Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Isolierung und Kultur mikrovaskulärer Endothelzellen im Maushirn

140 Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/70909

⸱

17. Juli 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Vascular Physiology Laboratory, 2Biomedical Sciences Doctorate Program, Universidad de Talca, 3Faculty of Health Sciences, University of Talca, 4Group of Research and Innovation in Vascular Health, GRIVAS Health, 5Consortium for Research and Innovation Neurovascular (NEUROVAS)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Protokoll wird für die Isolierung und Primärkultur von mikrovaskulären Endothelzellen (BMEC) aus neonatalem Maus-Hirngewebe vorgestellt, um ein robustes In-vitro-Modell zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schrankfunktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu erstellen.

Zusammenfassung

Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMEC) im Gehirn sind die Hauptzelle der Blut-Hirn-Schranke (BBB) und spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung des molekularen Transports und der Aufrechterhaltung der Homöostase des zentralen Nervensystems. Zuverlässige In-vitro-Modelle des Gehirnendothels sind unerlässlich, um die Physiologie und Dysfunktion der BBB bei neurologischen und systemischen Erkrankungen zu untersuchen. Ein reproduzierbares Protokoll zur Isolierung und Primärkultur von BMECs aus dem neonatalen murinen Großhirnrinden wird beschrieben. Die Methode umfasst die Teilung des kortikalen Gewebes, mechanische und enzymatische Dissoziation, die Entfernung von Myelinreste mittels eines Rinderserum-Albumin-(BSA)-Dichtegradienten sowie die Anreicherung der Endothelzellen mittels CD31-basierter Immunselektion. Isolierte Zellen werden anschließend auf kollagenbeschichteten Platten kultiviert und durch morphologische Bewertung, Immunfluoreszenz-Detektion von Endothelmarkern, Angiogenes Röhrenbildungstests und transendotheliale elektrische Widerstandsmessungen (TEER) zur Bewertung der Barriereeigenschaften charakterisiert. Dieses Protokoll bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Gewinnung primärer BMEC-Kulturen, die zur Untersuchung der BBB-Biologie, der endothelialen Signalübertragung und neurovaskulärer Interaktionen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen geeignet sind.

Einleitung

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ist eine hochspezialisierte Struktur, die den Austausch von Substanzen zwischen dem zentralen Nervensystem (ZNS) und dem systemischenKreislauf streng reguliert. Das BBB wird hauptsächlich durch mikrovaskuläre Endothelzellen im Gehirn gebildet, die durch enge Verbindungen verbunden sind. Diese Endothelzellen arbeiten in einem mehrzelligen System, das als neurovaskuläre Einheit (NVU) bekannt ist und zu dem auch Astrozyten, Perizyten, Neuronen, Gliazellen und die Basalmembran2 gehören. Unter diesen Komponenten spielen mikrovaskuläre Endothelzellen (BMECs) im Gehirn eine zentrale Rolle, indem sie eine kontinuierliche Schicht mit engen Verbindungen bilden, tausende selektive Transportersysteme, begrenzten vesikularen Transport und durch geringe Expression von Adhäsionsmolekülen, die den Durchgang von gelösten Stoffen und Zellen in das Hirnparenchym 3,4 einschränken.

Neben ihrer Rolle als physische und selektive Barriere sind BMECs aktiv an wesentlichen Prozessen beteiligt, darunter neurovaskuläre Signalübertragung, Regulierung des Gehirnblutflusses, lokale Immunantworten und insbesondere die zerebrale Angiogenese5. Letzterer Prozess ist während der embryonalen Entwicklung entscheidend, wird aber auch bei pathologischen Erkrankungen wie Schlaganfall, Ischämie oder Entzündung reaktiviert. BMECs reagieren auf proangiogene Signale wie den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und den Plazentawachstumsfaktor (PLGF) und koordinieren die Bildung und Reifung neuer Gefäße 6,7. Daher würde eine endotheliale Dysfunktion des Gehirns die Integrität des BBB und der Homöostase des Gehirns stark beeinträchtigen.

Die Untersuchung von BMECs in vitro ermöglicht es uns, sowohl die Physiologie des BBB als auch die Mechanismen, die die Gehirnangiogenese regulieren, zu modellieren. Die Isolierung dieser Zellen aus dem Hirngewebe stellt jedoch erhebliche technische Herausforderungen dar, da das neuronale Gewebe komplex ist, Myelin häufig vorhanden ist und Kulturen mit hoher Endothelreinheit erhalten werden müssen. Obwohl unsterbliche Zelllinien verfügbar sind, haben sie erhebliche Einschränkungen hinsichtlich ihrer phänotypischen und funktionellen Repräsentativität8.

