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Neue Kombination von Antioxidantien zur Wiederherstellung gesunder interzellulärer Kommunikation in einem in-vitro-Modell unter Verwendung eines konditionierten Mediums aus alter Zellen

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DOI:

10.3791/70923

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24. April 2026

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1Biotechnology Unit, Mesoestetic Pharma Group

Korrespondierende Autoren: Alfredo Martínez-Gutierrez <amartinez@mesoestetic.com>

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Methode untersucht, wie seneszente Hautfibroblasten gesunde Fibroblasten beeinflussen. Die Seneszenz wird durch UVB-Exposition induziert, und das konditionierte Medium wird auf normale Fibroblasten angewendet. Sie hilft dabei, bioaktive Verbindungen zu bewerten, die auf veränderte Zell-zu-Zell-Kommunikation bei der Hautalterung abzielen.

Zusammenfassung

Hautalterung ist ein multifaktorieller Prozess, der durch Veränderungen auf molekularer und zellulärer Ebene angeführt wird, auch bekannt als Kennzeichen des Alterns. Eine dieser Veränderungen besteht aus veränderter interzellulärer Kommunikation, die zu Hautgewebedysfunktion und strukturellen Schäden beiträgt. Hier wird ein in-vitro-Modell präsentiert, das diese Hautalterungsmerkmale nachahmt, indem gesunde Fibroblasten mit einem konditionierten Medium aus seneszenten Fibroblasten inkubiert werden. Erstens können UVB-bestrahlte Fibroblasten auf Veränderungen der Genexpression analysiert werden, die mit photoaging assoziiert sind. Zweitens kann konditioniertes Medium aus UVB-induzierten seneszenten Fibroblasten gewonnen und auf gesunde Fibroblasten übertragen werden, was zu einer Herunterregulierung extrazellulärer Matrixproteine und einer Hochregulation der proinflammatorischen Zytokin-Genexpression führt. Diese Veränderungen werden durch eine neuartige Kombination von Antioxidantien (Vitamin C + Idebenon) entgegengewirkt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das In-vitro-Modell verwendet werden kann, um die Wirksamkeit neuartiger Verbindungen bei Hautdermalzellalterungsmerkmalen zu bewerten und somit Verbindungen auszuwählen, die die Hautregenerations- und Verjüngungsprozesse modulieren können.

Einleitung

Hautalterung ist der natürliche Prozess mit verminderten Hautfunktionen und -eigenschaften, einschließlich Verlust von Festigkeit, Elastizität und erhöhtem Durchhängen. Dies wird durch äußere Faktoren wie UV-Exposition und Verschmutzung beschleunigt, die Zellen schädigen und Veränderungen auf molekularerEbene 1 verursachen. Diese Veränderungen sind durch aktuelle Forschungen gut charakterisiert und als Kennzeichen des Alterns identifiziert, darunter genomische Instabilität, Telomerverfall, epigenetische Veränderungen, Proteostaseverlust, defekte Makroautophagie, deregulierte Nährstoffsensorik, mitochondriale Dysfunktion, zelluläre Senezenz, Stammzellerschöpfung, veränderte interzelluläre Kommunikation, chronische Entzündung und Dysbiose2. Diese Merkmale erklären, wie subzelluläre Schäden zu Gewebedysfunktion führen und so den Alterungsprozess begünstigen. Interessanterweise wirken diese Veränderungen nicht unabhängig, sondern bilden eine interdependente Netzwerksignatur. Primärschäden wie genomische Schäden oder epigenetische Veränderungen akkumulieren sich und verursachen schließlich zelluläre Senezenz. Im Fall der Haut wird dies hauptsächlich durch UV-Schäden verursacht, wobei die Photoalterung der Hauptfaktor für Hautalterungsmerkmaleist. Seneszente Zellen zeigen eine erhöhte Produktion von proinflammatorischen Zytokinen, Matrix-Metalloproteinasen und Wachstumsfaktoren, die auch als seneszenzassoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP) bekannt sind und IL6, IL8, MMP1, MMP3, TNFA oder IL1A, unter anderem 4,5,6, umfassen. Diese ausgeschiedenen Faktoren beeinflussen nicht nur die strukturellen Eigenschaften der Haut, wie die dermale extrazelluläre Matrix, sondern stören auch die Funktion der umliegenden Zellen. Dazu gehört die Freisetzung von Zytokinen, die die Melanozytenaktivierung anregen, um altersbedingte Hauthyperpigmentierung auszulösen (wie Stammzellfaktor oder IL18), oder andere schädliche Proteine, die die Funktion der umliegenden gesunden Fibroblasten verändern, deren Funktion beeinträchtigen und zur verstärkten Amplifikation des seneszenten Phänotyps 7,8,9,10,11 beitragen. Daher sind chronische Entzündungen und veränderte interzelluläre Kommunikation Schlüsseltreiber des schädlichen Zustands, der diese molekularen Veränderungen in visuelle Alterungszeichen wie Hautalterung übersetzt, wie Falten, Erschlaffung, Altersflecken oder Verlust von Festigkeit.

