Identifikation modifizierter Histone als bindende Substrate des menschlichen Spindlin-Familienmitglieds 4 (SPIN4) mittels Peptidarrays und natives Nukleosomen-Pulldowns

Summary

Genetische Varianten im menschlichen Spindlin-Familienmitglied 4 (SPIN4) wurden kürzlich bei Patienten mit Knochenüberwucherung identifiziert, einer neuartigen Entwicklungsstörung. Ein Protokoll und neue Ergebnisse zur Beschreibung der biochemischen Identifikation modifizierter Histone im Kontext von Nukleosomen als SPIN4-bindende Substrate werden präsentiert.

Abstract

Das menschliche Spindlin-Familienmitglied 4 (SPIN4) hat sich gerade als neuartiger Regulator des Knochenwachstums etabliert. Funktionsverlust-Varianten bei SPIN4 wurden bei Patienten mit einem prä- und postnatalen Überwucherungssyndrom identifiziert, das auf X-chromobund-dominante Weise vererbt wird. SPIN4 enthält drei Tandemwiederholungen von Tudor-Domänen, die jeweils einen eigenen aromatischen Käfig bilden. Diese Tudor-Domänen gelten als epigenetische Lesedomänen für methylierte Arginin- und Lysinreste von Histonen, basierend auf der Sequenzhomologie. Die genauen Bindungssubstrate von SPIN4 bleiben jedoch unklar. Menschliches SPIN4 wurde sowohl in seiner Wildtyp- als auch in seiner krankheitserregenden mutierten Form erfolgreich über ein Insektenzellexpressionssystem erzeugt. Durch ein Histonmodifikations-Peptidarray wurden die unterschiedlichen Bindungsaffinitäten zwischen Wildtyp- und mutantem SPIN4 bestimmt. Funktionale Validierungen zeigten außerdem, dass SPIN4 ein echter Leser der Histon-H3-Lysin-4-Methylierung (H3K4me) ist, was durch biochemische Pulldowns nativer Mononukleosomen belegt wird. Dieser integrierte Ansatz ermöglicht eine schnelle Identifizierung epigenetischer Leseproteine als Bindungsziel.

Introduction

Spindlin-Familienmitglied 4 (SPIN4) ist epigenetischer Leser und wurde kürzlich mit dem Überwucherungssyndrom in Verbindung gebracht, wobei es eine Konstellation von prä- und postnatalem Überwuchern sowie große Körpergröße ^1,2 zeigt. Spin4-Knockout-(KO)-Mäuse wiederholten den exakten menschlichen Phänotyp, was die Kausalität unterstützte. Bis heute ist SPIN4 der einzige identifizierte exklusive epigenetische Leser, der das Knochenwachstum negativ reguliert. Die biochemischen Eigenschaften von SPIN4, einem wichtigen epigenetischen Leser für das Wachstum, sind jedoch noch nicht charakterisiert, was eine entscheidende Wissenslücke beim Verständnis der grundlegenden, krankheitserregenden Mechanismen dieser neuartigen Entwicklungsstörung hinterlässt. SPIN4 enthält drei Tandemwiederholungen von Tudor-Domänen, die allgemein als methylierte Arginin- oder Lysin-Histon-Leseprotein-Domänen³ angesehen werden. Eine SPIN4^{D82H-Missense-Variante} wurde kürzlich bei einer Patientin mit pränatalem und postnatalem Knochenüberwucherungssyndrom identifiziert. Diese Mutation betrifft die erste Tudor-Domäne von SPIN4; die relevanten Bindungssubstrate dieser Tudor-Domänen bleiben jedoch unklar, was die funktionelle Dissektion der SPIN4-abhängigen Regulation von Chromatin und Genexpression während der Knochenentwicklung einschränkt.

Die Identifikation neuer histon-bindender Substrate der Leserproteindomänen beruht nicht auf einem einheitlichen, standardisierten Ansatz. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) des Histons finden meist an Histonschweiften statt, die von den Kernnukleosompartikeln nach außen herausragen. Die Erkennung von PTMs auf Histonschwänzen durch Reader-Proteindomänen ist sehr variabel und erfordert oft multivalente, elektrostatische Wechselwirkungen zwischen nukleosomaler DNA, Linker-DNA und/oder anderen Histondomänen, um die Leser-Ziel-Interaktion kollektiv zu stabilisieren⁴. Derzeit wurden PTMs von Histonschwanzpeptiden in Form von Mikroarrays hergestellt und von mehreren^Anbietern kommerzialisiert. Obwohl das HPTONSCHWANZ-peptidbasierte Screening für bindende Ziele der Leserproteindomänen hochdurchsetzt ist, liefert es oft falsch-positive Treffer ohne Nukleosomen. Darüber hinaus sind die experimentellen Bedingungen für solche Screens hochgradig empirisch und variieren von Protein zu Protein, was sie technisch schwierig macht. Synthetisches nukleosombasiertes PTM-Screening oder Pulldown bietet eine deutlich robustere Anzeige, ist jedoch deutlich teurer und durchsatzarm, da die Rekonstituierung von Nukleosomen mit variablen Kombinationen von PTMs von Natur aus eine Herausforderung darstellt.

