Schutz der Islet-Beta-Zellen vor durch Eisenüberlastung induzierten Schädigungen durch das lange, nicht-kodierende RNA mütterlich exprimierte Gen 3

Zusammenfassung

Eisenüberladung reduzierte die MEG3-Expression im Bauchspeicheldrüsengewebe. MEG3 könnte eine schützende Rolle gegen eiseninduzierte Insel-β-Zell-Apoptose spielen, was möglicherweise eine Modulation des NF-ĸB-Wegs beinhaltet. Dieser Mechanismus kann zu einer Inseldysfunktion bei Patienten mit β-TM mit Eisenüberlastung beitragen.

Zusammenfassung

Patienten mit Beta-Thalassämie major (β-TM) weisen häufig einen abnormalen Glukosestoffwechsel auf, und Faktoren wie Eisenüberlastung, chronische Anämie, hormonelle Ungleichgewichte, Leberfunktionsstörungen und entzündungsassoziierte Insulinresistenz gelten als wichtige Beitragende zur Dysfunktion der Bauchspeicheldrüseninsel. Lange nicht-kodierende Ribonukleinsäuren (lncRNAs) werden zunehmend für ihre regulatorische Rolle bei der Zellapoptose und der Glukosehomöostase anerkannt. Diese Studie untersucht die Funktion der lncRNA, dem mütterlich exprimierten Gen 3 (MEG3), bei eiseninduzierter Insel-β-Zell-Verletzung. Ein Eisenüberlast-Mausmodell wurde durch intraperitoneale Injektion von Eisendextran induziert. Eisenablagerung und Gewebeschäden in der Bauchspeicheldrüse wurden mittels Preußisch Blau sowie Hämatoxylin- und Eosinfärbung untersucht, und die MEG3-Expression wurde mittels Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) quantifiziert. In vitro wurden MIN6-Zellen mit MEG3 Small Interfering RNA transfektiert, um die Apoptose mittels Durchflusszytometrie zu untersuchen, und die Aktivität des NF-kappa (ĸ)B-Signalwegs wurde mittels Western Blotting bewertet. Die histologische Färbung bestätigte eine bedeutende Eisenablagerung und strukturelle Schäden im Bauchspeicheldrüsengewebe von eisenüberlasteten Mäusen. Die RT-PCR-Analyse zeigte eine deutliche Reduktion der MEG3-Expression in der Bauchspeicheldrüse (S<0,05). In vitro erhöhte MEG3-Knockdown die Apoptose von MIN6-Zellen signifikant im Vergleich zu Kontrollen. Die Western-Blot-Analyse zeigte einen erhöhten NF-ĸB-Spiegel, was auf die Aktivierung des NF-ĸB-Signalwegs in MEG3-gestillten Zellen hinweist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die MEG3-Downregulation die Apoptose der Insel-β-Zelle über NF-ĸB-Signalübertragung unter Eisenüberlastungsbedingungen verbessern kann. Das MEG3-Gen könnte eine schützende Rolle gegen eiseninduzierte Insel-β-Apoptose spielen, was möglicherweise eine Modulation des NF-ĸB-Wegs beinhaltet. Dieser Mechanismus kann zu einer Inseldysfunktion bei Patienten mit β-TM mit Eisenüberlastung beitragen.

