigkeit verbleibt, während das Harz feucht bleibt (wie in Schritt 2.2.2 beschrieben).
      3. Lassen Sie den Meniskus nicht unter die Harzoberfläche fallen oder die Säule austrocknen (siehe Endpunkt definiert in Schritt 3.3.2.2), da dies Luft in das Harzbett einführt und die Eluation stört. Wenn der flüssige Meniskus die Harzoberfläche erreicht, gehen Sie sofort zu Schritt 3.3.2.4 über.
      4. Fügen Sie sofort 550 μL PBS hinzu, um die Elution einzuleiten.
      5. Sammeln Sie das Hohlraumvolumen (700 μL).
      6. Entsorge das leere Volumen oder behalte es als nicht-EV-Fraktion.
      7. Beginnen Sie sofort mit dem Sammeln des EV-angereicherten Anteils, nachdem das 700 μL Hohlraumvolumen eluiert wurde.
      8. Sammeln Sie 850 μL EV-angereichertes Eluat nach dem 700 μL Hohlraumvolumen.
      9. Alternativ können sequentielle Fraktionen von etwa 170 μL aufgenommen werden, um Reinheit gegenüber Ertrag zu optimieren.
        HINWEIS: Kleinere Volumina werden empfohlen, wenn eine höhere Reinheit erforderlich ist (z. B. für proteomische Analysen oder empfindliche nachgelagerte Anwendungen), während größere Mengen verwendet werden können, um den Gesamt-EV-Ertrag zu maximieren.
      10. Bewerten Sie die Fraktionen für EV-Markierungen und sammeln Sie bei Bedarf EV-angereicherte Fraktionen.
        HINWEIS: Halten Sie die Spalte kontinuierlich am Laufen. Während eine Fraktion fertig wird, fügen Sie PBS hinzu, um eine konstante Flüssigkeit über dem Harzbett zu halten und zu verhindern, dass die Säule austrocknet.

