Diese Methode untersucht, wie seneszente Hautfibroblasten gesunde Fibroblasten beeinflussen. Die Seneszenz wird durch UVB-Exposition induziert, und das konditionierte Medium wird auf normale Fibroblasten angewendet. Sie hilft dabei, bioaktive Verbindungen zu bewerten, die auf veränderte Zell-zu-Zell-Kommunikation bei der Hautalterung abzielen.
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Methodenartikel
Neue Kombination von Antioxidantien zur Wiederherstellung gesunder interzellulärer Kommunikation in einem in-vitro-Modell unter Verwendung eines konditionierten Mediums aus alter Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hautalterung ist ein multifaktorieller Prozess, der durch Veränderungen auf molekularer und zellulärer Ebene angeführt wird, auch bekannt als Kennzeichen des Alterns. Eine dieser Veränderungen besteht aus veränderter interzellulärer Kommunikation, die zu Hautgewebedysfunktion und strukturellen Schäden beiträgt. Hier wird ein in-vitro-Modell präsentiert, das diese Hautalterungsmerkmale nachahmt, indem gesunde Fibroblasten mit einem konditionierten Medium aus seneszenten Fibroblasten inkubiert werden. Erstens können UVB-bestrahlte Fibroblasten auf Veränderungen der Genexpression analysiert werden, die mit photoaging assoziiert sind. Zweitens kann konditioniertes Medium aus UVB-induzierten seneszenten Fibroblasten gewonnen und auf gesunde Fibroblasten übertragen werden, was zu einer Herunterregulierung extrazellulärer Matrixproteine und einer Hochregulation der proinflammatorischen Zytokin-Genexpression führt. Diese Veränderungen werden durch eine neuartige Kombination von Antioxidantien (Vitamin C + Idebenon) entgegengewirkt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das In-vitro-Modell verwendet werden kann, um die Wirksamkeit neuartiger Verbindungen bei Hautdermalzellalterungsmerkmalen zu bewerten und somit Verbindungen auszuwählen, die die Hautregenerations- und Verjüngungsprozesse modulieren können.
Einleitung
Hautalterung ist der natürliche Prozess mit verminderten Hautfunktionen und -eigenschaften, einschließlich Verlust von Festigkeit, Elastizität und erhöhtem Durchhängen. Dies wird durch äußere Faktoren wie UV-Exposition und Verschmutzung beschleunigt, die Zellen schädigen und Veränderungen auf molekularerEbene 1 verursachen. Diese Veränderungen sind durch aktuelle Forschungen gut charakterisiert und als Kennzeichen des Alterns identifiziert, darunter genomische Instabilität, Telomerverfall, epigenetische Veränderungen, Proteostaseverlust, defekte Makroautophagie, deregulierte Nährstoffsensorik, mitochondriale Dysfunktion, zelluläre Senezenz, Stammzellerschöpfung, veränderte interzelluläre Kommunikation, chronische Entzündung und Dysbiose2. Diese Merkmale erklären, wie subzelluläre Schäden zu Gewebedysfunktion führen und so den Alterungsprozess begünstigen. Interessanterweise wirken diese Veränderungen nicht unabhängig, sondern bilden eine interdependente Netzwerksignatur. Primärschäden wie genomische Schäden oder epigenetische Veränderungen akkumulieren sich und verursachen schließlich zelluläre Senezenz. Im Fall der Haut wird dies hauptsächlich durch UV-Schäden verursacht, wobei die Photoalterung der Hauptfaktor für Hautalterungsmerkmaleist. Seneszente Zellen zeigen eine erhöhte Produktion von proinflammatorischen Zytokinen, Matrix-Metalloproteinasen und Wachstumsfaktoren, die auch als seneszenzassoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP) bekannt sind und IL6, IL8, MMP1, MMP3, TNFA oder IL1A, unter anderem 4,5,6, umfassen. Diese ausgeschiedenen Faktoren beeinflussen nicht nur die strukturellen Eigenschaften der Haut, wie die dermale extrazelluläre Matrix, sondern stören auch die Funktion der umliegenden Zellen. Dazu gehört die Freisetzung von Zytokinen, die die Melanozytenaktivierung anregen, um altersbedingte Hauthyperpigmentierung auszulösen (wie Stammzellfaktor oder IL18), oder andere schädliche Proteine, die die Funktion der umliegenden gesunden Fibroblasten verändern, deren Funktion beeinträchtigen und zur verstärkten Amplifikation des seneszenten Phänotyps 7,8,9,10,11 beitragen. Daher sind chronische Entzündungen und veränderte interzelluläre Kommunikation Schlüsseltreiber des schädlichen Zustands, der diese molekularen Veränderungen in visuelle Alterungszeichen wie Hautalterung übersetzt, wie Falten, Erschlaffung, Altersflecken oder Verlust von Festigkeit.
