Propentofyllin lindert incisionelle Hyperalgesie durch Regulierung der ERK1/2-Phosphorylierung in spinalen Astrozyten und Mikroglia

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht die Wirkung von intrathekal verabreichtem Propentofyllin auf die Abschwächung der incisionellen Hyperalgesie und ob dieser Effekt mit Veränderungen in spinalen glialen Markern sowie in der Phosphorylierung der extrazellulären signalregulierten Kinase 1 und 2 bei Ratten assoziiert ist.

Zusammenfassung

Spinale Astrozyten, Mikroglia und die extrazelluläre signalregulierte Kinase 1 und 2 (ERK1/2) sind an der Schmerzverarbeitung beteiligt. Diese Studie untersuchte, ob eine präoperative intrathekale Gabe von Propentofyllin (PPF) akute, durch einen Schnitt verursachte Hyperalgesie bei Ratten abschwächt und ob dieser Effekt mit spinalen Glia-Markern und der Phosphorylierung von ERK1/2 assoziiert ist. Sechsundsechzig männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden zufällig auf leere, Schnittschmerz-, normales Kochsalzlösungs-, Dimethylsulfoxid-, PPF- und U0126-Gruppen verteilt. Mechanische und thermische Hyperalgesie wurden zum Grundwert sowie 2, 4, 8, 24 und 72 h nach dem Schnitt bewertet. Spinale neuronale und gliale Marker, p-ERK1/2 sowie entzündliche Mediatoren wurden mittels Western Blotting und Immunfluoreszenz analysiert. Zusätzlich wurden Experimente mit primären spinalen Astrozyten durchgeführt, um die ERK1/2-abhängige Freisetzung entzündlicher Mediatoren zu untersuchen. Die präoperative intrathekale Gabe von PPF verringerte die mechanische und thermische Hyperalgesie während des gesamten 72-stündigen Beobachtungszeitraums, während U0126 die Hyperalgesie hauptsächlich in der frühen postoperativen Phase abschwächte. Vier Stunden nach dem Schnitt waren beide Behandlungen mit einer verminderten spinalen Expression von GFAP, Iba-1 und p-ERK1/2 sowie einer reduzierten Immunreaktivität von TNF-α und COX-2 assoziiert. In kultivierten Astrozyten verringerte PPF die durch LPS induzierte Freisetzung entzündlicher Mediatoren, während eine konstitutiv aktive ERK1/2 diesen Effekt abschwächte. Diese Ergebnisse stützen eine Assoziation zwischen der antihyperalgetischen Wirkung von PPF und der Modulation spinaler glialer, ERK1/2-abhängiger und entzündlicher Reaktionen nach einem Schnitt.

Einleitung

Schmerzen nach operativen Einschnitten, eine häufige Form akuter Schmerzen nach chirurgischen Eingriffen, halten in der Regel nicht länger als 7 Tage an, weisen jedoch komplexe pathologische Mechanismen auf, die sich von denen entzündlicher und neuropathischer Schmerzen unterscheiden^1,2. Wenn schneidende Schmerzen während ihrer Entstehung unzureichend kontrolliert werden, können sie sich weiter zu einem chronischen Schmerzsyndrom entwickeln, und ihr Charakter kann sich von akuten Gewebeschmerzen hin zu neuropathischen oder gemischten Schmerzen verändern³. Im Allgemeinen ist die Gabe von Analgetika wie Opioiden und nichtsteroidalen Antirheumatika die gebräuchlichste Form der Schmerzlinderung nach einem Einschnitt. Allerdings können bei kontinuierlicher oder hochdosierter Anwendung dieser Substanzen zahlreiche Nebenwirkungen auftreten, was die Notwendigkeit sichererer und wirksamerer analgetischer Strategien unterstreicht.

Zuverlässige wissenschaftliche Belege deuten darauf hin, dass Propentofyllin (PPF) die Hyperalgesie bei verschiedenen Schmerzprozessen lindert^4,5. Darüber hinaus kann die analgetische Wirkung von PPF teilweise durch die Hemmung der spinalen Expression von mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPKs), wie p38 und c-Jun-N-terminalen Kinasen (JNKs), erreicht werden⁶. Obwohl die Wirkungen von PPF auf die p38- und JNK-Signalwege bereits belegt sind, blieb eine mögliche Modulation des extrazellulären signalregulierten Kinase-1- und -2-(ERK1/2)-Signalwegs, einer weiteren wichtigen MAPK-Unterfamilie, die an der Schmerzsignalübertragung beteiligt ist, bei akutem Schnittschmerz bisher unerforscht. Diese Wissenslücke ist insbesondere vor dem Hintergrund bedeutsam, dass die Aktivierung von ERK1/2 im Vergleich zu p38 und JNK unterschiedliche zeitliche und zelluläre Muster aufweist, was auf potenziell einzigartige therapeutische Ansatzpunkte hindeutet.

Gliazellen, einschließlich Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten, galten ursprünglich als verbindende und stützende Struktur des Nervengewebes. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass Astrozyten und Mikroglia eine wichtige Rolle bei der Regulierung der synaptischen Plastizität und der Weiterleitung von Schmerzinformationen spielen⁷. Als residente Makrophagen des Gehirns und des Rückenmarks können Mikroglia bereits in einem sehr frühen Stadium des Schmerzprozesses durch verschiedene extrazelluläre Stimulussignale aktiviert werden, anschließend proliferieren und große Mengen entzündungsfördernder Zytokine freisetzen, wodurch die Leitung von Schmerzsignalen vom Rückenmark zum Gehirn verstärkt wird^8,9. Gleichzeitig können aktivierte Astrozyten die Freisetzung des erregenden Neurotransmitters Glutamat hochregulieren und Informationen direkt an sensorische Neuronen senden, indem sie die interzelluläre Kommunikation verstärken¹⁰.

Studien haben gezeigt, dass eine Aktivierung von Astrozyten im frühen Stadium (innerhalb der ersten 24 h) bei durch eine Inzision verursachten Schmerzen auftritt, während die Aktivierung von Mikrogliazellen deutlich später erfolgt^11,12. Zudem wies eine Studie darauf hin, dass aktivierte Mikrogliazellen nur einen begrenzten Einfluss auf die mechanische Hyperalgesie bei durch Inzision verursachten Schmerzen haben¹³. Diese Befunde verdeutlichen, dass weiterhin offene Fragen bezüglich der unterschiedlichen Rollen von Astrozyten und Mikrogliazellen bei akuten Schmerzen bestehen. Propentofyllin, ein glial modulierendes Agens, wurde bereits als wirksam bei der Linderung von Hyperalgesie berichtet, indem es die Aktivierung von Astrozyten und Mikrogliazellen nach chronischer nervenkomprimierender Verletzung, akuter Nervenverletzung und akuter Gewebeverletzung reguliert^4,5. Bislang ist jedoch nach bestem Wissen keine Studie dazu veröffentlicht worden, welche Wirkung PPF auf die Aktivierung von Astrozyten oder Mikrogliazellen bei akuten, durch Inzision verursachten Schmerzen hat.

Die extrazelluläre Signal-regulierte Kinase 1 und 2, eine wichtige MAPK-Unterfamilie, die abwärts von der durch Mitogene aktivierte Proteinkinase 1 und 2 (MEK1/2) aktiviert wird, ist weithin mit der nozizeptiven Verarbeitung und neuronalen Plastizität assoziiert^14,15. Frühere Studien haben gezeigt, dass phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2) in spinalen Neuronen durch nozizeptive Reize induziert werden kann und auch in Astrozyten und Mikroglia bei entzündlichen oder neuropathischen Schmerzzuständen nachweisbar ist^16,17,18,19. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die pharmakologische Hemmung des MEK1/2–ERK1/2-Signalwegs mechanische und thermische Hyperalgesie in mehreren Schmerzmodellen abschwächt^{20,21,22,23,24,25}.

Die zelluläre Verteilung von spinalen ERK1/2, insbesondere in Astrozyten und Mikroglia, die durch einen akuten Schnitt aktiviert wird, sowie deren Rolle bei der schnittinduzierten Schmerzbildung ist jedoch bisher unzureichend geklärt. Frühere Studien der Forschungsgruppe deuten darauf hin, dass PPF die akute schnittbedingte Hyperalgesie bei Ratten lindert, indem es die spinale JNK- und p38-Signalübertragung reduziert; ob PPF jedoch auch die ERK1/2-vermittelte Signalübertragung in spinalen glialen Zellen während der schnittinduzierten Schmerzbildung moduliert, bleibt unklar. Daher sollte die vorliegende Studie als Erweiterung der bestehenden Konzepte zu glialen Zellen und MAPK-Signalwegen in der Schmerzforschung betrachtet werden und nicht als vollständig unabhängiges mechanistisches Paradigma. Ihr Hauptunterschied zu früheren Arbeiten liegt in der gezielten Betrachtung des akuten schnittbedingten Schmerzes, der Untersuchung von ERK1/2 statt p38/JNK als dem fokussierten MAPK-Komponenten und der Analyse der frühen spinalen zellulären Verteilung von p-ERK1/2 im Zusammenhang mit einer PPF-Behandlung.

Diese Studie wurde konzipiert, um zu untersuchen, ob eine präoperative intrathekal verabreichte Gabe von PPF die inkisionelle Hyperalgesie in einem Ratten-Plantar-Inzisionsmodell abschwächt und ob dieser Effekt mit der ERK1/2-Phosphorylierung oder Veränderungen in der Expression spinaler neuronaler und glialer Marker sowie entzündungsfördernder Mediatoren, Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) und Cyclooxygenase-2 (COX-2), assoziiert ist. Genauer gesagt unterscheidet sich diese Studie von früheren Berichten durch die Kombination einer Verhaltensbewertung mit einer zeitlich aufgelösten Western-Blot-Analyse; durch den pharmakologischen Vergleich mit dem MEK1/2-Inhibitor U0126; sowie durch die qualitative immunfluoreszenzgestützte Lokalisation von p-ERK1/2 in spinalen Neuronen, Astrozyten und Mikroglia innerhalb eines Modells für akuten inkisionellen Schmerz. Obwohl ihr mechanistisches Konzept auf früherer Literatur aufbaut, die eine Beteiligung glialer Modulation und MAPK-Signalgebung am Schmerz beschreibt, soll die vorliegende Arbeit zusätzliche Hinweise auf die mögliche Beteiligung spinaler, ERK1/2-vermittelter glialer Reaktionen in der frühen Phase der inkisionellen Hyperalgesie liefern.

