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Forschungsartikel

Propentofyllin lindert incisionelle Hyperalgesie durch Regulierung der ERK1/2-Phosphorylierung in spinalen Astrozyten und Mikroglia

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DOI:

10.3791/70927

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14. August 2026

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1Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, 2Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht die Wirkung von intrathekal verabreichtem Propentofyllin auf die Abschwächung der incisionellen Hyperalgesie und ob dieser Effekt mit Veränderungen in spinalen glialen Markern sowie in der Phosphorylierung der extrazellulären signalregulierten Kinase 1 und 2 bei Ratten assoziiert ist.

Zusammenfassung

Spinale Astrozyten, Mikroglia und die extrazelluläre signalregulierte Kinase 1 und 2 (ERK1/2) sind an der Schmerzverarbeitung beteiligt. Diese Studie untersuchte, ob eine präoperative intrathekale Gabe von Propentofyllin (PPF) akute, durch einen Schnitt verursachte Hyperalgesie bei Ratten abschwächt und ob dieser Effekt mit spinalen Glia-Markern und der Phosphorylierung von ERK1/2 assoziiert ist. Sechsundsechzig männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden zufällig auf leere, Schnittschmerz-, normales Kochsalzlösungs-, Dimethylsulfoxid-, PPF- und U0126-Gruppen verteilt. Mechanische und thermische Hyperalgesie wurden zum Grundwert sowie 2, 4, 8, 24 und 72 h nach dem Schnitt bewertet. Spinale neuronale und gliale Marker, p-ERK1/2 sowie entzündliche Mediatoren wurden mittels Western Blotting und Immunfluoreszenz analysiert. Zusätzlich wurden Experimente mit primären spinalen Astrozyten durchgeführt, um die ERK1/2-abhängige Freisetzung entzündlicher Mediatoren zu untersuchen. Die präoperative intrathekale Gabe von PPF verringerte die mechanische und thermische Hyperalgesie während des gesamten 72-stündigen Beobachtungszeitraums, während U0126 die Hyperalgesie hauptsächlich in der frühen postoperativen Phase abschwächte. Vier Stunden nach dem Schnitt waren beide Behandlungen mit einer verminderten spinalen Expression von GFAP, Iba-1 und p-ERK1/2 sowie einer reduzierten Immunreaktivität von TNF-α und COX-2 assoziiert. In kultivierten Astrozyten verringerte PPF die durch LPS induzierte Freisetzung entzündlicher Mediatoren, während eine konstitutiv aktive ERK1/2 diesen Effekt abschwächte. Diese Ergebnisse stützen eine Assoziation zwischen der antihyperalgetischen Wirkung von PPF und der Modulation spinaler glialer, ERK1/2-abhängiger und entzündlicher Reaktionen nach einem Schnitt.

Einleitung

Schmerzen nach operativen Einschnitten, eine häufige Form akuter Schmerzen nach chirurgischen Eingriffen, halten in der Regel nicht länger als 7 Tage an, weisen jedoch komplexe pathologische Mechanismen auf, die sich von denen entzündlicher und neuropathischer Schmerzen unterscheiden1,2. Wenn schneidende Schmerzen während ihrer Entstehung unzureichend kontrolliert werden, können sie sich weiter zu einem chronischen Schmerzsyndrom entwickeln, und ihr Charakter kann sich von akuten Gewebeschmerzen hin zu neuropathischen oder gemischten Schmerzen verändern3. Im Allgemeinen ist die Gabe von Analgetika wie Opioiden und nichtsteroidalen Antirheumatika die gebräuchlichste Form der Schmerzlinderung nach einem Einschnitt. Allerdings können bei kontinuierlicher oder hochdosierter Anwendung dieser Substanzen zahlreiche Nebenwirkungen auftreten, was die Notwendigkeit sichererer und wirksamerer analgetischer Strategien unterstreicht.

Zuverlässige wissenschaftliche Belege deuten darauf hin, dass Propentofyllin (PPF) die Hyperalgesie bei verschiedenen Schmerzprozessen lindert4,5. Darüber hinaus kann die analgetische Wirkung von PPF teilweise durch die Hemmung der spinalen Expression von mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPKs), wie p38 und c-Jun-N-terminalen Kinasen (JNKs), erreicht werden6. Obwohl die Wirkungen von PPF auf die p38- und JNK-Signalwege bereits belegt sind, blieb eine mögliche Modulation des extrazellulären signalregulierten Kinase-1- und -2-(ERK1/2)-Signalwegs, einer weiteren wichtigen MAPK-Unterfamilie, die an der Schmerzsignalübertragung beteiligt ist, bei akutem Schnittschmerz bisher unerforscht. Diese Wissenslücke ist insbesondere vor dem Hintergrund bedeutsam, dass die Aktivierung von ERK1/2 im Vergleich zu p38 und JNK unterschiedliche zeitliche und zelluläre Muster aufweist, was auf potenziell einzigartige therapeutische Ansatzpunkte hindeutet.