Die spezifischen Proteine, die zu den schädlichen Effekten von SASP beitragen, können mit bekannten Techniken wie dem enzymgebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA), Luminex, quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) oder Western Blot untersucht werden, um weitere 5,12 zu nennen. Dieser Ansatz ist jedoch nützlich, um spezifische Proteine aus individueller Perspektive zu identifizieren und einen bestimmten Wirkmechanismus zu charakterisieren, berücksichtigt jedoch nicht die Auswirkungen des vollständigen SASP auf benachbarte Zellen. Hier wird ein in-vitro-Protokoll vorgeschlagen, um die Wirkung des SASP zu untersuchen, der durch UVB-induzierte seneszente dermale Fibroblasten auf gesunde benachbarte Fibroblasten produziert wird und das veränderte interzelluläre Kommunikationskennzeichen des Alterns nachahmt. Wie bereits erwähnt, ist UV der Haupttreiber der Zellalterung in der Haut. Daher wird UV-Schaden als Schadensquelle über replikative oder onkogen-induzierte Seneszenz ausgewählt, um das aktuelle Modell3 zu bilden. Dafür wird das Medium verwendet, das die von seneszenten Fibroblasten ausgeschiedenen Faktoren (konditioniertes Medium) enthält, und Marker der Zellfunktion werden in gesunden Fibroblasten, die mit diesem Medium inkubiert werden, quantifiziert. Nach diesem Protokoll werden nach dem Transfer des konditionierten Mediums von seneszenten zu gesunden Zellen UVB-induzierte seneszente Fibroblasten gewonnen, um molekulare Merkmale wie Gene, die an proinflammatorischen und parakrinen Signalübertragungen beteiligt sind, zu quantifizieren. Zweitens werden gesunde Fibroblasten, behandelt mit konditioniertem Medium aus seneszenten Fibroblasten, um die Wirkung des SASP auf benachbarte Zellen zu charakterisieren und Gene zu quantifizieren, die an der extrazellulären Matrix, Wachstumsfaktoren und Fibroblastenaktivierung beteiligt sind. So wird der Effekt von interessierenden Verbindungen (COI) sowohl zunächst in seneszenten Fibroblasten als auch anschließend in gesunden Fibroblasten analysiert, die mit dem konditionierten Medium behandelt wurden. Bezüglich dieser Verbindungen haben frühere Forschungen gezeigt, dass Antioxidantien wirksam sind, um Anzeichen photoaginginduzierter Hautalterung zu verhindern und zu korrigieren. Folglich wird die Kombination zweier Antioxidantien (Vitamin C und Idebenon) verwendet, um einige der durch UVB induzierten Veränderungen rückgängig zu machen, sowohl in seneszenten Zellen als auch in gesunden Zellen, die mit einem konditionierten Medium aus seneszenten Zellen inkubiert sind 13,14,15

Insgesamt ist dieses Protokoll darauf ausgelegt, die Auswirkungen von SASP auf Hautzellen zu untersuchen und neuartige Moleküle/Interventionen zu identifizieren, die veränderte interzelluläre Kommunikation wiederherstellen und somit für regenerative und biostimulierende Produkte in der ästhetischen Medizin und regenerativen Dermatologie geeignet sind.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten humanen dermalen Fibroblasten wurden von einem kommerziellen Zelllinienanbieter gewonnen. Da keine primären menschlichen Proben, Patientendaten oder In-vivo-Experimente beteiligt waren, waren für diese Studie keine Genehmigung und eine informierte Einwilligung durch das Institutional Review Board (IRB) erforderlich.

1. Seneszenzinduktion bei dermalen Fibroblasten mittels UVB

  1. Erplatte menschliche dermale Fibroblasten mit einer Dichte von 6 × 104 Zellen pro Bohrloch in einer 6-Well-Platte mit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS).
  2. Nach 24 Stunden wird das Zellkulturmedium entfernt und durch 1 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pro Bohrloch ersetzt.
  3. Bestrahlen Sie die Zellen mit UVB-Licht bei 25 mJ/cm².
    HINWEIS: Diese Energie wurde für das in diesem Protokoll verwendete UVB-Bestrahlungsgerät optimiert (siehe Materialtabelle), um genügend Schäden zu verursachen, um die Alterung auszulösen, während übermäßige Schäden, die zu Apoptose führen könnten, vermieden werden. Bei Verwendung anderer Geräte sollte die Bestrahlungsenergie entsprechend angepasst werden.
    VORSICHT: UVB-Strahlung ist gefährlich. Verwenden Sie geeignete Schutzausrüstung und Abschirmung, um eine Exposition zu vermeiden.
  4. Entfernen Sie PBS und fügen Sie pro Welle 2 ml frisches Zellkulturmedium hinzu.
  5. Nach 72 Stunden wird das Zellkulturmedium entfernt, pro Bohrloch 1 ml PBS hinzugefügt und UVB-Bestrahlung wie in Schritt 1.3 beschrieben wiederholt.
  6. Nach 72 Stunden wird das Zellkulturmedium entfernt und 0,5 ml 0,05 % Trypsin-EDTA pro Bohrung hinzugefügt. Inkubiert 1–2 Minuten bei 37 °C, dann entnimmt man die Zellen mit 1,5 ml frischem Zellkulturmedium.
  7. Die Zellen werden mit einer Dichte von 8 × 104 Zellen pro Bohrloch in einer 6-Well-Platte mit einem Zellkulturmedium (DMEM ergänzt mit 10 % FBS) plattiert. Nach diesem Schritt wird die zelluläre Seneszenz induziert.