Dieses Protokoll beschreibt einen schnellen Ansatz zur Identifizierung von Histon-PTMs in Nukleosomen als bindende Ziele von SPIN4. Rekombinantes SPIN4 wurde rekonstruiert und gegen ein kommerzielles Histon-PTM-Peptidarray getestet, um potenzielle Bindungsziele zu identifizieren. Native Mononukleosomen mit verschiedenen endogenen Histon-PTMs wurden anschließend aus lebenden Zellen erzeugt. Der SPIN4-Pulldown von Mononukleosomen ermöglichte eine antikörperbasierte gezielte Validierung von Histon-PTMs nach dem ersten Screening. Diese integrierte biochemische Strategie demonstriert einen Proof-of-Principle-Ansatz für zeit- und kosteneffiziente Zielfindung und kann leicht angewendet werden, um bindende Substrate anderer schlecht charakterisierter epigenetischer Leseproteine zu identifizieren.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren mit HEK293FT Zellen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Biosafety Committee (IBC) der Virginia Commonwealth University durchgeführt.

1. Reinigung rekombinanter menschlicher SPIN4

1. Klone vollwertige Wildtyp-SPIN4 oder SPIN4^D82H mit einem N-terminalen 1× FLAG-Epitop-Tag in einen baculoviralen Vektor ^6,7.
2. Bereite Baculovirus vor, indem Sf9-Zellen mit baculoviralen Vektoren transfiziert werden, Viren entnommen werden, wenn die Zellen platzen, aliquotieren und das Virus bei −80 °C ^6,7 speichern.
3. In einer 500-ml-Erlenmeyer-Flasche werden 100 ml Wachstumsmedium, 1,5 × 10 8-Sf9-Zellen und 1 mL P1-Baculovirus hinzugefügt.
4. Inkubieren Sie die Kultur bei 27,5 °C in einem orbitalen Shaker-Inkubator mit 125 U/min für 72 Stunden im Dunkeln.
5. Reinigen Sie FLAG-SPIN4 mit FLAG-Affinitätsgel im BC150-Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren und elutieren Sie das Protein mit 1× FLAG-Peptid bei 0,1 mg/mL.
6. Um das 1× FLAG-Peptid vollständig zu entfernen, wird das elutierte FLAG-SPIN4 gegen den BC150-Proteinspeicherpuffer bei 4 °C in folgender Reihenfolge eingesetzt:
   1. Erste Dialyse: 1 L, 1 H.
   2. Zweite Dialyse: 2 L, über Nacht.
   3. Dritte Dialyse: 1 L, 1 H.
7. Konzentrieren Sie das dialysierte Protein auf das gewünschte Volumen (für SPIN4 von 600 μL bis 150 μL).
8. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bicinconinsäure-(BCA)-Test und berechnen Sie entsprechend die molare Konzentration.
9. Die Menge des bei jedem Reinigungsschritt gewonnenen Rohproteins und die entsprechenden geschätzten Erträge werden in der ergänzenden Tabelle 1 zusammengefasst. Die Reinigung erfolgte mit 250 mL Sf9-Kultur unter Verwendung von 400 μL Anti-FLAG-Affinitätsgel-Schlamm.
10. Verdünnen Sie konzentriertes SPIN4 um 10 × im BC150 Protein Storage Buffer (ergänzende Tabelle 2). Laden Sie 1, 2, 5, 10 und 20 μL auf ein 15%iges SDS–PAGE-Gel und visualisieren Sie es mit Coomassie-Blau-Färbung (Abbildung 1A).
11. Quantifizieren Sie die Bandintensität mit einer Bildanalyse-Software, um die relative Signalintensität zwischen Spuren mit gleicher Lautstärke zu bestimmen.
12. Teile das Intensitätsverhältnis durch das Molekulargewicht jedes Proteins, um das molare Verhältnis zu erhalten.
13. Verwenden Sie dieses Molarverhältnis, um die in Schritt 1.8 geschätzte Molarkonzentration zu korrigieren.
14. Aliquot gereinigtes Protein, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei −80 °C lagern. Für den kurzfristigen Gebrauch über Nacht bei 4 °C lagern, bevor Sie mit dem nächsten Experiment fortfahren.