Gliazellen, einschließlich Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten, galten ursprünglich als verbindende und stützende Struktur des Nervengewebes. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass Astrozyten und Mikroglia eine wichtige Rolle bei der Regulierung der synaptischen Plastizität und der Weiterleitung von Schmerzinformationen spielen7. Als residente Makrophagen des Gehirns und des Rückenmarks können Mikroglia bereits in einem sehr frühen Stadium des Schmerzprozesses durch verschiedene extrazelluläre Stimulussignale aktiviert werden, anschließend proliferieren und große Mengen entzündungsfördernder Zytokine freisetzen, wodurch die Leitung von Schmerzsignalen vom Rückenmark zum Gehirn verstärkt wird8,9. Gleichzeitig können aktivierte Astrozyten die Freisetzung des erregenden Neurotransmitters Glutamat hochregulieren und Informationen direkt an sensorische Neuronen senden, indem sie die interzelluläre Kommunikation verstärken10.

Studien haben gezeigt, dass eine Aktivierung von Astrozyten im frühen Stadium (innerhalb der ersten 24 h) bei durch eine Inzision verursachten Schmerzen auftritt, während die Aktivierung von Mikrogliazellen deutlich später erfolgt11,12. Zudem wies eine Studie darauf hin, dass aktivierte Mikrogliazellen nur einen begrenzten Einfluss auf die mechanische Hyperalgesie bei durch Inzision verursachten Schmerzen haben13. Diese Befunde verdeutlichen, dass weiterhin offene Fragen bezüglich der unterschiedlichen Rollen von Astrozyten und Mikrogliazellen bei akuten Schmerzen bestehen. Propentofyllin, ein glial modulierendes Agens, wurde bereits als wirksam bei der Linderung von Hyperalgesie berichtet, indem es die Aktivierung von Astrozyten und Mikrogliazellen nach chronischer nervenkomprimierender Verletzung, akuter Nervenverletzung und akuter Gewebeverletzung reguliert4,5. Bislang ist jedoch nach bestem Wissen keine Studie dazu veröffentlicht worden, welche Wirkung PPF auf die Aktivierung von Astrozyten oder Mikrogliazellen bei akuten, durch Inzision verursachten Schmerzen hat.

Die extrazelluläre Signal-regulierte Kinase 1 und 2, eine wichtige MAPK-Unterfamilie, die abwärts von der durch Mitogene aktivierte Proteinkinase 1 und 2 (MEK1/2) aktiviert wird, ist weithin mit der nozizeptiven Verarbeitung und neuronalen Plastizität assoziiert14,15. Frühere Studien haben gezeigt, dass phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2) in spinalen Neuronen durch nozizeptive Reize induziert werden kann und auch in Astrozyten und Mikroglia bei entzündlichen oder neuropathischen Schmerzzuständen nachweisbar ist16,17,18,19. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die pharmakologische Hemmung des MEK1/2–ERK1/2-Signalwegs mechanische und thermische Hyperalgesie in mehreren Schmerzmodellen abschwächt20,21,22,23,24,25.

Die zelluläre Verteilung von spinalen ERK1/2, insbesondere in Astrozyten und Mikroglia, die durch einen akuten Schnitt aktiviert wird, sowie deren Rolle bei der schnittinduzierten Schmerzbildung ist jedoch bisher unzureichend geklärt. Frühere Studien der Forschungsgruppe deuten darauf hin, dass PPF die akute schnittbedingte Hyperalgesie bei Ratten lindert, indem es die spinale JNK- und p38-Signalübertragung reduziert; ob PPF jedoch auch die ERK1/2-vermittelte Signalübertragung in spinalen glialen Zellen während der schnittinduzierten Schmerzbildung moduliert, bleibt unklar. Daher sollte die vorliegende Studie als Erweiterung der bestehenden Konzepte zu glialen Zellen und MAPK-Signalwegen in der Schmerzforschung betrachtet werden und nicht als vollständig unabhängiges mechanistisches Paradigma. Ihr Hauptunterschied zu früheren Arbeiten liegt in der gezielten Betrachtung des akuten schnittbedingten Schmerzes, der Untersuchung von ERK1/2 statt p38/JNK als dem fokussierten MAPK-Komponenten und der Analyse der frühen spinalen zellulären Verteilung von p-ERK1/2 im Zusammenhang mit einer PPF-Behandlung.

Diese Studie wurde konzipiert, um zu untersuchen, ob eine präoperative intrathekal verabreichte Gabe von PPF die inkisionelle Hyperalgesie in einem Ratten-Plantar-Inzisionsmodell abschwächt und ob dieser Effekt mit der ERK1/2-Phosphorylierung oder Veränderungen in der Expression spinaler neuronaler und glialer Marker sowie entzündungsfördernder Mediatoren, Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) und Cyclooxygenase-2 (COX-2), assoziiert ist. Genauer gesagt unterscheidet sich diese Studie von früheren Berichten durch die Kombination einer Verhaltensbewertung mit einer zeitlich aufgelösten Western-Blot-Analyse; durch den pharmakologischen Vergleich mit dem MEK1/2-Inhibitor U0126; sowie durch die qualitative immunfluoreszenzgestützte Lokalisation von p-ERK1/2 in spinalen Neuronen, Astrozyten und Mikroglia innerhalb eines Modells für akuten inkisionellen Schmerz. Obwohl ihr mechanistisches Konzept auf früherer Literatur aufbaut, die eine Beteiligung glialer Modulation und MAPK-Signalgebung am Schmerz beschreibt, soll die vorliegende Arbeit zusätzliche Hinweise auf die mögliche Beteiligung spinaler, ERK1/2-vermittelter glialer Reaktionen in der frühen Phase der inkisionellen Hyperalgesie liefern.

