Entstehung und Differenzierung menschlicher olfaktorischer Epithelorganoide aus adulten Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen etablierten Ansatz zur Isolierung von olfaktorischen Vorläuferzellen aus adulten menschlichen superioren Nasenmuschelgeweben, um olfaktorische Epithelorganoide zu erzeugen. Es beschreibt außerdem eine chemische Induktionsstrategie, um die Differenzierung dieser Organoide zu reifen, olfaktorischen sensorischen Neuronen voranzutreiben und so die Modellierung der humanen olfaktorischen Neurogenese zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Das humane olfaktorische Epithel besitzt eine bemerkenswerte neurogene Kapazität, die von einer ansässigen Population basaler Stammzellen erhalten wird; Die Entwicklung eines dynamischen In-vitro-Modells , das diesen regenerativen Prozess getreu nachbildet, hat sich jedoch als herausfordernd erwiesen. Hier stellen wir ein etabliertes Protokoll zur Erzeugung von olfaktorischen Organoiden aus Vorläuferzellen vor, die aus adulten menschlichen superioren Nasenmuschelgeweben isoliert sind. Diese Organoide behalten die Stammart, wie die SOX2-Expression zeigt, und zeigen ein räumlich organisiertes Differenzierungsmuster, das durch eine einheitliche Expression des unreifen neuronalen Markers GAP43 und periphere Lokalisierung des reifen olfaktorischen Sensorneuron-Markers OMP gekennzeichnet ist. Eine anschließende gezielte Differenzierung mit dem Notch-Inhibitor LY411575, dem Wnt-Aktivator CHIR-99021 und Retinsäure erzeugte marker-positive olfaktorische sensorische neuronähnliche Zellen, die OMP und den neuronalen Marker Tuj1 (Klasse III β-Tubulin) koexprimierten. Dieses vom Menschen abgeleitete Modell umgeht die Einschränkungen der Maussysteme und bietet eine robuste in-vitro-Plattform zur Untersuchung der olfaktorischen Neurogenese, COVID-19-assoziierter Anosmie und anderer olfaktorisch bedingter neurodegenerativer Störungen.

Einleitung

Das humane olfaktorische System unterstützt die kontinuierliche Neurogenese,1 ein Prozess, der hauptsächlich von basalen Stammzellen im olfaktorischen Epithel angetrieben wird, insbesondere von horizontalen Basalzellen (HBCs) und kugeligen Basalzellen (GBCs). ^2,3 GBCs differenzieren sich konstitutiv zu olfaktorischen sensorischen Neuronen (OSNs), während HBCs ruhend bleiben, bis sie durch eine Verletzung aktiviert werden. ^4,5 Die Geruchswahrnehmung beginnt, wenn Geruchsmoleküle an Rezeptoren auf den Cilien der OSNs binden und eine Signaltransduktionskaskade auslösen, die Informationen an die Riechkugel und den Kortex weiterleitet. ⁶ Die Entwicklung und Erhaltung dieser sensorischen Funktion wird vom olfaktorischen Epithel gesteuert.

Geruchsdysfunktion, die durch physikalische, chemische oder biologische Verletzungen verursacht wird, löst sich oft spontan. ⁷ Dennoch betrifft sie 1,5 % bis 25 % der Weltbevölkerung⁸ und kann durch verschiedene Ursachen verursacht werden, darunter Trauma, ⁹ Infektionen, ¹⁰ und neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson¹¹; In diesen Fällen ist die spontane Genesung häufig unvollständig oder abwesend. Aktuelle therapeutische Ansätze, wie olfaktorisches Training und Kortikosteroid-Verabreichung, zeigen nur begrenzte Wirksamkeit. ^12,13 Diese therapeutische Lücke resultiert aus einem unvollständigen Verständnis der Mechanismen, die das Überleben und die Regeneration des olfaktorischen Neuroepithels nach einer Verletzung steuern, eine Wissenslücke, die durch die Unzulänglichkeit bestehender in-vitro-Modelle zur Untersuchung der menschlichen Geruchswissenschaft weiter verschärft wird.