2. Histonpeptid-Array

1. Bereiten Sie einen Peptidarray-Blockpuffer vor, indem Sie 5 g Bovine Serum Albumin (BSA) im BC150 Protein Storage Buffer auf ein Endvolumen von 100 ml auflösen.
2. Optional können Sie den Reaktionsbereich auf dem Peptidarray mit einem hydrophoben Markerstift markieren, um den Reagenzverbrauch zu minimieren.
3. Geben Sie mehrere Filterpapierblätter in eine 15 cm große Petrischale und befeuchten Sie sie mit Wasser.
4. Positionieren Sie die Peptidarrays auf den angefeuchteten Filterpapieren.
5. Füge vorsichtig einen 300-μL-Blockpuffer hinzu, um jeden Bereich des Arrays vollständig abzudecken.
6. Decken Sie die Petrischale ab und inkubieren Sie sie 1–3 Stunden bei Zimmertemperatur.
7. Bereiten Sie FLAG-SPIN4 im Blockpuffer auf eine Endkonzentration von 1 μM vor.
8. Bereite 1× FLAG-Peptid im Blockpuffer auf eine Endkonzentration von 1 μM vor.
9. Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern und unerwünschte Hintergründe zu reduzieren, führen Sie die folgenden Schritte in einem Kühlraum durch. Verschiebe die blockierten Arrays (mit der Petrischale) in den Kühlraum, bevor du Proteine hinzufügst.
10. Entferne überschüssigen Blockpuffer aus den Arrays.
11. Fügen Sie vorsichtig das gewünschte FLAG-SPIN4-Protein oder FLAG-Peptid als Kontrolle auf jeden Block hinzu.
12. Decken Sie die Petrischube ab und brüten Sie sie über Nacht im Kühlraum aus.
13. Gib etwa 50 ml Peptidarray-Waschpuffer in eine Western Blot Waschbox und bring sie in den Kühlraum.
14. Entsorgen Sie die Proteinlösung und übertragen Sie die Arrays sofort mit der Reaktionsseite nach oben in den Waschpuffer.
15. Waschen Sie die Arrays fünfmal wie folgt: die ersten beiden Waschen jeweils 1 Minute und die übrigen drei Waschen jeweils 5 Minuten.
16. Spülen Sie die Arrays mit einem Peptid-Array-Blockierungspuffer, um Rückstände des Waschmittels zu entfernen, und legen Sie sie dann zurück in die Petrischale.
17. Bereiten Sie Anti-FLAG-Antikörperlösung in 1:2000 Verdünnung vor und fügen Sie 300 μL pro Block hinzu.
18. Inkubieren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
19. Wiederhole die Schritte 2.14 bis 2.16, um die Arrays zu reinigen.
20. Bereiten Sie HRP-konjugierte Ziegen-Anti-Maus-IgG-Lösung (sekundäre Antikörper) in 1:6000-Verdünnung vor und fügen Sie 300 μL pro Block hinzu.
21. Inkubieren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
22. Wiederhole die Schritte 2.14 bis 2.16, um die Arrays zu reinigen.
23. Platziere die Arrays in einen transparenten Schutzfolie.
24. Fügen Sie etwa 1 ml Enhanced Chemiluminescence (ECL)-Substrat hinzu, um eine gleichmäßige Abdeckung der Reaktionsoberfläche zu gewährleisten.
25. Entfernen Sie Luftblasen und nehmen Sie chemilumineszente und hellfeldige Bilder mit einem geeigneten Bildgebungssystem (z. B. digitale Bildsensoren oder autoradiographische Filme) auf (Abbildung 1B).
26. Analysieren Sie die Signalintensität gemäß der Peptidarray-Software und den zugehörigen Online-Tools (Abbildung 2A–C).

3. Großformatige Ausdrucksweise von FLAG-SPIN4 für den Pulldown-Assay

1. In einem 500-mL Erlenmeyer-Kolben fügen Sie 125 mL ESF921-Medium, 1,8 × 10 8-Sf9-Zellen und 1,2 mL P1-Baculovirus hinzu, das FLAG-SPIN4 oder FLAG-SPIN4^D82H exprimiert.
2. Inkubieren bei 27,5 °C in einem Orbitalshaker-Inkubator (125 U/min) für 72 Stunden.
3. Aliquot die Kultur wie folgt:
   1. 4 ml Kultur in ein 15-ml-Rohr zur Titration.
   2. 30 mL Kultur in vier 50-mL-Röhren.
4. Zentrifugieren Sie die Röhren bei 600 × g für 15 Minuten und entsorgen Sie den Überstandsmittel.
5. Die Pellets in flüssigem Stickstoff einfrieren und bis zur Verwendung bei −80 °C aufbewahren.