Im Vergleich zu herkömmlichen postoperativen Analgetika können zielgerichtete Ansätze eine definierte Signalkomponente testen, bieten jedoch möglicherweise nur zeitlich begrenzte Vorteile und erfordern oft eine invasive Applikation; die Hemmung von MEK1/2–ERK1/2 hat in mehreren experimentellen Schmerzmodellen antihyperalgetische Wirkungen gezeigt^{20,21,22,23,24,25}. PPF unterscheidet sich von einem einzelnen Pfadinhibitor, da es gliale Reaktionen moduliert und mit mehr als einem MAPK-assoziierten Prozess in Verbindung gebracht wurde^4,5,6. Die praktische Übertragung bleibt durch das präklinische Design, die präoperative intrathekale Verabreichung, die ausschließliche Verwendung männlicher Ratten sowie das Fehlen von Dosis-Wirkungs-Untersuchungen und Sicherheitsstudien in größeren chirurgischen Modellen eingeschränkt.

Protokoll

Die durchgeführten Experimente wurden von dem Ethikkomitee des Zweiten Angegliederten Krankenhauses der Lanzhou-Universität, Provinz Gansu, China, genehmigt (Ethikgenehmigungsnummer 2017-070). Alle Verfahren folgten den Richtlinien der International Association for the Study of Pain²⁶. Insgesamt wurden 66 erwachsene männliche Sprague–Dawley-Ratten aus einem akkreditierten Laboratoriumstierzentrum mit einem Gewicht von 200–250 g verwendet. Nur männliche Ratten wurden in diese Studie eingeschlossen, um potenzielle Variabilität aufgrund geschlechtsabhängiger hormoneller Einflüsse zu reduzieren. Alle Protokolle wurden gemäß den Richtlinien der International Association for the Study of Pain²⁶ durchgeführt, und es wurden alle erforderlichen Maßnahmen unternommen, um Leid zu minimieren. Detaillierte Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien, Verbrauchsmaterialien, Instrumenten und Software finden sich in der Tabelle der Materialien.

Tiere

Die Ratten wurden vor der Operation paarweise und nach der Inzision einzeln mit Futter und Wasser gehalten. ad libitumDer Raum wurde bei einem 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Wechsel und einer Temperatur von 24 °C ± 2 °C gehalten.

Intrathekale Injektion und Modell für incisionelle Schmerzen

Für die intrathekale Applikation von Lösungen wurden Ratten mit 1,5–3 % Sevofluran (über eine Nasenkonne) anästhesiert und in Bauchlage mit gebeugter Wirbelsäule positioniert. Das Fell im lumbalen Bereich wurde rasiert und die Haut über dem Zwischenwirbelraum L5–L6 desinfiziert. Eine Mikrospritze wurde perkutan in den Zwischenwirbelraum L5–L6 eingeführt. Ein erfolgreicher Zugang zum Subarachnoidalraum zeigte sich durch ein plötzliches Zucken oder Bewegen des Schwanzes während der Nadelvorschub und wurde zusätzlich durch das Auftreten von Liquor cerebrospinalis bei leichter Aspiration bestätigt. Falls diese Zeichen nicht beobachtet wurden, wurde die Nadellage vor der Injektion korrigiert. Die Injektion erfolgte erst, nachdem beide Bestätigungskriterien erfüllt waren; Tiere, die nach der Injektion abnorme neurologische Symptome zeigten, wurden ausgeschlossen. Die jeweilige Lösung wurde anschließend langsam injiziert, und die Haut wurde nach der Injektion erneut gereinigt. Der chirurgische Eingriff dauerte etwa 3 min, und die Ratten erholten sich im Allgemeinen innerhalb von 5–10 min von der Anästhesie.

Das Rattenmodell für incisionelle Schmerzen wurde wie zuvor beschrieben etabliert²⁷. Nach der Anästhesie wurde die plantare Fläche der Hinterpfote mit 10 % Povidon-Jod desinfiziert. In die plantare Haut wurde ein 1 cm langer Längsschnitt gesetzt, der etwa 0,5 cm von der Ferse entfernt begann und in Richtung der Zehen verlief. Der Schnitt durchdrang Haut und Faszie. Der Musculus plantaris wurde vorsichtig mit okularen Pinzetten angehoben und unter Erhaltung der gesamten Gewebeintegrität longitudinal incidiert. Anschließend wurde das Muskelgewebe repositioniert, sanfter Druck zur Erzielung der Hämostase ausgeübt, und die Wunde wurde mit zwei Matratzen-Nähten aus 3-0-Nylon verschlossen. Die Operationsstelle wurde nach der Naht erneut desinfiziert. Nach der Operation wurden die Tiere einzeln untergebracht und durften sich in einer ruhigen, warmen Umgebung erholen, geschützt vor starkem Licht und mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Die Tiere wurden postoperativ überwacht, und jene, die die vorab festgelegten Kriterien nicht erfüllten, wurden umgehend ausgeschlossen. Eine Wundinfektion wurde anhand von Rötung, Schwellung und erhöhter lokaler Temperatur um die Wunde herum, abnormalem gelb-grünem eitrigem Exsudat mit üblem Geruch, verzögerter Wundheilung mit anhaltender Wundöffnung, Nekrose und Zunahme der Wundgröße sowie systemischen Zeichen wie erhöhter Körpertemperatur, Lethargie und Futterverweigerung festgestellt. Weitere Ausschlusskriterien waren das Ausbleiben der Erholung von der Anästhesie innerhalb von 30 Minuten, intraoperative Muskelquerdurchtrennung oder neurovaskuläre Verletzung, postoperative Selbstverstümmelung, fehlgeschlagene Modellerstellung sowie neurologische Defizite wie Lähmung der Hintergliedmaßen oder Unfähigkeit, Gewicht zu tragen, die nicht auf die incisionellen Schmerzen zurückzuführen waren. Ratten mit Wundinfektion oder Wunddehiszenz wurden von der Studie ausgeschlossen.

Verhaltensmessung

Die mechanische Schwelle für die Pfotenrückzugsreaktion (PWMT) und die thermische Latenz für die Pfotenrückzugsreaktion (PWTL) wurden von einem Untersucher gemessen, der bezüglich der Gruppenzuteilung verblindet war. Die Tests wurden in einem ruhigen Raum zu einer konstanten Tageszeit durchgeführt, nachdem die Tiere sich mindestens 10 Minuten akklimatisiert hatten; die Umgebung, der Maschen- oder Glasboden, die Umgebungsbeleuchtung und die Intensität der Wärmequelle wurden zwischen den Gruppen konstant gehalten. Für die PWMT-Testung wurden kalibrierte von-Frey-Fäden (0,4 g, 0,6 g, 1,0 g, 1,4 g, 2,0 g, 4,0 g, 6,0 g, 8,0 g, 10,0 g und 15,0 g) senkrecht zur plantaren Oberfläche nahe der Wunde angelegt, bis sich der Faden um etwa 1–2 mm verbog. Aufeinanderfolgende Reize wurden durch 2 Minuten getrennt, und die 50 %-PWMT wurde nach der Auf-und-ab-Methode²⁸ bestimmt. Für die PWTL-Testung wurden Ratten einzeln in transparente Behälter auf einen Glasboden gesetzt, und die Strahlungswärmequelle wurde mit der plantaren Fläche neben der Wunde ausgerichtet. Eine Obergrenze von 30 s verhinderte Gewebeschäden, aufeinanderfolgende Expositionen wurden durch 2 Minuten getrennt, und der Mittelwert aus drei Messungen wurde erfasst²⁹. Ein positives Rückzugsverhalten galt als Pfotenheben, -schütteln oder -lecken; Versuche, die durch Pflegeverhalten, Fortbewegung oder Verlust der Ausrichtung zur Wärmequelle beeinträchtigt waren, wurden nach erneuter Akklimatisierung wiederholt.

Western-Blot-Analyse

Zu den voreingestellten Zeitpunkten wurden die Ratten durch Halswirbeldislokation euthanasiert und das L4–L6-Lendenmarkssegment rasch in Radioimmunpräzipitationspuffer (RIPA-Puffer), ergänzt mit Proteaseinhibitor im Verhältnis 100:1, entnommen. Das Gewebe wurde homogenisiert, 20 min auf Eis gehalten und bei 4 °C 20 min lang mit 15.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde im Verhältnis 3:1 mit 4×-Lade-Puffer vermischt, 5 min in siedendem Wasser erhitzt und bei −80 °C gelagert. Proteineproben (30 µg pro Lane) wurden auf 10 %igen Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen getrennt und auf 0,45- oder 0,22-µm-PVDF-Membranen (Polyvinylidenfluorid) übertragen. Der erfolgreiche Transfer wurde überprüft, indem die erwartete Wanderung des vorgefärbten Molekulargewichtsmarkers sowie das Fehlen offensichtlicher ungleichmäßiger oder unterbrochener Transferbereiche bestätigt wurden. Die Membranen wurden 2 h bei Raumtemperatur mit 5 % Magermilchpulver und 3 % Rinderserumalbumin blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen NeuN (1:8.000), GFAP (1:4.000), Iba-1 (1:3.000), p-ERK1/2 (1:1.000), t-ERK1/2 (1:3.000) oder GAPDH (1:2.000) inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen in Tris-gepuffertem Salzlösung, die 0,05 % Tween 20 (pH 7,4) enthielt, wurden die Membranen 1 h bei Raumtemperatur mit dem entsprechenden mit Peroxidase konjugierten sekundären Antikörper (1:5.000) inkubiert. Die Signale wurden mittels verstärkter Chemilumineszenz entwickelt und auf Film mit dem gleichen Belichtungsbereich innerhalb jedes Zielproteins aufgezeichnet. Ein Untersucher, der über die Gruppenzuteilung geblendet war, analysierte die Bandendichte mithilfe einer Bildanalyse-Software. Die Bilder wurden in 8-Bit-Graustufen umgewandelt, ein identisches rechteckiges Interessenareal wurde auf jede Bande angewendet, der lokale Hintergrund aus einem benachbarten leeren Bereich wurde subtrahiert und die integrierte Dichte wurde erfasst. Für alle Lanes eines Blots wurden dieselbe Arealgröße und dieselbe Hintergrundkorrektur verwendet. NeuN, GFAP, Iba-1 und t-ERK1/2 wurden auf GAPDH normalisiert; p-ERK1/2 wurde auf t-ERK1/2 normalisiert; die Werte wurden anschließend relativ zur Kontrollgruppe (Blank-Gruppe) ausgedrückt.