Einleitung

Beta-(β)-Thalassämie sind eine Gruppe vererbter hämatologischer Erkrankungen, die durch eine verminderte oder fehlende Produktion der β-Globin-Kette gekennzeichnet sind, was zu chronischer Anämie und ineffektiver Erythropoiese^führt. Bei Patienten mit transfusionsabhängiger β-Thalassämie major (β-TM) führen wiederholte Bluttransfusionen und Hämolyse häufig zu einer systemischen Eisenüberlastung, die mehrere Organe schädigen und zu einer Reihe endokriner Komplikationen beitragen kann, darunter ein abnormer Glukosestoffwechsel². Darüber hinaus erhöht chronische Anämie die Belastung der Bauchspeicheldrüse, hormonelle Ungleichgewichte, die die Glukoseregulation beeinträchtigen, Leberfunktionsstörungen, die den Glukosestoffwechsel beeinträchtigen, und durch entzündliche Prozesse induzierte Insulinresistenz können alle zu Hyperglykämie bei Patienten mit β-TM beitragen. Daher sind Glukosestoffwechselstörungen in β-TM multifaktoriell ^2,3. Eine aktuelle Metaanalyse berichtete, dass die Prävalenz von beeinträchtigter Nüchternglukose, beeinträchtigter Glukosetoleranz (IGT) und Diabetes mellitus (DM) bei Patienten mit β-TM bei 17,21 %, 12,46 % bzw. 6,54 % betrug, was auf eine zunehmende Belastung durch Glukosestoffwechselstörungen in dieser Population hinweist³.

Trotz seiner zunehmenden klinischen Relevanz sind die zugrunde liegenden Mechanismen des abnormen Glukosestoffwechsels in β-TM weiterhin wenig verstanden. Frühere Studien haben gezeigt, dass chronische Eisenüberlastung, hauptsächlich durch wiederholte Transfusionen und Hämolyse, zu einer übermäßigen Eisenablagerung in der Bauchspeicheldrüse führen kann, insbesondere in Inselzellen β. Diese Ansammlung fördert die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und verschärft oxidativen Stress, was mitochondriale Dysfunktion auslöst, die Insulinsynthese und -sekretion beeinträchtigt und letztlich β-Zell-Apoptose und Insulinmangel auslöst ^4,6. Darüber hinaus kann eine Eisenüberladung durch oxidative, stressvermittelte Entzündungen und Störungen der Insulinsignalwege zur peripheren Insulinresistenz beitragen. Die molekularen Wege, die Eisenüberlastung mit β-Zellverletzung und systemischer Glukosedysregulation in Verbindung bringen, sind jedoch komplex und noch nicht vollständig geklärt. Lange nicht-kodierende Ribonukleinsäuren (lncRNAs) – eine Klasse von Transkripten, die länger als 200 Nukleotide sind und keine Proteine codieren – haben sich als wichtige Regulatoren in verschiedenen biologischen Prozessen etabliert, darunter Glukosehomöostase, Insulinsekretion und oxidative Stressreaktionen ^7,8,9. Pankreasinseln β Zellen sind dafür bekannt, über 1.000 lncRNAs zu exprimieren, was auf ihre potenzielle regulatorische Rolle bei der Erhaltung der endokrinen Funktion hindeutet.

Über die lncRNA-Expressionsprofile und ihre funktionelle Rolle im Zusammenhang mit durch Eisenüberladung induzierten Insel-β-Zellschaden, insbesondere bei β-TM, ist jedoch wenig bekannt. Jüngste Fortschritte zeigten, dass LncRNA MEG3 (MEG3) die Insulinsekretion fördert und die Apoptose der Bauchspeicheldrüsen-β-Zellen¹¹ hemmt. Seine Wirkung auf die β-Zellen der Bauchspeicheldrüse unter Eisenüberlastbedingungen bleibt jedoch schwer fassbar. In anderen pathologischen Kontexten wurde gezeigt, dass lncRNAs mit wichtigen Signalwegen wie NF-kappa (ĸ)B, JNK und Nrf2 interagieren, die ebenfalls an oxidativem Stress und eisenüberlastbedingter Zellverletzung^{beteiligt sind.} Konkret ist NF-ĸB ein zentraler Transkriptionsfaktor, der unter oxidativem Stress aktiviert wird und an der β-Zell-Apoptose unter Eisenüberlastbedingungen in Verbindung gebracht wird. 15,16,17. Daher untersucht diese Studie, ob die MEG3-Downregulation die Apoptose der β-Zell-Inseln über NF-ĸB-Signalübertragung unter Eisenüberlastbedingungen verbessern kann. Diese Arbeit könnte neue Einblicke in die molekularen Mechanismen liefern, die dem abnormalen Glukosestoffwechsel bei β-TM zugrunde liegen.