Im Vergleich zu herkömmlichen postoperativen Analgetika können zielgerichtete Ansätze eine definierte Signalkomponente testen, bieten jedoch möglicherweise nur zeitlich begrenzte Vorteile und erfordern oft eine invasive Applikation; die Hemmung von MEK1/2–ERK1/2 hat in mehreren experimentellen Schmerzmodellen antihyperalgetische Wirkungen gezeigt20,21,22,23,24,25. PPF unterscheidet sich von einem einzelnen Pfadinhibitor, da es gliale Reaktionen moduliert und mit mehr als einem MAPK-assoziierten Prozess in Verbindung gebracht wurde4,5,6. Die praktische Übertragung bleibt durch das präklinische Design, die präoperative intrathekale Verabreichung, die ausschließliche Verwendung männlicher Ratten sowie das Fehlen von Dosis-Wirkungs-Untersuchungen und Sicherheitsstudien in größeren chirurgischen Modellen eingeschränkt.

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Protokoll

Die durchgeführten Experimente wurden von dem Ethikkomitee des Zweiten Angegliederten Krankenhauses der Lanzhou-Universität, Provinz Gansu, China, genehmigt (Ethikgenehmigungsnummer 2017-070). Alle Verfahren folgten den Richtlinien der International Association for the Study of Pain26. Insgesamt wurden 66 erwachsene männliche Sprague–Dawley-Ratten aus einem akkreditierten Laboratoriumstierzentrum mit einem Gewicht von 200–250 g verwendet. Nur männliche Ratten wurden in diese Studie eingeschlossen, um potenzielle Variabilität aufgrund geschlechtsabhängiger hormoneller Einflüsse zu reduzieren. Alle Protokolle wurden gemäß den Richtlinien der International Association for the Study of Pain26 durchgeführt, und es wurden alle erforderlichen Maßnahmen unternommen, um Leid zu minimieren. Detaillierte Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien, Verbrauchsmaterialien, Instrumenten und Software finden sich in der Tabelle der Materialien.

Tiere

Die Ratten wurden vor der Operation paarweise und nach der Inzision einzeln mit Futter und Wasser gehalten. ad libitumDer Raum wurde bei einem 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Wechsel und einer Temperatur von 24 °C ± 2 °C gehalten.

Intrathekale Injektion und Modell für incisionelle Schmerzen

Für die intrathekale Applikation von Lösungen wurden Ratten mit 1,5–3 % Sevofluran (über eine Nasenkonne) anästhesiert und in Bauchlage mit gebeugter Wirbelsäule positioniert. Das Fell im lumbalen Bereich wurde rasiert und die Haut über dem Zwischenwirbelraum L5–L6 desinfiziert. Eine Mikrospritze wurde perkutan in den Zwischenwirbelraum L5–L6 eingeführt. Ein erfolgreicher Zugang zum Subarachnoidalraum zeigte sich durch ein plötzliches Zucken oder Bewegen des Schwanzes während der Nadelvorschub und wurde zusätzlich durch das Auftreten von Liquor cerebrospinalis bei leichter Aspiration bestätigt. Falls diese Zeichen nicht beobachtet wurden, wurde die Nadellage vor der Injektion korrigiert. Die Injektion erfolgte erst, nachdem beide Bestätigungskriterien erfüllt waren; Tiere, die nach der Injektion abnorme neurologische Symptome zeigten, wurden ausgeschlossen. Die jeweilige Lösung wurde anschließend langsam injiziert, und die Haut wurde nach der Injektion erneut gereinigt. Der chirurgische Eingriff dauerte etwa 3 min, und die Ratten erholten sich im Allgemeinen innerhalb von 5–10 min von der Anästhesie.