4. Titration des Perlen-Lysat-Verhältnisses für FLAG-SPIN4 und FLAG-SPIN4^D82H

1. Fügen Sie jedem der Sf9-Pellets aus 5 mL der in Abschnitt 3, Schritt 3.1, beschriebenen Sf9-Kultur 1 ml BC150-Lysepuffer hinzu.
2. Sonikieren Sie die Lysate, um eine vollständige Störung zu gewährleisten: 30 % Amplitude, 5 Sekunden Ein/5 Sekunden Aus, für eine Gesamtsonikationszeit von 15 Sekunden.
3. Zentrifugieren Sie bei 20.000 × g, 4 °C, für 10 Minuten und übertragen Sie den Überstandsstoff auf frische 1,5-ml-Röhren.
4. Bereiten Sie für jede Pulldown-Reaktion eine 20 μL Anti-FLAG-Affinitätsgel-Schlamm vor (60 μL für 3 Titrationen)
5. Waschen Sie die Perlen mit BC150 Lysis-Puffer:
   1. Füge 1 mL BC150-Lysepuffer hinzu und wirbel kurzzeitig vor.
   2. Zentrifugiere bei 3.000 × g für 1 Minute.
   3. Aspiriere und entsorge das Supernatantant.
6. Setzen Sie die Perlen für jede 1 Pulldown-Reaktion (120 μL bei 3 Titrationen) in einen 40 μL BC150-Lysepuffer wieder auf.
7. Kombinieren Sie das Lysat in 1,5-mL-Röhren, die BC150-Lysispuffer und Perlensuspension enthalten (ergänzende Tabelle 3)
8. Inkubieren Sie die Röhren auf einem Röhrenrotator mit 15 U/min bei 4 °C für 1,5 Stunden.
9. Zentrifugiere bei 3.000 × g für 1 Minute und aspiriere das Supernatant.
10. Wasche die Perlen dreimal wie folgt:
    1. Perlen im 500 μL BC150 Lysepuffer wieder suspendieren und kurzzeitig vortexen.
    2. Zentrifugiere bei 3.000 × g für 1 Minute.
    3. Aspiriere das Supernatant.
11. Perlen in einem 20 μL 1× Laemmli-Puffer wieder suspendieren und 5 Minuten bei 95 °C inkubieren.
12. Zentrifugiere bei 3.000 × g für 1 Minute.
13. Verwenden Sie das Supernatant auf einem 15%igen SDS–PAGE-Gel und färben Sie mit Coomassie Blue, um den Proteinertrag zu schätzen.
14. Basierend auf den Daten wählen Sie ein Lysat-zu-Perlen-Verhältnis, das die Antikörperbindungsstellen der Perlen sättigt. In den Experimenten reichte ≥300 μL Lysat pro 20 μL Perlen aus, um die volle Bindungskapazität zu erreichen.
    HINWEIS: "Sättigung der Antikörperbindungsstellen" ist definiert als der Punkt, an dem die Erhöhung des Lysatvolumens nicht mehr zu einer besseren Erholung des Zielproteins führt.
    HINWEIS: Bei derselben Molarität zeigt SPIN4^D82H eine geringere Bindungsaffinität zum FLAG-Affinitätsgel als das Wildtyp-Gegenstück.
    HINWEIS: In diesem experimentellen Kontext wurde 1 ml Lysat aus 6 Millionen Sf9-Zellen gewonnen (berechnet als 1,5 × 10⁶ Zellen/mL × 4 mL), was darauf hindeutet, dass SPIN4, exprimiert aus ~6 Millionen Sf9-Zellen, ausreicht, um 20 μL Anti-FLAG-Affinitätsgel-Schlamm zu sättigen.

5. Großflächige Vorbereitung von anti-FLAG-Affinitätsgel-gebundenem FLAG-SPIN4 als Köder

1. Für jedes zu testende Protein werden zwei Pellets aus 30-mL-Kulturen gesammelt. Jedes Pellet wird in einem 6-mL BC150-Lysepuffer wieder suspendiert, in ein 15-mL-Zentrifugenrohr übertragen und das Gesamtvolumen mit BC150-Lysispuffer auf 13 mL eingestellt.
2. Sonikieren Sie jede Probe auf Eis mit 100 % Amplitude, 15 s ein/30 s aus, für eine Gesamtsonikationszeit von 2 Minuten.
3. Die Lysate werden in vorgekühlte Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhren übertragen und 15 Minuten lang bei 20.000 × g, 4 °C, zentrifugiert.
4. Fügen Sie 200 × (Anzahl der Proben + 1) × 1,1 μL Anti-FLAG-Affinitätsgel-Schlamm zu einem 1,5-mL Zentrifugenrohr hinzu.
5. Waschen Sie die Perlen einmal mit >5-Säulenvolumen (CV) BC150-Lysepuffer.
6. Setzen Sie die Perlen in 400 × (Anzahl der Proben + 1) × 1,1 μL BC150-Lysepuffer wieder auf.
7. Übertragen Sie die in Schritt 4 gewonnenen Supernatanten auf 15-mL-Zentrifugenröhren.
8. Fügen Sie 500 μL der Stufen-5,7-Perlenfederung zu jedem Rohr hinzu.
9. In einem Rohr wird 3 mL BC150-Lysepuffer und 60 μL 1× FLAG-Peptid (100 mM) als Negativkontrolle hinzugefügt.
10. Inkubieren Sie die Proben auf einem Röhrenrotator mit 120 U/min bei 4 °C für 1,5 Stunden.
11. Zentrifugiere bei 2.000 × g für 5 Minuten und entsorge das Supernatant.
12. Die Perlen in einer angemessenen Menge Supernatant wieder suspendieren und in 1,5-mL-Röhren übertragen.
13. Zentrifugiere bei 3.000 × g für 1 Minute und aspiriere das Supernatant.
14. Waschen Sie die Perlen fünfmal mit BC150-Lysepuffer wie folgt:
    1. Die Perlen in einem 1-mL BC150-Lysepuffer wieder suspendieren.
    2. Für die 4. und 5. Waschphase legen Sie die Proben auf einen Röhrenrotator mit 20 U/min bei 4 °C für 10 Minuten.
    3. Zentrifugieren Sie bei 3.000 × g für 1 Minute und aspirieren Sie das Supernatant.
15. Die Perlen in einem 200 μL BC150 Lysepuffer wieder suspendieren.
16. Nehmen Sie 9 μL der Bead/Puffer-Suspension und analysieren Sie den Proteingehalt mit 15 % SDS–PAGE, gefolgt von Coomassie-Blau-Färbung.
17. Da der Proteininput die Bindungskapazität der Kugeln übersteigt, sollte die Menge des Proteins pro Perlenvolumen in allen Proben ähnlich sein. Halbquantifizieren Sie die Bandintensität durch digitale Bildanalyse und passen Sie die Perlenmengen für nachfolgende Reaktionen an.