Immunfluoreszenz

Zu vorbestimmten Zeitpunkten wurden die Ratten mit 3 % Natriumpentobarbital (1,5 mL/kg) anästhesiert und über das Herz mit 300 mL vorgekühlter 0,01 mol/L Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS; pH 7,4) und anschließend mit 250 mL vorgekühltem 4 %igen Paraformaldehyd perfundiert. Das L4–L6-Rückenmark wurde anschließend 6 h in 4 %igem Paraformaldehyd fixiert, über Nacht bei 4 °C in 20–30 %iger Saccharose-PBS-Lösung kryoprotegiert und bei −22 °C in 10 µm dicke Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden in 0,01 mol/L PBS gewaschen, 1 h bei Raumtemperatur in 10 % Zieusersum blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern gegen NeuN (1:100), GFAP (1:1.000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) oder COX-2 (1:50) inkubiert. Nach drei Waschschritten in PBS wurden die Schnitte 1 h bei Raumtemperatur mit den entsprechenden grün- oder rotgefärbten sekundären Antikörpern (1:400) inkubiert, erneut dreimal in PBS gewaschen und mit einem Antifade-Medium unter einem Deckglas eingebettet. Als Negativkontrollen wurden in jeder Färbungsserie Schnitte ohne Zugabe des Primärantikörpers mitverarbeitet. Die Bildaufnahme erfolgte durch einen untersuchungsblinden Forscher mittels eines Fluoreszenzmikroskops. Übersichtsbilder mit niedriger Vergrößerung wurden mit einem 10×-Objektiv aufgenommen, während zelluläre Immunreaktivität und Bilder zur Ko-Lokalisation je nach entsprechendem Abbildungsteil mit 20×- oder 40×-Objektiven angefertigt wurden. Für Vergleiche innerhalb derselben Abbildung und Färbungsserie wurden nach Optimierung unterhalb der Sättigung die Objektivvergrößerung, Beleuchtungsintensität, Belichtungszeit, Detektorgewinnung, Kameraeinstellungen und Bildverarbeitungsparameter festgelegt. Die einzelnen Fluoreszenzkanäle wurden sequenziell aufgenommen, um eine Überlappung der Kanäle zu minimieren. Pro Tier wurden drei nicht überlappende Felder im ipsilateralen Hinterhorn erfasst. Die Fluoreszenzintensität wurde mit Bildanalyse-Software quantifiziert, nachdem eine Umwandlung in 8-Bit-Daten erfolgte, ein Hintergrundabzug anhand eines zellfreien Bereichs durchgeführt wurde und für jede Färbungsserie ein identischer Bereich von Interesse sowie ein einheitlicher Schwellenwert angewendet wurden; die Werte der Felder wurden gemittelt, um pro Tier einen einzelnen Wert zu erhalten. Felder mit Überbelichtung, Gewebefaltung, Einrissen, unscharfer Fokussierung oder ungleichmäßigem Hintergrund wurden ausgeschlossen und unter denselben nicht-sättigenden Einstellungen erneut aufgenommen. Die Färbung wurde akzeptiert, wenn die Gewebearchitektur intakt war, das Zielsignal über dem Signal der Kontrolle ohne Primärantikörper lag und keine größeren Falten, Einrisse oder gesättigten Bereiche die Analyse beeinträchtigten.

In vitro-Experimente mit primären spinalen Astrozyten

Primäre rattenliche spinale Astrozyten wurden unter standardmäßigen sterilen Bedingungen in vollständigem Kulturmedium bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO₂-Inkubator kultiviert. Die Zellen wurden verwendet, wenn sie eine Konfluenz von etwa 70–80 % erreicht hatten, und wurden den Gruppen Kontrolle, LPS-stimuliert, LPS + PPF, LPS + U0126 und ERK1/2-Rettung zugeordnet. PPF und U0126 wurden jeweils in einer Konzentration von 10 µM zugegeben. LPS-Stimulation, Behandlung mit Wirkstoffen und die Bedingungen der Zellgewinnung waren innerhalb jedes Experiments in parallelen Wells identisch. Zur Analyse der Wegselektivität wurden Zelllysate für die Westernblot-Detektion von p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, Gesamt-p38, p-JNK, Gesamt-JNK sowie der entsprechenden Ladekontrolle gesammelt. Kulturüberstände aus parallelen Wells wurden gesammelt, durch Zentrifugation geklärt und mittels enzymegebundener Immunosorbens-Assay (ELISA) gemäß den Herstelleranweisungen auf TNF-α, PGE2 und IL-6 analysiert. Die Densitometrie der Westernblots erfolgte nach denselben Bildanalyseprinzipien wie oben beschrieben. Bei Rettungsversuchen wurde das endogene ERK1/2 durch siRNA-Transfektion unterdrückt, und vor der Behandlung wurde ein konstitutiv aktiver ERK1/2-(CA-ERK1/2-)Expressionskonstrukt eingeführt. Die Effizienz der Genunterdrückung und Überexpression wurde vor der Interpretation der Zytokindaten durch Westernblotting bestätigt. Zellen, die dem Transfektionsreagenz ohne aktive siRNA oder Konstrukt ausgesetzt waren, dienten bei Bedarf als prozedurale Kontrollen.

Experimenteller Aufbau

Untergruppeneinteilung der Versuchstiere

Die Ratten wurden mithilfe einer Zufallszahltabelle sechs Gruppen zugeordnet, und die Gruppeneinteilung wurde vor der Verhaltensprüfung und der Gewebegewinnung abgeschlossen. Die sechs Gruppen umfassten eine Leergruppe (n = 6), eine Gruppe mit incisionellem Schmerz (IP; n = 18), eine Gruppe mit normalem Kochsalz (NS; 0,9 % NS, 10 µL; n = 9), eine PPF-Gruppe (10 µg in 10 µL; n = 12), eine Dimethylsulfoxid-Gruppe (DMSO; 10 % DMSO, 10 µL; n = 9) und eine U0126-Gruppe (10 µg in 10 µL; n = 12). Ratten der Leergruppe erhielten weder einen plantaren Einschnitt noch eine intrathekale Injektion und dienten als unbehandelte Kontrollen. Ratten der IP-Gruppe erhielten einen plantaren Einschnitt, ohne vorher eine intrathekale Injektion als Prämedikation zu erhalten. Ratten der NS-, PPF-, DMSO- und U0126-Gruppen erhielten 30 Minuten vor dem plantaren Einschnitt eine intrathekale Gabe des jeweiligen Wirkstoffs. Die NS-Gruppe diente als Vehikelkontrolle für PPF, während die DMSO-Gruppe als Vehikelkontrolle für U0126 fungierte.

Dosen von Propentofyllin und U0126

Propentofyllin ist ein glialer Modulator, und eine Dosis von 10 µg wurde gewählt, da sie in früheren Studien der Forschungsgruppe akute Hyperalgesie gelindert hatte. U0126 ist ein nicht-adenosintriphosphat-kompetitiver MEK1/2-Inhibitor, der zur Blockade der ERK1/2-Phosphorylierung eingesetzt wird. In verschiedenen Schmerzmodellen wurden wirksame intrathekale Dosen von 1–10 µg berichtet^30,31,32; im vorliegenden Versuch wurde die Dosis von 10 µg verwendet. U0126 wurde in 10 % Dimethylsulfoxid gelöst, während PPF in 0,9 %iger Kochsalzlösung gelöst wurde. Die endgültigen Konzentrationen betrugen 1 µg/µL. Arzneimittel und Applikationsmittel wurden vor der Operation hergestellt, bei 4 °C aufbewahrt und innerhalb von 12 Stunden verwendet.

Wirkung der präoperativen intrathekalen Verabreichung von Propentofyllin oder U0126 auf die Hyperalgesie

Sechs Ratten jeder Gruppe wurden zufällig für die Verhaltensmessung 24 h vor der Operation ausgewählt, und die resultierenden PWMTs und PWTLs wurden als Basiswerte festgelegt. Intrathekale Injektionen wurden 30 min vor der Operation verabreicht. Um die Wirkungen der präoperativen intrathekalen Verabreichung von PPF und U0126 auf mechanische und thermische Hyperalgesie zu bewerten, wurden PWMT und PWTL 2 h, 4 h, 8 h, 24 h und 72 h nach der Inzision bestimmt.

Experimenteller Versuchsplan zur Bewertung der Wirkungen einer präoperativen intrathekal verabreichten Gabe von Propentofyllin oder U0126 auf die Expression neuronaler und glialer Marker im Rückenmark nach einer Inzision

Um den geeigneten Zeitpunkt nach dem Einschnitt für die Beurteilung des Behandlungseffekts zu bestimmen, wurde zunächst eine vorläufige Zeitreihenanalyse in der IP-Gruppe durchgeführt. Konkret wurden Ratten der IP-Gruppe 2 h, 4 h, 24 h und 72 h nach dem Einschnitt euthanasiert, und die Expressionslevel der Zellmarker NeuN, GFAP und Iba-1 im Rückenmark wurden mittels Western Blot bestimmt (n = 3 pro Zeitpunkt). Aufgrund dieser vorläufigen Analyse wurden die ersten 4 h nach dem Einschnitt als frühes Beobachtungsfenster nach der Operation gewählt, da die NeuN-Expression zum Zeitpunkt von 4 h ihren höchsten Wert erreichte und da frühe molekulare Veränderungen als am relevantesten für die initiale Entwicklung der incisionellen Hyperalgesie angesehen wurden. Der Zeitpunkt von 4 h sollte jedoch nicht alle zeitlichen molekularen Veränderungen nach dem Einschnitt repräsentieren.

Zu diesem ausgewählten Zeitpunkt wurden Ratten, die eine intrathekale Injektion erhalten hatten, für die Western-Blot-Analyse verschiedener Zellmarker (n = 3 pro Gruppe) und die immunfluoreszenzgestützte Beurteilung der Morphologie unterschiedlicher Zelltypen (n = 3 pro Gruppe) euthanasiert. In der Leergruppe wurden Ratten zufällig getötet, um die Grundexpression verschiedener Zellmarker (NeuN, GFAP und Iba-1) im Rückenmark mittels Western Blot (n = 3) sowie die Morphologie unterschiedlicher Zellen (Neuronen, Astrozyten und Mikroglia) mittels Immunfluoreszenz (n = 3) zu bestimmen. Somit diente die Leergruppe als nicht incisierte, unbehandelte Basisgruppe zur Kontrolle.