In diesem Zusammenhang stellen die Protokolle für die Primärkultur von BMECs aus neonatalen Mausmodellen ein mächtiges experimentelles Werkzeug dar, da sie viele morphologische, molekulare und funktionelle Eigenschaften des Gehirnendothels in vivo bewahren. Mehrere etablierte Protokolle zur Isolierung von BMEC der Maus basieren jedoch auf mechanischer Dissoziation in Kombination mit Dichtegradienten (Dextran oder Percoll), was oft zu variabler Endothelanreicherung und Restkontamination durch Perizyten, Astrozyten und Myelinreste9 führt. Die antibiotikabasierte Reinigung mit Puromycin verbessert die Reinheit des Endothels (bis zu ~95 %), kann aber aufgrund der Hemmung der Proteinsynthese und möglichen Auswirkungen auf den endothelialen Phänotyp10 Zellstress verursachen. Alternativ bieten fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsmethoden (FACS) hochgereinigte Populationen, erfordern jedoch spezialisierte Geräte und umfangreiche Verarbeitung, was die Lebensfähigkeit und Skalierbarkeitverringern kann 11. Neuere neonatale Protokolle vermeiden Dichtegradienten und reduzieren die Anzahl der Zentrifugationsschritte, wodurch der Ertrag verbessert und die Kontaminationbegrenzt wird.

Aufbauend auf diesem Hintergrund beschreibt diese Arbeit ein optimiertes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus neonatalen Maus-Mikrovaskulaturen. Diese Methode kombiniert präzise anatomische Dissektion, effiziente enzymatische Verdauung, Myelinentfernung mittels eines Bovinen Serum-Albumin-(BSA)-Gradienten und Anreicherung durch Immunselektion mit magnetischen Mikrosphären, die mit dem CD31-Marker konjugiert sind. Das Protokoll ermöglicht die Gewinnung lebensfähiger, reproduzierbarer und angereicherter Primärkulturen, die sich für Studien zur zerebralen Angiogenese, neurovaskulärer Interaktion, endothelialer Signalübertragung und BBB-Dysfunktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen eignen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Das Bioethik- und Biosicherheitskomitee der Universität Bío-Bío genehmigte dieses Projekt (Fondecyt-Förderung 1240925). Die Arbeit mit Tieren wurde gemäß den grundlegenden Prinzipien der drei R bei der Verwendung von Versuchstierendurchgeführt 13 und gemäß den Empfehlungen der Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren, die von den National Institutes of Health derVereinigten Staaten veröffentlicht wurden. Die Tiere wurden in geeigneten Umgebungen im Bioterium der Universität Bío-Bío unter standardisierten Unterbringungsbedingungen gehalten (12 Stunden Hell/Dunkel-Zyklus, kontrollierte Temperatur von 22 ± 2 °C, mit ad libitum-Zugang zu Futter und Wasser).

Um die Zellen zu gewinnen, wurden Wildtyp-(WT) trächtige Mäuse (C57BL/6) im Alter zwischen 4 und 6 Monaten eingesetzt. Nach der Geburt blieben die Welpen bis zum postnatalen Tag 5 (P5) bei der Mutter. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Nachkommen tief mit Isofluran betäubt, bis die Reflexe vor der Euthanasie verloren gingen. Unterkühlung wurde ausschließlich als Ergänzung zur Minimierung der Bewegung eingesetzt und wurde sofort von einer Enthauptung gefolgt. Alle Eingriffe wurden gemäß den Richtlinien der American Veterinary Medical Association (AVMA) für die Euthanasie von Tieren (2020)15 und internationalen Vorschriften zur Pflege und Nutzung von Labortieren (NIH)14 durchgeführt. Der Großhirnrinde wurde isoliert und zur Entwicklung dieses experimentellen Protokolls verwendet (siehe Protokollschritt 3). Die Materialtabelle listet die in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Antikörper auf.