6. Herstellung von Mononukleosomen aus HEK293FT Zellen

1. Wachsen Sie HEK293FT Zellen in 15 cm Gewebekultur-Schalen mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) in DMEM-Medien bei 37 °C in einem 5 % CO-2-befeuchteten Inkubator auf etwa 90 % Konfluenz.
2. Frühe Durchgänge HEK293FT Zellen werden kommerziell gewonnen und durch STR-Profilierung authentifiziert.
   HINWEIS: Eine 15 cm große Schüssel ergibt ~27 Millionen Zellen, was für 1–2 Pulldown-Reaktionen reicht. Für sechs Reaktionen (einschließlich negativer Kontrollen) bereiten Sie mindestens drei 15-cm-Gerichte vor. Wenn die Zielhiston-posttranslationale Modifikation (PTM) selten oder instabil ist, wird die Zellzahl entsprechend um 2–10 erhöht×
3. (Optional) Je nach interessierender Histonmodifikation werden geeignete PTM-Inhibitoren (ergänzende Tabelle 2) in das Kulturmedium gegeben und 24 Stunden inkubiert.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann ausgelassen werden, wenn zahlreiche Histon-PTMs vorhanden sind.
4. Wenn die Zellen nahezu 100 % Konfluenz erreichen, sammeln Sie sie wie folgt:
   1. Aspiriere das Kulturmedium.
   2. Spülen Sie die Zellen vorsichtig mit 10 ml eiskaltem PBS ab und aspirieren Sie dann.
   3. Füge 5 ml eiskalten PBS hinzu.
   4. Kratze die Zellen auf Eis und übertrage sie in ein 50-mL-Rohr (alle Schüssel können kombiniert werden).
   5. Zentrifugiere bei 13.000 × g, 4 °C, für 10 Minuten.
   6. Entsorge das Supernatant.
5. (Optional) Entweder fahren Sie sofort fort oder frieren Sie das Zellpellet für spätere Verwendung ein:
   1. Schätzen Sie das Pelletvolumen.
   2. In 9 × Pelletvolumen von Puffer G erneut suspendieren, um eine endgültige Glycerolkonzentration von 20 % zu erreichen.
   3. Schnellfrieren Sie in flüssigem Stickstoff und lagern Sie bei −80 °C.
6. Wenn Sie mit gefrorenem Pellet fortfahren, tauen Sie das Pellet auf Eis auf, zentrifugieren Sie es bei 1.300 × g, 4 °C, für 5 Minuten und entsorgen Sie das Supernatantum.
7. Suspendieren Sie das (frische oder aufgetaute) Pellet in einem Pelletvolumen von 10 × TMSD-Puffer (40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 250 mM Saccharose, 1 mM DTT) mit Proteaseinhibitoren mit einer serologischen Pipette.
8. Bereiten Sie 10 % NP-40 frisch im TMSD-Puffer vor und fügen Sie 0,11× Gesamtreaktionsvolumen hinzu, um eine endgültige NP-40-Konzentration von ~1 % zu erreichen.
9. Inkubieren Sie die Federung auf einem Röhrenrotator mit 120 U/min bei 4 °C für 5 Minuten.
10. Mischen Sie 10 μL der Suspension mit 10 μL Trypanblau und beobachten Sie unter dem Mikroskop die Nuklearfärbung. Stellen Sie sicher, dass die Kerne vollständig vom Zytosol isoliert sind (Abbildung 3A).
11. Wenn etwa 95 % der Kerne Trypanblau-positiv sind, geht man zum nächsten Schritt über. Für HEK293FT Zellen reicht typischerweise eine Inkubation von 1 % NP-40 für 5 Minuten aus. Für andere Zelltypen überprüfen und passen Sie die Inkubationszeit an.
12. Zentrifugieren Sie bei 1.300 × g, 4 °C, für 5 Minuten und entsorgen Sie das Überstandsmittel.
13. Die Kugel in 10× Pelletvolumen des TMSD-Puffers wieder suspendieren.
14. Wiederholen Sie die Schritte 6.12 bis 6.13 fünfmal, um den restlichen NP-40 vollständig zu entfernen.
15. Das Pellet in 5× Pelletvolumen von Puffer B wieder suspendieren.
16. Fügen Sie 1 Einheit Mikrokokkalnuklease (MNase) pro 10.000 Kerne hinzu und inkubieren Sie in einem 37 °C Wasserbad. Bewegen Sie gelegentlich das Rohr während der Inkubation, damit die Kerne gleichmäßig wieder suspendiert bleiben