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Ergebnisse

Um die Wirksamkeit dieses Protokolls zur Isolierung gewebeabgeleiteter sEVs zu bewerten, werden repräsentative Ergebnisse aus SkM- und BM-Proben präsentiert. Die erfolgreiche Isolierung wurde definiert durch (i) die Anreicherung kanonischer EV-Marker (TSG101, CD63, CD81 und CD9) in frühen SEC-Fraktionen, (ii) minimale Detektion intrazellulärer Schadstoffe (z. B. Calnexin und BiP), (iii) eine unimodale Partikelgrößenverteilung mit der Mehrheit der Partikel <200 nm, (iv) die Visualisierung...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen robusten und reproduzierbaren Ansatz zur Isolierung von sEV-angereicherten Präparaten direkt aus SkM und BM, zwei Geweben mit geringer Ertragsgelenk und stark heterogene Gewebe. Während EV-Isolierung für Biofluide und Zellkultursysteme gut etabliert ist, bleiben standardisierte Methoden für gewebebasierte EVs aufgrund von Herausforderungen im Zusammenhang mit Gewebedissoziation, Kontamination durch intrazelluläres Material und Variabilität im Ertrag begr...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Jennie Yang, Dariusz Żurawek und Volodymyr Yerko für die technische Unterstützung und hilfreichen Diskussionen. Wir sind der Center for Applied Nanomedicine-Plattform, insbesondere Nadim Tawil und Laura Montermini, dankbar für die Unterstützung bei der Charakterisierung und Datenerfassung von extrazellulären Vesikeln. Wir danken auch dem Personal der Tierklinik, Guylaine Gadoury und Tara Thomson, für ihre Unterstützung beim Umgang mit Mäusen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL ZentrifugenrohrSarstedt72.690.300Allgemeines Mikrozentrifugenrohr, das im gesamten Protokoll verwendet wird
1,5 mL Röhrchen mit geringer ProteinbindungSarstedt72.706.600Verwendet für die Handhabung von EV, die Sammlung von SEC-Fraktionen und die Lagerung
0,2 mL PCR-RöhrchenFisher Scientific14-222-262Verwendet für die Einrichtung der Knochenmarkextraktion mit dem angestochenen Röhrchen
16 G NadelBD305197Verwendet zum Durchstechen des 0,2 mL PCR-Röhrchens
30 µm ZellsiebMiltenyi Biotec 130-098-458Verwendet für die Filtration von Skelettmuskelproben
70% EthanolSigma-Aldrich1.11727Verwendet zur Sterilisation von Pinzetten
BiosicherheitsschrankN.A.N.A.Verwendet für die sterile Handhabung von Gewebe
KnochenschneidinstrumentFisher Scientific10-001-976Verwendet zum Trennen von Femur und Tibia und zur Freilegung des Knochenmarks
Bovines Serumalbumin (BSA)BioShopALB001Verwendet für Western Blot Blocking und Antikörperverdünnung
Calciumchloriddihydrat (CaCl2·2H2O)BioShopCCL302Verwendet für die Zubereitung des HEPES-Puffers
Kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter, 200-MeshSigma-Aldrich930342Verwendet für die TEM-Stichprobenvorbereitung
Zentrifugales Filter, 100 kDa MWCOMilliporeSigmaUFC810096Verwendet für die EV-Konzentration
Collagenase DRoche11088858001Verwendet für die enzymatische Verdauung von Skelettmuskel
CryovialSarstedt72.690.300Verwendet zur Lagerung von Gewebe und Knochen
Deionisiertes Wasser (ultrarein)N.A.N.A.Verwendet für die Pufferzubereitung und TEM-Waschschritte
DNase IRoche11284932001Verwendet für die enzymatische Verdauung von Skelettmuskel
TrockeneisN.A.N.A.Verwendet zum Abkühlen und Transport von Proben
Enhanced Chemiluminescence-SubstratBiorad1705061Verwendet für die Western Blot-Detektion
Filtereinheit, 0,22 µmSarstedt83.3941.501Verwendet zum Filtern von PBS, wo anwendbar
Pinzette / PinzetteMilliporeSigmaF3892Verwendet für die Gewebehandhabung
GlutaraldehydN.A.N.A.Verwendet für die TEM-Fixierung
GlycinN.A.N.A.Verwendet in TEM-Gitterwaschschritten
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14175-095Verwendet für die DNase I-Stammlösungszubereitung
HEPESBioShopHEP001.500Verwendet für die Zubereitung von HEPES-NaOH-Puffer
Streptavidin, konjugiert mit Horseradish-PeroxidaseThermo FisherS911Verwendet für die Western Blot-Detektion
Imagingsystem für ChemilumineszenzBiorad12003153Verwendet zum Abbilden von Western Blot-Membranen
KClBioShopPOC308Verwendet für die Zubereitung von HEPES-Puffer
Magnesiumchlorid (MgCl2)BioShopMAG510.500Verwendet für die Zubereitung von HEPES-Puffer
2-MethylbutanThermo Fisher78-78-4Verwendet für das Schnappfrieren von Skelettmuskel
MilligrammwaageMilliporeSigmaZ741359Verwendet zum Wiegen von Gewebe und Knochenmark
NaClBioShopSOD004.1Verwendet für die Zubereitung von HEPES-Puffer
Nanopartikel-Tracking-AnalyseinstrumentMalvern PanalyticalNanoSight NS300NanoSight NS300 wird für die Partikelgrößenbestimmung und Zählung verwendet
NaOHBioShopSHY500.500Verwendet zur pH-Wert-Einstellung
NitrocellulosemembranBioRad1704271Verwendet für die Western Blot Übertragung
NutatingmixerLabnet S0500Verwendet während der enzymatischen Verdauung
P1000 PipetteMilliporeSigmaFA10006M-1EAVerwendet für Gewebetransfer
Pipettenspitze, 1 mLSarstedt70.3050.275Die Spitze wird beschnitten, um die Öffnung für den Transfer von Gewebefragmenten zu vergrößern
Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)WisentINC 811.012-FLWird im gesamten Protokoll verwendet; auch verwendet für SEC-Gleichgewichtung und Elution
Phosphatase-InhibitorMilliporeSigma4906845001Verwendet für die Western Blot Lysatzubereitung
PetrischaleMilliporeSigmaCLS351146Verwendet für die Knochenmarkvorbereitung
Polyacrylamidgel, 4–20% Gradienten-Stain-FreeBioRad4561094Verwendet für die Western Blot-Trennung
Protease-InhibitorMilliporeSigma11697498001Verwendet für die Western Blot Lysatzubereitung
RPMI-1640 MediumSigma-AldrichR7388-500MLUnangereichert; kein FBS oder Antibiotika
RIPA-Puffer, 10×Merck20-188Verwendet für die Proteinextraktion für Western Blotting
Skalpell, steril, einwegUltident Paragon02-90000-10Verwendet zum Zerkleinern von Skelettmuskelgewebe
SEC-Säule, ursprünglich 70 nmIZONICO70PVerwendet für SEC von Skelettmuskel
SEC-Säule, einzel 70 nmIZONICS70PVerwendet für SEC von Knochenmark
NatriumazidSigma-AldrichS200

Referenzen

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Schlagwörter

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