1. Vorbereitung des Endothelkulturmediums

  1. Um 500 ml Kulturmedium für endotheliale Zellen der Maushirn in einem sterilen Behälter herzustellen, mischen Sie 250 ml DMEM ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS), 250 ml Endothelzellkulturmedium ergänzt mit 10 % FBS.
    HINWEIS: Das Kulturmedium liefert wichtige endotheliale Wachstumsfaktoren und unterstützt die Zellproliferation. Wenn das referenzierte Produkt (siehe Materialtabelle) nicht verfügbar ist, können gleichwertige Endothelzellpräparate (z. B. EKG, Hydrocortison und L-Glutamin) zu DMEM + FBS hinzugefügt werden, um ähnliche Wachstumsbedingungen16 zu erreichen.
  2. Steril filtern Sie das gesamte Medium (10 % FBS) durch einen 0,22-μm-Filter, um die Sterilität zu gewährleisten.
  3. Lagern Sie das zubereitete Medium bis zur Verwendung bei 4 °C. Bereiten Sie alle 2–4 Wochen frisches Medium vor, um die Wachstumsfaktoraktivität aufrechtzuerhalten.

2. Beschichtung der Kulturplatten

HINWEIS: Um die Zelladhärenz zu fördern und den endothelialen Phänotyp aufrechtzuerhalten, müssen Kulturplatten mit Typ-I-Kollagen vorbeschichtet werden. Die Schritte zu diesem Prozess sind wie folgt:

  1. Bereiten Sie die Vorbeschichtungslösung vor, indem Sie Typ-I-Kollagen (0,1 mg/mL), M Essigsäure zur Löslichkeit des Kollagens und steriles Basalmedium mischen, um ein Gesamtvolumen von 15 ml zu erreichen. Mische vorsichtig, bis das Kollagen vollständig gelöst ist, und passe die Lösung bei Bedarf auf pH 4,0 ein. Die Lösung steril durch einen 0,22-μm-Filter filtern und bis zur Anwendung auf Eis lassen , um die Kollagenstabilität zu erhalten.
    HINWEIS: Typ-I-Kollagen ahmt die Basalmembran nach, unterstützt die Anhaftung von Endothelzellen und hilft, den Zellphänotyp aufrechtzuerhalten.
  2. Homogenisiere die Lösung unter sterilen Bedingungen. Tragen Sie die Lösung gleichmäßig auf, um die gesamte Oberfläche der Kulturplatten zu bedecken.
    HINWEIS: Es wird nur das nötige Volumen verwendet, um die Oberfläche zu bedecken.
  3. Inkubieren Sie die Platten über Nacht (12–16 H) bei 37 °C, damit das Kollagen richtig adsorbieren kann. Vor dem Aussäen der Zellen entfernen Sie überschüssige Beschichtungslösung und waschen Sie die Platten zweimal mit steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS, pH 7,4), um Restsäure und ungebundenes Kollagen zu entfernen.

3. Isolierung der Gehirn-Mischzellkultur

HINWEIS: Dieses Protokoll baut auf früheren Berichten 9,17 auf, die darauf abzielten, BMECs aus dem Großhirnrinden von P5-Mäusen zu isolieren.

