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Diese Studie wurde vom Ethikausschuss des Hebei General Hospital genehmigt (Genehmigungsnummer: 2025-LW-0265). Aufgrund der retrospektiven Natur der Studie wurde nach Ablauf der Datenerhebung die ethische Genehmigung eingeholt, die vom Ausschuss für nicht-interventionelle Studien mit anonymisierten klinischen Daten genehmigt wurde. Die Verpflichtung zur schriftlichen informierten Zustimmung wurde aufgehoben.
Teilnehmerauswahl
Potenzielle Teilnehmer wurden zwischen Juli 2022 und Mai 2024 aus der Abteilung für Nephrologie am Hebei General Hospital rekrutiert. Alle Patienten wurden nach vordefinierten Ein- und Ausschlusskriterien untersucht.
Die Einschlusskriterien waren wie folgt: Diagnose der diabetischen Nephropathie (DN) im Mogensen-Stadium III23, definiert als persistierende Albuminurie mit einem Albumin-zu-Kreatinin-Urin-Verhältnis (UAlb/UCR) von 30–300 mg/g in mindestens zwei von drei Spoturinproben, die über 3–6 Monate entnommen wurden, ohne Hämaturie oder schnell nachlassende Nierenfunktion, was auf eine nicht-diabetische Nierenerkrankung hindeutet; geschätzte glomeruläre Filtrationsrate (eGFR) ≥45 mL/min/1,73 m² , berechnet mit der CKD-EPI-Gleichung; Erstdiagnose von DN ohne vorherige Vitamin-D-, Probukol- oder immunsuppressive Therapie für DN; Alter <75 Jahre; und klinisch stabiler Zustand ohne akute diabetische Komplikationen wie diabetische Ketoazidose oder hyperglykämischer hyperosmolarer Zustand oder aktive schwere Infektionen innerhalb von 4 Wochen vor der Einschreibung. Für die Aufnahme war keine Nierenbiopsie erforderlich; Patienten mit Verdacht auf nicht-diabetische Nierenerkrankung, einschließlich aktivem Urinablagerung, schnell fortschreitender Glomerulonephritis oder systemischer Autoimmunerkrankung, wurden jedoch ausgeschlossen.
Die Ausschlusskriterien umfassten schwerwiegende systemische Erkrankungen wie Malignitäten, schwere Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder Autoimmunerkrankungen; bekannte Allergie gegen Vitamin D, Probucol, Valsartan, Atorvastatin oder Insulin; Schwangerschaft oder Laktation; und die kürzliche Einnahme von Medikamenten innerhalb von 4 Wochen, die die Studienergebnisse beeinträchtigen könnten, darunter Immunsuppressiva oder Kortikosteroide.
Gruppenzuweisung
Der Screening-Arzt blieb bis zur Bestätigung der Berechtigung blind gegenüber der endgültigen Gruppenzuteilung.
Demografische und klinische Ausgangsmerkmale, darunter Alter, Geschlecht, Dauer von Diabetes und DN sowie Vorgeschichte von Bluthochdruck oder Hyperlipidämie, wurden erfasst.
Diese Studie verwendete ein retrospektives, nicht-randomisiertes kontrolliertes Design. Um Selektionsverzerrung zu minimieren und potenzielle Störfaktoren wie zeitliche Veränderungen und arztbezogene Variabilität zu adressieren, basierte die Gruppenzuweisung auf chronologischer Aufnahmereihenfolge und nicht auf der Präferenz von Arzt oder Patienten.
Patienten, die zwischen Juli 2022 und Dezember 2023 aufgenommen wurden, erhielten eine Standard-Dreifachtherapie bestehend aus Valsartan, Atorvastatin und Probucol und wurden der Kontrollgruppe zugeteilt (n = 56). Patienten, die zwischen Januar 2024 und Mai 2024 aufgenommen wurden und eine vierfache Therapie (Valsartan, Atorvastatin, Probucol und Vitamin D) erhielten, wurden der Beobachtungsgruppe zugeteilt (n = 94).
Die größere Zahl der Patienten in der Beobachtungsgruppe spiegelte eine verstärkte klinische Anwendung der ergänzenden Vitamin-D-Therapie im Studienzentrum ab Anfang 2024 wider, basierend auf neuen Erkenntnissen. Die demografischen und klinischen Merkmale der Basislinien waren zwischen den Gruppen vergleichbar (Tabelle 1; P>0,05), und während des Studienzeitraums traten keine signifikanten Veränderungen in den diagnostischen Kriterien, Labormethoden oder der Zusammensetzung des Ärzteteams auf.