Die spezifischen Proteine, die zu den schädlichen Effekten von SASP beitragen, können mit bekannten Techniken wie dem enzymgebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA), Luminex, quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) oder Western Blot untersucht werden, um weitere 5,12 zu nennen. Dieser Ansatz ist jedoch nützlich, um spezifische Proteine aus individueller Perspektive zu identifizieren und einen bestimmten Wirkmechanismus zu charakterisieren, berücksichtigt jedoch nicht die Auswirkungen des vollständigen SASP auf benachbarte Zellen. Hier wird ein in-vitro-Protokoll vorgeschlagen, um die Wirkung des SASP zu untersuchen, der durch UVB-induzierte seneszente dermale Fibroblasten auf gesunde benachbarte Fibroblasten produziert wird und das veränderte interzelluläre Kommunikationskennzeichen des Alterns nachahmt. Wie bereits erwähnt, ist UV der Haupttreiber der Zellalterung in der Haut. Daher wird UV-Schaden als Schadensquelle über replikative oder onkogen-induzierte Seneszenz ausgewählt, um das aktuelle Modell3 zu bilden. Dafür wird das Medium verwendet, das die von seneszenten Fibroblasten ausgeschiedenen Faktoren (konditioniertes Medium) enthält, und Marker der Zellfunktion werden in gesunden Fibroblasten, die mit diesem Medium inkubiert werden, quantifiziert. Nach diesem Protokoll werden nach dem Transfer des konditionierten Mediums von seneszenten zu gesunden Zellen UVB-induzierte seneszente Fibroblasten gewonnen, um molekulare Merkmale wie Gene, die an proinflammatorischen und parakrinen Signalübertragungen beteiligt sind, zu quantifizieren. Zweitens werden gesunde Fibroblasten, behandelt mit konditioniertem Medium aus seneszenten Fibroblasten, um die Wirkung des SASP auf benachbarte Zellen zu charakterisieren und Gene zu quantifizieren, die an der extrazellulären Matrix, Wachstumsfaktoren und Fibroblastenaktivierung beteiligt sind. So wird der Effekt von interessierenden Verbindungen (COI) sowohl zunächst in seneszenten Fibroblasten als auch anschließend in gesunden Fibroblasten analysiert, die mit dem konditionierten Medium behandelt wurden. Bezüglich dieser Verbindungen haben frühere Forschungen gezeigt, dass Antioxidantien wirksam sind, um Anzeichen photoaginginduzierter Hautalterung zu verhindern und zu korrigieren. Folglich wird die Kombination zweier Antioxidantien (Vitamin C und Idebenon) verwendet, um einige der durch UVB induzierten Veränderungen rückgängig zu machen, sowohl in seneszenten Zellen als auch in gesunden Zellen, die mit einem konditionierten Medium aus seneszenten Zellen inkubiert sind 13,14,15
Insgesamt ist dieses Protokoll darauf ausgelegt, die Auswirkungen von SASP auf Hautzellen zu untersuchen und neuartige Moleküle/Interventionen zu identifizieren, die veränderte interzelluläre Kommunikation wiederherstellen und somit für regenerative und biostimulierende Produkte in der ästhetischen Medizin und regenerativen Dermatologie geeignet sind.
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Protokoll
Die in dieser Studie verwendeten humanen dermalen Fibroblasten wurden von einem kommerziellen Zelllinienanbieter gewonnen. Da keine primären menschlichen Proben, Patientendaten oder In-vivo-Experimente beteiligt waren, waren für diese Studie keine Genehmigung und eine informierte Einwilligung durch das Institutional Review Board (IRB) erforderlich.
1. Seneszenzinduktion bei dermalen Fibroblasten mittels UVB
- Erplatte menschliche dermale Fibroblasten mit einer Dichte von 6 × 104 Zellen pro Bohrloch in einer 6-Well-Platte mit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS).
- Nach 24 Stunden wird das Zellkulturmedium entfernt und durch 1 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pro Bohrloch ersetzt.
- Bestrahlen Sie die Zellen mit UVB-Licht bei 25 mJ/cm².
HINWEIS: Diese Energie wurde für das in diesem Protokoll verwendete UVB-Bestrahlungsgerät optimiert (siehe Materialtabelle), um genügend Schäden zu verursachen, um die Alterung auszulösen, während übermäßige Schäden, die zu Apoptose führen könnten, vermieden werden. Bei Verwendung anderer Geräte sollte die Bestrahlungsenergie entsprechend angepasst werden.