Protokoll

Die in der vorliegenden Studie verwendeten experimentellen Protokolle wurden vom Ethikausschuss des Hainan General Hospital genehmigt (Protokoll Nr. 2021-239). Der US National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals sowie die Declaration of Helsinki wurden in allen experimentellen Verfahren strikt befolgt. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Tiermodell und experimentelles Design

In dieser Studie wurden sechsunddreißig männliche C57BL/6J-Mäuse (4 Wochen alt, ca. 20 g) verwendet. Alle Mäuse wurden unter Standardlaborbedingungen (20–25 °C, 50%–65% relative Luftfeuchtigkeit, 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus) mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Nach einer 7-tägigen Akklimatisierungsphase wurden die Mäuse zufällig in zwei Gruppen (n=18 pro Gruppe) eingeteilt: die Eisenüberlastungsgruppe (Modellgruppe), die zweimal pro Woche für 4 Wochen intraperitoneale Injektionen von Eisendextran (0,2 g/kg) erhielt; und die Kontrollgruppe, die durch intraperitoneale Injektion äquivalente Mengen normaler Kochsalzlösung erhielt. Nach 4 Wochen wurden die Mäuse eingeschläfert und Bauchspeicheldrüsengewebe für eine anschließende Analyse entnommen.

2. Messung des Serumeisens

Blutproben wurden aus dem retro-orbitalen Sinus unter 1 % Pentobarbitalanästhesie während der Diestrus entnommen. Nachdem das Blut 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde, wurde es bei 4 °C, 3.000 U/min für 15 Minuten zentrifugiert. Das Serum wurde getrennt und bei -80 °C gelagert. Die Serumeisenkonzentrationen wurden mit einem kolorimetrischen Eisentestkit nach dem Protokoll des Herstellers bestimmt.

3. Histologische Analyse

Bauchspeicheldrüsengewebeproben wurden zur Fixierung in 4 % Paraformaldehyd eingetaucht, gefolgt von einer Paraffineinbettung vor der Schnittvorbereitung. Serielle Gewebeschnitte mit einer Dicke von 4–5 μm wurden gewonnen und mit standardmäßigen Deparaffinisations- und Rehydrationsverfahren verarbeitet. Die histomorphologische Untersuchung wurde anschließend mittels Hämatoxylin- und Eosinfärbung durchgeführt, während die Eisenablagerung im Bauchspeicheldrüsengewebe mittels Preußischer Blaufärbung nach konventionellen histologischen Färbungsprotokollen untersucht wurde.

4. Zellkultur und kleine interferierende Ribonukleinsäuretransfektion

Die MIN6-β-Zellen der Maus wurden im hochglukosereichen Eagle-Medium von Dulbecco kultiviert, ergänzt mit 15 % fetalem Rinderserum, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 10 mM HEPES, 50 mM Natriumpyruvat und 50 μmol/L β-Mercapttoethanol. Alle Experimente wurden bei 80 % Zellkonfluenz durchgeführt. Jedes Mal während der Zellkultur werden 6–8 ml Kulturmedium entnommen. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ gehalten. Für funktionelle Studien wurden MIN6-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase mit lncRNA-spezifischen kleinen interferierenden (si)RNA transfektiert (wobei ausgewählte lncRNA basierend auf Mikroarray-Ergebnissen angegriffen wurde; Inhibitorgruppe) oder negative Kontroll-siRNA (Inhibitor NC-Gruppe) mit Lipofectamin 2000, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach 24 Stunden Kultivierung wurden die Zellen mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) oder Western Blot analysiert, um die Knockdown-Effizienz zu bestimmen. Zielsequenzen dieser siRNA waren wie folgt: siMEG3: GCGUCUUCCUGUGCCAUUUTTAAAUGGCACAGGAAGACGCTT; siNC: UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGGGAGAATT. Jedes Experiment wurde dreimal durchgeführt und dreimal wiederholt.

5. Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionstest

Die Gesamt-RNA wurde aus Bauchspeicheldrüsengewebeproben und MIN6-Zellen mit einem kommerziell erhältlichen phenolbasierten RNA-Isolationsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Komplementäre DNA wurde mit einem Reverse-Transkriptions-Set in einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 μL synthetisiert. Nach der Reverse-Transkription lag die cDNA-Konzentration der meisten Proben bei etwa 1 μg/μL basierend auf der Quantifizierungsanalyse der Proben. Anschließend wurde 1 μL cDNA-Vorlage für die quantitative Echtzeit-PCR-Amplifikation verwendet. qRT-PCR wurde mit einem auf SYBR Green basierenden PCR-Detektionskit unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: 95 °C für 30 S, 90 °C für 15 S, 60 °C für 34 Sekunden und 68 °C für 30 S. Die relativen Genexpressionsniveaus wurden mit der vergleichenden Schwellenwertzyklus-Methode (^{2-ΔCT-Methode} ) bestimmt. GAPDH wurde als internes Referenzgen zur Normalisierung von Echtzeit-PCR-Daten verwendet. Alle experimentellen Verfahren wurden nach den jeweiligen Herstellerprotokollen durchgeführt, und jedes Experiment wurde mindestens dreimal unabhängig wiederholt. Die in dieser Studie verwendeten Primer-Sequenzen sind in ergänzenden Tabellen 1 und 2 aufgeführt.

6. Zellzählungs-Kit-8-Assay

Die Zellproliferationskapazität wurde mittels eines Zellzähl-Kit-8-Tests gemäß den Richtlinien des Herstellers bestimmt. Kurz gesagt: MIN6-Zellen wurden in 96-Well-Kulturplatten mit einer Dichte von 5 x 10^{3 Zellen pro} Bohrloch nach der Transfektion mit si-MEG3 oder si-NC verschichtet und für 24 Stunden aufrechterhalten. Zu den festgelegten Zeitpunkten wurden 10 μL Zellviabilitätsreagenz in jedes Bohrloch eingebracht, und die Platten wurden bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert. Die Absorptionswerte wurden anschließend bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser gemessen. Die Zelllebensfähigkeit wurde als Prozentsatz relativ zur Kontrollgruppe berechnet.

7. Apoptose-Detektion durch Durchflusszytometrie

Apoptotische Veränderungen in MIN6-Zellen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Annexin V-FITC/PI Apoptose-Detektionskit untersucht. Nach 48 Stunden siRNA-Transfektion wurden die Zellen entnommen, zweimal mit kalt phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in einem Bindungspuffer wieder suspendiert. Anschließend wurden die Zellen mit 5 μL Annexin V-FITC und 5 μL Propidiumiodid für 15 Minuten bei Raumtemperatur unter dunklen Bedingungen inkubiert. Unmittelbar nach der Färbung wurden die Proben mittels Durchflusszytometrie analysiert. Frühe und späte apoptotische Zellpopulationen wurden mithilfe von Flowzytometrie-Software quantifiziert. Der Anteil der apoptotischen Zellen wurde anschließend für Intergruppenvergleiche berechnet. Jedes Experiment wurde dreimal unabhängig durchgeführt.

8. Western Blot Analyse

Western-Blot-Experimente wurden gemäß zuvor berichteten Protokollen¹⁸ durchgeführt. Die Zellen wurden zunächst mit Trypsin verdaut, gesammelt und mithilfe eines Radioimmunpräzipitations-Lysepuffers auf Eis lysiert. Die Proteinkonzentrationen wurden quantifiziert, und entsprechende Mengen Proteins wurden auf 10%igen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Elektrophoresegelen getrennt, bevor sie auf Polyvinylidenfluoridmembranen übertragen wurden. Nach der Membranblockierung wurden die Proben mit primären Antikörpern gegen NF-κB (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000), Caspase-3 (1:1000) und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) (1:2000) bei den angegebenen Verdünnungsverhältnissen inkubiert, gefolgt von der Inkubation mit Meerrettichperoxidase-gebundenen sekundären Antikörpern. Proteinsignale wurden mit einem chemilumineszenzierten System detektiert und mit der ImageJ-Software quantifiziert. GAPDH wurde als interne Belastungskontrolle verwendet, und die Proteinexpressionsniveaus wurden als Faltenänderungen relativ zur Kontrollgruppe angegeben.

9. Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit dem Mann–Whitney U Test¹⁹ mittels statistischer Analyse durchgeführt. Ein p-Wert <0,05 galt als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Bewertung des Eisenüberlast-Mausmodells und Messung der mütterlich exprimierten Gen-3-Expression in Bauchspeicheldrüsengeweben

Um die Rolle von MEG3 in vivo zu untersuchen, entwickelten wir ein Eisenüberlastungsmodell bei Mäusen mittels intraperitonealer Injektion von Eisendextran. Im Vergleich zur Kontrollgruppe waren die Serumeisenwerte in der Modellgruppe signifikant erhöht (p<0,05) (Abbildung 1A). Die histologische Untersuchung ergab eine b...

Diskussion

Ein abnormaler Glukosestoffwechsel ist eine häufige und ernste Komplikation bei Patienten mit β-TM und äußert sich oft als IGT oder DM. In dieser Studie stellten wir fest, dass eine Eisenüberladung zu einer Schädigung der Bauchspeicheldrüse führte und die Expression von lncRNA MEG3 im Bauchspeicheldrüsengewebe signifikant verringerte, begleitet von einer erhöhten Apoptose der Insel- β-Zellen. Darüber hinaus förderte die Knockdown von MEG3 in MIN6-Zellen die β-Zell-Apoptose und war mit de...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1M Tris-HCL (pH=6.8)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	T1020
50bp DNA Ladder	TIANGEN	MD108
50bp DNA Ladder	TIANGEN	MD108
6×DNA Loading Buffer	TIANGEN	GH101-01
6×DNA Loading Buffer	TRANS	GH101-01
-80ºC refrigerator	BIOBASE	BDF-86V348
ABI 7500 real-time PCR system	Applied Biosystems, USA
Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit	MULTI SCIENCES	AP101-100-kit
BCA Protein Assay Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd.	E-BC-K318-M
Biopulverizer	biospec
BSA	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	A8020
C57BL/6J male mice	Gempharmatech Co,Jiangsu,China
CCK-8 Cell Proliferation Assay Kit	KeyGEN BioTECH	KGA317
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
DMEM	KeyGEN BioTECH
Flow cytometry	ACEA Biosciences, USA	NovoCyte 2060R
Fluorescence PCR instrument	Bio-Rad Laboratories, Shanghai
Glycine	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	G8200
High-capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Servicebio	GB23301	1/2000
HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Servicebio	GB23303	1/2000
Human LncRNA Array V5.0	Arraystar,Rockville, Maryland, USA
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
Microarray scanner	Agilent Technologies,California, USA
MIN6 cell	procell	KGM12800N
Mini-Bead-Beater-16	biospec
Mouse Anti-GAPDH	TransGen Biotech	HC301	1/2000
NanoDrop spectrophotometer	NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA	ND-2000
PAGE Pre-Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	A1010
Primers	Generay Biotech,Anhui, China
PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser	CWBIO,Jiangsu, China
PVDF	Millipore	IPVH00010
Rabbit Anti Bax	proteintech	50599-2-ig	1/5000
Rabbit Anti Bcl-2	abcam	ab194583	1/1000
Rabbit Anti Caspase3	abcam	ab184787	1/2000
Rabbit Anti P65	abcam	ab32536	1/8000
Rabbit Anti p-P65	Affinity	af2006	1/1000
TB Green Premix Ex Taq II	TaKaRa, Japan
TRIzol	Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA
TRIzol reagent	CWBIO,Jiangsu, China
Ultra-sensitive chemiluminescence imaging system instrument	Bio-Rad Laboratories, Shanghai	Chemi DocTM XRS+
Ultraviolet spectrophotometer	NanoPhotometer	NP80