Behandlungseffekte auf spinale p-ERK1/2 und entzündungsfördernde Mediatoren

Um den geeigneten Zeitpunkt nach dem Einschnitt zur Beurteilung der Behandlungseffekte auf die Expression von p-ERK1/2 und die Spiegel entzündlicher Zytokine zu bestimmen, wurde zunächst eine vorläufige Zeitreihenanalyse in der IP-Gruppe durchgeführt. Konkret wurden Ratten der IP-Gruppe 2 h, 4 h, 24 h und 72 h nach dem Einschnitt euthanasiert, und die spinale Expression von p-ERK1/2 wurde mittels Western Blot bestimmt (n = 3 pro Zeitpunkt). Basierend auf diesem Zeitverlaufsversuch sowie dem Zeitpunkt, zu dem die NeuN-Expression nach dem Einschnitt am höchsten war, wurde 4 h nach dem Einschnitt als fester Zeitpunkt für die anschließende Bewertung der Effekte einer präoperativen intrathekal verabreichten Gabe von PPF oder U0126 auf die spinale Expression von p-ERK1/2 und entzündliche Zytokine festgelegt. Dieser Zeitpunkt wurde als frühes mechanistisches Beobachtungsfenster gewählt und nicht als umfassende Darstellung aller zeitlichen Veränderungen nach dem Einschnitt.

Zu diesem gewählten Zeitpunkt wurden Ratten, die eine intrathekale Injektion erhalten hatten, zur Western-Blot-Analyse der Expression von p-ERK1/2 (n = 3 pro Gruppe) und zur immunfluoreszenzgestützten Beurteilung entzündlicher Zytokine (n = 3 pro Gruppe) euthanasiert. In der Leergruppe wurden Ratten zufällig getötet, um die Grundexpression von p-ERK1/2 im Rückenmark mittels Western Blot (n = 3) sowie von entzündlichen Zytokinen (TNF-α und COX-2) mittels Immunfluoreszenz (n = 3) zu bestimmen. Somit diente die Leergruppe als nicht incisierte, unbehandelte Basislinienkontrolle.

Zelluläre Lokalisation von spinalen p-ERK1/2 in Neuronen, Astrozyten und Mikroglia

Um die zelluläre Verteilung von p-ERK1/2 im Rückenmark nach dem Schnitt weiter zu untersuchen, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung in den Gruppen Blank und IP 4 h nach dem Schnitt durchgeführt (n = 3).

Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die Stichprobengröße wurde anhand früherer Studien der Forschungsgruppe und vorläufiger Experimente bestimmt. Verhaltensdaten wurden mittels zweifaktorieller Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (ANOVA) analysiert, wobei die Gruppe als zwischen den Probanden liegender Faktor und die Zeit als innerhalb der Probanden liegender Faktor berücksichtigt wurden. Zeitverlaufsdaten von Western Blots wurden mittels einfaktorieller ANOVA gefolgt von Bonferroni-korrigierten paarweisen Vergleichen ausgewertet. Western-Blot- und Immunfluoreszenzdaten zu festgelegten Zeitpunkten wurden mittels einfaktorieller ANOVA mit Bonferroni-korrigierten geplanten Vergleichen ausgewertet; Zweigruppenvergleiche wurden mittels Students t-Test durchgeführt. Die Normalverteilung und die Varianzhomogenität wurden mit dem Shapiro-Wilk-Test bzw. dem Levene-Test überprüft. Ein zweiseitiger p-Wert < 0,05 galt als signifikant. Die statistischen Analysen wurden mit der im Materialverzeichnis aufgeführten Statistiksoftware durchgeführt. Bei den in vitro-Astrozytenexperimenten wurden unabhängige Kulturexperimente als Analyseeinheit betrachtet; die Dichtometrie von Western Blots und die Zytokinkonzentrationen wurden je nach Fall mittels einfaktorieller ANOVA gefolgt von Bonferroni-korrigierten geplanten Vergleichen oder Students t-Test für vorab festgelegte Zweigruppenvergleiche verglichen.

VERFÜGBARKEIT VON DATEN:

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, sind in Supplementary File 1 enthalten.

Ergebnisse

Die Wirkungen einer Inzision und der präoperativen intrathekalen Verabreichung von Propentofyllin oder U0126 auf die Hyperalgesie nach einer Inzision

Mechanische Hyperalgesie

Es gab keine signifikanten Unterschiede in den PWMTs zwischen den sechs Gruppen 24 h vor der Operation (p > 0,05; Abbildung 1A,B). In der IP-Gruppe nahm die PWMT nach dem Einschnitt ab und blieb von 2 h bis 72 h nach dem Einschnitt signifikant niedriger als der Ausgangswert (p < 0,05 gegenüber Ausgangswert; Abbildung 1A). In den NS- und DMSO-Gruppen zeigten sich nach dem Einschnitt keine signifikanten Unterschiede in den PWMTs zwischen den Zeitpunkten (p > 0,05 gegenüber der IP-Gruppe; Abbildung 1B). In der PPF-Gruppe war die PWMT von 2 h bis 72 h nach dem Einschnitt signifikant höher als in der IP-Gruppe (p < 0,05 gegenüber der IP-Gruppe; Abbildung 1A), und 72 h nach dem Einschnitt unterschied sie sich nicht mehr signifikant vom Ausgangswert (p > 0,05 gegenüber Ausgangswert; Abbildung 1A). In der U0126-Gruppe waren die PWMTs während der ersten 24 h nach dem Einschnitt signifikant höher als in der IP-Gruppe (p < 0,05 gegenüber der IP-Gruppe; Abbildung 1A), doch dieser Effekt hielt bis 72 h nach dem Einschnitt nicht an, zu dem Zeitpunkt blieb die PWMT signifikant niedriger als der Ausgangswert und unterschied sich nicht mehr signifikant von der in der IP-Gruppe (p < 0,05 gegenüber Ausgangswert; p > 0,05 gegenüber der IP-Gruppe; Abbildung 1A).

Thermische Hyperalgesie

Es gab keine signifikanten Unterschiede in den PWTLs zwischen den sechs Gruppen 24 h vor der Operation (p > 0,05; Abbildung 1C,D). In der IP-Gruppe sank der PWTL von 24,85 s ± 1,06 s vor der Operation auf 4,38 s ± 1,02 s 4 h nach dem Schnitt und stieg anschließend teilweise auf 18,37 s ± 1,38 s 72 h nach dem Schnitt an, blieb jedoch während des gesamten Beobachtungszeitraums signifikant unter dem Ausgangswert (p < 0,05 gegenüber Ausgangswert; Abbildung 1C). In den NS- und DMSO-Gruppen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in den PWTLs zwischen den Zeitpunkten nach dem Schnitt (p > 0,05 gegenüber der IP-Gruppe; Abbildung 1D). In der PPF-Gruppe war der PWTL während des gesamten 72-h-Beobachtungszeitraums signifikant höher als in der IP-Gruppe (p < 0,05 gegenüber der IP-Gruppe; Abbildung 1C); 72 h nach dem Schnitt hatte er sich auf ein Niveau erholt, das nicht signifikant vom Ausgangswert abwich (p > 0,05 gegenüber Ausgangswert; Abbildung 1C). In der U0126-Gruppe war der PWTL während der ersten 24 h nach dem Schnitt signifikant höher als in der IP-Gruppe (p < 0,05 gegenüber der IP-Gruppe; Abbildung 1C); dieser Effekt hielt 72 h nach dem Schnitt nicht mehr an, zu diesem Zeitpunkt blieb der PWTL signifikant unter dem Ausgangswert und unterschied sich nicht mehr signifikant von dem der IP-Gruppe (p < 0,05 gegenüber Ausgangswert; p > 0,05 gegenüber der IP-Gruppe; Abbildung 1C).

Western-Blot-Analyse zeitlicher Veränderungen in der Expression von Markern für spinale Zellen und der Phosphorylierung der extrazellulären signalregulierten Kinase 1 und 2 nach Inzision

Es wurden mehrere Banden mit exakten molekularen Gewichten mittels eines spezifischen Antikörpers auf PVDF-Membranen nachgewiesen, darunter NeuN (48 und 50 kD), GFAP (50 kD), Iba-1 (17 kD), p-ERK1/2 (p-ERK1 = 44 kD; p-ERK2 = 42 kD), t-ERK1/2 (t-ERK1 = 44 kD; t-ERK2 = 42 kD) und GAPDH (36 kD). Die GAPDH-Bande diente als Kontrolle für NeuN, GFAP, Iba-1 und t-ERK1/2, und die t-ERK1/2-Bande wurde als Kontrolle für p-ERK1/2 verwendet.

Die Western-Blot-Daten der Rückenmarkproben der IP-Gruppe zeigten nach der Inzision Anstiege in unterschiedlichem Ausmaß (Abbildung 2A). Die Expression des neuronenspezifischen nukleären Proteins erreichte 4 h nach der Inzision ihren höchsten Wert (p < 0,001 gegenüber dem Ausgangswert; Abbildung 2A) und blieb 72 h nach der Inzision signifikant erhöht (p < 0,001 gegenüber dem Ausgangswert; Abbildung 2A). Die Konzentrationen des glialen fibrillären sauren Proteins stiegen im Verlauf des 72-stündigen Beobachtungszeitraums allmählich an (p < 0,001 gegenüber dem Ausgangswert; Abbildung 2A), wobei der höchste Wert unter allen untersuchten Zeitpunkten nach 72 h gemessen wurde. Ebenso stieg Iba-1 4 h nach der Inzision signifikant an (p < 0,001 gegenüber dem Ausgangswert; Abbildung 2A) und schwankte danach in einem engen Bereich. Bemerkenswerterweise zeigten die Western-Blot-Daten der Rückenmarkproben der IP-Gruppe, dass die Aktivierung von ERK1/2 nur während der ersten 24 h nach der Inzision zunahm (p < 0,05 gegenüber dem Ausgangswert; Abbildung 2B), jedoch 72 h nach der Inzision abnahm (p < 0,05 gegenüber dem Ausgangswert; Abbildung 2B), während die Expression von t-ERK/2 zu keinem Zeitpunkt eine signifikante Veränderung aufwies.

Western-Blot-Analyse der Wirkung der präoperativen intrathekalen Verabreichung von Propentofyllin oder U0126 auf die Expression von Zellmarkern und phosphoryliertem extrazellulärem signalreguliertem Kinase 1 und 2 im Rückenmark

Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die NeuN-Expression 4 h nach dem Einschnitt ihr Maximum erreichte, während die Verhaltensmessung zu diesem Zeitpunkt ihren niedrigsten Schwellenwert aufwies. Daher wurden die Auswirkungen einer intrathekalen Gabe von PPF und U0126 30 min vor der Operation auf die Expression von Zellmarkern und die Phosphorylierung von ERK1/2 4 h nach dem Einschnitt untersucht.

Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe die spinale Expression aller Zellmarker in der IP-Gruppe 4 h nach der Inzision signifikant erhöht war (p < 0,05 gegenüber Ausgangswert; Abbildung 3). Im Vergleich zur IP-Gruppe verringerte die präoperative intrathekale Gabe von PPF die spinale Expression von NeuN (p < 0,05 vs IP-Gruppe; Abbildung 3A), GFAP (p < 0,05 vs IP-Gruppe; Abbildung 3B) und Iba-1 (p < 0,01 vs IP-Gruppe; Abbildung 3C). Im Vergleich zur IP-Gruppe reduzierte auch die präoperative intrathekale Verabreichung von U0126 die spinale Expression von NeuN (p < 0,01 vs IP-Gruppe; Abbildung 3D), GFAP (p < 0,05 vs IP-Gruppe; Abbildung 3E) und Iba-1 (p < 0,01 vs IP-Gruppe; Abbildung 3F). Im Vergleich zur Kontrollgruppe blieb die NeuN-Expression in der PPF-Gruppe jedoch signifikant höher als der Ausgangswert (p < 0,01 vs Ausgangswert; Abbildung 3A), während die NeuN-Expression in der U0126-Gruppe signifikant niedriger lag als in der Kontrollgruppe (p < 0,01 vs Ausgangswert; Abbildung 3D). Bei GFAP und Iba-1 liegt der Schwerpunkt des Textes nun auf dem Vergleich mit der IP-Gruppe, wie in Abbildung 3 dargestellt. Die präoperative intrathekale Gabe von NS und DMSO hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Expression der untersuchten Zellmarker.

Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Expression von spinalen t-ERK1/2 zwischen den Gruppen Blank, IP, NS und PPF 4 h nach der Inzision nicht signifikant unterschiedlich war (Abbildung 4A). Im Gegensatz dazu war die Expression von p-ERK1/2 in den Gruppen IP und NS 4 h nach der Inzision im Vergleich zur Blank-Gruppe signifikant erhöht (p < 0,001 vs. Blank-Gruppe; Abbildung 4B). Im Vergleich zur IP-Gruppe reduzierte die präoperative intrathekale Gabe von PPF die Expression von p-ERK1/2 4 h nach der Inzision signifikant (p < 0,001 vs. IP-Gruppe; Abbildung 4B). Gegenüber der NS-Gruppe war die Expression von p-ERK1/2 in der PPF-Gruppe ebenfalls signifikant niedriger (p < 0,01 vs. NS-Gruppe; Abbildung 4B). Allerdings blieb die Expression von p-ERK1/2 in der PPF-Gruppe 4 h nach der Inzision im Vergleich zur Blank-Gruppe weiterhin signifikant erhöht. Ebenso unterschied sich die Expression von spinalen t-ERK1/2 zwischen den Gruppen Blank, IP, DMSO und U0126 4 h nach der Inzision nicht signifikant (Abbildung 4C). Im Vergleich zur Blank-Gruppe war die Expression von p-ERK1/2 in den Gruppen IP und DMSO 4 h nach der Inzision signifikant erhöht (p < 0,001 vs. Blank-Gruppe; Abbildung 4D). Im Vergleich zur IP-Gruppe verringerte die präoperative intrathekale Gabe von U0126 die Expression von p-ERK1/2 signifikant (p < 0,001 vs. IP-Gruppe; Abbildung 4D). Gegenüber der DMSO-Gruppe war die Expression von p-ERK1/2 in der U0126-Gruppe ebenfalls signifikant niedriger (p < 0,001 vs. DMSO-Gruppe; Abbildung 4D). Bemerkenswerterweise zeigte die Expression von p-ERK1/2 in der U0126-Gruppe 4 h nach der Inzision im Vergleich zur Blank-Gruppe keinen signifikanten Unterschied. Eine Vorbehandlung mit NS oder DMSO hatte im Vergleich zur IP-Gruppe keinen signifikanten Einfluss auf die Expression von p-ERK1/2.

Immunfluoreszenzbeobachtungen von Markern für Rückenmarkzellen und entzündungsfördernden Mediatoren

Die Ergebnisse der Immunfluoreszenz zeigten qualitativ eine stärkere NeuN-Immunreaktivität im ipsilateralen Hinterhorn 4 h nach dem Schnitt im Vergleich zur kontralateralen Seite (Abbildung 5). In der Kontrollgruppe zeigten repräsentative Aufnahmen die Grundwerte der NeuN-, GFAP- und Iba-1-Immunreaktivität im ipsilateralen dorsalen Rückenmarkshorn (Abbildung 6A–C). In der IP-Gruppe war die NeuN-Immunreaktivität qualitativ stärker als in der Kontrollgruppe (Abbildung 6D im Vergleich zu Abbildung 6A), die GFAP-Immunreaktivität ebenfalls stärker (Abbildung 6E im Vergleich zu Abbildung 6B) und die Iba-1-Immunreaktivität ebenfalls erhöht (Abbildung 6F im Vergleich zu Abbildung 6C). Gleichzeitig erschienen die Astrozyten und Mikrogliazellen in der IP-Gruppe hypertrophisch mit vergrößerten Zellkörpern sowie dickeren und stärker verzweigten Fortsätzen (Abbildung 6E,F).

In der PPF-Gruppe deuteten repräsentative Bilder auf eine schwächere NeuN-Immunreaktivität im Vergleich zur IP-Gruppe hin (Abbildung 6G im Vergleich zu Abbildung 6D), eine schwächere GFAP-Immunreaktivität (Abbildung 6H im Vergleich zu Abbildung 6E) und eine schwächere Iba-1-Immunreaktivität (Abbildung 6I im Vergleich zu Abbildung 6F). In der U0126-Gruppe deuteten repräsentative Bilder ebenfalls auf eine schwächere NeuN-Immunreaktivität im Vergleich zur IP-Gruppe hin (Abbildung 6J im Vergleich zu Abbildung 6D), eine schwächere GFAP-Immunreaktivität (Abbildung 6K im Vergleich zu Abbildung 6E) und eine schwächere Iba-1-Immunreaktivität (Abbildung 6L im Vergleich zu Abbildung 6F). In beiden Gruppen, der PPF- und der U0126-Gruppe, erschienen Astrozyten und Mikrogliazellen weniger hypertrophisch, mit kleineren Zellkörpern und weniger sowie dünneren Fortsätzen (Abbildung 6H,I,K,L). Die entsprechende Analyse der Fluoreszenzintensität von NeuN, GFAP und Iba-1 war konsistent mit den repräsentativen Immunfluoreszenzbeobachtungen (Abbildung 6M–O, jeweils).

4 h nach dem Schnitt waren die TNF-α- und COX-2-Immunreaktivität sowie die relative Fluoreszenzintensität im ipsilateralen Hinterhorn der IP-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöht. Beide Parameter waren nach präoperativer intrathekaler Behandlung mit PPF oder U0126 niedriger (Abbildung 7A–C).

Zelluläre Lokalisation von spinalen p-ERK1/2 mittels Immunfluoreszenz

Die Ergebnisse der Immunfluoreszenz zeigten, dass in der Kontrollgruppe die p-ERK1/2-Immunreaktivität im Rückenmark schwach war und nur in NeuN-positiven Neuronen beobachtet wurde (Abbildung 8A–C). Im Gegensatz dazu war die p-ERK1/2-Immunreaktivität 4 h nach dem Schnitt im ipsilateralen dorsalen Horn des Rückenmarks deutlich erhöht und ko-lokalisierte nicht nur mit Neuronen, sondern auch mit GFAP-positiven Astrozyten und Iba-1-positiven Mikrogliazellen (Abbildung 8D–I). Dieser Befund weist darauf hin, dass der Schnitt eine breitere zelluläre Verteilung von p-ERK1/2 induzierte, die sich von ausschließlich Neuronen unter Grundbedingungen auf Neuronen, Astrozyten und Mikrogliazellen nach der Verletzung ausweitete.

In-vitro-Validierung des ERK1/2-abhängigen Mechanismus in spinalen Astrozyten

Um weiter zu untersuchen, ob PPF die Freisetzung entzündungsfördernder Mediatoren über ERK1/2-vermittelte Signalwege auf zellulärer Ebene unterdrücken kann, wurden primäre spinale Astrozyten der Ratte mit LPS stimuliert und mit PPF oder U0126 (10 µM) behandelt. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass PPF die durch LPS induzierte Expression von p-ERK1/2 verringerte, während die Phosphorylierung von p-p38 und p-JNK nicht deutlich verändert war (Abbildung 9A), was unter diesen Bedingungen auf eine relative Selektivität des ERK1/2-Signalwegs hindeutet. Parallel dazu senkte PPF im Vergleich zur Stim-Gruppe die Konzentrationen von TNF-α, PGE2 (ein downstream Produkt der COX-2-Aktivität) und IL-6 im Kulturüberstand; U0126 zeigte ähnliche inhibitorische Effekte (Abbildung 9B).

Um zu überprüfen, ob eine anhaltende ERK1/2-Aktivierung die entzündungshemmende Wirkung von PPF abschwächen könnte, wurden Rettungsversuche durchgeführt. Endogenes ERK1/2 wurde mittels siRNA herunterreguliert, und anschließend wurde ein konstitutiv aktiver ERK1/2 (CA-ERK1/2)-Konstrukt eingeführt (Abbildung 9C). In Astrozyten, die CA-ERK1/2 exprimierten, verringerte PPF die Spiegel von TNF-α, PGE2 oder IL-6 nicht mehr in gleichem Maße (Abbildung 9D), was darauf hinweist, dass die Unterdrückung der ERK1/2-Phosphorylierung zur entzündungshemmenden Wirkung von PPF in diesem in vitro-Astrozyten-System beiträgt.

Zusammenfassend liefern diese in vitro-Befunde zelluläre Hinweise darauf, dass PPF die Freisetzung entzündungsfördernder Mediatoren über einen ERK1/2-abhängigen Mechanismus in spinalen Astrozyten abschwächt, was die in vivo-Beobachtungsdaten ergänzt.