In den letzten Jahren hat die Entwicklung vielfältiger menschlicher Organoidmodelle neue technologische Plattformen zur Untersuchung menschlicher Krankheiten geschaffen. ¹⁴ Organoide, die aus adulten Stammzellen (AdSCs) gewonnen wurden, auch als geweberesidente Stammzellen bezeichnet, wurden erfolgreich für eine Reihe von endodermbasierten Geweben erzeugt, darunter Magen, Leber, Bauchspeicheldrüse, Lunge und Blase. 15,16,17,18,19 Im Gegensatz dazu bleibt die Etablierung menschlicher olfaktorischer Epithelorganoide aus dem vom Ektoderm abgeleiteten olfaktorischen Placode technisch herausfordernd. Eine große praktische Herausforderung ist die Schwierigkeit, dauerhaft lebensfähiges olfaktorisches Epithelgewebe aus der menschlichen oberen Nasenmuschel zu gewinnen. Der Standort und das Ausmaß des olfaktorischen Bereichs variieren erheblich zwischen den Individuen und erleben eine ausgeprägte altersbedingte Degeneration. Eine unbeabsichtigte Ansammlung von respiratorischem statt olfaktorischem Epithel beeinträchtigt die Kulturergebnisse. Um dem entgegenzuwirken, haben wir das Protokoll von 2021 von Ren et al. verfeinert, die erfolgreich Zellcluster aus humaner olfaktorischer Schleimhaut kultiviert ^haben,20 um zuverlässig humane olfaktorische Epithelorganoide zu erzeugen. Unser Ansatz erzeugt menschliche olfaktorische Epithelorganoide mit einer dreidimensionalen, hierarchisch organisierten Architektur und unterstützt deren Differenzierung in olfaktorische sensorische Neuronen. Dieses Modell bietet eine wertvolle experimentelle Plattform, um die Mechanismen zu untersuchen, die das Schicksal von olfaktorischen Epithel-Stammzellen bestimmen, und potenzielle therapeutische Wirkstoffe für olfaktorische Störungen zu screenen.

Zusammenfassend ist das Hauptziel dieser Methode, einen standardisierten Arbeitsablauf zur Erzeugung und Differenzierung menschlicher olfaktorischer Epithelorganoide aus adulten Vorläuferzellen zu etablieren. Die Begründung für diesen Ansatz ist es, die kritische Lücke zu schließen, die durch das Fehlen physiologisch relevanter In-vitro-Modelle des menschlichen Geruchssystems entsteht. Im Vergleich zu traditionellen zweidimensionalen (2D) Monoschichtkulturen oder Mausmodellen bietet dieses dreidimensionale (3D), vom Menschen abgeleitete System den deutlichen Vorteil, die komplexe räumliche Organisation und den menschenspezifischen genetischen Kontext der olfaktorischen Schleimhaut getreu wiederzubilden. Damit Forscher dieses Protokoll in Betracht ziehen, ist es wichtig zu erkennen, dass die präzise Isolierung des lebensfähigen olfaktorischen Epithels aus dem menschlichen oberen Turbinat, während eine Kontamination mit dem respiratorischen Epithel vermieden wird, außergewöhnlich herausfordernd ist und stark vom Alter der Patienten sowie individuelle anatomische Unterschiede beeinflusst wird. Daher eignet sich dieses Protokoll besonders gut für Forscher, die regelmäßigen Zugang zu menschlichen klinischen Proben haben und versuchen, die humane olfaktorische Neurogenese, virusinduzierte Anosmie oder olfaktorische Defizite im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen zu modellieren.

Protokoll

Diese Studie wurde mit Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) des West China Hospital der Universität Sichuan durchgeführt (Genehmigungsnummer 2024 (31)). Vor der Gewebeentnahme und Datenveröffentlichung wurde von allen teilnehmenden Patienten eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt. Proben des oberen Muschelmuschelgewebes wurden von Patienten entnommen, die sich einer endoskopischen Schädelbasisoperation oder einer Ethmoid-Sinus-Operation wegen Hhirebrospinalflüssigkeitsrhinorrhoe unterzogen hatten.

1. Gewebeprobenverarbeitung und -transport

1. Unmittelbar nach der Entnahme werden die Gewebeproben in ein vorgekühltes, steriles Transportmedium gelegt, das aus DMEM/F12/HEPES-Basalmedium besteht, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum und 5 % Penicillin-Streptomycin-Lösung, und sie bei 4 °C ins Labor transportieren.
   HINWEIS: Das Serum hilft, die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten, während die Antibiotikamischung eine mögliche mikrobielle Kontamination während des Transports verhindert. Halte die Transportzeit unter 2 Stunden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