Das Rattenmodell für incisionelle Schmerzen wurde wie zuvor beschrieben etabliert27. Nach der Anästhesie wurde die plantare Fläche der Hinterpfote mit 10 % Povidon-Jod desinfiziert. In die plantare Haut wurde ein 1 cm langer Längsschnitt gesetzt, der etwa 0,5 cm von der Ferse entfernt begann und in Richtung der Zehen verlief. Der Schnitt durchdrang Haut und Faszie. Der Musculus plantaris wurde vorsichtig mit okularen Pinzetten angehoben und unter Erhaltung der gesamten Gewebeintegrität longitudinal incidiert. Anschließend wurde das Muskelgewebe repositioniert, sanfter Druck zur Erzielung der Hämostase ausgeübt, und die Wunde wurde mit zwei Matratzen-Nähten aus 3-0-Nylon verschlossen. Die Operationsstelle wurde nach der Naht erneut desinfiziert. Nach der Operation wurden die Tiere einzeln untergebracht und durften sich in einer ruhigen, warmen Umgebung erholen, geschützt vor starkem Licht und mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Die Tiere wurden postoperativ überwacht, und jene, die die vorab festgelegten Kriterien nicht erfüllten, wurden umgehend ausgeschlossen. Eine Wundinfektion wurde anhand von Rötung, Schwellung und erhöhter lokaler Temperatur um die Wunde herum, abnormalem gelb-grünem eitrigem Exsudat mit üblem Geruch, verzögerter Wundheilung mit anhaltender Wundöffnung, Nekrose und Zunahme der Wundgröße sowie systemischen Zeichen wie erhöhter Körpertemperatur, Lethargie und Futterverweigerung festgestellt. Weitere Ausschlusskriterien waren das Ausbleiben der Erholung von der Anästhesie innerhalb von 30 Minuten, intraoperative Muskelquerdurchtrennung oder neurovaskuläre Verletzung, postoperative Selbstverstümmelung, fehlgeschlagene Modellerstellung sowie neurologische Defizite wie Lähmung der Hintergliedmaßen oder Unfähigkeit, Gewicht zu tragen, die nicht auf die incisionellen Schmerzen zurückzuführen waren. Ratten mit Wundinfektion oder Wunddehiszenz wurden von der Studie ausgeschlossen.

Verhaltensmessung

Die mechanische Schwelle für die Pfotenrückzugsreaktion (PWMT) und die thermische Latenz für die Pfotenrückzugsreaktion (PWTL) wurden von einem Untersucher gemessen, der bezüglich der Gruppenzuteilung verblindet war. Die Tests wurden in einem ruhigen Raum zu einer konstanten Tageszeit durchgeführt, nachdem die Tiere sich mindestens 10 Minuten akklimatisiert hatten; die Umgebung, der Maschen- oder Glasboden, die Umgebungsbeleuchtung und die Intensität der Wärmequelle wurden zwischen den Gruppen konstant gehalten. Für die PWMT-Testung wurden kalibrierte von-Frey-Fäden (0,4 g, 0,6 g, 1,0 g, 1,4 g, 2,0 g, 4,0 g, 6,0 g, 8,0 g, 10,0 g und 15,0 g) senkrecht zur plantaren Oberfläche nahe der Wunde angelegt, bis sich der Faden um etwa 1–2 mm verbog. Aufeinanderfolgende Reize wurden durch 2 Minuten getrennt, und die 50 %-PWMT wurde nach der Auf-und-ab-Methode28 bestimmt. Für die PWTL-Testung wurden Ratten einzeln in transparente Behälter auf einen Glasboden gesetzt, und die Strahlungswärmequelle wurde mit der plantaren Fläche neben der Wunde ausgerichtet. Eine Obergrenze von 30 s verhinderte Gewebeschäden, aufeinanderfolgende Expositionen wurden durch 2 Minuten getrennt, und der Mittelwert aus drei Messungen wurde erfasst29. Ein positives Rückzugsverhalten galt als Pfotenheben, -schütteln oder -lecken; Versuche, die durch Pflegeverhalten, Fortbewegung oder Verlust der Ausrichtung zur Wärmequelle beeinträchtigt waren, wurden nach erneuter Akklimatisierung wiederholt.

Western-Blot-Analyse

Zu den voreingestellten Zeitpunkten wurden die Ratten durch Halswirbeldislokation euthanasiert und das L4–L6-Lendenmarkssegment rasch in Radioimmunpräzipitationspuffer (RIPA-Puffer), ergänzt mit Proteaseinhibitor im Verhältnis 100:1, entnommen. Das Gewebe wurde homogenisiert, 20 min auf Eis gehalten und bei 4 °C 20 min lang mit 15.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde im Verhältnis 3:1 mit 4×-Lade-Puffer vermischt, 5 min in siedendem Wasser erhitzt und bei −80 °C gelagert. Proteineproben (30 µg pro Lane) wurden auf 10 %igen Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen getrennt und auf 0,45- oder 0,22-µm-PVDF-Membranen (Polyvinylidenfluorid) übertragen. Der erfolgreiche Transfer wurde überprüft, indem die erwartete Wanderung des vorgefärbten Molekulargewichtsmarkers sowie das Fehlen offensichtlicher ungleichmäßiger oder unterbrochener Transferbereiche bestätigt wurden. Die Membranen wurden 2 h bei Raumtemperatur mit 5 % Magermilchpulver und 3 % Rinderserumalbumin blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen NeuN (1:8.000), GFAP (1:4.000), Iba-1 (1:3.000), p-ERK1/2 (1:1.000), t-ERK1/2 (1:3.000) oder GAPDH (1:2.000) inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen in Tris-gepuffertem Salzlösung, die 0,05 % Tween 20 (pH 7,4) enthielt, wurden die Membranen 1 h bei Raumtemperatur mit dem entsprechenden mit Peroxidase konjugierten sekundären Antikörper (1:5.000) inkubiert. Die Signale wurden mittels verstärkter Chemilumineszenz entwickelt und auf Film mit dem gleichen Belichtungsbereich innerhalb jedes Zielproteins aufgezeichnet. Ein Untersucher, der über die Gruppenzuteilung geblendet war, analysierte die Bandendichte mithilfe einer Bildanalyse-Software. Die Bilder wurden in 8-Bit-Graustufen umgewandelt, ein identisches rechteckiges Interessenareal wurde auf jede Bande angewendet, der lokale Hintergrund aus einem benachbarten leeren Bereich wurde subtrahiert und die integrierte Dichte wurde erfasst. Für alle Lanes eines Blots wurden dieselbe Arealgröße und dieselbe Hintergrundkorrektur verwendet. NeuN, GFAP, Iba-1 und t-ERK1/2 wurden auf GAPDH normalisiert; p-ERK1/2 wurde auf t-ERK1/2 normalisiert; die Werte wurden anschließend relativ zur Kontrollgruppe (Blank-Gruppe) ausgedrückt.