  1. Opfere fünf P5-Welpen mit Tiefenanästhesie und Isofluran; Verwenden Sie Hypothermie nur als Ergänzung, gefolgt von der Halswirbelenthauptung.
    HINWEIS: Ab diesem Schritt müssen alle Verfahren in einem laminarströmenden biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden.
  2. Sammeln Sie die Gehirne (Abbildung 1A) und legen Sie sie in steriles kaltes PBS (1x) in einem 50-ml-konischen Rohr, bis alle Gehirne verarbeitet sind.
  3. Trennen Sie die Meningen, indem Sie jedes Gehirn vorsichtig auf einer sterilisierten Nitrocellulose-Membran rollen. Übertragen Sie das Gehirn auf eine 100 mm große Platte mit kaltem PBS (1x). Entfernen Sie mit einem sterilen Skalpell den Hirnstamm, das Kleinhirn, den Thalamus und die Riechbrille (Abbildung 1B,C).
  4. Sammeln Sie die resultierenden meningenfreien Großhirnkortex und lagern Sie sie in kaltem PBS (1x). Übertragen Sie sofort den gesamten Hirnrinde in ein 50 ml konisches Rohr mit 5 ml PBS 1x auf Eis (Abbildung 1D).
  5. Das Gewebe wird mechanisch mit einer sterilen Schere dissoziiert, gefolgt von einer 1-mL-Pipette, bis keine Stücke mehr sichtbar sind und die Suspension homogen ist (Abbildung 1E).
    HINWEIS: Die Pipettenspitze kann abgeschnitten werden, um die mechanische Belastung während der Trituration zu verringern. Die Gewebedissoziation erfolgt durch kontrollierte Absaugung und sanftes Pipetten, während eine breitere Spitzenöffnung Scherkräfte und mechanische Zelllyse minimiert und so die Lebensfähigkeit der Zellen bewahrt.
  6. Sammle alle Gewebe und lege sie in 15-mL-Röhren.
  7. Um das Gewebe zu verdauen, wird die Probe in ein steriles 15-ml-konisches Rohr mit 2 mL Kollagenase-Lösung (2 mg/mL in DMEM) gegeben und 2 Stunden bei 37 °C auf einem Orbitalshaker bei 180 U/min inkubiert.
  8. Nach der Verdautung geben Sie 5 ml DMEM mit 10 % FBS ergänzt zur Suspension und zentrifugieren Sie bei 3.000 × g für 10 Minuten (siehe Abbildung 1F). Entsorge das Supernatant.
  9. Um Myelin zu entfernen, wird das Pellet in 4 mL 20 % BSA in PBS (W/V) wieder suspendiert und bei 3.000 × g für 20 Minuten zentrifugiert (Abbildung 1G). Nach der Zentrifugation werden vorsichtig die obere milchige Schicht mit Myelin mit einer Pasteur-Pipette entfernt und alle verbleibenden Supernatanten entsorgt (Abbildung 1H).
  10. Die Kugel in 2 ml DMEM mit 10 % FBS wieder suspendieren und dann erneut mit 3.000 × g für 10 Minuten zentrifugieren. Entsorge das Supernatant und suspendiere das letzte Pellet dann vorsichtig in 1 mL DMEM mit 10 % FBS.
    HINWEIS: In diesem Stadium enthält die endgültige Resuspension eine heterogene Population von hirnabgeleiteten Zellen, die durch Gewebedissoziation entstehen. Diese Mischung kann mikrovaskuläre Endothelzellen, Astrozyten, Perizyten und andere neuronale Zellen im Gehirn umfassen. Weitere Reinigungs- und Kulturschritte sind erforderlich, um BMECs selektiv zu bereichern.
  11. Vor dem Anlegen der isolierten Zellen wird die Beschichtungslösung von den vorbereiteten Kulturplatten entfernt (siehe Schritt 2.3) und jeder Brunnen zweimal mit sterilem PBS (1x) abgespült.
  12. Säen Sie die resuspendierten Zellen (Schritt 3.10) auf die beschichteten Platten (empfohlen: 60 mm Schalen).
    HINWEIS: Typischerweise wird die gesamte Zellsuspension, die aus einer Isolierung gewonnen wird, in ein oder zwei beschichtete Schalen verteilt, die jeweils 5 ml Endothelwachstumsmedium enthalten.
  13. Halten Sie die Kulturen im Endothelzellmedium bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ aufrecht. Ersetzen Sie das Medium alle 2–3 Tage. Wenn Kulturen 90–100 % Konfluenz erreichen, wird mit der Immunselektion mit CD31-beschichteten Perlen zur Anreicherung der Endothelzellen fortfahren.
    HINWEIS: Nach der Isolierung und der ersten Kultureinrichtung ergibt das Verfahren typischerweise etwa 5 × 106 Zellen pro Präparation, die an kollagenbeschichteten Platten haften und die charakteristische Kopfsteinpflastermorphologie endothelialer Monoschichten entwickeln.