2. Gewebevorverarbeitung (auf Eis durchgeführt)

1. Die Probe in eine vorgekühlte, sterile Kulturschale umleiten, das Transportmedium entfernen und das Gewebe mit einem modifizierten PBS-Puffer waschen, der 5 % Penicillin–Streptomycin-Lösung enthält. Führen Sie die Waschung wie folgt durch: Geben Sie 5 ml vorgekühlte Waschlösung in die Schale, klopfen Sie vorsichtig 5–7 Mal auf das Gewebe und saugen Sie die Flüssigkeit vollständig an. Wiederhole diesen Waschgang dreimal, um Blutzellen und Gewebereste zu entfernen.
2. Mit steriler Mikroskopschere wird das Gewebe in Fragmente von etwa 1–2 mm³ gehackt.
   HINWEIS: Während dieses Schrittes sollten Sie die Gewebehydration aufrechterhalten, es mit stumpfen Spitzen sichern und die Trimmzeit minimieren, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

3. Enzymatische Verdauung

1. Übertragen Sie das mechanisch dissoziierte Gewebe in ein 15-mL-Zentrifugenrohr und fügen Sie 3 ml vorgewärmten (37 °C) Verdauungspuffer (mit 0,125 % Trypsin und 10 U/mL DNase I) hinzu, wobei ein Enzym-Gewebe-Volumen-Verhältnis von 3:1 aufrechterhalten wird. Inkubieren Sie den Schlauch 20 Minuten lang in einem 37 °C starken Wasserbad mit sanftem Rühren. Untersuchen Sie die Probe alle 5 Minuten, um den Verdauungsfortschritt zu überwachen und ein Gewebeverklumpen zu vermeiden.
2. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie ein gleiches Volumen Abschlusslösung hinzufügen, DMEM/F12/HEPES Basalmedium, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum. Pipette die Mischung vorsichtig 10 Mal auf und ab, um eine vollständige Vermischung und einen effektiven Kontakt zwischen den Enzymen und den inhibitorischen Komponenten sicherzustellen.
   HINWEIS: Das im Serum vorhandene α1-Antitrypsin neutralisiert die Trypsinaktivität effizient.

4. Herstellung einer einzelligen Suspension

1. Setzen Sie ein 40 μm Zellsieb auf ein 50 mL Zentrifugenrohr. Mit einer abgeschnittenen 1-ml-Pipettenspitze überträgt man das verdaute Gewebe und die Flüssigkeit aus dem 15-ml-Rohr auf das Sieb. Das Material auf dem Filter mit der Pipettenspitze vorsichtig zu schwenken, um den Durchgang zu erleichtern, und spülen Sie das Sieb anschließend mit zusätzlicher 1–2 ml Abschlusslösung ab. Sobald die gesamte Flüssigkeit durch das Sieb gegangen ist, wird das Filtrat aus dem 50-mL-Rohr in ein neues 15-mL-Zentrifugenrohr umgeleitet.
2. Zentrifugiere die Suspension bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Beobachten Sie das charakteristische Zellpellet am Boden des Röhrchens und saugen Sie vorsichtig das Supernatant an, wobei etwa 100 μL übrig bleiben, um das Zellpellet nicht zu stören oder zu verlieren.

5. Etablierung eines dreidimensionalen Kultursystems

1. Ohne das Zellpellet in einem Kulturmedium neu zu suspendieren, wird es direkt mit Matrigel mit einer vorgekühlten, niedrig bindenden Pipettenspitze kombiniert, um eine präzise Dichte von 10.000 Zellen/μL zu erreichen. Geben Sie 40 μL dieser Zell-Matrigel-Mischung in jede Mulde einer 24-Well-Platte und 20 μL in jede konfokale Schale mit Glasboden. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 30 Minuten, damit die Matrigel polymerisieren und ein dreidimensionales Gerüst bilden kann.
2. Nach der Matrigel-Verfestigung werden vorsichtig 500 μL serumfreies olfaktorisches Stammzellkulturmedium entlang der Wellwand hinzugefügt, um eine Störung des Gels zu vermeiden. Halten Sie die Kulturen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ und ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage durch frisches, vorgewärmtes Medium.
   HINWEIS: Das olfaktorische Nährstoff-Kulturmedium für neuronale Stammzellen besteht aus DMEM/F12/HEPES, ergänzt mit folgenden Komponenten: R-Spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), einem primären antimikrobiellen Mittel (100 μg/mL), N2-Supplement (1 %), B27-Präparat (2 %) und L-Glutamin (1 %).