2. Behandlung von seneszenten Zellen mit interessanten Verbindungen

  1. Nach 24 Stunden wird das Zellkulturmedium entfernt und 2 ml Zellkulturmedium mit interessanten Verbindungen hinzugefügt.
  2. Nach weiteren 24 Stunden wird eine separate Charge menschlicher dermaler Fibroblasten (wie in Schritt 1.1 beschrieben) in 6-Well-Platten plattiert. Diese Zellen dienen als gesunde dermale Fibroblasten für den Transfer des konditionierten Mediums.

3. Konditionierter Mediumtransfer von seneszenten Zellen zu gesunden Zellen

  1. Nach 48 Stunden nach der Compoundbehandlung der seneszenten Zellen und 24 Stunden nach dem Plattieren gesunder Fibroblasten werden 2 ml konditioniertes Medium pro Brunnen aus seneszenten Zellen aufgenommen und an die gesunden Fibroblasten übertragen.
    HINWEIS: Entfernen Sie das Kulturmedium aus gesunden Fibroblasten unmittelbar vor der Zugabe des konditionierten Mediums, um eine effiziente Übertragung zu gewährleisten.
  2. Fügen Sie den seneszenten Zellen 1 ml PBS hinzu und entnehmen Sie sie mit Trypsin wie in Schritt 1.6 beschrieben. Verwenden Sie diese Zellen zur Analyse von Alters- oder Entzündungsmarkern mittels eines ELISA-Kits oder qPCR.
    HINWEIS: Zellpellets können bei −80 °C gelagert werden, wenn stromabwärts nicht sofort Assays durchgeführt werden.
  3. Inkubieren Sie gesunde Fibroblasten mit konditioniertem Medium bei 37 °C und 5 % CO₂ für 24 Stunden.

4. Gesunde Zellen entnehmen zur Fibroblastaktivierungsanalyse durch Genexpressionsanalyse

  1. Nach 24 Stunden Inkubation mit konditioniertem Medium entnehmen Sie gesunde Fibroblasten mit Trypsin wie in Schritt 1.6 beschrieben. Analyse der Genexpression der extrazellulären Matrix mittels qPCR.
  2. Führen Sie qPCR-Analyse durch.
    1. RNA aus Zellpellets gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahieren (RNA-Extraktionskit).
    2. Führen Sie eine Reverse-Transkription von 200-ng-RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers durch (Reverse Transcription Kit).
    3. Amplifizieren Sie cDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers (qPCR-Mastermischung). Führen Sie qPCR unter folgenden Bedingungen durch: 95 °C für 30 Sekunden, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 5 Sekunden und 60 °C für 30 Sekunden. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
GenVorwärtssequenzRückwärtssequenz
CDKN2A5'-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3'5'-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3'
CDKN1A5'-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA-3'5'-CCAGGACTGCAGGCTTCCT-3'
SCF5'-AATCCTCTCGTCAAAAACTGAAGG-3'5'-CCATCTCGCTTATCCAACAATGA-3'
IL-185'-TGCAGTCTACACAGCTTCGG-3'5'-GTTTGTTGCGAGAGGAAGCG-3'
ELN5'-GCAGGAGTTAAGCCCAAGG-3'5'-TGTAGGGCAGTCCATAGCCACA-3'
FBN15'-GGTGAATGTACAAACACAGTCAGTCAGCAGCAG-3'5' – ATAGGAACAGAGCACAGCTTGTTGA-3'
IL-65'-AGCCCTGAGAAAGGAGACATGTA-3'5'-TCTGCCAGTGCCTCTTTGC-3'
IL-85'-ATTTCTGCAGCTCTGTGTGTGAAGGT-3'5'-TTTTTTATGAATTCTCAGCCCT-3'
CTGF5'-GGAAATGCTGTGAGGAGTGGGTGTGTGT-3'5'-TGTCTTCCAGTCGGTAGGCAGCTA-3
IGF15'-CAGAGACAGATAGAGCCTGCG-3'5'-CAGGTAACTCGTGCAGAGCA-3'

Tabelle 1: Liste der für qPCR-Tests verwendeten Primer. Für jeden Primer werden Vorwärts- und Rückwärtssequenzen bereitgestellt, die den in diesem Modell untersuchten und quantifizierten Genen entsprechen.

