Aconitin induziert bei Ratten Myokardinschäden, die mit der Aktivierung des JNK1/2-Signalwegs verbunden sind

Zusammenfassung

Diese Studie untersuchte die potenzielle Rolle der JNK1/2-Signalübertragung bei Aconitin-induzierten Myokardschäden bei Ratten. Eine erhöhte Phosphorylierung von JNK1/2 war mit Myokardschäden assoziiert, während die pharmakologische Hemmung des JNK-Weges die Myokardschädigung teilweise linderte, was darauf hindeutet, dass die JNK-Signalübertragung an der durch Aconitin induzierten Kardiotoxizität beteiligt sein könnte.

Zusammenfassung

Eine akute Aconitin-(Acon)-Vergiftung kann zu Arrhythmien und Myokardschäden führen; Die zugrundeliegenden Mechanismen bleiben jedoch unklar. Diese Studie untersuchte den Mechanismus der durch akuten Acon-Vergiftung ausgelösten Myokardinschäden. Ein Rattenmodell (n = 51) der akuten Acon-Vergiftung wurde durch intragastrische Verabreichung entwickelt. Elektrokardiographische Nachverfolgungen wurden verwendet, um Veränderungen des Herzrhythmus zu dokumentieren. Hämatoxylin- und Eosin-(HE)-Färbungen sowie Masson-Färbungen wurden durchgeführt, um eine myokardiale pathologische Verletzung und Kollagenablagerung zu bewerten. Die Expressionsniveaus von kardialen Enzymen und Proteinen im venösen Blut wurden mit enzymgekoppelten Immunsorbent-Assay-Kits (ELISA) nachgewiesen. Die Struktur-Aktivitäts-Beziehung zwischen Acon und dem JNK-Weg wurde durch molekulare Andockung untersucht. Die Expressionsniveaus phosphorylierter c-Jun N-terminaler Kinase 1/2 (JNK1/2) Proteine wurden durch Western-Blotting nachgewiesen. In dieser Studie wurden ventrikuläre Arrhythmien bei Ratten nach intragastrischer Verabreichung von Acon beobachtet. Das Myokardgewebe zeigte eine ungeordnete Anordnung von Myokardfasern und -zellen, begleitet von abnormer Kollagenablagerung. Molekulare Andockergebnisse deuteten auf mögliche Wechselwirkungen zwischen Acon und JNK1/2 hin. Gleichzeitig waren die Expressionsniveaus von Herzenzymen und -proteinen sowie phosphoryliertem JNK1/2 signifikant erhöht. Weitere Studien zeigten, dass die Behandlung mit dem JNK-Inhibitor die durch Acon-induzierte Herzverletzung bei Ratten teilweise umkehren SP600125. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Phosphorylierung von JNK1/2 an der Entwicklung von Myokardschäden beteiligt ist, die durch eine akute Aconitinvergiftung ausgelöst wird. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung des JNK1/2-Signalwegs zu Aconitin-induzierten Myokardschäden beiträgt und dass die Hemmung des JNK1/2-Wegs die durch akute Aconitin-Vergiftung verursachte Myokardinschädigung lindern kann.

Einleitung

Acon ist ein natürlicher Diterpen-Alkaloid-Extrakt aus der Aconitum-Pflanze der Familie der Ranunculaceae. Es hat entzündungshemmende ^1,2, analgetische, antitumoröse, antirheumatische, immunmetabolische und blutzirkulationsfördernde Wirkung ^3,4,5. Eine unangemessene oder übermäßige Verwendung von Acon-haltigen Präparaten kann jedoch zu schweren Vergiftungen führen. Zu den durch Aconitin-Vergiftung verursachten Symptome gehören Herzsymptome⁶, neurologische Symptome⁷ und Magen-Darm-Symptome⁸. In den letzten Jahren gab es weltweit häufig Berichte über Fälle von Aconit-Vergiftung oder Tod ^9,10,11. Acon-Vergiftung äußert sich hauptsächlich im Herz-Kreislauf-System, Nervensystem und Verdauungssystem. Unter ihnen ist die Haupttodesursache durch Vergiftung die Kardiotoxizität. Die Herzschäden, die Acon verursacht, sind sehr schwerwiegend; Insbesondere erschwert der kurze Einbruch des Syndroms die zeitnahe Durchführung der klinischen Behandlung. Normalerweise verursacht eine akute Acon-Vergiftung innerhalb^{weniger Stunden} Übelkeit, Durchfall, Schwindel, Brustschmerzen, Atemnot und andere erste Symptome. Derzeit ist der detaillierte Mechanismus der Myokardinschäden durch eine akute Acon-Vergiftung noch unklar, und es gibt keine klinisch wirksamen Medikamente, die die Myokardinschäden durch Acon-Vergiftung ^12,13 wirksam lindern können.