Immunfluoreszenz

Zu vorbestimmten Zeitpunkten wurden die Ratten mit 3 % Natriumpentobarbital (1,5 mL/kg) anästhesiert und über das Herz mit 300 mL vorgekühlter 0,01 mol/L Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS; pH 7,4) und anschließend mit 250 mL vorgekühltem 4 %igen Paraformaldehyd perfundiert. Das L4–L6-Rückenmark wurde anschließend 6 h in 4 %igem Paraformaldehyd fixiert, über Nacht bei 4 °C in 20–30 %iger Saccharose-PBS-Lösung kryoprotegiert und bei −22 °C in 10 µm dicke Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden in 0,01 mol/L PBS gewaschen, 1 h bei Raumtemperatur in 10 % Zieusersum blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern gegen NeuN (1:100), GFAP (1:1.000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) oder COX-2 (1:50) inkubiert. Nach drei Waschschritten in PBS wurden die Schnitte 1 h bei Raumtemperatur mit den entsprechenden grün- oder rotgefärbten sekundären Antikörpern (1:400) inkubiert, erneut dreimal in PBS gewaschen und mit einem Antifade-Medium unter einem Deckglas eingebettet. Als Negativkontrollen wurden in jeder Färbungsserie Schnitte ohne Zugabe des Primärantikörpers mitverarbeitet. Die Bildaufnahme erfolgte durch einen untersuchungsblinden Forscher mittels eines Fluoreszenzmikroskops. Übersichtsbilder mit niedriger Vergrößerung wurden mit einem 10×-Objektiv aufgenommen, während zelluläre Immunreaktivität und Bilder zur Ko-Lokalisation je nach entsprechendem Abbildungsteil mit 20×- oder 40×-Objektiven angefertigt wurden. Für Vergleiche innerhalb derselben Abbildung und Färbungsserie wurden nach Optimierung unterhalb der Sättigung die Objektivvergrößerung, Beleuchtungsintensität, Belichtungszeit, Detektorgewinnung, Kameraeinstellungen und Bildverarbeitungsparameter festgelegt. Die einzelnen Fluoreszenzkanäle wurden sequenziell aufgenommen, um eine Überlappung der Kanäle zu minimieren. Pro Tier wurden drei nicht überlappende Felder im ipsilateralen Hinterhorn erfasst. Die Fluoreszenzintensität wurde mit Bildanalyse-Software quantifiziert, nachdem eine Umwandlung in 8-Bit-Daten erfolgte, ein Hintergrundabzug anhand eines zellfreien Bereichs durchgeführt wurde und für jede Färbungsserie ein identischer Bereich von Interesse sowie ein einheitlicher Schwellenwert angewendet wurden; die Werte der Felder wurden gemittelt, um pro Tier einen einzelnen Wert zu erhalten. Felder mit Überbelichtung, Gewebefaltung, Einrissen, unscharfer Fokussierung oder ungleichmäßigem Hintergrund wurden ausgeschlossen und unter denselben nicht-sättigenden Einstellungen erneut aufgenommen. Die Färbung wurde akzeptiert, wenn die Gewebearchitektur intakt war, das Zielsignal über dem Signal der Kontrolle ohne Primärantikörper lag und keine größeren Falten, Einrisse oder gesättigten Bereiche die Analyse beeinträchtigten.