Ergebnisse

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Simulation des veränderten interzellulären Kommunikationskennzeichens des Alterns in vitro. Abbildung 1 zeigt ein grafisches Schema, das die Hauptschritte des Protokolls darstellt, einschließlich Senezenzinduktion, Markerquantifizierung und Analyse veränderter interzellulärer Kommunikation in Hautzellen in vitro.

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Abbildung 1: Grafische Zusammenfassung des Protokolls, einschließlich der Hauptschritte. Eine schematische Zusammenfassung der Hauptschritte des Protokolls. Zunächst wird die Seneszenz durch UVB-Schäden bei gesunden Fibroblasten indaugiert. Anschließend werden seneszente Fibroblasten mit der interessierenden Verbindung (COI) behandelt und Zellen entnommen, um SASP- und epigenetische Veränderungen zu bewerten. Parallel dazu wird ein konditioniertes Medium auf gesunde Fibroblasten übertragen, um die Wirkung ausgeschiedener Faktoren auf die extrazelluläre Matrix und Entzündungsmarker in benachbarten gesunden Zellen zu charakterisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Humane dermale Fibroblasten werden zunächst durch wiederholte UVB-Bestrahlung in die Seneszenz gebracht und simulieren so den Prozess der Hautfotoalterung. Nach der Induzierung zeigen diese seneszenten Fibroblasten charakteristische seneszente Merkmale (Abbildung 2), produzieren proinflammatoriske Zytokine (Abbildung 3) und zeigen veränderte epigenetische Modifikationen, die mit dem Altern assoziiert sind (Abbildung 4), was den seneszenten Phänotyp bestätigt.

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Abbildung 2: Validierung positiver Senezenzmarker in UVB-bestrahlten Fibroblasten. (A, B) Beta-Galaktosidase-assoziierte Senezenzfärbung (10× Vergrößerung) von nicht bestrahlten Kontrollzellen (A) und UVB-bestrahlten Kontrollzellen (B). (C) Genexpression kanonischer Senezenzzellzyklusregulatoren (CDKN2A und CDKN1A). Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar (SD, n = 3). Die statistische Analyse erfolgte mit dem Student's t-Test, bei dem "a" p < 0,05 im Vergleich von Kontrolle und UVB-Kontrolle und "b" p < 0,01 anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 3: Quantifizierung der proinflammatorischen Genexpression in seneszenten Fibroblasten. Genexpressionswerte von SCF und IL18 in Kontrollzellen, UVB-induzierten seneszenten Fibroblasten und UVB-induzierten seneszenten Fibroblasten, behandelt mit Idebenon (1 μM) und Vitamin C (3 mM) für 48 Stunden. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar (SD, n = 3). Die statistische Analyse erfolgte mit Student's t-Test, bei dem "a" p < 0,01 im Vergleich von Kontrolle und UVB-Kontrolle angibt, "b" p < 0,05 im Vergleich von Kontrolle und UVB-Kontrolle und "c" p < 0,001 im Vergleich von UVB-Kontrolle mit UVB-Behandlung anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Quantifizierung altersbedingter epigenetischer Veränderung bei seneszenten Fibroblasten. H3K27me3-Methylierungswerte in UVB-induzierten seneszenten Fibroblasten und UVB-induzierten seneszenten Fibroblasten, die mit Idebenon (1 μM) und Vitamin C (3 mM) für 48 Stunden behandelt wurden, im Vergleich zu nicht-seneszenten Kontrollzellen. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar (SD, n = 3). Die statistische Analyse wurde mit Student's t-Test durchgeführt, wobei "a" p < 0,05 im Vergleich von Kontrolle und UVB-Kontrolle angibt, und "b" p < 0,05 im Vergleich von UVB-Kontrolle mit UVB-Behandlung mit Verbindungen anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Wie in Abbildung 3 gezeigt, sind die photoagingassoziierten Zytokine Stammzellfaktor (SCF) und IL18 in seneszenten dermalen Fibroblasten hochreguliert. Darüber hinaus weisen seneszente Fibroblasten veränderte Spiegel des epigenetischen Markers H3K27me3 auf (Abbildung 4). In beiden Fällen werden diese Veränderungen durch Behandlung mit einer Kombination von Antioxidantien (Vitamin C und Idebenon) rückgängig gemacht. Dies zeigt den Nutzen der Methode nicht nur zur Modellierung des Alterungsprozesses in vitro , sondern auch zur Überprüfung potenzieller Verbindungen, die diesen Prozess angreifen und die schädlichen Auswirkungen seneszenter Zellen abmildern könnten.