6. Passaging und Differenzierung

1. Die Organoid-Rückgewinnungslösung 10 Minuten vor der Anwendung auf Eis kühlen; Aspiratiere das Kulturmedium aus den Bohrlöchern und gib dann 1 ml eiskalte Rückgewinnungslösung zu jedem Bohrloch. Neigen Sie die Platte auf einen 45°-Winkel und aspirieren und dosieren Sie die Lösung vorsichtig 5–7x, um Organoide aus der Basalmembranmatrix zu lösen und die resultierende Suspension in ein 15-mL-Zentrifugenrohr zu übertragen. Das Rohr wird 3–5 Minuten auf Eis befruchtet, dann bei 300 × g 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert und das Supernatant vorsichtig entfernt, wobei etwa 100 μL Flüssigkeit übrig bleiben, um den Verlust des Pellets zu verhindern.
2. Gib 1 ml organoides Dissoziationsreagenz direkt in das Zellpellet und inkubiere das Röhrchen bei 37 °C mit sanftem Schütteln bei 220 U/min für 5 Minuten. Beenden Sie die Verdauung sofort, indem Sie ein gleiches Volumen Stop-Lösung hinzufügen, und pipkettieren Sie die Mischung vorsichtig 5x auf und ab, um die Homogenität zu gewährleisten. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C, um die dissoziierten Zellen zu sammeln.
3. Setzen Sie das Zellpellet in Matrigel mit einem Volumen von 40 μL pro Bohrloch für 24-Well-Platten oder 20 μL pro Bohrloch für Glasboden-Konfokalkultur-Schalen wieder auf; Sorgfältig mit einer vorgekühlten, wenig bindenden Pipettenspitze mischen, um eine gleichmäßige Suspension zu gewährleisten. Nach dem Aussäen in die passenden Teller oder Schalen werden die Konstrukte 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, um die Matrigel-Polymerisation und die Bildung eines dreidimensionalen Gerüsts zu ermöglichen. Anschließend fügen Sie vorsichtig 500 μL spezialisiertes, serumfreies sphäroides Kulturmedium für olfaktorische neuronale Stammzellen entlang der Wellwände hinzu, um eine Störung des Gels zu vermeiden. Kulturen werden in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit aufbewahrt.
4. Ungefähr sieben Tage nach dem Durchgehen, sobald die neue Generation der olfaktorischen Epithelorganoide zu Sphäroiden umgeformt hat, wird das Expansionsmedium von den konfokalen Glasbodenschalen aspiriert und durch Differenzierungsmedium ersetzt. Ersetze das Differenzierungsmedium alle 3 Tage durch frisches, vorgewärmtes Medium. Morphologisch unterschiedliche Riechneuronen werden typischerweise nach etwa 7 Tagen Differenzierung unter Mikroskopie sichtbar.
   HINWEIS: Das Differenzierungsmedium besteht aus DMEM/F12/HEPES, ergänzt mit R-Spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), LY411575 (5 μM), CHIR99021 (3 μM), Retinsäure (RA, 1 μM), einem primären antimikrobiellen Wirkstoff (100 μg/mL), N2-Supplement (1 %), B27-Präparat (2 %) und L-Glutamin (1 %).

7. Immunfluoreszenz

1. Aspirieren Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Proben vorsichtig einmal mit 500 μL PBS. Entfernen Sie das PBS, fügen Sie dann 500 μL 4%-Paraformaldehyd hinzu und fixieren Sie die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren und das Fixativ entsorgen; Anschließend werden die fixierten Proben mit PBS (3 x 500 μL) gewaschen und bei bis zu 48 Stunden bei 4 °C gelagert.
2. Aspiratiere das PBS und gib 500 μL Permeabilisierungslösung (0,2 % Triton X-100 in PBS) hinzu, inkubiere 15 Minuten bei Raumtemperatur, dann aspiriere und entsorge die Lösung. Waschen Sie die Proben mit 0,02 % PBST (0,02 % Triton X-100 in PBS; 3 x 500 μL).
3. Gib 500 μL Blocklösung (3 % BSA in PBS) hinzu und brüte 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
4. Aspirieren Sie die Blocklösung und ersetzen Sie sie durch 500 μL primäre Antikörperlösung, die durch Verdünnung des entsprechenden primären Antikörpers (z. B. Anti-GAP43 bei 1:160, Anti-OMP bei 1:50 oder Anti-SOX2 bei 1:50) in Blocklösung hergestellt wird und über Nacht bei 4 °C inkubiert wird. Am folgenden Tag wird die primäre Antikörperlösung aspiriert und die Proben mit 0,02 % PBST (3 x 500 μL) gewaschen.
5. Fügen Sie 500 μL sekundäre Antikörperlösung hinzu, die einen Alexa Fluor 488– oder Alexa Fluor 555–konjugierten Sekundärantikörper enthält, der 1:500 in Blocklösung verdünnt ist, und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Aspirieren Sie die sekundäre Antikörperlösung und führen Sie zusätzliche Waschphasen mit 0,02 % PBST (3 x 500 μL) durch.
6. Fügen Sie 500 μL DAPI-Arbeitslösung (DAPI in PBS verdünnt) hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten im Dunkeln, um die Kerne zu färben. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Proben mit 0,02 % PBST (3 x 500 μL). Bewahren Sie die gefärbten Proben bis zu 48 Stunden vor der Bildgebung bei 4 °C auf.