In vitro-Experimente mit primären spinalen Astrozyten

Primäre rattenliche spinale Astrozyten wurden unter standardmäßigen sterilen Bedingungen in vollständigem Kulturmedium bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO2-Inkubator kultiviert. Die Zellen wurden verwendet, wenn sie eine Konfluenz von etwa 70–80 % erreicht hatten, und wurden den Gruppen Kontrolle, LPS-stimuliert, LPS + PPF, LPS + U0126 und ERK1/2-Rettung zugeordnet. PPF und U0126 wurden jeweils in einer Konzentration von 10 µM zugegeben. LPS-Stimulation, Behandlung mit Wirkstoffen und die Bedingungen der Zellgewinnung waren innerhalb jedes Experiments in parallelen Wells identisch. Zur Analyse der Wegselektivität wurden Zelllysate für die Westernblot-Detektion von p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, Gesamt-p38, p-JNK, Gesamt-JNK sowie der entsprechenden Ladekontrolle gesammelt. Kulturüberstände aus parallelen Wells wurden gesammelt, durch Zentrifugation geklärt und mittels enzymegebundener Immunosorbens-Assay (ELISA) gemäß den Herstelleranweisungen auf TNF-α, PGE2 und IL-6 analysiert. Die Densitometrie der Westernblots erfolgte nach denselben Bildanalyseprinzipien wie oben beschrieben. Bei Rettungsversuchen wurde das endogene ERK1/2 durch siRNA-Transfektion unterdrückt, und vor der Behandlung wurde ein konstitutiv aktiver ERK1/2-(CA-ERK1/2-)Expressionskonstrukt eingeführt. Die Effizienz der Genunterdrückung und Überexpression wurde vor der Interpretation der Zytokindaten durch Westernblotting bestätigt. Zellen, die dem Transfektionsreagenz ohne aktive siRNA oder Konstrukt ausgesetzt waren, dienten bei Bedarf als prozedurale Kontrollen.

Experimenteller Aufbau

Untergruppeneinteilung der Versuchstiere

Die Ratten wurden mithilfe einer Zufallszahltabelle sechs Gruppen zugeordnet, und die Gruppeneinteilung wurde vor der Verhaltensprüfung und der Gewebegewinnung abgeschlossen. Die sechs Gruppen umfassten eine Leergruppe (n = 6), eine Gruppe mit incisionellem Schmerz (IP; n = 18), eine Gruppe mit normalem Kochsalz (NS; 0,9 % NS, 10 µL; n = 9), eine PPF-Gruppe (10 µg in 10 µL; n = 12), eine Dimethylsulfoxid-Gruppe (DMSO; 10 % DMSO, 10 µL; n = 9) und eine U0126-Gruppe (10 µg in 10 µL; n = 12). Ratten der Leergruppe erhielten weder einen plantaren Einschnitt noch eine intrathekale Injektion und dienten als unbehandelte Kontrollen. Ratten der IP-Gruppe erhielten einen plantaren Einschnitt, ohne vorher eine intrathekale Injektion als Prämedikation zu erhalten. Ratten der NS-, PPF-, DMSO- und U0126-Gruppen erhielten 30 Minuten vor dem plantaren Einschnitt eine intrathekale Gabe des jeweiligen Wirkstoffs. Die NS-Gruppe diente als Vehikelkontrolle für PPF, während die DMSO-Gruppe als Vehikelkontrolle für U0126 fungierte.

Dosen von Propentofyllin und U0126

Propentofyllin ist ein glialer Modulator, und eine Dosis von 10 µg wurde gewählt, da sie in früheren Studien der Forschungsgruppe akute Hyperalgesie gelindert hatte. U0126 ist ein nicht-adenosintriphosphat-kompetitiver MEK1/2-Inhibitor, der zur Blockade der ERK1/2-Phosphorylierung eingesetzt wird. In verschiedenen Schmerzmodellen wurden wirksame intrathekale Dosen von 1–10 µg berichtet30,31,32; im vorliegenden Versuch wurde die Dosis von 10 µg verwendet. U0126 wurde in 10 % Dimethylsulfoxid gelöst, während PPF in 0,9 %iger Kochsalzlösung gelöst wurde. Die endgültigen Konzentrationen betrugen 1 µg/µL. Arzneimittel und Applikationsmittel wurden vor der Operation hergestellt, bei 4 °C aufbewahrt und innerhalb von 12 Stunden verwendet.

Wirkung der präoperativen intrathekalen Verabreichung von Propentofyllin oder U0126 auf die Hyperalgesie

Sechs Ratten jeder Gruppe wurden zufällig für die Verhaltensmessung 24 h vor der Operation ausgewählt, und die resultierenden PWMTs und PWTLs wurden als Basiswerte festgelegt. Intrathekale Injektionen wurden 30 min vor der Operation verabreicht. Um die Wirkungen der präoperativen intrathekalen Verabreichung von PPF und U0126 auf mechanische und thermische Hyperalgesie zu bewerten, wurden PWMT und PWTL 2 h, 4 h, 8 h, 24 h und 72 h nach der Inzision bestimmt.

Experimenteller Versuchsplan zur Bewertung der Wirkungen einer präoperativen intrathekal verabreichten Gabe von Propentofyllin oder U0126 auf die Expression neuronaler und glialer Marker im Rückenmark nach einer Inzision

Um den geeigneten Zeitpunkt nach dem Einschnitt für die Beurteilung des Behandlungseffekts zu bestimmen, wurde zunächst eine vorläufige Zeitreihenanalyse in der IP-Gruppe durchgeführt. Konkret wurden Ratten der IP-Gruppe 2 h, 4 h, 24 h und 72 h nach dem Einschnitt euthanasiert, und die Expressionslevel der Zellmarker NeuN, GFAP und Iba-1 im Rückenmark wurden mittels Western Blot bestimmt (n = 3 pro Zeitpunkt). Aufgrund dieser vorläufigen Analyse wurden die ersten 4 h nach dem Einschnitt als frühes Beobachtungsfenster nach der Operation gewählt, da die NeuN-Expression zum Zeitpunkt von 4 h ihren höchsten Wert erreichte und da frühe molekulare Veränderungen als am relevantesten für die initiale Entwicklung der incisionellen Hyperalgesie angesehen wurden. Der Zeitpunkt von 4 h sollte jedoch nicht alle zeitlichen molekularen Veränderungen nach dem Einschnitt repräsentieren.