Diese schädlichen Auswirkungen seneszenter Zellen werden zudem beobachtet, wenn das konditionierte Medium aus seneszenten Zellen auf gesunde Fibroblasten angewendet wird. Wie in Tabelle 2 gezeigt, ist die Expression von extrazellulären Matrixproteinen (ELN, FBN1), Wachstumsfaktoren (CTGF, IGF1) und proinflammatorischen Zytokinen (IL6, IL8) in gesunden Fibroblasten nach 24 Stunden Inkubation mit konditioniertem Medium dysreguliert. Bemerkenswert ist, dass die Behandlung mit einer Kombination aus Vitamin C und Idebenon diese Veränderungen wiederherstellt, indem extrazelluläre Matrixproteine und Wachstumsfaktoren hochreguliert werden, während proinflammatorische Zytokine herunterreguliert werden (Tabelle 2).

Normal frisch
Wachstumsmedium		Konditioniertes Medium
aus seneszenten Cellen
GenSteuerungSteuerungVitamin C + Idebenon
ELN1.000,68 (±0,07) a0,87 (±0,05) c
FBN11.000,80 (±0,01) b0,93 (±0,07) c
IL-61.001.53 (±0.13) a1.13 (±0.14) c
IL-81.001.07 (±0.21)0,41 (±0,24) c
CTGF1.000,94 (±0,07)1,33 (±0,10) c
IGF11.000,49 (±0,06) b5,55 (±0,73) d

Tabelle 2: Einfluss des konditionierten Mediums aus seneszenten Fibroblasten auf die Funktion gesunder Fibroblasten. Genexpression der extrazellulären Matrix (ELN, FBN1), der Entzündung (IL6, IL8) und der Wachstumsfaktor-Marker (CTGF, IGF1) in gesunden Fibroblasten, die 24 Stunden mit einem konditionierten Medium aus seneszenten Fibroblasten, behandelt oder nicht mit Idebenon (1 μM) und Vitamin C (3 mM) für 48 Stunden inkubiert wurden. Die Standardabweichung (SD, n = 3) für jede Quantifizierung wird in Klammern angegeben, und die statistische Analyse wurde mit dem Student-t-Test durchgeführt, bei dem "a" p < 0,05 anzeigt, der unbehandelte Kontrolle mit konditioniertem Medium vergleicht; "b" zeigt p < 0,01 an, der unbehandelte Kontrolle mit konditionierter mittelbehandelter Kontrolle vergleicht; "c" zeigt p < 0,05 an, der konditionierte, mittelbehandelte Kontrolle mit konditionierter mediumbehandelter Kontrolle mit Idebenon + Vitamin C vergleicht; und "d" zeigt p < 0,001 an, die konditionierte, mittelbehandelte Kontrolle mit konditionierter mediumbehandelter Kontrolle mit Idebenon + Vitamin C vergleicht.

Diskussion

Das Verständnis des Alterungsprozesses auf molekularer Ebene ist der Schlüssel zur Entwicklung neuartiger Ansätze und Interventionen, die altersbedingte Merkmale verzögern und die Lebensdauer sowie Funktionalität von Zellen und Geweben verlängern. Die Definition und Identifikation der Kennzeichen des Alterns war entscheidend für die Schaffung eines wissenschaftlichen Rahmens für die Entwicklung dieser Interventionen 2,16. Zu den anerkannten Merkmalen des Alterns gehört die veränderte interzelluläre Kommunikation zu einem grundlegenden Merkmal, das durch eine beeinträchtigte und dysfunktionale Signalübertragung zwischen den Zellen gekennzeichnet ist, die altersbedingte Gewebedegeneration auslöst. In gealterter Haut fördert die Ansammlung alternder Zellen eine proinflammatoriske Mikroumgebung, die die Funktionsfähigkeit benachbarter nicht-seneszenter Zellen verändert, was wiederum Gewebeschäden durch eine verminderte zelluläre Aktivität verschärft. Dieses Phänomen gipfelt in einer verminderten Synthese extrazellulärer Matrixproteine und Wachstumsfaktoren sowie erhöhten Konzentrationen schädlicher Proteine wie Matrix-Metalloproteinasen, die sich letztlich als sichtbare Anzeichen der Hautalterung manifestieren, darunter matter Teint, verminderte Festigkeit und das Auftreten von Falten 6,17,18.

Angesichts der Komplexität der vollständigen Charakterisierung des Zellsekretoms wird ein neuartiges Protokoll vorgeschlagen, um die globalen parakrinen Effekte von ausgeschiedenen Faktoren aus seneszenten dermalen Fibroblasten auf gesunde Fibroblasten zu untersuchen. Erstens wird die Seneszenz bei menschlichen dermalen Fibroblasten mittels UVB-Licht induziert, da UV-Schäden einer der Haupttreiber der Hautphotoaging13 sind. Die Seneszenz-Induktion ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll, da Zellen den vollständigen seneszenzassoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) erwerben müssen, um die veränderte interzelluläre Kommunikation während des Alterns zu simulieren. Der seneszente Zustand entsteht, nachdem Zellen chronische, irreparable Schäden erleiden, was zu einem dauerhaften Stopp der Zellproliferation führt. Das Schadensniveau muss sorgfältig moduliert werden, um eine ordnungsgemäße Senezenz zu verursachen. In diesem Protokoll reichen zwei UVB-Bestrahlungen aus, die mehrere Tage auseinanderliegen, um diesen Zustand zu erreichen, während eine einzige Hochdosis-Exposition zu Apoptose statt zu Seneszenz führt. Die Hochregulierung der CDKN2A - (p16)- und CDKN1A -(p21)-Genexpression sowie eine positive Beta-Galaktosidase-Färbung bestätigen die erfolgreiche Induktion des seneszenten Phänotyps.