4. Isolierung von mikrovaskulären Endothelzellen (BMEC) im Gehirn mittels CD31-Magnetperlen

  1. Vorbereitung und Ablösung der Zellen
    1. Sobald die Kulturen 90–100 % Zusammenfluss erreichen, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS (1x), um das Restmedium zu entfernen.
    2. Gib 1 ml Trypsin (0,5 % 1x) zur Platte und inkubiere 3–5 Minuten bei 37 °C, um die Zellen abzutrennen.
    3. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 1 ml Endothelkulturmedium mit 10 % FBS hinzufügen. Die Zellsuspension (~2 mL) wird in ein steriles Mikrozentrifugenrohr übertragen und bei 220 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Entsorge das Supernatant.
  2. Herstellung von CD31-Magnetperlen
    1. Setze 8 μL CD31-Magnetperlen in ein neues 15-mL-Rohr. Wasche die Perlen mit 1 ml 1%-Hank-Lösung und suspendiere sie vorsichtig wieder, indem du das Rohr verschiebst.
    2. Setze das Rohr für 2 Minuten auf einen Magneten, um die Perlen auszufällen. Entferne das Überdeckmittel vorsichtig, ohne die Perlen zu stören. Wiederhole den Waschschritt dreimal.
      HINWEIS: Arbeiten Sie immer nah am Magneten, um den Verlust der Perlen zu vermeiden, und führen Sie diesen Schritt unter sterilen Bedingungen durch, um eine Kontamination der primären Zellkultur zu verhindern.
  3. Inkubation von Zellen mit Perlen
    1. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml 1%iger Hank-Lösung mit FBS (um unspezifische Bindungen zu reduzieren).
    2. Die Zellen werden mit einer 1.000-μL-Pipette in das Rohr mit den vorgewaschenen Perlen übertragen. Die Mischung 20 Minuten lang mit sanftem Schütteln auf Eis bebrüten.
  4. Magnetische Trennung von Endothelzellen
    1. Setzen Sie das Rohr für 3 Minuten auf einen Magneten, um perlengebundene Endothelzellen auszufällen.
    2. Entferne das Supernatant vorsichtig.
      HINWEIS: In diesem Stadium können zwei isolierte Zelltypen gereinigt werden – eine Endothelzelle (siehe Schritt 4.5) und eine Mischung verschiedener Hirnzelltypen. An diesem Punkt stehen zwei Optionen zur Verfügung.
      1. Entferne und entsorge das Supernatant (d. h. die Mischung der Gehirnzellen), während das Rohr am Magneten bleibt. Waschen Sie die perlengebundenen Zellen (also CD31+- Zellen) mit 2 ml Hank-Lösung und wiederholen Sie dies dreimal.
      2. Verwenden Sie das Supernatant mit Zellresten, um eine neue Kultur zu erzeugen, die nicht selektierte Zellen enthält (z. B. Fibroblasten, Astrozyten, Mikroglia, Neuronen, Perizyten und andere).
  5. Kultivierung gereinigter BMECs
    1. Suspendieren Sie die perlengebundenen Endothelzellen in 7 ml vollständigen Endothelmediums (10 % FBS).
    2. Säen Sie die Zellen über Nacht auf eine 60 mm lange Platte, die zuvor mit Kollagen beschichtet ist (siehe Abschnitt 2). Inkubieren unter Standardbedingungen (37 °C, 5 % CO₂).
      HINWEIS: Der endotheliale Phänotyp ist bis Passage (p) 3 unter den beschriebenen Kulturbedingungen erhalten. Um die blut-hirn-barrierebezogenen Eigenschaften zu erhalten, werden experimentelle Tests mit frühen Durchgängen (p0–p3) empfohlen.