Zu diesem ausgewählten Zeitpunkt wurden Ratten, die eine intrathekale Injektion erhalten hatten, für die Western-Blot-Analyse verschiedener Zellmarker (n = 3 pro Gruppe) und die immunfluoreszenzgestützte Beurteilung der Morphologie unterschiedlicher Zelltypen (n = 3 pro Gruppe) euthanasiert. In der Leergruppe wurden Ratten zufällig getötet, um die Grundexpression verschiedener Zellmarker (NeuN, GFAP und Iba-1) im Rückenmark mittels Western Blot (n = 3) sowie die Morphologie unterschiedlicher Zellen (Neuronen, Astrozyten und Mikroglia) mittels Immunfluoreszenz (n = 3) zu bestimmen. Somit diente die Leergruppe als nicht incisierte, unbehandelte Basisgruppe zur Kontrolle.

Behandlungseffekte auf spinale p-ERK1/2 und entzündungsfördernde Mediatoren

Um den geeigneten Zeitpunkt nach dem Einschnitt zur Beurteilung der Behandlungseffekte auf die Expression von p-ERK1/2 und die Spiegel entzündlicher Zytokine zu bestimmen, wurde zunächst eine vorläufige Zeitreihenanalyse in der IP-Gruppe durchgeführt. Konkret wurden Ratten der IP-Gruppe 2 h, 4 h, 24 h und 72 h nach dem Einschnitt euthanasiert, und die spinale Expression von p-ERK1/2 wurde mittels Western Blot bestimmt (n = 3 pro Zeitpunkt). Basierend auf diesem Zeitverlaufsversuch sowie dem Zeitpunkt, zu dem die NeuN-Expression nach dem Einschnitt am höchsten war, wurde 4 h nach dem Einschnitt als fester Zeitpunkt für die anschließende Bewertung der Effekte einer präoperativen intrathekal verabreichten Gabe von PPF oder U0126 auf die spinale Expression von p-ERK1/2 und entzündliche Zytokine festgelegt. Dieser Zeitpunkt wurde als frühes mechanistisches Beobachtungsfenster gewählt und nicht als umfassende Darstellung aller zeitlichen Veränderungen nach dem Einschnitt.

Zu diesem gewählten Zeitpunkt wurden Ratten, die eine intrathekale Injektion erhalten hatten, zur Western-Blot-Analyse der Expression von p-ERK1/2 (n = 3 pro Gruppe) und zur immunfluoreszenzgestützten Beurteilung entzündlicher Zytokine (n = 3 pro Gruppe) euthanasiert. In der Leergruppe wurden Ratten zufällig getötet, um die Grundexpression von p-ERK1/2 im Rückenmark mittels Western Blot (n = 3) sowie von entzündlichen Zytokinen (TNF-α und COX-2) mittels Immunfluoreszenz (n = 3) zu bestimmen. Somit diente die Leergruppe als nicht incisierte, unbehandelte Basislinienkontrolle.

Zelluläre Lokalisation von spinalen p-ERK1/2 in Neuronen, Astrozyten und Mikroglia

Um die zelluläre Verteilung von p-ERK1/2 im Rückenmark nach dem Schnitt weiter zu untersuchen, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung in den Gruppen Blank und IP 4 h nach dem Schnitt durchgeführt (n = 3).

Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die Stichprobengröße wurde anhand früherer Studien der Forschungsgruppe und vorläufiger Experimente bestimmt. Verhaltensdaten wurden mittels zweifaktorieller Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (ANOVA) analysiert, wobei die Gruppe als zwischen den Probanden liegender Faktor und die Zeit als innerhalb der Probanden liegender Faktor berücksichtigt wurden. Zeitverlaufsdaten von Western Blots wurden mittels einfaktorieller ANOVA gefolgt von Bonferroni-korrigierten paarweisen Vergleichen ausgewertet. Western-Blot- und Immunfluoreszenzdaten zu festgelegten Zeitpunkten wurden mittels einfaktorieller ANOVA mit Bonferroni-korrigierten geplanten Vergleichen ausgewertet; Zweigruppenvergleiche wurden mittels Students t-Test durchgeführt. Die Normalverteilung und die Varianzhomogenität wurden mit dem Shapiro-Wilk-Test bzw. dem Levene-Test überprüft. Ein zweiseitiger p-Wert < 0,05 galt als signifikant. Die statistischen Analysen wurden mit der im Materialverzeichnis aufgeführten Statistiksoftware durchgeführt. Bei den in vitro-Astrozytenexperimenten wurden unabhängige Kulturexperimente als Analyseeinheit betrachtet; die Dichtometrie von Western Blots und die Zytokinkonzentrationen wurden je nach Fall mittels einfaktorieller ANOVA gefolgt von Bonferroni-korrigierten geplanten Vergleichen oder Students t-Test für vorab festgelegte Zweigruppenvergleiche verglichen.