Abbildung 1: Wirkungen einer präoperativen intrathekalen Gabe von PPF oder U0126 auf die durch einen Schnitt verursachte mechanische und thermische Hyperalgesie. (A) PWMT in den Gruppen „Blank“, IP, PPF und U0126. (B) PWMT in den Gruppen IP und Fahrzeugkontrolle. (C) PWTL in den Gruppen „Blank“, IP, PPF und U0126. (D) PWTL in den Gruppen IP und Fahrzeugkontrolle. Die Daten sind als Mittelwert ± SD angegeben (n = 6 Ratten pro Gruppe) und wurden mittels zweifaktorieller Varianzanalyse mit Messwiederholung ausgewertet. ***p < 0,001 im Vergleich zum Ausgangswert; #p < 0,05, ##p < 0,01 und ###p < 0,001 im Vergleich zur IP-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Zeitlicher Verlauf der Expression von Markern für Rückenmarkszellen und der Phosphorylierung von ERK1/2 nach dem Schnitt. (A) Quantifizierung und repräsentative Western Blots von NeuN, GFAP und Iba-1 in der IP-Gruppe vom Ausgangswert bis 72 h nach dem Schnitt. (B) Quantifizierung und repräsentative Western Blots von t-ERK1/2 und p-ERK1/2 über denselben Zeitraum. Die Werte wurden auf die Kontrollgruppe (100 %) normiert und sind als Mittelwert ± SD dargestellt (n = 3 Ratten pro Zeitpunkt). Gesamte Unterschiede wurden mittels einfaktorieller ANOVA mit den angegebenen paarweisen Vergleichen analysiert. *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 im Vergleich zum Ausgangswert. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Wirkungen einer präoperativen intrathekalen Gabe von PPF oder U0126 auf neuronale und gliale Marker im Rückenmark 4 h nach dem Schnitt. (A–C) NeuN, GFAP und Iba-1 in der Kontroll-, IP-, NaCl- und PPF-Gruppe. (D–F) NeuN, GFAP und Iba-1 in der Kontroll-, IP-, Dimethylsulfoxid- und U0126-Gruppe. Repräsentative Western Blots sind rechts dargestellt. Die Werte wurden auf die Kontrollgruppe (100 %) normiert und sind als Mittelwert ± SD angegeben (n = 3 Ratten pro Gruppe). *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 im Vergleich zur Kontrollgruppe; #p < 0,05 und ##p < 0,01 im Vergleich zur IP-Gruppe; Δp < 0,05, ΔΔp < 0,01 und ΔΔΔp < 0,001 im Vergleich zur entsprechenden Vehicle-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Wirkungen einer präoperativen intrathekalen Gabe von PPF oder U0126 auf die Phosphorylierung von spinalen ERK1/2 vier Stunden nach dem Schnitt. (A,B) t-ERK1/2 und p-ERK1/2 in der Kontrollgruppe, IP-, NaCl- und PPF-Gruppe. (C,D) t-ERK1/2 und p-ERK1/2 in der Kontrollgruppe, IP-, DMSO- und U0126-Gruppe. Repräsentative Western Blots sind rechts dargestellt. Die Werte wurden auf die Kontrollgruppe (100 %) normiert und als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben (n = 3 Ratten pro Gruppe). **p < 0,01 und ***p < 0,001 im Vergleich zur Kontrollgruppe; ###p < 0,001 im Vergleich zu IP; ΔΔp < 0,01 und ΔΔΔp < 0,001 im Vergleich zur entsprechenden Vehicle-Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Ipsilaterale und kontralaterale NeuN-Immunreaktivität im Rückenmark nach Inzision. Ein repräsentativer transversaler Abschnitt des Lendenrückenmarks aus der IP-Gruppe 4 h nach der Inzision zeigt NeuN-Färbung in den kontralateralen und ipsilateralen Hinterhörnern. Das Bild ist repräsentativ für n = 3 Ratten und dient dem qualitativen anatomischen Vergleich. Maßstab = 500 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Auswirkungen von PPF und U0126 auf die immunreaktive Aktivität von Spinalneuronen und Gliazellen 4 h nach dem Schnitt. (A–C) NeuN, GFAP und Iba-1 in der Kontrollgruppe. (D–F) Entsprechende Färbungen in der IP-Gruppe. (G–I) Entsprechende Färbungen nach PPF-Behandlung. (J–L) Entsprechende Färbungen nach U0126-Behandlung. (M–O) Relative Fluoreszenzintensitäten von NeuN, GFAP und Iba-1. Die Balken zeigen den Mittelwert ± SD (n = 3 Ratten pro Gruppe); *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 für die angegebenen Vergleiche. Maßstabsbalken = 200 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Spinal TNF-α- und COX-2-Immunreaktivität nach Inzision und Behandlung. (A) Repräsentative TNF-α- und COX-2-Bilder aus den Gruppen Kontrolle, IP, PPF und U0126 vier Stunden nach Inzision. (B) Relative TNF-α-Fluoreszenzintensität. (C) Relative COX-2-Fluoreszenzintensität. Die Balken zeigen Mittelwert ± SD (n = 3 Ratten pro Gruppe); ***p < 0,001 für die angegebenen Vergleiche. Maßstabsbalken = 200 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8: Zelluläre Lokalisation von p-ERK1/2 im Rückenmark 4 h nach dem Schnitt. (A–C) Doppelmarkierung von p-ERK1/2 mit NeuN, GFAP und Iba-1 im Leergruppenansatz. (D–F) Entsprechende Doppelmarkierungen in der IP-Gruppe; Pfeile kennzeichnen repräsentative Zellen mit Ko-Lokalisation. Rot zeigt p-ERK1/2 an, grün kennzeichnet das Zellmarkermolekül und gelb deutet auf Ko-Lokalisation hin. (G–I) Relative Fluoreszenzintensitäten in Bereichen, die positiv für NeuN, GFAP bzw. Iba-1 waren. Die Balken zeigen Mittelwert ± SD (n = 3 Ratten pro Gruppe); **p < 0,01 und ***p < 0,001 für die angegebenen Vergleiche. Maßstabsbalken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 9: ERK1/2-abhängige entzündungshemmende Wirkungen von PPF in primären spinalen Astrozyten der Ratte. (A) Repräsentative Western Blots, die zeigen, dass PPF die durch LPS induzierte p-ERK1/2 reduzierte, ohne offensichtlichen Effekt auf p-p38 oder p-JNK. (B) TNF-α-, PGE2- und IL-6-Konzentrationen in Kulturüberständen nach Behandlung mit LPS, PPF oder U0126. (C) Western Blots zur Bestätigung des siRNA-vermittelten ERK1/2-Knockdowns und der Expression von konstitutiv aktivem ERK1/2 (CA-ERK1/2). (D) TNF-α-, PGE2- und IL-6-Konzentrationen nach Expression von CA-ERK1/2 mit oder ohne PPF. Die Balken zeigen den Mittelwert ± SD unabhängiger in vitro-Experimente; ***p < 0,001 für die angegebenen Vergleiche; ns, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zusatzdatei 1: Daten zur Unterstützung der Ergebnisse dieser Studie.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die meisten Patienten leiden nach einer Operation unter akuten Schmerzen, nicht nur körperlich, sondern manchmal auch psychisch³³, doch über die detaillierten Mechanismen akuter postoperativer Schmerzen ist noch vieles unbekannt. Neben den wirksamen Eigenschaften von analgetischen Arzneimitteln treten unvermeidliche Nebenwirkungen auf, weshalb die Erforschung sicherer und wirksamer Analgetika von entscheidender Bedeutung ist. Diese Studie basierte auf einem zuvor validierten Rattenmodell mit chirurgischem Einschnitt zur Simulation akuter postoperativer Schmerzen, das einfach und praktikabel herzustellen war²⁷. Die vorliegende Studie untersuchte Veränderungen spinaler neuronaler und glialer Marker, der ERK1/2-Phosphorylierung sowie entzündungsfördernder Mediatoren nach dem Einschnitt und prüfte, ob die antihyperalgetische Wirkung einer präoperativen intrathekalen Gabe von PPF mit parallelen Veränderungen der spinalen ERK1/2-Phosphorylierung und der Expression entzündlicher Zytokine verbunden war.

Nach der Inzision entwickelten Ratten der IP-Gruppe ausgeprägte mechanische und thermische Hyperalgesie, während die Vorbehandlung mit dem Fahrzeugmittel keinen nachweisbaren Einfluss auf verhaltensbezogene oder molekulare Ergebnisse hatte. Diese Befunde untermauern die Stabilität des Modells und deuten darauf hin, dass die beobachteten Effekte in den PPF- und U0126-Gruppen unwahrscheinlich auf das Injektionsverfahren oder das Fahrzeugmittel selbst zurückzuführen waren. Zudem sollte der Anstieg der NeuN-Expression nach der Inzision mit Vorsicht als Veränderung der Expression eines neuronalen Markers und nicht als direkter Nachweis neuronaler Aktivierung interpretiert werden. Insgesamt liefern diese Beobachtungen die Grundlage für die Untersuchung glialer und ERK1/2-bezogener Reaktionen in der frühen Entstehung von Inzisionsschmerz.

Es wurde gezeigt, dass Gliazellen eine wichtige Rolle bei der synaptischen Bildung, der synaptischen Informationsübertragung und -integration sowie der Regulierung der synaptischen Plastizität spielen. Die immunologischen und proinflammatorischen Funktionen von Gliazellen bei der Schmerzverarbeitung, insbesondere von aktivierten spinalen Astrozyten und Mikroglia, können die zentrale Sensibilisierung verstärken, die an der Vermittlung von Hyperalgesie und postoperativen Verhaltensänderungen beteiligt ist^7,34. Maladaptive neurologische Veränderungen im Rückenmark können zu einer erhöhten Reagibilität auf nozizeptive oder nicht-nozizeptive Reize führen. Zahlreiche Befunde deuten darauf hin, dass die Aktivierung spinaler Astrozyten und Mikroglia an der Entstehung und Aufrechterhaltung von Hyperalgesie in Modellen von spinalem Nervenverletzungen³⁵, durch Gewebestrukturinaktivator induzierten Schmerzen¹⁶, Schnittschmerzen^11,12 und Knochenkrebs-schmerzen^19,31 beteiligt ist. Daher scheint die Aktivierung spinaler Gliazellen ein gemeinsames Merkmal mehrerer Schmerzzustände zu sein, und eine weitergehende Untersuchung ihrer Rolle bei Schnittschmerzen könnte das derzeitige Verständnis der Mechanismen postoperativer Schmerzen erweitern.