Behandlungsregime und Verabreichung
Alle Teilnehmer erhielten während des 8-monatigen Studienzeitraums eine standardisierte tägliche subkutane Insulininfusion zur glykämischen Kontrolle. Die Insulindosierung wurde individuell entsprechend der täglichen Überwachung des kapillaren Blutzuckers angepasst. Die Patienten der Kontrollgruppe erhielten Valsartan (80 mg einmal täglich auf nüchternen Magen), Atorvastatin (20 mg einmal täglich) und Probucol (250 mg zweimal täglich) für 8 Monate. Die Patienten in der Beobachtungsgruppe erhielten dasselbe Valsartan-, Atorvastatin- und Probucol-Regime mit identischen Dosierungen und Zeitplänen sowie tägliche orale Vitamin-D-Supplementierung.
Die Vitamin-D-Dosierung wurde anhand der Ausgangswerte von Serum-25-Hydroxyvitamin D [25(OH)D] bestimmt, die bei der Einschreibung mittels Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) gemessen wurden. Die Vitamin-D-Ausreichendheit wurde definiert als 25(OH)D ≥30 ng/mL, eine Insuffizienz als 20 ng/mL ≤25(OH)D <30 ng/mL und ein Mangel als 25(OH)D <20 ng/mL. Patienten, die Nahrungsergänzungsmittel zur Vorbeugung von Mangel erhielten, erhielten 600–800 IU/Tag, während Patienten mit etablierter Vitamin-D-Insuffizienz oder -Mangel 2000 IU/Tag erhielten.
Sicherheitsüberwachungs- und Stoppkriterien
Um die Sicherheit der Teilnehmer während der 8-monatigen Behandlungsphase sicherzustellen, wurden die Serumwerte von Kalzium, Phosphor und Nebenschilddrüsenhormon (PTH) zu Beginn und alle 4 Wochen gemessen, um durch Vitamin-D-induzierte Hyperkalzämie und Kalzium-Phosphor-Ungleichgewicht zu überwachen. Ein 12-Ableger-Elektrokardiogramm (EKG) wurde zu Baseline und nach 8 Monaten durchgeführt, um die QTc-Intervallverlängerung im Zusammenhang mit Probukol zu beurteilen. Bei Patienten mit Ausgangs-QTc ≥450 ms bei Männern oder ≥460 ms bei Frauen wurde das EKG im ersten Monat wiederholt.
Nierenfunktionsparameter, einschließlich Serumkreatinin und eGFR, zusammen mit Serumelektrolyten, wurden im ersten Monat und danach alle zwei Wochen überwacht. Die Teilnehmer wurden angewiesen, neue Symptome sofort zu melden. Die Kriterien für Behandlungsabbruch umfassten korrigiertes Serumcalcium >10,5 mg/dL (2,62 mmol/L), bestätigt durch wiederholte Tests innerhalb von 48 Stunden; QTc-Intervall >500 ms oder mehr >60 ms vom Ausgangsstand bei zwei aufeinanderfolgenden EKG; Verdopplung des Serumkreatinins gegenüber dem Ausgangspunkt oder Entwicklung einer akuten Nierenschädigung gemäß den Kriterien Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO); und jedes unerwünschte Ereignis der Stufe ≥3 gemäß den Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE), das möglich, wahrscheinlich oder definitiv mit Vitamin D oder Probucol in Zusammenhang steht. Schwere unerwünschte Ereignisse wurden innerhalb von 24 Stunden dem Ethikausschuss des Krankenhauses gemeldet.
Biologische Probenentnahme und -verarbeitung
Vor Behandlungsbeginn und nach Abschluss der 8-monatigen Behandlungsphase wurden Blut- und Urinproben entnommen. Alle Proben wurden morgens nach einem nächtlichen Fasten von 8–12 Stunden entnommen. Etwa 20 ml venöses Blut wurden mit Standard-Phlebotomie-Techniken in Serumseparator- und EDTA-Röhren entnommen. Die Blutproben durften 30 Minuten bei Raumtemperatur gerinnen und wurden bei 1000 × g 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Klare Serumsupernatanten wurden sorgfältig aspiriert, ohne das Gerinnsel oder die Buffy-Schicht zu stören, in Kryoviale für verschiedene Tests eingeschleust, mit Teilnehmer-ID, Datum und Probentyp beschriftet und bis zur Analyse bei −80 °C gelagert. Serumproben konnten bis zu 12 Monate bei −80 °C gelagert werden.