8. Konfokalmikroskopische Bildgebung

1. Führen Sie eine Konfokalmikroskopie mit einer Z-Achse von 1 μm für Organoide mit einem Durchmesser von ≤100 μm und 0,5 μm für Organoide größer als 100 μm durch. Bilder im mehrkanaligen sequentiellen Modus aufnehmen, scannen Sie in folgender Reihenfolge: DAPI, FITC, TRITC und Cy5. Importiere die erworbenen Z-Stack-Bildsequenzdateien in die 3D-Rendering-Software (z. B. Imaris). Nutzen Sie die 3D-Volumen-Rendering-Funktion, um ein vollständiges dreidimensionales Modell des Organoids zu erstellen. Beobachten Sie dieses rekonstruierte Modell, um die räumliche Verteilung spezifischer zellulärer Marker (z. B. SOX2, GAP43 und OMP) zu visualisieren und qualitativ die hierarchische Architektur sowie den neuronalen Differenzierungsstatus der olfaktorischen Epithelorganoide als Endpunkt zu bestätigen.

Ergebnisse

Isolierung des olfaktorischen Epithelgewebes und Kultur primärer olfaktorischer Epithelorganoide
Um ein Kultursystem für olfaktorische Epithelorganoide zu etablieren, isolierten wir das olfaktorische Epithel aus menschlichem oberen Muschelgewebe und betteten es in eine dreidimensionale Matrigelmatrix ein (Abbildung 1). Aufbauend auf den von Ren et al. gemeldeten Kulturbedingungen validierten und verfeinerten wir die Konzentrationen der wi...

Diskussion

Organoide stellen ein einzigartiges In-vitro-Modell dar, da ihre selbstorganisierende, dreidimensionale Architektur der nativen menschlichen Gewebe eng nachahmen und in manchen Fällen histologisch nicht von tatsächlichen Organen zu unterscheiden sein kann. ¹⁴ Die Etablierung menschlicher Organoidmodelle ist daher entscheidend für die Untersuchung menschlicher Krankheiten. Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung eines Organoidkultursystems aus primäre...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ALEXA FLUOR 488 ESS	Thermo	A11055	1:500
ALEXA FLUOR 555 ESS	Thermo	A31572	1:500
Anti-GAP43 Antikörper	Abcam	ab75810	1:160
Anti-OMP Antikörper	SANTA CRUZ	sc-365818	1:50
Anti-Sox-2 Antikörper	SANTA CRUZ	sc-365823	1:50
B-27 Ergänzung	Gibco	17504044	2%
CHIR99021	Novoprotein	HY-10182	3 µM
DMEM/F12/HEPES	Procell	PM150310	/
Glutamax (L-Glutamin-Ergänzung)	Gibco	35050061	1%
LY411575	Novoprotein	HY-50752	5 µM
Matrigel (Basalmembran-Matrix)	Corning	356231	4% (Vol/Vol)
N-2 Ergänzung	Gibco	17502048	1%
Organoid-Dissoziationsreagenz	Precedo	PRS-ODR	/
Organoid-Recovery-Lösung	Thewellbio	MS04-100	/
Primocin (primäres antimikrobielles Mittel)	Invivogen	ant-pm-05	100 µg/mL
Rekombinantes Humanes EGF	Novoprotein	C029	50 ng/mL
Rekombinantes Humanes Noggin	Novoprotein	CB89	100 ng/mL
Rekombinantes Humanes RSPO1	Novoprotein	CX83	200 ng/mL
Rekombinantes Humanes Wnt3a	Novoprotein	C18K	50 ng/mL
Retinsäure	MCE	HY-14649	1 µM
Y27632	MCE	HY-10071	10 µM