VORSICHT: UVB-Strahlung ist gefährlich. Verwenden Sie geeignete Schutzausrüstung und Abschirmung, um eine Exposition zu vermeiden. - Entfernen Sie PBS und fügen Sie pro Welle 2 ml frisches Zellkulturmedium hinzu.
- Nach 72 Stunden wird das Zellkulturmedium entfernt, pro Bohrloch 1 ml PBS hinzugefügt und UVB-Bestrahlung wie in Schritt 1.3 beschrieben wiederholt.
- Nach 72 Stunden wird das Zellkulturmedium entfernt und 0,5 ml 0,05 % Trypsin-EDTA pro Bohrung hinzugefügt. Inkubiert 1–2 Minuten bei 37 °C, dann entnimmt man die Zellen mit 1,5 ml frischem Zellkulturmedium.
- Die Zellen werden mit einer Dichte von 8 × 104 Zellen pro Bohrloch in einer 6-Well-Platte mit einem Zellkulturmedium (DMEM ergänzt mit 10 % FBS) plattiert. Nach diesem Schritt wird die zelluläre Seneszenz induziert.
2. Behandlung von seneszenten Zellen mit interessanten Verbindungen
- Nach 24 Stunden wird das Zellkulturmedium entfernt und 2 ml Zellkulturmedium mit interessanten Verbindungen hinzugefügt.
- Nach weiteren 24 Stunden wird eine separate Charge menschlicher dermaler Fibroblasten (wie in Schritt 1.1 beschrieben) in 6-Well-Platten plattiert. Diese Zellen dienen als gesunde dermale Fibroblasten für den Transfer des konditionierten Mediums.
3. Konditionierter Mediumtransfer von seneszenten Zellen zu gesunden Zellen
- Nach 48 Stunden nach der Compoundbehandlung der seneszenten Zellen und 24 Stunden nach dem Plattieren gesunder Fibroblasten werden 2 ml konditioniertes Medium pro Brunnen aus seneszenten Zellen aufgenommen und an die gesunden Fibroblasten übertragen.
HINWEIS: Entfernen Sie das Kulturmedium aus gesunden Fibroblasten unmittelbar vor der Zugabe des konditionierten Mediums, um eine effiziente Übertragung zu gewährleisten. - Fügen Sie den seneszenten Zellen 1 ml PBS hinzu und entnehmen Sie sie mit Trypsin wie in Schritt 1.6 beschrieben. Verwenden Sie diese Zellen zur Analyse von Alters- oder Entzündungsmarkern mittels eines ELISA-Kits oder qPCR.
HINWEIS: Zellpellets können bei −80 °C gelagert werden, wenn stromabwärts nicht sofort Assays durchgeführt werden. - Inkubieren Sie gesunde Fibroblasten mit konditioniertem Medium bei 37 °C und 5 % CO₂ für 24 Stunden.
4. Gesunde Zellen entnehmen zur Fibroblastaktivierungsanalyse durch Genexpressionsanalyse
- Nach 24 Stunden Inkubation mit konditioniertem Medium entnehmen Sie gesunde Fibroblasten mit Trypsin wie in Schritt 1.6 beschrieben. Analyse der Genexpression der extrazellulären Matrix mittels qPCR.
- Führen Sie qPCR-Analyse durch.
- RNA aus Zellpellets gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahieren (RNA-Extraktionskit).
- Führen Sie eine Reverse-Transkription von 200-ng-RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (Reverse Transcription Kit).