17. Zu den angegebenen Zeitpunkten (0,5, 1 und 2,5 H) werden 50 μL der Reaktion in 1,5-mL-Röhren entnommen, sofort 1 μL 0,5 M EDTA-Na (pH 8,0) hinzugefügt und vortexiert.
18. Extrahieren Sie DNA von jedem Zeitpunkt nach dem untenstehenden Verfahren:
    1. Fügen Sie 80 μL H₂O, 30 μL 10 % SDS und 20 μL 5 M NaCl hinzu; Wirbel.
    2. Fügen Sie 200 μL Phenol/Chloroform hinzu; Vortex gründlich.
    3. Zentrifuge bei 20.000 × g, RT, 3 Minuten.
    4. Übertragen Sie vorsichtig das Supernatant auf ein neues 1,5-ml-Rohr.
    5. Fügen Sie 1 ml 100 % Ethanol und 20 μL 3 M Natriumacetat (pH 5,2) hinzu; Wirbel.
    6. Zentrifuge bei 20.000 × g, RT, 5 Minuten.
    7. Entferne Supernatant, gib 1 ml 70% Ethanol dazu.
    8. Zentrifuge bei 20.000 × g, RT, 1 Min.
    9. Entferne das Überdachungsmittel und trockne das Pellet bei 55 °C mit offenem Deckel für 10 Minuten.
    10. Setzen Sie das Pellet in einen 50-μL-TE-Puffer wieder auf.
19. Nehmen Sie Proben mit einem 1%-TBE-Agarosegel, um die Größe der Mononukleosom-DNA (147 bp) zu bestätigen (Abbildung 3B).
20. (Optional) Die Verdauungseffizienz von Mikrokokkalnuklease (MNase) variiert je nach Zelltyp; bei Bedarf kann zusätzliches MNase mitten in der Reaktion hinzugefügt werden, um Polynukleosomen vollständig zu entfernen. Wenn zum Beispiel 1-Stunden- und 2-Stunden-Proben ähnlich erscheinen, fügen Sie bei 3 Stunden mehr MNase hinzu.
21. Wenn ein vorherrschendes ~147-bp-Band beobachtet wird oder zusätzliche MNase/verlängerte Inkubation die Fragmentgröße nicht mehr verändert, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 0,5 M EDTA-Na (pH8,0) zu einer Endkonzentration von 2 mM hinzufügen.
22. Zentrifugiere bei 1.300 × g, 4 °C, für 5 Minuten. Sammle das Supernatant (S1).
23. Das Pellet in 10× Pelletvolumen mit TE-Puffer + Proteaseinhibitoren wieder suspendieren und die Probe mindestens 30 Minuten auf einem Röhrenrotator mit 20 U/min bei 4 °C inkubieren.
    HINWEIS: Die Effizienz der Mononukleosomenextraktion variiert je nach Zelltyp. 0–300 mM NaCl können verwendet werden, um Nukleosomen effizient zu extrahieren.
24. Zentrifugiere bei 1.300 × g, 4 °C, für 5 Minuten. Sammle das Supernatant (S2).
25. Übertragen Sie jeweils 50 μL von S1 und S2 auf getrennte 1,5-mL-Röhren.
26. Analysieren Sie alle Fraktionen mittels Agarose-Gelelektrophorese (Schritte 6.17 bis 6.18), um die Verteilung der DNA-Größe und die Extraktionseffizienz zu bewerten. Die meisten Mononukleosomen befinden sich in der S2-Fraktion (Abbildung 3C).
27. S2 in Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhren übertragen und 10 Minuten lang bei 20.000 × g, 4 °C, drehen, um unlösliches Material zu entfernen.
28. Sammeln Sie das Supernatant und dialysieren Sie gegen den BC150-Lysepuffer (ohne Inhibitoren):
    1. Erste Dialyse: 1 L, 1 H.
    2. Zweite Dialyse: 2 L, über Nacht.
29. Nach der Dialyse wird erneut bei 20.000 × g, 4 °C, für 10 Minuten zentrifugiert, um verbleibende unlösliche Ablagerungen zu entfernen.
30. Sammle das letzte Supernatant.
31. Mische 5 μL des Supernatants mit 35 μL BC150 Lysepuffer und 10 μL 5× Laemmli-Puffer, erhitze bei 95 °C für 5 Minuten und fülle 1, 2, 5, 10 und 20 μL auf ein 15% SDS–PAGE Gel.
32. Last 1, 2 und 5 μL 0,1 mg/mL BSA im Laemmli-Puffer als Referenz für die Ausbeutesabschätzung.
33. Färben Sie mit Coomassie-Blau und schätzen Sie die Nukleosomenausbeute halbquantitativ mit einer Bildanalyse-Software (Abbildung 3D).