5. Zellcharakterisierung

  1. Mikroskopische Beobachtung von perlengefangenen Zellen
    HINWEIS: Unter den in diesem Protokoll beschriebenen Kulturbedingungen können primäre BMECs typischerweise bis zu drei Durchgänge (p3) erhalten bleiben, wobei ihre charakteristische endotheliale Morphologie und Phänotyp erhalten bleiben. Je nach Saatdichte und Wachstumsrate können Kulturen in der Regel bis zu etwa 2–3 Wochen in vitro erhalten bleiben, bevor signifikante phänotypische Veränderungen auftreten.
    1. Nach der Immunselektion mit CD31-Magnetperlen werden die angeschlossenen Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet (Abbildung 2A).
      1. Achten Sie innerhalb von 5–7 Tagen auf CD31-positive Endothelzellen mit typischer Kopfstein-Morphologie und der Bildung homogener Monoschichten.
        HINWEIS: Während der Immunselektion binden CD31-beschichtete magnetische Perlen speziell an Endothelzellen und bereichern so die Endothelpopulation. Nach dem Selektionsprozess können die Perlen (etwa 4,5 μm im Durchmesser) während der frühen Durchgänge weiterhin mit Endothelzellen assoziiert oder von ihnen internalisiert werden. Diese nehmen typischerweise mit anschließenden Wascharbeiten und Kulturerhaltung ab und beeinträchtigen weder die Lebensfähigkeit der BMEC noch das Zellwachstum (Abbildung 2B).
      2. Verwenden Sie die einheitliche Morphologie und das Fehlen von verlängerten oder astrozytenähnlichen Zellen, um die Reinheit der Endothelpopulation abzuschätzen.
  2. Immunfluoreszenz für CD31 und GLUT1
    1. Samen 2 × 103 BMECs auf kollagenbeschichteten Deckschichten und Kultur bis zur 80–90%igen Konfluenz.
    2. Die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur (22–25 °C) fixieren und mit PBS waschen.
    3. Permeabilisiere mit 0,1 % Triton X-100 für 5 Minuten und blockiere die unspezifische Bindung mit 5 % BSA für 30 Minuten.
    4. Inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen CD31 und GLUT1 (Glukosetransporter spezifisch für das Gehirnendothel).
    5. Waschen Sie mit PBS und inkubieren Sie 1 Stunde lang mit den entsprechenden fluoreszierenden sekundären Antikörpern.
    6. Gegenfärbungskerne mit 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) und montieren Sie die Deckfolien mit Antifade-Montagemedium.
    7. Visualisieren Sie unter einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop. Suchen Sie nach CD31, das an Zellgrenzen lokalisiert ist (Abbildung 3A), während GLUT1 zytoplasmatische und membranale Verteilung zeigt und die endotheliale Identität und den Phänotyp des Gehirnendothels bestätigt (Abbildung 3B).
      HINWEIS: Repräsentative Bilder aus unabhängigen BMEC-Isolationen zeigen die typische Morphologie und Markerexpression kultivierter BMECs. Das Vorhandensein von Tight-Junction-Proteinen wie Claudin-5 kann ebenfalls zur Charakterisierung des Gehirnendothels verwendet werden. Um die Reinheit der Endothelkulturen weiter zu bewerten, kann eine zusätzliche Immunfluoreszenzfärbung mit negativen Markern für andere neuronale Zelltypen durchgeführt werden. Zum Beispiel kann das gliale fibrilläre saure Protein (GFAP) zum Nachweis von Astrozyten verwendet werden, und das ionisierte calciumbindende Adaptermolekül 1 (Iba1) zur Identifizierung von Mikroglialzellen. Das Fehlen einer Färbung dieser Marker bestätigt das Fehlen einer Kontamination durch diese nicht-endothelialen Zellpopulationen (Abbildung 3C,D).
  3. Röhrenbildungs-Assay
    HINWEIS: Endothelzellen zeigen in den Matrigel-Assays18 eine proangiogene Kapazität, und die endotheliale Identität kann mit diesem Test bestätigt werden.
    1. Eine 96-Well-Platte mit Matrigel vorbeschichten und 30 Minuten bei 37 °C polymerisieren lassen.
    2. Samen 1 × 10,4 BMECs pro Bohrloch in 100 μL vollständigen Endothelmediums (10 % FBS). Inkubieren Sie bei 37 °C und überwachen Sie die Röhrenbildung über 4–8 Stunden mit einem Phasenkontrastmikroskop (Abbildung 4A).
    3. Quantifizieren Sie die gesamte Röhrenlänge, Anzahl der Übergänge und Netze mit ImageJ (Angiogenesis Analyzer Plugin)19. (Abbildung 4B).
      HINWEIS: Die Fähigkeit der BMECs, miteinander verbundene röhrenförmige Strukturen zu bilden, bestätigt ihr angiogenes Potenzial und ihre endotheliale Funktionalität.
  4. Messung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER)
    HINWEIS: Gehirnendothelzellen müssen eine enge Barriere bilden, da sie ein entscheidender Bestandteil des BBB20 sind. Die Endothelkapazität zur Erzeugung einer elektrischen Barriere muss bestätigt werden.
    1. Same 20.000 BMECs auf kollagenbeschichteten Transwell-Einsätzen (Porengröße 0,4 μm) im oberen Kompartiment und Kultur bis zur Zusammenfluss.
    2. Messung des TEER mit einem Epithelvoltohmmeter zur Beurteilung der Monoschichtintegrität. Täglich aufzeichnen Sie TEER-Werte bis zur Stabilisierung; ein Anstieg des Widerstands weist auf die Bildung enger interzellulärer Verbindungen hin, die für funktionelle Endothelbarrieren charakteristisch sind (Abbildung 4C).
      HINWEIS: Überreste der nicht ausgewählten Zellmischung, einschließlich Astrozyten, können zur Erzeugung eines Kokultursystems verwendet werden. Diese Konfiguration erfordert eine sorgfältige Optimierung des Zellverhältnisses zwischen dem oberen (BMECS) und dem unteren (nicht ausgewählten Zellmix) Kompartiment, das in jedem Labor standardisiert werden sollte. Diese Kokultur-Konfiguration wurde aus den zuvor beschriebenen BBB-Modellen21 adaptiert.
    3. Säen Sie die nicht selektierte Zellmischung (Schritt 4.4.2.2) im unteren Brunnen der Kulturplatte und BMECs auf der Oberseite der Transwell-Einsatzmembran.
      HINWEIS: Ein repräsentatives Experiment zum Vergleich von Monokultur- und Kokulturbedingungen wurde einbezogen, um die Dichtigkeit der Barrieren anhand von TEER-Messungen zu bewerten (Abbildung 4C).