Für die 24-stündige Harnproteinausscheidung (24 h UPE) entsorgten die Teilnehmer die erste Morgenurinprobe um 7:00 Uhr am ersten Tag und sammelten anschließend den gesamten Urin, einschließlich der ersten Urinprobe um 7:00 Uhr am zweiten Tag, in einen bereitgestellten Sammelbehälter. Die Teilnehmer wurden angewiesen, den Sammelbehälter während der Sammelphase zu kühlen. Das gesamte Urinvolumen wurde erfasst, gründlich vermischt und für die Laboranalyse freigegeben. Die Proben wurden bei einer Analyse innerhalb von 24 Stunden bei 4 °C oder bei −20 °C für spätere Analysen gelagert.
Für das Urinalbumin-zu-Kreatinin-Verhältnis (UAlb/UCR) wurden die Urinproben des ersten Morgens in sterilen Behältern in sterilen Behältern entnommen und ähnlich verarbeitet. Die gleichen Verfahren wurden nach Abschluss der achtmonatigen Behandlung wiederholt.
Biochemische und klinische Parameteranalyse
Gefrorene Serumproben wurden vor der Serumkreatininanalyse (SCr) auf Eis oder bei 4 °C aufgetaut. SCr wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mittels eines enzymatischen kolorimetrischen Tests auf einem automatisierten biochemischen Analysator gemessen. Die tägliche Kalibrierung wurde mit Mehrstufigkeitskalibratoren durchgeführt, und in jeder Charge wurden zwei Schichten kommerzieller Qualitätskontrollmaterialien enthalten. Die Proben wurden doppelt analysiert, und Tests mit einem Variationskoeffizienten von >5 % wurden wiederholt. Die untere Detektionsgrenze für SCr betrug 2,0 μmol/L.
Die Proteinkonzentration in 24-Stunden-Urin-Aliquots wurde mit der Pyrogallol-Rot-Molybdat-Methode gemessen. Die Proben wurden doppelt analysiert, und Qualitätskontrollmaterialien wurden bei jedem Durchlauf einbezogen. Proben oberhalb des Kalibrierungsbereichs (>3,0 g/L) wurden mit normaler Kochsalzlösung verdünnt und neu bewertet. Die 24-stündige UPE wurde anhand der Proteinkonzentration im Urin und des gesamten Urinvolumens berechnet.
Die Konzentrationen von Urinalbumin und Kreatinin in den Urinproben am ersten Morgen wurden mit dem biochemischen Analysator gemessen, und das UAlb/UCR-Verhältnis wurde anschließend berechnet.
Nüchternplasmaglukose (FPG) und 2-stündige postprandiale Glukose (2h-PPG) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem validierten Blutzuckermessgerät und kapillaren Fingerstichblutproben gemessen.
Glykiertes Hämoglobin (HbA1c) wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit einem eigenen HbA1c-Analysesystem analysiert. Die Teilnehmer wurden angewiesen, 7 Tage lang fettabsenkende Medikamente und 24 Stunden lang fettreiche Mahlzeiten oder Alkohol zu vermeiden, bevor nach der Behandlung Blut entnommen wurde. Serumtotalcholesterin (TC), Triglyzeride (TG), hochdichtes Lipoproteincholesterin (HDL-C) und niedrigdichtes Lipoproteincholesterin (LDL-C) wurden mittels enzymatischer Tests gemessen. Täglich wurden zweistufige Qualitätskontrollmaterialien analysiert. Die Lipidparameter wurden zunächst in Singulicate gemessen, und Proben mit einem Variationskoeffizienten von >10 % wurden doppelt neu bewertet. Die Detektionsgrenzen betrugen 0,1 mmol/L für TC, 0,05 mmol/L für TG, 0,08 mmol/L für HDL-C und 0,10 mmol/L für LDL-C. LDL-C-Werte wurden durch einen direkten Test oder durch die Friedewald-Gleichung bestimmt, wenn die Triglyzeridwerte <400 mg/dL betrugen.