Sobald die Zellen dem Senescenz-Induktionsprotokoll ausgesetzt sind, werden Marker quantifiziert, um den Erfolg zu bestätigen. Einerseits zeigen UVB-bestrahlte Fibroblasten einen Anstieg von H3K27me3 (Abbildung 4), was mit epigenetischen Veränderungen in geschädigten Zellenkorreliert 19,20. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass diese epigenetische Modifikation an der Regulierung von Zellschäden und Reparaturprozessen in seneszenten Zellen beteiligt ist. Ein Anstieg dieses Markers korreliert mit der Unterdrückung langlebigkeitsassoziierter Gene und der Bildung von seneszenzassoziierten Heterochromatin-Foci, was folglich eine Form epigenetischer Drift darstellt, die mit Alterungsmerkmalen21,22 assoziiert ist. Daher wird er derzeit als Marker für epigenetische Altersänderungen verwendet.

Andererseits zeigen diese Fibroblasten auch eine Hochregulierung klassischer Senezenzmarker, einschließlich der seneszenzassoziierten Beta-Galaktosidase-Färbung und erhöhter Expression von CDKN2A (p16INK4a) und CDKN1A (p21WAF1/CIP1) (Abbildung 2)23. Interessanterweise zeigen diese Zellen auch eine Hochregulation zusätzlicher proinflammatorischer Zytokine, die zur Photoalterung und altersbedingter Hyperpigmentierung beitragen, darunter SCF und IL18 (Abbildung 3)7,8,9,10,11. Bemerkenswert ist, dass diese Zytokine die Melanogenese in epidermalen Melanozyten stimulieren können, was den Nutzen dieses Modells zur Screening von Verbindungen unterstreicht, die den dermalen Einfluss auf die Hautpigmentierung im Kontext der Photoaging modulieren. Diese Ergebnisse bestätigen die erfolgreiche Induktion des seneszenten Zustands. Wie in Abbildung 3 und Abbildung 4 gezeigt, stellt die Kombination der in diesem Protokoll verwendeten Verbindungen (Vitamin C + Idebenon) Veränderungen der H3K27me3-Spiegel sowie der SCF- und IL18-Genexpression wieder her, was auf das Potenzial dieses Modells hinweist, auf Verbindungen zu screenen, die die proinflammatoriske Zytokinexpression und epigenetische Veränderungen in seneszenten Fibroblasten regulieren. Die Wirkung dieser Antioxidantien auf klassische Altersmarker wird im aktuellen Protokoll nicht bewertet, könnte aber als ergänzender Schritt aufgenommen werden.

Der nächste Schritt besteht darin, konditioniertes Medium von seneszenten Fibroblasten (die Faktoren absondern) auf gesunde Fibroblasten zu übertragen, um die Wirkung von SASP auf benachbarte Zellen zu charakterisieren und die funktionellen Folgen der veränderten interzellulären Kommunikation widerzuspiegeln. Dieser Ansatz ermöglicht die Quantifizierung der Funktionsmarker von Fibroblasten, einschließlich extrazellulärer Matrixkomponenten, Wachstumsfaktoren und entzündlichen Zytokin-Genexpressionen, durch parakrine Faktoren aus seneszenten Zellen beeinflusst werden. Dennoch sollte der potenzielle Effekt von Restverbindungen im konditionierten Medium nicht unterschätzt werden, sodass die beobachteten Ergebnisse sowohl durch parakrine Faktoren von seneszenten Zellen als auch durch Restkonzentrationen der während der Behandlung verwendeten Verbindungen beeinflusst werden können. Ein entscheidender Aspekt dieses Protokolls ist der Transfer des konditionierten Mediums von seneszenten zu gesunden Zellen am selben Tag. Im Gegensatz dazu frieren andere Studien konditioniertes Medium ein und tauen es auf, wenn gesunde Zellen nicht sofort verfügbar sind. Obwohl ausgeschiedene Faktoren bei −80 °C stabil bleiben, ist dies im vorliegenden Modell nicht validiert; Daher bleibt die potenzielle Auswirkung der Frost-Tau-Zyklen noch zu bestimmen.