Die vorliegenden Ergebnisse stützen die Ansicht, dass spinale Astrozyten und Mikrogliazellen an der frühen neuroinflammatorischen Reaktion nach einer Inzision beteiligt sind¹². Statt identische zeitliche Muster aufzuweisen, zeigten GFAP, Iba-1 und p-ERK1/2 teilweise unterschiedliche zeitliche Verläufe, was darauf hindeutet, dass verschiedene gliazellbezogene Prozesse zu unterschiedlichen Phasen der postoperativen Schmerzentwicklung beitragen könnten^31,35. Die Immunfluoreszenz-Befunde unterstützen diese Interpretation weiter, indem sie hypertrophe morphologische Veränderungen in Astrozyten und Mikrogliazellen nach der Inzision zeigen. Gemeinsam mit den Zunahmen der Immunreaktivität von TNF-α und COX-2 sind diese Beobachtungen vereinbar mit dem Konzept, dass gliazellassoziierte inflammatorische Signalwege zur akuten Inzisionshyperalgesie beitragen^7,36.

Propentofyllin, ein Derivat der Methylxanthin, wurde ursprünglich als zerebrovaskulär wirksames Medikament aufgrund seiner antiplättchenwirksamen Eigenschaften und seiner Unterstützung der Langzeitgedächtnisbildung untersucht³⁷. Doch die regulatorische Wirkung von PPF auf Gliazellen macht es auch potenziell als Analgetikum wertvoll. Studien zeigen, dass PPF die Aktivierung von Mikrogliazellen hemmen kann, indem es den Abbau von intrazellulärem cyclischem Adenosinmonophosphat inhibiert und die Wiederaufnahme von extrazellulärem Adenosin vermindert^4,5. In einer in vitro-Studie inhibierte PPF die Proliferation von Astrozyten, indem es den durch TNF-α induzierten mTOR-Signalweg (mammalian target of rapamycin) behinderte⁶. Somit ist es die regulatorische Wirkung von PPF auf Gliazellen, die dessen Beteiligung an der Modulation von Schmerzprozessen ermöglicht.

Der anhaltende antihyperalgetische Effekt von PPF in der vorliegenden Studie, zusammen mit der Verringerung der Expression von GFAP und Iba-1, stützt die Interpretation, dass eine Modulation der Gliazellen ein wichtiger Bestandteil der analgetischen Wirkung von PPF in diesem Modell darstellt. Frühere Studien haben ebenfalls darauf hingewiesen, dass PPF gliazellvermittelte entzündliche Signalwege in Schmerzzuständen unterdrücken könnte^5,31. Zudem legt die parallele Abnahme von TNF-α und COX-2 nahe, dass PPF die postoperative Schmerzempfindung teilweise durch Abschwächung gliazellassoziiierter entzündlicher Reaktionen verringern könnte. Da die vorliegenden Daten jedoch assoziativ und nicht mechanistisch sind, sollten diese Befunde als Hinweis auf eine Beteiligung der Gliazellen und nicht als Beweis für einen direkten kausalen Wirkmechanismus gewertet werden.

Die Beteiligung von ERK1/2, einem Paar wichtiger intrazellulärer, signalregulierter Kinasen, an der Entwicklung und Aufrechterhaltung verschiedener Schmerzprozesse (durch Vermittlung der neuronalen Erregbarkeit und synaptischen Plastizität im Gehirn und Rückenmark) ist nachgewiesen²¹. Beispielsweise zeigte eine Studie, dass die Injektion von Capsaicin oder Formalin einen kurzen und schnellen Anstieg von p-ERK1/2 im Rückenmark induzierte, die Aktivierung von ERK1/2 im Rückenmark jedoch deutlich länger andauerte nach Injektion von komplettem Freund-Adjuvans oder Bienenvenom (nach einer kurzen Latenzzeit)^38,39. Umgekehrt erreichte die Aktivierung von ERK1/2 im Rückenmark nach Nervenverletzung in einer anderen Studie extrem früh einen Höhepunkt und blieb über einen gewissen Zeitraum bestehen, wobei Hyperalgesie nach dem Peak von p-ERK1/2 auftrat³⁵. Daher kann die Phosphorylierung von ERK1/2 in unterschiedlichen Schmerzprozessen zu verschiedenen Zeitpunkten auftreten, und eine Hochregulation von p-ERK1/2 im Rückenmark könnte sowohl für die unmittelbare Induktion als auch für langfristige Genantworten von Bedeutung sein.

In der vorliegenden Studie stieg die durch den Schnitt induzierte Phosphorylierung von ERK1/2 innerhalb der ersten 24 h nach dem Eingriff im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant an, wobei die Expression von p-ERK1/2 nach 4 h nach dem Schnitt ihren Höhepunkt erreichte (wie zuvor beschrieben)²⁴, was mit dem Zeitpunkt übereinstimmt, zu dem die Expression von NeuN am höchsten war. Gleichzeitig zeigten die Ergebnisse der Immunfluoreszenz, dass die durch den Schnitt induzierte Phosphorylierung von ERK1/2 gleichzeitig in Neuronen, Astrozyten und Mikroglia im ipsilateralen dorsalen Horn des Rückenmarks auftrat, was die Ansicht stützt, dass ERK1/2-vermittelte Signalwege besonders für die frühe Phase der inkisionellen Hyperalgesie von Bedeutung sind. Außerdem verringerte die präoperative intrathekale Verabreichung von U0126 die Expression spinaler Glia-Marker, von NeuN und von p-ERK1/2 vier Stunden nach dem Schnitt und linderte sowohl die mechanische als auch die thermische Hyperalgesie in der frühen postoperativen Phase, was darauf hindeutet, dass das spinale p-ERK1/2 an der frühen Phase der akuten Hyperalgesie nach dem Schnitt beteiligt sein könnte. Da jedoch GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 und die Verhaltensausgänge unterschiedliche zeitliche Verläufe aufwiesen, sollte die vorliegende mechanistische Interpretation auf die frühe postoperative Phase, repräsentiert durch den Zeitpunkt von 4 h, beschränkt bleiben und nicht auf den gesamten postoperativen Zeitraum verallgemeinert werden.

Darüber hinaus verringerte die präoperative intrathekale Gabe von PPF in der vorliegenden Studie die Phosphorylierung von ERK1/2 vier Stunden nach dem Schnitt, was darauf hindeutet, dass die beobachteten Veränderungen der spinalen Expression von NeuN, GFAP und Iba-1 zumindest teilweise mit ERK1/2-vermittelten Signalwegen assoziiert sein könnten. Die präoperative intrathekale Gabe von U0126 verringerte ebenfalls die Immunreaktivität von TNF-α und COX-2, was eine mögliche Verbindung zwischen der Phosphorylierung von ERK1/2 und der Expression entzündlicher Mediatoren nach dem Schnitt unterstützt. Die zusätzlichen in vitro-Astrozytenexperimente, dargestellt in Abbildung 9, lieferten zelluläre Hinweise auf eine ERK1/2-abhängige antientzündliche Komponente, da eine anhaltende ERK1/2-Aktivierung die Fähigkeit von PPF abschwächte, die Freisetzung von TNF-α, PGE2 und IL-6 zu reduzieren. Da diese Rescue-Experimente jedoch in kultivierten Astrozyten und nicht im intakten Rückenmark durchgeführt wurden und da keine in vivo-Rescue- oder zelltypselektive Manipulation erfolgte, sollten die in vivo-Schlussfolgerungen weiterhin als unterstützend, jedoch nicht als definitive Beweise für einen kausalen, ERK1/2-abhängigen Mechanismus angesehen werden.

Um mögliche Zusammenhänge zwischen der Aktivierung von Gliazellen, der Expression von p-ERK1/2 und der Freisetzung entzündlicher Zytokine weiter zu diskutieren, wurden die mit Immunfluoreszenz beobachteten räumlichen Lokalisierungsmuster berücksichtigt. Nach der Inzision wurde p-ERK1/2 im dorsalen Horn des Rückenmarks 4 h nach der Inzision gemeinsam mit GFAP-positiven Astrozyten und Iba-1-positiven Mikrogliazellen exprimiert. In Kombination mit den Ergebnissen aus Western Blot und Immunfluoreszenz, die zeigen, dass sowohl PPF als auch U0126 mit einer verminderten Expression von p-ERK1/2, TNF-α und COX-2 assoziiert waren, legen diese Daten nahe, dass die Phosphorylierung von ERK1/2 in spinalen Gliazellen an der entzündlichen Reaktion nach einer Inzision beteiligt sein könnte. Die in vitro-Daten aus primären Astrozyten unterstützen zudem einen direkten zellulären Zusammenhang zwischen PPF-Behandlung, Unterdrückung von ERK1/2 und Freisetzung entzündlicher Mediatoren. Dennoch zeigen die in vivo-Befunde Assoziationen und behandlungsbedingte parallele Veränderungen, während die zellulären Experimente diese ergänzen, aber eine zellspezifische kausale Validierung in vivo nicht ersetzen. Da die Immunfluoreszenzanalyse auf einer begrenzten Anzahl von Tieren und Bildfeldern basierte, sollten diese Beobachtungen vorsichtig und im Zusammenhang mit den Western Blot- und in vitro-Ergebnissen interpretiert werden.

Mehrere prozedurale Schritte wirken sich überproportional auf die Reproduzierbarkeit aus. Die intrathekale Injektion erfordert sowohl eine charakteristische Schwanzreaktion als auch die Bestätigung durch Liquor cerebrospinalis; Widerstand während der Injektion, fehlende Bestätigung oder ein neues neurologisches Defizit sollten eine Ausschließung und nicht eine erneute Injektion an derselben Stelle nach sich ziehen. Das Verhaltenstest ist empfindlich gegenüber Akklimatisation, Haltungsbedingungen, Platzierung des Reizes und Erwartungen des Untersuchers, weshalb Verblindung, feste Zeitintervalle und konsistente Umgebungsbedingungen unerlässlich sind. Auch die Zeitpunkt der Gewebegewinnung, der einheitliche Proteinentransfer, die Antikörperinkubation sowie identische Mikroskopie-Einstellungen innerhalb jeder Färbungsserie sind von gleicher Bedeutung. Zu den häufigen Problemen zählen variable Withdrawal-Schwellen aufgrund unzureichender Akklimatisation, schwache oder ungleichmäßige Western-Blot-Banden infolge unvollständigen Transfers oder Überbelichtung sowie ein hoher Fluoreszenz-Hintergrund aufgrund ungenügender Waschschritte, zu hoher Antikörperkonzentration oder gesättigter Aufnahme-Einstellungen.