7. Modifizierter Nukleosomenpulldown

1. Bereiten Sie einen 2× Bead-Blocking-Puffer vor, indem Sie 1 g BSA im BC150-Lysepuffer auf ein finales Volumen von 10 ml auflösen und dann vortexen, bis es vollständig aufgelöst ist.
2. Übertragen Sie FLAG-SPIN4-WT und FLAG-SPIN4^D82H-Perlen mit entsprechenden molaren Proteinmengen (aus Abschnitt 5, Schritte 5.16 bis 5.17) in separate 1,5-mL-Röhren.
3. Fügen Sie ein gleiches Volumen negativer Kontrollkugeln (aus Abschnitt 5, Schritt 10) zur FLAG-SPIN4-WT-Probe hinzu.
4. Stellen Sie das Gesamtvolumen aller Perlenproben mit dem BC150-Lysepuffer so an, dass sie identisch sind.
5. Fügen Sie jedem Röhrchen mit Perlen ein gleiches Volumen von 2× Beadblocker hinzu und geben Sie einen BC150-Lysepuffer.
6. Inkubieren Sie die Proben auf einem Röhrenrotator mit 20 U/min bei 4 °C über Nacht (O/N).
7. Taue eine angemessene Menge von 1× Nukleosomen auf, die aus HEK293FT Zellen auf Eis extrahiert wurde. Das erforderliche Volumen hängt vom gewünschten Molarverhältnis von Nukleosomen zu SPIN4 ab. Zur anfänglichen Optimierung verwenden Sie ein 1:1-Molarverhältnis zwischen Nukleosom und SPIN4.
8. Mischen Sie 1× Nukleosom mit einem gleichen Volumen von 2× Perlenblockierungspuffer gründlich.
9. Kombinieren Sie die Mischung aus Schritt 7.8 mit den vorblockierten Perlen in einem 15-mL-Rohr.
10. Inkubieren Sie die Mischung auf einem Röhrenrotator mit 20 U/min bei 4 °C für 4 Stunden oder über Nacht.
11. Zentrifugiere bei 3.000 × g, 4 °C, für 3 Minuten.
12. Entsorge das Supernatant vorsichtig.
13. Die Perlen werden in einem 1-mL BC150-Lysepuffer wieder suspendiert und auf 1,5-mL-Röhren übertragen.
14. Wasche die Perlen dreimal wie folgt:
    1. Zentrifugiere bei 3.000 × g, 1 Minute, und aspiriere das Supernatant.
    2. Die Perlen in einem 1-mL BC150-Lysepuffer wieder suspendieren.
    3. Rühren Sie gelegentlich das Rohr, damit die Perlen beim Waschen gleichmäßig aufgehängt bleiben.
15. Waschen Sie die Perlen zweimal zusätzlich wie folgt:
    1. Zentrifugieren Sie mit 3.000 × g, 1 Minute, und aspirieren Sie das Überstandsmittel.
    2. Resuspendiere Perlen in einem 1 mL BC150-Lysepuffer.
    3. Drehen Sie bei 20 U/min, 4 °C, für 10 Minuten.
16. Nach dem Waschen werden die Perlen in 9-Säulen-Bänden (CV) des BC150-Lysepuffers wieder aufgehängt.
17. Nehmen Sie 160 μL aus jeder Probe, mischen Sie sie mit 40 μL 5× Laemmli-Puffer und erhitzen Sie sie bei 95 °C für 5 Minuten.
    HINWEIS: Eine Flag-Peptid-Elution des Protein-Nukleosom-Komplexes wird empfohlen, was sauberere Ergebnisse mit weniger Hintergrund liefert.
18. Zentrifugiere bei 3.000 × g, Raumtemperatur, für 5 Minuten.
19. Füllen Sie 5 μL des Supernatanten auf ein 15%iges SDS–PAGE-Gel und führen Sie eine Silberfärbung durch (Abbildung 4A).
20. Geben Sie weitere 5 μL des Supernatanten auf ein 15%iges SDS–PAGE-Gel, übertragen Sie es auf eine PVDF-Membran und sondieren Sie mit den entsprechenden primären und sekundären Antikörpern, die spezifisch für die Zielhiston-PTMs sind (Abbildung 4B).

Results

Um die bindenden Substrate des humanen SPIN4 zu untersuchen, wurden Wildtyp-SPIN4 und ein patientenabgeleiteter Mutant, der mit dem Überwuchssyndrom assoziiert ist, mittels eines Sf9-Insekten-Zellexpressionssystems rekonstituiert. Konkret handelt es sich dabei um eine Fehlinterpretation von Aspartinsäure (D) zu Histidin (H) am Rest 82 (D82H), die sich in der ersten Tudor-Domäne von SPIN4 befindet, was auf seine Rolle bei der Regulierung der Substratbindung von SPIN4 hindeutet. Ein baculo...