- Amplifizieren Sie cDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers (qPCR-Mastermischung). Führen Sie qPCR unter folgenden Bedingungen durch: 95 °C für 30 Sekunden, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 5 Sekunden und 60 °C für 30 Sekunden. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
| Gen | Vorwärtssequenz | Rückwärtssequenz |
| CDKN2A | 5'-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3' | 5'-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3' |
| CDKN1A | 5'-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA-3' | 5'-CCAGGACTGCAGGCTTCCT-3' |
| SCF | 5'-AATCCTCTCGTCAAAAACTGAAGG-3' | 5'-CCATCTCGCTTATCCAACAATGA-3' |
| IL-18 | 5'-TGCAGTCTACACAGCTTCGG-3' | 5'-GTTTGTTGCGAGAGGAAGCG-3' |
| ELN | 5'-GCAGGAGTTAAGCCCAAGG-3' | 5'-TGTAGGGCAGTCCATAGCCACA-3' |
| FBN1 | 5'-GGTGAATGTACAAACACAGTCAGTCAGCAGCAG-3' | 5' – ATAGGAACAGAGCACAGCTTGTTGA-3' |
| IL-6 | 5'-AGCCCTGAGAAAGGAGACATGTA-3' | 5'-TCTGCCAGTGCCTCTTTGC-3' |
| IL-8 | 5'-ATTTCTGCAGCTCTGTGTGTGAAGGT-3' | 5'-TTTTTTATGAATTCTCAGCCCT-3' |
| CTGF | 5'-GGAAATGCTGTGAGGAGTGGGTGTGTGT-3' | 5'-TGTCTTCCAGTCGGTAGGCAGCTA-3 |
| IGF1 | 5'-CAGAGACAGATAGAGCCTGCG-3' | 5'-CAGGTAACTCGTGCAGAGCA-3' |
Tabelle 1: Liste der für qPCR-Tests verwendeten Primer. Für jeden Primer werden Vorwärts- und Rückwärtssequenzen bereitgestellt, die den in diesem Modell untersuchten und quantifizierten Genen entsprechen.
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Ergebnisse
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Simulation des veränderten interzellulären Kommunikationskennzeichens des Alterns in vitro. Abbildung 1 zeigt ein grafisches Schema, das die Hauptschritte des Protokolls darstellt, einschließlich Senezenzinduktion, Markerquantifizierung und Analyse veränderter interzellulärer Kommunikation in Hautzellen in vitro.
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Diskussion
Das Verständnis des Alterungsprozesses auf molekularer Ebene ist der Schlüssel zur Entwicklung neuartiger Ansätze und Interventionen, die altersbedingte Merkmale verzögern und die Lebensdauer sowie Funktionalität von Zellen und Geweben verlängern. Die Definition und Identifikation der Kennzeichen des Alterns war entscheidend für die Schaffung eines wissenschaftlichen Rahmens für die Entwicklung dieser Interventionen 2,16. Zu den ...
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Offenlegungen
Alle Autoren waren bei der Mesoestetic Pharma Group, S.L. beschäftigt.
Danksagungen
Die Autoren möchten den Mitwirkenden für ihre Unterstützung und Ratschläge bei diesem Projekt danken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 6-well plates | Fisher Scientific | 10578911 | Zellkultur-Multiwell-Platten für den Einsatz während des Assays (Seneszenzinduktion und Behandlung mit Verbindungen) |
| Bio-LINK Crosslinker BLX-312/36 (UVB-Bestrahlungsgerät) | Vilber Lourmat | VL-6111-1090-1 | Gerät zur Erzeugung von Schäden durch UVB-Bestrahlung und in der Folge zur Induktion der Seneszenz |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Merck Life science | D6046-500ML | Standard-Zellkulturmedium für dermales Fibroblasten |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fisher Scientific | 17593595 | Nährstoffzusatz als Quelle für Wachstumsfaktoren, Hormone, Proteine und essentielle Mikronährstoffe für das Zellwachstum |
| H3K27me3 ELISA kit | Epigentek | P-3014T-096 | Ein spezifisches Immunoassay zur Erkennung der epigenetischen Modifikation von H3K27me3 in biologischen Proben |
| Human dermal fibroblasts | Promocell | C-12302 | Haupthautzelle in der Dermis und Regulator der Hautphotoalterung |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Merck Life science | D8537-500ML | Pufferlösung, die die physiologische Umgebung nachahmt. Wird zum Waschen von Zellen verwendet, ohne Stress zu induzieren oder die Zelllebensfähigkeit zu reduzieren |
| PrimeScript RT reagent kit (reverse transcription kit) | Takara Bio | RR037A | Das Kit zur Gewinnung von cDNA aus RNA, die aus Zellen isoliert wurde. 2. Schritt für qPCR-Assay nach RNA-Reinigung. |
| TB Green Premix Ex Taq (qPCR master mix) | Takara Bio | RR420A | Das Kit zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion von cDNA zur Quantifizierung der Genexpressionsniveaus. 3. Schritt für qPCR-Assay nach Reverse-Transkription. |
| Total RNA Purification Kit (RNA extraction kit) | Norgen | 17200 | Das Kit zur Gewinnung von RNA aus geernteten Zellen. 1. Schritt für qPCR-Assay nach Zellgewinnung. |
| Trypsin/EDTA 0,05% | Merck Life science | T2601-100ML | Enzymlösung, die in den Ernte-/Passageschritten für die Zellablösung von Zellkulturplatten verwendet wird |
Referenzen
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