6. Ausbau und Erhaltung gereinigter BMECs

  1. Kulturbedingungen
    1. Halten Sie die gereinigten BMECs in einem vollständigen Endothelkulturmedium (10 % FBS) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator (95 % Luftfeuchtigkeit) mit 5 % CO₂. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 2–3 Tage, um frische Nährstoffe bereitzustellen und die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.
  2. Überwachung von Zellwachstum und Morphologie
    1. Beobachten Sie die Kulturen täglich unter einem Phasenkontrastmikroskop, um Zellanheftung, Wachstum und Morphologie zu überwachen. Achten Sie auf die charakteristische Kopfsteinpflaster-Morphologie der BMECs, die innerhalb von 5–7 Tagen eine konfluente Monoschicht bilden.
  3. Subkultivierung und Durchgang
    1. Wenn die Kulturen eine Konfluenz von 80–90 % erreichen, werden die Zellen mit 0,05–0,1 % Trypsin für 3–5 Minuten bei 37 °C abgetrennt.
    2. Neutralisieren Sie das Trypsin mit einem gleichen Volumen vollständigen Mediums, zentrifugieren Sie bei 220 × g für 10 Minuten bei 4 °C und suspendieren Sie das Pellet erneut in frischem Endothelmedium.
    3. Säen Sie die Zellen auf kollagenbeschichtete Platten mit der gewünschten Dichte für die fortgesetzte Expansion.
      HINWEIS: Begrenzen Sie die BMEC-Durchgänge auf 3–5, um den endothelialen Phänotyp und die funktionelle Integrität zu erhalten.
  4. Optionale Kryokonservierung
    1. Zur Langzeitlagerung werden BMECs im Gefriermedium (10 % DMSO im vollständigen endothelialen Medium) wieder suspendiert. Langsam in einem kontrollierten Gefrierfach auf –80 °C einfrieren und dann für die Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff umleiten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Isolierung und Kultur primärer BMECs aus Neugeborenenmäusen (P5). Diese Zellen sind die Hauptzellkomponente des BBB und daher ein wertvolles experimentelles Werkzeug zur Untersuchung der zerebrovaskulären Physiologie und Pathophysiologie. Eine erfolgreiche Isolierung und Kultur von mikrovaskulären Endothelzellen (BMEC) im Gehirn wurde durch morphologische, phänotypische und funktionelle Bewertungen nachgewiesen.

D...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die Isolierung von BMECs ist ein instrumentelles Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen, die die Physiologie des BBB und seine Funktionsstörung in verschiedenen Pathologien des zentralen Nervensystems (ZNS)regulieren, einschließlich Schlaganfall. Im Gegensatz zu unsterblichen Zelllinien bewahren primäre BMEC-Kulturen wichtige phänotypische und funktionelle Merkmale des Gehirnendothels, darunter die Expression enger gebundener ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Teile dieses Manuskripts wurden mit OpenAIs ChatGPT (GPT-4, Juli 2025-Version) verfasst, um Klarheit, Sprache und Kohärenz zu verbessern. Die Autoren haben alle KI-unterstützten Inhalte kritisch geprüft, redigiert und genehmigt. Für Datenanalyse, Ergebnisinterpretation oder die Erstellung wissenschaftlicher Schlussfolgerungen wurden keine KI-Werkzeuge verwendet.