Wie erwartet, verändert die Exposition gesunder Fibroblasten gegenüber einem konditionierten Medium aus seneszenten Fibroblasten die Expression von extrazellulären Matrixkomponenten, Wachstumsfaktoren und entzündlichen Zytokinen (Tabelle 2). Bemerkenswert ist, dass die Behandlung mit Vitamin C plus Idebenon diese Veränderungen umkehrt, was zeigt, dass das Modell die veränderte interzelluläre Kommunikation in gealterten Zellen effektiv repräsentiert und das Potenzial dieser Kombination als vielversprechenden Ansatz für dermatologische und medizinische ästhetische Anwendungen unterstützt, die darauf abzielt, Alterungsmerkmale zu mildern und die Langlebigkeit der Hautzellen zu fördern.

Was alternative Ansätze betrifft, so haben frühere Studien antikörperbasierte Techniken wie ELISA, Western Blot oder Luminex 24,25,26 verwendet. Diese Methoden sind nützlich, um spezifische Proteine innerhalb des SASP zu identifizieren und zu charakterisieren; sie erfassen jedoch nicht die Auswirkungen der komplexen Mischung aus Proteinen und Faktoren, die im Sekretom vorhanden sind. Im Gegensatz dazu bietet die Verwendung eines konditionierten Mediums aus seneszenten Zellen – das eine Vielzahl ausgeschiedener biologischer Moleküle enthält – einen umfassenderen Ansatz zur Bewertung veränderter interzellulärer Kommunikation in vitro. Frühere Studien haben mit konditioniertem Mediumtransfer die Auswirkungen sekretierter Faktoren unter definierten Bedingungen27,28 bewertet, einschließlich ihrer Auswirkungen auf andere Zelltypen wie Stammzellen oder Keratinozyten29,30. In diesem Protokoll wird eine Methode vorgeschlagen, um die parakrinen Effekte seneszenter dermaler Fibroblasten auf benachbarte gesunde Fibroblasten zu charakterisieren, wobei eine spezifische Genexpressionssignatur mit extrazellulärer Matrix, Wachstumsfaktor und entzündlichen Wegen identifiziert wird. Dieser Ansatz stellt ein wertvolles In-vitro-Werkzeug dar, um veränderte interzelluläre Kommunikation im Zusammenhang mit dem Altern zu modellieren.

Einschränkungen

Eine Haupteinschränkung der vorliegenden Studie liegt in der fehlenden Identifizierung der spezifischen Mechanismen oder Proteine, die für die beobachteten Veränderungen verantwortlich sind. Mangels proteomischer Techniken bewertet dieses Protokoll die globale Wirkung des SASP, ohne den spezifischen Beitrag von Zytokinen, Wachstumsfaktoren oder anderen von seneszenten Fibroblasten ausgeschiedenen Proteinen zu berücksichtigen.

Eine weitere Einschränkung betrifft den Ursprung des konditionierten Mediums, das aus zuvor mit den getesteten Verbindungen behandelten Zellen gewonnen wird. Daher können nach der Behandlung gesunder Fibroblasten Restmengen dieser Verbindungen verbleiben. Daher könnten die beobachteten Effekte auf gesunde Fibroblasten nicht nur auf ausgeschiedene Faktoren aus seneszenten Zellen zurückzuführen sein, sondern auch auf Restverbindungen, die ursprünglich während der Behandlung der seneszenten Zellen zugeführt wurden. Um dieses Problem zu lösen, könnte ein verbessertes experimentelles Design die Behandlung von seneszenten Zellen mit den Verbindungen für 48 Stunden umfassen, gefolgt vom Ersatz durch frisches Zellkulturmedium und einer zusätzlichen 24-stündigen Inkubation, nach der das Medium entnommen und auf gesunde Fibroblasten übertragen wird.

Ein weiterer relevanter Aspekt ist der potenzielle Einfluss der Zellanzahl auf die beobachteten Ergebnisse. Obwohl zunächst eine festgelegte Anzahl von Zellen ausgesat wird, kann die Behandlung die endgültige Zellanzahl verändern und folglich die beobachteten Ergebnisse bei gesunden Fibroblasten beeinflussen. Daher könnten die geernteten Zellen gezählt werden, sodass das Volumen des konditionierten Mediums vor dem Transfer angepasst werden kann. Darüber hinaus konzentriert sich das aktuelle Protokoll auf die Bewertung der Wirkung von Verbindungen auf proinflammatoriske Zytokine in seneszenten Fibroblasten, behandelt jedoch nicht deren Auswirkungen auf klassische Senezenzmarker wie p16-, p21- oder Beta-Galactosidase-Färbungen.

Abschließend sollte beachtet werden, dass konditioniertes Medium, das aus kultivierten seneszenten Fibroblasten abgeleitet ist, möglicherweise nicht vollständig die Komplexität von in vivo Hautalterung oder systemischer entzündlicher Signalwege wiederholt.

Fehlerbehebung

Nach UVB-Bestrahlung können Fibroblasten im Vergleich zu Kontrollzellen unveränderte Werte der H3K27me3-, SCF- und IL18-Genexpression zeigen, was darauf hindeutet, dass die Alterung nicht erfolgreich induziert wurde; in diesem Fall sollte die UVB-Dosis überprüft und angepasst werden. Umgekehrt, wenn Zellen ein hohes Apoptoseniveau zeigen, was sich in einer signifikanten Verringerung der lebensfähigen Zellanzahl widerspiegelt, deutet dies darauf hin, dass übermäßige Schäden entstanden sind und die UVB-Energie reduziert werden sollte.