Analyse der Immunfunktion und der Entzündungsmarker
Die Serum-Immunglobulin-G-(IgG)-Konzentrationen wurden mit einem kommerziellen humanen IgG-ELISA-Kit gemessen. Der Nachweisbereich des Tests betrug 1,37–1000 ng/mL, die Empfindlichkeit 0,52 ng/mL, der Intraassay-Variationskoeffizient <6 % und der Variationskoeffizient zwischen dem Assay <9 %. Alle Proben wurden doppelt analysiert, und hochwertige und minderwertige Kontrollmaterialien wurden auf jeder Platte mitgeliefert. Platten mit QC-Werten außerhalb von 2 Standardabweichungen von Zielwerten wurden abgelehnt und wiederholt. Proben oberhalb des oberen Standardlimits wurden 1:2 verdünnt und neu bewertet.
Alle Reagenzien und Serumproben wurden vor der Analyse auf Raumtemperatur ausgeglibt. Serumproben wurden gemäß den Kit-Anweisungen verdünnt, typischerweise bei einer Verdünnung von 1:100.000. Standards, verdünnte Proben und Rohlinge (100 μL) wurden zu geeigneten Brunnen vorbeschichteter Mikroplatten hinzugefügt und bei 37 °C 90 Minuten inkubiert. Die Brunnen wurden dreimal vor der Inkubation mit biotinyliertem Detektionsantikörper für 60 Minuten bei 37 °C gewaschen. Nach weiterem Waschen wurde Meerrettichperoxidase-Konjugat hinzugefügt und 30 Minuten im Dunkeln inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Substratlösung hinzugefügt und die Mischung 15 Minuten im Dunkeln inkubiert, bevor die Stopplösung hinzugefügt wurde. Die optische Dichte wurde bei 450 nm gemessen, mit Referenzwellenlängen von 570 nm oder 630 nm. Standardkurven wurden erstellt, um IgG-Konzentrationen zu berechnen.
Die Lymphozyten-Subsets wurden mittels Durchflusszytometrie auf einem BD FACSCanto II mit 488 nm und 640 nm Lasern analysiert. Die Vorwärtsstreuspannung wurde auf 300 V eingestellt, die Seitenstreuung auf 350 V, und die Photomultiplierrohrspannungen für FITC-, APC- und PE-Kanäle auf 400 V, 550 V bzw. 480 V. Doublets wurden unter Verwendung von FSC-A versus FSC-H Gating ausgeschlossen.
Die Viability-Färbung wurde mit 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) durchgeführt, und es wurden nur 7-AAD-negative Ereignisse analysiert. Vollblutproben wurden in ungefärbte, isotypkontrollierte und Reagenzgläser verteilt. Antihumane Antikörper CD3-FITC, CD4-APC und CD8-PE wurden Reagenzgläsern zugesetzt, während passende Isotyp-Kontrollantikörper in Kontrollröhrchen eingesetzt wurden. Die Proben wurden 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vergütungskontrollen wurden mit BD CompBeads vorbereitet, und die automatische Vergütung erfolgte in der FACSDiva-Software. Rote Blutkörperchen wurden mit einem RBC-Lysepuffer lysiert, dann gewaschen und in einem Färbepuffer mit 7-AAD wieder suspendiert.
Zur täglichen Zytometer-Einrichtung und Tracking-Perlen wurden zur Qualitätskontrolle verwendet. Die Gating-Hierarchie umfasste den Ausschluss von Doublets, die Auswahl von Lymphozyten, das Viability Gating (Viability Gating), das CD3+-Gating und die Identifikation der CD4/CD8-Teilmenge. Mindestens 50.000 lebende Lymphozyten-Ereignisse wurden pro Probe aufgenommen, wobei die Gesamtzahl der Ereignisse zwischen 100.000 und 150.000 lag. Die Daten wurden mit der FlowJo-Software analysiert, und Prozentsätze der CD3+-, CD4+- und CD8+-Zellen sowie CD4+/CD8+-Verhältnisse wurden berechnet.
Die Serumkonzentrationen von hs-CRP, IL-6, TNF-α und MCP-1 wurden mit kommerziellen ELISA-Kits gemessen. Detektionsbereiche und Empfindlichkeiten waren wie folgt: hs-CRP (0,07–12,5 ng/mL; Empfindlichkeit 0,022 ng/mL), IL-6 (0,7–300 pg/mL; Empfindlichkeit 0,35 pg/mL), TNF-α (1,6–100 pg/mL; Empfindlichkeit 0,8 pg/mL) und MCP-1 (5–1000 pg/mL; Empfindlichkeit 2,5 pg/mL). Alle Tests wurden doppelt durchgeführt. Auf jeder Platte waren minderwertige und hochwertige Kontrollmaterialien enthalten. Die Intraassay-Variationskoeffizienten betrugen <8 %, die Interassay-Variationskoeffizienten <10 %. Werte unterhalb der Detektionsgrenzwerte wurden als halb des unteren Quantifizierungslimits erfasst, während Werte oberhalb des höchsten Standards verdünnt und neu bewertet wurden. Die Proben durchliefen vor der Analyse nur einen Gefroren-Tau-Zyklus. Zytokin-ELISA-Verfahren folgten Protokollen, die identisch mit denen für IgG ELISA beschrieben sind, gemäß den Herstelleranweisungen bezüglich Verdünnungsfaktoren, Inkubationsbedingungen und Temperaturen.