VERFÜGBARKEIT VON DATEN:

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, sind in Supplementary File 1 enthalten.

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Ergebnisse

Die Wirkungen einer Inzision und der präoperativen intrathekalen Verabreichung von Propentofyllin oder U0126 auf die Hyperalgesie nach einer Inzision

Mechanische Hyperalgesie

Es gab keine signifikanten Unterschiede in den PWMTs zwischen den sechs Gruppen 24 h vor der Operation (p > 0,05; Abbildung 1A,B). In der IP-Gruppe nahm das PWMT nach dem Schnitt ab und blieb von 2 h bis 72 h n...

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Diskussion

Die meisten Patienten leiden nach einer Operation unter akuten Schmerzen, nicht nur körperlich, sondern manchmal auch psychisch33, doch über die detaillierten Mechanismen akuter postoperativer Schmerzen ist noch vieles unbekannt. Neben den wirksamen Eigenschaften von analgetischen Arzneimitteln treten unvermeidliche Nebenwirkungen auf, weshalb die Erforschung sicherer und wirksamer Analgetika von entscheidender Bedeutung ist. Diese Studie basierte auf einem zuvor validierten Rattenmodell mit chiru...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine persönlichen, finanziellen, kommerziellen oder akademischen Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Haijiao Zhou und Ming Wang für technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,01 M PBS-PufferSolarbioP1020
1,0 M Tris-HCl-Puffer (pH 6,8)SolarbioT1020
1,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,8)SolarbioT1010
10% Natriumdodecylsulfat (SDS)SolarbioS1010
10× TBST-StandardlösungSolarbioT1081
30% AcrylamidSolarbioA1010
4× Protein-Lade-PufferSolarbioP1041
Adobe PhotoshopAdobe—
AmmoniumpersulfatSolarbioA1030
Automatische Schollen-EismaschineChangshu XuekeIMS-40
Rinderserumalbumin (BSA)SolarbioA8020
Cryostat CM150LeicaCM150
Digitaler pH-Meter—PHS-3C
Dimethylsulfoxid (DMSO)SolarbioD8371
Elektronische AnalysenwaageCany—
Verstärktes Chemilumineszenz-(ECL-)ReagenzSolarbioPE0010
FilmKodak—
Fluoreszenzmikroskop DP71OlympusDP71
Einbettmedium für GefrierschnitteSakura4583
GelelektrophoreseapparatBIO-RAD—
GlycerinSolarbioIG0910
GlycinSolarbioG8200
Ziegen-Anti-Maus-Alexa Fluor 594 SekundärantikörperProteintechSA00013-3
Ziegen-Anti-Maus-Horseradish-Peroxidase-konjugierter SekundärantikörperZSGB-BIOZB2305
Ziegen-Anti-Kanin-Alexa Fluor 488 SekundärantikörperProteintechSA00013-2
Ziegen-Anti-Kanin-Horseradish-Peroxidase-konjugierter SekundärantikörperZSGB-BIOZB2301
ZiegenserumSolarbioSL038
GraphPad PrismGraphPad Software5
Kühlzentrifuge mit hoher Drehzahl 3K15Sigma3K15
Horizontaler Orbitalschüttler TS-1000Haimen QilinbeierTS-1000
ImageJNational Institutes of Health1.51j8
MethanolTianjin Guangfu—
Maus-Anti-Ratte GAPDH-PrimärantikörperProteintech60004-1-Ig
Maus-Anti-Ratte p-ERK1/2-PrimärantikörperCST9101S
Na2HPO3Tianjin Beichen Fangzheng—
NaH2PO3Tianjin Damao—
ParaformaldehydBiosharpBL539A
Mikroskopobjektträger für pathologische UntersuchungenShitai—
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)BeyotimeST506
Plantar Test 37370UGO BASILE37370
Polyvinylidenfluorid-MembranSolarbio—
Propentofyllin (PPF)TaosuT19812
Kaninchen-Anti-Ratte COX-2-PrimärantikörperAbcamAb179800
Kaninchen-Anti-Ratte GFAP-PrimärantikörperProteintech16825-1-AP
Kaninchen-Anti-Ratte Iba-1-PrimärantikörperProteintech10904-1-AP
Kaninchen-Anti-Ratte NeuN-PrimärantikörperAbcamAb279297
Kaninchen-Anti-Ratte t-ERK1/2-PrimärantikörperProteintech11257-1-AP
Kaninchen-Anti-Ratte TNF-α-PrimärantikörperProteintech29652-1-AP
RIPA-LysispufferSolarbioR0010
SDSSolarbioS8010
MagermilchpulverSolarbioD8340
SPSSIBM22
Tetramethylethylendiamin (TEMED)SolarbioT8090
TrisSolarbioT8060
Triton X-100SolarbioT8200
U0126-EtOHSelleckS1102
Ultra-tieftemperaturgefrierschrankHaier—
Ultra-tieftemperaturgefrierschrankSanyo—
Ultrapure-Wasser-ReinigungssystemHeal Force—
von-Frey-FädenNorth Coast Medical—

Referenzen

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