Mögliche optionale Änderungen des Protokolls

Mögliche optionale Änderungen des Protokolls (nicht validiert in der aktuellen Studie) umfassen die Erweiterung der Biomarker-Anzeige, um zusätzliche Marker sowohl in seneszenten als auch in gesunden Fibroblasten zu bewerten, insbesondere solchen, die in hier nicht berücksichtigten Signalwegen wie mitochondrialer Funktion oder Stoffwechsel beteiligt sind. Darüber hinaus kann der seneszente Zustand durch alternative Reize induziert werden, einschließlich replikativer Seneszenz, die durch wiederholtes Passieren erreicht wird, bis die Proliferation aufhört. Zusätzlich kann konditioniertes Medium aus seneszenten Fibroblasten auf andere Hautzelltypen wie Keratinozyten oder Melanozyten angewendet werden, um weitere biologische Prozesse wie Pigmentierung, epidermale Regeneration oder Barrierefunktion zu untersuchen.

Fazit

Abschließend zeigt dieses Protokoll den Nutzen der Methode als Screening-Tool zur Identifizierung neuartiger Wirkstoffe oder Interventionen, die die veränderte interzelluläre Kommunikation in der Dermis regulieren – ein zentrales molekulares Merkmal des Alterns. Diese Forschung liefert ein Modell, das den Einfluss von seneszenten Fibroblasten auf gesunde Fibroblasten im Kontext der Haut-Photoaging darstellt und so die Untersuchung und Bewertung sowohl seneszenter als auch nicht-seneszenter Zellzustände ermöglicht. Als positive Kontrolle hebt das vorgeschlagene Protokoll das Potenzial einer Kombination von Vitamin C und Idebenon als wirksamer Antioxidans-Cocktail mit regenerativen und reparativen Eigenschaften in gealterter menschlicher Dermis hervor.

Offenlegungen

Alle Autoren waren bei der Mesoestetic Pharma Group, S.L. beschäftigt.

Danksagungen

Die Autoren möchten den Mitwirkenden für ihre Unterstützung und Ratschläge bei diesem Projekt danken.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6-well platesFisher Scientific10578911Zellkultur-Multiwell-Platten für den Einsatz während des Assays (Seneszenzinduktion und Behandlung mit Verbindungen)
Bio-LINK Crosslinker BLX-312/36 (UVB-Bestrahlungsgerät)Vilber LourmatVL-6111-1090-1Gerät zur Erzeugung von Schäden durch UVB-Bestrahlung und in der Folge zur Induktion der Seneszenz
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Merck Life scienceD6046-500MLStandard-Zellkulturmedium für dermales Fibroblasten
Fetal bovine serum (FBS)Fisher Scientific17593595Nährstoffzusatz als Quelle für Wachstumsfaktoren, Hormone, Proteine und essentielle Mikronährstoffe für das Zellwachstum
H3K27me3 ELISA kitEpigentekP-3014T-096Ein spezifisches Immunoassay zur Erkennung der epigenetischen Modifikation von H3K27me3 in biologischen Proben
Human dermal fibroblastsPromocellC-12302Haupthautzelle in der Dermis und Regulator der Hautphotoalterung
Phosphate buffered saline (PBS)Merck Life scienceD8537-500MLPufferlösung, die die physiologische Umgebung nachahmt. Wird zum Waschen von Zellen verwendet, ohne Stress zu induzieren oder die Zelllebensfähigkeit zu reduzieren
PrimeScript RT reagent kit (reverse transcription kit)Takara BioRR037A Das Kit zur Gewinnung von cDNA aus RNA, die aus Zellen isoliert wurde. 2. Schritt für qPCR-Assay nach RNA-Reinigung.
TB Green Premix Ex Taq  (qPCR master mix)Takara BioRR420ADas Kit zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion von cDNA zur Quantifizierung der Genexpressionsniveaus. 3. Schritt für qPCR-Assay nach Reverse-Transkription.
Total RNA Purification Kit (RNA extraction kit)Norgen17200Das Kit zur Gewinnung von RNA aus geernteten Zellen. 1. Schritt für qPCR-Assay nach Zellgewinnung.
Trypsin/EDTA 0,05% Merck Life scienceT2601-100MLEnzymlösung, die in den Ernte-/Passageschritten für die Zellablösung von Zellkulturplatten verwendet wird

Referenzen

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HautalterungUVB-bestrahlte FibroblastenGenexpressionextrazelluläre Matrixproinflammatorische ZytokineAntioxidations-Kombination
Neue Kombination von Antioxidantien zur Wiederherstellung gesunder interzellulärer Kommunikation in einem in-vitro-Modell unter Verwendung eines konditionierten Mediums aus alter Zellen
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