Klinische Outcome-Bewertung und Datenmanagement
Am Ende der achtmonatigen Behandlungsphase bewerteten behandelnde Ärzte, die für die Gruppenzuweisung blind waren, den klinischen Status der Teilnehmer. Patienten wurden als entlassen klassifiziert, wenn alle vordefinierten klinischen Verbesserungskriterien für diabetische Nephropathie mindestens zwei aufeinanderfolgende Wochen erfüllt waren: ≥30 % Reduktion der 24-stündlichen UPE im Vergleich zum Ausgangswert, Stabilisierung oder Verbesserung des eGFR, definiert als Rückgang <5 mL/min/1,73 m² gegenüber dem Ausgangsstand, und Ausbleiben akuter diabetischer Komplikationen oder anderer Erkrankungen, die eine weitere stationäre Versorgung erfordern. Teilnehmer, die nicht alle Kriterien erfüllten, wurden als nicht entlassen eingestuft. Anschließend wurden für jede Gruppe klinische Ansprechraten berechnet.
Alle gesammelten demographischen, laborbezogenen und klinischen Daten wurden in eine elektronische Datenbank eingegeben, indem zwei unabhängige Forscher doppelt eingegeben wurden. Reichweitenprüfungen und Konsistenzprüfungen wurden durchgeführt, um die Datengenauigkeit sicherzustellen. Primäre Endpunkte umfassten Veränderungen von Ausgangspunkt bis 8 Monate bei den Nierenfunktionsparametern, einschließlich 24 Stunden UPE und UAlb/UCR, sowie Immunfunktionsparametern, einschließlich CD3+ T-Zellanteil und CD4+/CD8+-Verhältnis. Sekundäre Endpunkte umfassten Veränderungen vom Ausgangspunkt bis 8 Monate der glykämischen Parameter (FPG, 2h-PPG, HbA1c), des Lipidprofils (TC, TG, LDL-C, HDL-C), entzündlichen Markern (hs-CRP, IL-6, TNF-α, MCP-1) und der klinischen Ansprechrate. Alle Ergebnismaße wurden zu Beginn innerhalb von 48 Stunden vor Behandlungsbeginn und nach der Behandlung innerhalb einer Woche nach Abschluss der 8-monatigen Behandlungsphase bewertet.
Statistische Analyse
Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS-Software durchgeführt. Kontinuierliche Variablen mit Normalverteilung wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben, während kategoriale Variablen als Häufigkeit und Prozentsatz angegeben wurden. Unabhängige Stichproben-T-Tests wurden für Gruppenvergleiche verwendet, Chi-Quadrat-Tests für kategorische Variablen. Die statistische Signifikanz wurde als P<0,05 definiert. Angesichts des explorativen Charakters der Studie und der großen Anzahl bewerteter Ergebnisse wurden sekundäre Endpunkte nicht auf Multiplizität angepasst. Daher galten P-Werte als beschreibend und nicht als bestätigend. Aufgrund des retrospektiven, nicht-randomisierten Studiendesigns waren alle Vergleiche zwischen Kontroll- und Beobachtungsgruppen nicht auf potenzielle Störer angepasst, und Rest-Störungen könnten bestehen geblieben sein. Alle 150 eingeschriebenen Patienten (56 in der Kontrollgruppe und 94 in der Beobachtungsgruppe) absolvierten die gesamte 8-monatige Behandlung und Nachsorge. Keine Patienten gingen bei der Nachsorge verloren, wurden nach der Einschreibung zurückgezogen oder ausgeschlossen. Es wurden keine fehlenden Daten für Ausgangsmerkmale oder Ergebnismaße festgestellt, einschließlich Nierenfunktion, Glukose- und Lipidprofil, Immunmarkern und entzündlichen Faktoren. Daher waren keine Imputationsverfahren erforderlich.