Das Protokoll kann je nach wissenschaftlicher Fragestellung angepasst werden. Ein breiterer Zeitverlauf kann verwendet werden, wenn späte gliale Reaktionen von Interesse sind, und Dosis-Wirksamkeitsreihen oder alternative Applikationswege können hinzugefügt werden, wenn die Übertragbarkeit im Vordergrund steht. Im Vergleich zu entzündlichen oder neuropathischen Schmerzmodellen ist das Plantarinzisionsmodell relativ schnell und praktikabel und reproduziert eine definierte postoperative Verletzung²⁷. Die Kombination von Verhaltensanalysen, Western Blotting und zellassoziierte Immunfluoreszenz liefert komplementäre funktionelle, molekulare und räumliche Informationen; es ist jedoch ressourcenintensiver als ein Einzelendpunkt-Assay und allein nicht ausreichend, um zellspezifische Kausalität nachzuweisen. Ein pharmakologischer Vergleich mit U0126 stärkt die Interpretation des Signalwegs, bleibt jedoch weniger spezifisch als genetische oder zelltypselektive Manipulation^{20,21,22,23,24,25}.

Zukünftige Anwendungen umfassen die Untersuchung beider Geschlechter, größere chirurgische Verletzungen, klinisch machbare Applikationswege, zusätzliche postoperative Zeitpunkte sowie Interventionen, die gezielt auf bestimmte gliale Zellpopulationen abzielen. Der Arbeitsablauf eignet sich gut zur Untersuchung potenzieller analgetischer oder glial-modulierender Therapien, da das Inzisionsmodell kurz ist, die Verhaltensendpunkte wiederholbar sind und die molekularen Assays Standardlaborverfahren nutzen. Die Reproduzierbarkeit hängt dennoch von vorab festgelegten Ausschlusskriterien, einer verblindeten Outcome-Beurteilung, konsistenter Bildaufnahme und einer vollständigen Dokumentation der Rohdaten und Analyseeinstellungen ab.

Einschränkungen

Die vorliegende Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Erstens stellt das Modell des plantaren Pfotenschnitts eine vergleichsweise geringfügige chirurgische Verletzung dar und spiegelt möglicherweise nicht größere chirurgische Eingriffe wie eine Thorakotomie oder Laparotomie vollständig wider. Daher ist Vorsicht geboten, wenn die hier vorgestellten Ergebnisse auf andere Formen von postoperativen Schmerzen übertragen werden. Zudem wurden ausschließlich männliche Sprague–Dawley-Ratten verwendet, was die Generalisierbarkeit der Ergebnisse hinsichtlich des Geschlechts einschränkt. Angesichts der bekannten geschlechtsspezifischen Unterschiede in Schmerzreaktionen, analgetischen Wirkungen und Aktivierungsmustern von Gliazellen sind weitere Studien unter Einbeziehung weiblicher Tiere erforderlich.

Die wichtigsten molekularen und histologischen Beobachtungen konzentrierten sich auf den Zeitpunkt 4 h nach der Inzision. Da verschiedene Endpunkte, einschließlich GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 und Verhaltensausgänge, unterschiedliche zeitliche Profile nach der Inzision zeigten, sollte die mechanistische Interpretation der vorliegenden Ergebnisse hauptsächlich auf das frühe postoperative Stadium beschränkt bleiben. Darüber hinaus wurden die molekularen Experimente hier mit einer relativ geringen Stichprobengröße durchgeführt, was die statistische Aussagekraft dieser Beobachtungen möglicherweise verringert.

Die extrazelluläre signalregulierte Kinase 1 und 2 wurden gemeinsam als p-ERK1/2 bewertet; ihre individuellen Beiträge wurden nicht separat untersucht. Daher konnten die jeweiligen Rollen von ERK1 und ERK2 bei der schmerzbedingten Verarbeitung nach einem Schnitt in der vorliegenden Studie nicht bestimmt werden. Außerdem basierte die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität auf einer begrenzten Anzahl von Tieren und Bildfeldern und beinhaltete keine stereologischen Zellzählungen oder formellen Koeffizienten zur Ko-Lokalisation. Diese Beobachtungen sollten daher vorsichtig interpretiert werden, zusammen mit den Ergebnissen der Western Blot-Analyse.

Abschließend lässt sich sagen, dass zwar die in vitro-Astrozyten-Rettungsexperimente mechanistische Hinweise auf die ERK1/2-abhängige Regulation inflammatorischer Mediatoren lieferten, die upstream liegenden regulatorischen Vorgänge nach der Inzision sowie die downstream liegenden Vorgänge im intakten Rückenmarksgewebe jedoch nicht eingehend untersucht wurden. Das in vitro-Kultursystem kann außerdem die Interaktionen zwischen Neuronen, Astrozyten, Mikroglia und eindringenden Immunzellen im dorsalen Horn des Rückenmarks nicht vollständig reproduzieren. Die vorliegende Studie stützt daher einen mit ERK1/2 verbundenen Mechanismus, belegt jedoch keine vollständige in vivo-zelltypspezifische Kausalität.

Schlussfolgerung

Die vorliegende Studie zeigt, dass die durch einen Schnitt verursachten Anstiege der spinalen Expression von NeuN, GFAP und Iba-1 durch die präoperative intrathekale Gabe von PPF abgeschwächt wurden. Dieser Effekt ging einher mit einer Linderung akuter mechanischer und thermischer Hyperalgesie sowie mit einer Verringerung der ERK1/2-Phosphorylierung und der Expression von TNF-α und COX-2 nach dem Schnitt. Diese Befunde stützen jedoch lediglich (ohne definitive mechanistische Beweise zu liefern) einen Zusammenhang zwischen der antihyperalgetischen Wirkung von PPF und einer verminderten ERK1/2-Phosphorylierung in spinalen Gliazellen (in Verbindung mit reduzierter Expression inflammatorischer Mediatoren). Die antihyperalgetische Wirkung von PPF blieb während des gesamten Beobachtungszeitraums nach dem Schnitt bestehen, während die Wirkung des MEK1/2-Inhibitors U0126 hauptsächlich auf die frühe postoperative Phase beschränkt war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die ERK1/2-Signalübertragung besonders relevant während der frühen Entstehung von Schnittschmerz sein könnte. Die länger anhaltende Wirkung von PPF deutet darauf hin, dass ihr Wirkmechanismus zusätzliche Signalwege umfasst, die über eine alleinige Hemmung von ERK1/2 hinausgehen. Daher könnte PPF eher eine potenzielle therapeutische Intervention und nicht primär ein biologisches Ziel darstellen, um das Management akuter postoperativer Schmerzen zu verbessern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,01 M PBS-Puffer	Solarbio	P1020
1,0 M Tris-HCl-Puffer (pH 6,8)	Solarbio	T1020
1,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,8)	Solarbio	T1010
10% Natriumdodecylsulfat (SDS)	Solarbio	S1010
10× TBST-Standardlösung	Solarbio	T1081
30% Acrylamid	Solarbio	A1010
4× Protein-Lade-Puffer	Solarbio	P1041
Adobe Photoshop	Adobe	—
Ammoniumpersulfat	Solarbio	A1030
Automatische Schollen-Eismaschine	Changshu Xueke	IMS-40
Rinderserumalbumin (BSA)	Solarbio	A8020
Cryostat CM150	Leica	CM150
Digitaler pH-Meter	—	PHS-3C
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Solarbio	D8371
Elektronische Analysenwaage	Cany	—
Verstärktes Chemilumineszenz-(ECL-)Reagenz	Solarbio	PE0010
Film	Kodak	—
Fluoreszenzmikroskop DP71	Olympus	DP71
Einbettmedium für Gefrierschnitte	Sakura	4583
Gelelektrophoreseapparat	BIO-RAD	—
Glycerin	Solarbio	IG0910
Glycin	Solarbio	G8200
Ziegen-Anti-Maus-Alexa Fluor 594 Sekundärantikörper	Proteintech	SA00013-3
Ziegen-Anti-Maus-Horseradish-Peroxidase-konjugierter Sekundärantikörper	ZSGB-BIO	ZB2305
Ziegen-Anti-Kanin-Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper	Proteintech	SA00013-2
Ziegen-Anti-Kanin-Horseradish-Peroxidase-konjugierter Sekundärantikörper	ZSGB-BIO	ZB2301
Ziegenserum	Solarbio	SL038
GraphPad Prism	GraphPad Software	5
Kühlzentrifuge mit hoher Drehzahl 3K15	Sigma	3K15
Horizontaler Orbitalschüttler TS-1000	Haimen Qilinbeier	TS-1000
ImageJ	National Institutes of Health	1.51j8
Methanol	Tianjin Guangfu	—
Maus-Anti-Ratte GAPDH-Primärantikörper	Proteintech	60004-1-Ig
Maus-Anti-Ratte p-ERK1/2-Primärantikörper	CST	9101S
Na2HPO3	Tianjin Beichen Fangzheng	—
NaH2PO3	Tianjin Damao	—
Paraformaldehyd	Biosharp	BL539A
Mikroskopobjektträger für pathologische Untersuchungen	Shitai	—
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)	Beyotime	ST506
Plantar Test 37370	UGO BASILE	37370
Polyvinylidenfluorid-Membran	Solarbio	—
Propentofyllin (PPF)	Taosu	T19812
Kaninchen-Anti-Ratte COX-2-Primärantikörper	Abcam	Ab179800
Kaninchen-Anti-Ratte GFAP-Primärantikörper	Proteintech	16825-1-AP
Kaninchen-Anti-Ratte Iba-1-Primärantikörper	Proteintech	10904-1-AP
Kaninchen-Anti-Ratte NeuN-Primärantikörper	Abcam	Ab279297
Kaninchen-Anti-Ratte t-ERK1/2-Primärantikörper	Proteintech	11257-1-AP
Kaninchen-Anti-Ratte TNF-α-Primärantikörper	Proteintech	29652-1-AP
RIPA-Lysispuffer	Solarbio	R0010
SDS	Solarbio	S8010
Magermilchpulver	Solarbio	D8340
SPSS	IBM	22
Tetramethylethylendiamin (TEMED)	Solarbio	T8090
Tris	Solarbio	T8060
Triton X-100	Solarbio	T8200
U0126-EtOH	Selleck	S1102
Ultra-tieftemperaturgefrierschrank	Haier	—
Ultra-tieftemperaturgefrierschrank	Sanyo	—
Ultrapure-Wasser-Reinigungssystem	Heal Force	—
von-Frey-Fäden	North Coast Medical	—