Danksagungen

Die Autoren möchten den Forschern von GRIVAS Health und NEUROVAS für ihre wertvollen Beiträge danken. Diese Studie wurde von Fondecyt Regular 1240295 finanziert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

```html
Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
60 mm KulturplattenCorning430166
96-Well-KulturplattenCorning41122107
EssigsäureSigma-AldrichA6283
Antibiotika-Antimykotikum (optional)Gibco15240062
Anti-CD31Santa Cruz sc-466941:100
Anti-GFAPThermo Fisher Scientific13-03001:500
Anti-GLUT1Abcamab1157301:200
Anti-Iba1Santa Cruzsc-327251:500
Anti-Maus-IgG Alexa Fluor (594-Farbstoff)Thermo Fisher ScientificA-110051:500
Anti-Rinder-IgG Alexa Fluor  (488-Farbstoff)Thermo Fisher ScientificA-110081:500
Automatische und serologische Pipetten Oxford LP  OXL.OXL.OSP-5C
Basismedium (für Kollagenlösung)Gibco (DMEM)11965092
Bovines Serumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA9647
Collagenase Typ IISigma-AldrichC6885
DAPIThermo Fisher Scientific622481 µg/mL
DMEM (hoch Glucose)Thermo Fisher Scientific11965092
EndoGRO-MV KomplettmediumMerck MilliporeSCME004Endothelzell-Wachstumsmedium
Falcon-Röhrchen (15 & 50 mL)Corning®352096 / 352070
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco (Thermo Fisher)16000044
FluoreszenzmikroskopMoticBA410
Handschuhe, Masken, LaborverbrauchsmaterialienVerschiedene Lieferanten—
Heparin (100 U/mL)Sigma-AldrichH3393
Invertiertes MikroskopOlympus CKX41
Magnetischer TrennmagnetEasySep  NC9284020
Orbital-Shaker (37 °C)Thermo Fisher ScientificSK-0180-S
ParafilmBemisPM996
PBS (1×)Thermo Fisher Scientific10010023
KühlzentrifugeHITACHICT5RE
SkalpellFine Science ToolsVerschiedene
Schere und feine PinzetteFine Science ToolsVerschiedene
Sterile Nitrozellulose-MembranBIO-RAD1620094
Typ I KollagenCorning 30394
```

Referenzen

  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. , (2020).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. , (2006).
  3. Saili, K. S., et al. Blood-brain barrier development: systems modeling and predictive toxicology. Birth Defects Res. , (2017).
  4. Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. J Neuroimmune Pharmacol. , (2006).
  5. Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. , (2010).
  6. Crouch, E. E., et al. Ensembles of endothelial and mural cells promote angiogenesis in prenatal human brain. Cell. , (2022).
  7. Risau, W. Developing brain produces an angiogenesis factor. Proc Natl Acad Sci U S A. , (1986).
  8. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: an overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. , (2016).
  9. Assmann, J., et al. Isolation and cultivation of primary brain endothelial cells from adult mice. Bio Protoc. , (2017).
  10. Bernard-Patrzynski, F., et al. Isolation of endothelial cells, pericytes and astrocytes from mouse brain. PLoS One. , (2019).
  11. Czupalla, C., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. Collagenase-based single cell isolation of primary murine brain endothelial cells using flow cytometry. Bio Protoc. , (2018).
  12. Nicolicht-Amorim, P., et al. Simple and efficient protocol to isolate and culture brain microvascular endothelial cells from newborn mice. Front Cell Neurosci. , (2022).
  13. Lee, K. H., Lee, D. W., Kang, B. C. The 3Rs principles in laboratory animal experiments. Lab Anim Res. , (2020).
  14. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington (DC). (2011).
  15. American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg (IL). (2020).
  16. Ruck, T., et al. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  17. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. , (2021).
  18. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
  19. Carpentier, G., Berndt, S., Ferratge, S., Rasband, W., Cuendet, M., et al. Angiogenesis analyzer for ImageJ: a comparative morphometric analysis of "endothelial tube formation assay" and "fibrin bead assay". Sci Rep. , (2020).
  20. Dithmer, S., Blasig, I. E., Fraser, P. A., Qin, Z., Haseloff, R. F. The basic requirement of tight junction proteins in blood-brain barrier function and their role in pathologies. Int J Mol Sci. , (2024).
  21. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB J. , (2002).
  22. Liebner, S., Czupalla, C. J., Wolburg, H. Current concepts of blood-brain barrier development. Int J Dev Biol. , (2011).
  23. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. , (2010).
  24. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. , (2005).
  25. Rahman, N. A., Rasil, A. N. H. M., Meyding-Lamade, U., Craemer, E. M., Diah, S., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: a systematic review. Brain Res. , (2016).
  26. Wu, W. Z., Bai, Y. P. Endothelial GLUTs and vascular biology. Biomed Pharmacother. , (2023).
  27. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines (Basel). , (2021).
  28. Pusztaszeri, M. P., Seelentag, W., Bosman, F. T. Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand factor, and Fli-1 in normal human tissues. J Histochem Cytochem. , (2006).
  29. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. , (2023).
  30. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: from physiology to disease and back. Physiol Rev. , (2019).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

NeurowissenschaftenAusgabe 233Ausgabe 233Diesen Monat in JoVEAusgabehirnendothelzellenPrimärkulturBlut-Hirn-Schrankezerebrale Angiogenese

Dieser Artikel wurde veröffentlicht

Video demnächst verfügbar

Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.