Discussion

Es wurde eine zeit- und kosteneffiziente Methode vorgestellt, um biochemisch spezifische Histon-PTMs als Ziele eines schlecht charakterisierten Proteins zu identifizieren und zu bewerten, wie seine krankheitsassoziierte Mutation die Bindungsaffinität des Ziels beeinflusst. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass keine teure oder zeitaufwändige Rekonstruktion synthetischer Nukleosomen erforderlich ist. Dieser Ansatz nutzte die Bequemlichkeit kommerzialisierter Histon-PTM-Peptidarra...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL Mikrozentrifugenröhren	Sarstedt	72.690.001	Allgemeine Experimente
15 cm Gewebekulturschale	Sarstedt	83.3903.300	Allgemeine Experimente
15-mL konische Zentrifugenröhren	Sarstedt	62.554.101	Allgemeine Experimente
50 mL konische Zentrifugenröhren	Sarstedt	62.548.004	Allgemeine Experimente
500 mL Erlenmeyer-Kolben	Stellar Scientific	CT229809	Sf9-Zellkultur
Amersham ImageQuant 800 CCD Imager	Cytiva	IMQ800	CCD-Bildgebungssystem
Anti-FLAG M2 Affinitätsgel	Sigma-Aldrich	A2220	Biochemischer Pulldown
Anti-FLAG M2-Antikörper	Sigma-Aldrich	F1804	Westlicher Blot
Aprotinin	MedChemExpress	HY-P0017	Proteaseinhibitor
Array-Analyse Sofrware	Aktives Motiv	https://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zip	MODified-Peptidarray-Datenanalyse
ASI Agarose LE	Alkali Scientific	A7700	DNA-Gel
Bac-to-Bac Baculovirus-Expressionssystem	Thermowissenschaftlich	10359016	Baculoviraler Ausdruck
Benzamidinhydrochlorid	MedChemExpress	HY-W018781	Proteaseinhibitor
Rinderserum-Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647	Proteinquantifizierungsstandard
Bromophenol Blue	Thermowissenschaftlich	A18469.08	Lammeli-Puffer
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermowissenschaftlich	20278	Proteien-Gel-Färbung
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D5545	Lysis-Puffer
EDTA	RPI-Forschungsprodukte	E58100	Lysis-Puffer
Verbessertes Chemilumineszenz-(ECL)-Substrat	Cytiva	RPN2232	Westlicher Blot
ESF 921 Insektenzellkulturmedium	Expressionssysteme	96-001	Sf9-Zellkultur
Ethanol (200 Proof)	Spektrumchemisch	ET107	DNA-Präzipitation
EVOS M5000 Bildgebungssystem	Invitrogen	M5000	Allgemeine Bildgebung
FLAG-Peptid	MedChemExpress	HY-P7006	Pulldown-Elution
Glycerol	Sigma-Aldrich	G77893	Speicherpuffer
H3K4me1 Antikörper	Aktives Motiv	39300	Westlicher Blot
H3K4ME2-Antikörper	Zellsignalübertragung	9725T	Westlicher Blot
H3K4me3-Antikörper	Zellsignalübertragung	9751T	Westlicher Blot
HEK293FT Zellen	Thermowissenschaftlich	R70007	Humane embryonale Nierenfibroblastzelllinie
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Lysis-Puffer
ImageJ	Nationale Gesundheitsinstitute	https://imagej.net/ij/download.html	Java-basiertes Bildverarbeitungsprogramm
Leupeptin-Hemisulfat	MedChemExpress	HY-18234A	Proteaseinhibitor
Mikrokokkalnuklease (MNase)	NEB	M0247S	Endonuklease für die Chromatinverdauung
Modell 120 Sonic Disembrator	Fisher Scientific	FB120110	Sonikation
MODifiziertes Histonpeptid-Array	Aktives Motiv	13005	Proteinbindungstest
Pepstatin A	MedChemExpress	HY-P0018	Proteaseinhibitor
Peroxidase-IgG-Fraktion monoklonaler Ziegen-Anti-Maus-IgG, leichtkettenspezifisch	Jackson ImmunoResearch	115-035-174	Westlicher Blot
pFastBac1-Flag-SPIN4	Thermowissenschaftlich	10360014	Baculoviraler Expressionsvektor
pFastBac1-Flag-SPIN4-D82H	Thermowissenschaftlich	10360014	Baculoviraler Expressionsvektor
Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1)	Sigma-Aldrich	P2069	DNA-Reinigung
Pierce Rapid Gold BCA Protein-Assay-Kit	Thermowissenschaftlich	PIA53226	Proteinquantifizierung
Pierce Silver Stain Kit	Thermowissenschaftlich	24612	Proteindetektion
PMSF-Proteasehemmer	Thermowissenschaftlich	36978	Proteaseinhibitor
Polyacrylamid-Gel	Intern hergestellt	N/A	Proteingel
Sf9-Insektenzellen	ATCC	CRL-1711	Insektenzelllinie zur Baculovirus-Expression
Slide-A-Lyzer MINI-Dialysegerät, 10K MWCO	Thermowissenschaftlich	69572	Proteindialyse
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	S8750	DNA-Präzipitation
Natriumchlorid	Fischer	BP358-1	Allgemeine Puffer
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	Allgemeine Puffer
Trypanblaue Lösung (0,4 %)	Thermowissenschaftlich	15250061	Kernfärbung