Schäden bei akuter Acon-Vergiftung, die es ermöglichen könnten, den Mechanismus der Myokardienschädigung zu erforschen, könnten eine bedeutende Möglichkeit für eine zeitabhängige Untersuchung darstellen. Ein solches Modell könnte das Potenzial für zukünftige Behandlungen von Patienten mit akuter Acon-Vergiftung haben und möglicherweise die frühzeitige Entwicklung des Syndroms verhindern. Studien haben die Rolle des c-Jun n-terminalen Kinase-(JNK)-Signalwegs in der Immunantwort auf Gifte spekuliert. Der JNK-Signalweg ist einer der mitogenaktivierten Proteinkinase-(MAPK)-Signalwege. Die JNK-Familie besitzt drei Gene (JNK1/MAPK8, JNK2/MAPK9 und JNK3/MAPK10). JNK1 und JNK2 können in den meisten Geweben, einschließlich des Herzens, exprimiert werden, während JNK3 hauptsächlich im Gehirn¹⁴ vorkommt und hauptsächlich mit dem oxidativen Stress und der Entzündungsreaktion der Zellen¹⁵ zusammenhängt. Studien haben ergeben, dass der JNK-vermittelte Signalweg eine wichtige Rolle bei Gehirn- und Myokardischämie/Reperfusionsverletzungen spielt^16,17. Die Verabreichung von C66 lindert fettreiche, durch die Ernährung induzierte Myokardentzündung, indem sie die JNK-Aktivierung in Mausherzen hemmt. Chlorogensäure lindert TNF-α-induzierte Cardiomyozytenschädigungen, indem sie die JNK-Signalübertragung¹⁹ hemmt. Pinocembrin lindert durch LPS verursachte Myokardschäden und entzündliche Reaktionen, indem es den p38/JNK MAPK-Signalweg hemmt, und lindert Herzfunktionsstörungen sowie Arrhythmien²⁰. Diese Studien zeigen, dass Veränderungen in der JNK-Signalübertragung, hauptsächlich JNK1/2, eng mit Myokardschäden zusammenhängen. Unterdessen ist JNK auch ein nachgelagertes Ziel von Acon für eine Reihe von Aktivitäten. Eine Studie ergab, dass hohe Dosen Acon-Exposition den Aktivierungsweg des JNK-Enzyms vermitteln können, was Entwicklungstoxizität bei Zebrafisch-Embryonen (Jungtieren) wie verkürzte Körperlänge, gekrümmte Körperform und Hirnentwicklungsstörungen^{verursacht 21}. Diese Studie legt nahe, dass Acon den JNK-Signalweg aktivieren könnte. Die Rolle des JNK-Signalwegs bei Myokardschäden durch akute Aconitinvergiftung ist jedoch unklar.

Diese Studie etablierte ein Rattenmodell für akute Acon-Vergiftung durch Myokardienschäden, indem verschiedene intragastrische Dosen und Zeitintervalle festgelegt wurden. Darüber hinaus untersuchten wir die Wirkung von Acon auf das Phosphorylierungsniveau von JNK1/2 im Myokard und die Aktivierung des JNK-Signalwegs in diesem Modell. Die Untersuchung der Rolle der JNK1/2-Phosphorylierung bei Myokardschäden bei Ratten, die durch akute Acon-Vergiftung induziert werden, bietet eine theoretische Grundlage für die Untersuchung von Myokardinschäden durch akute Acon-Vergiftung.

Protokoll

Der Versuchsplan und der Umsetzungsplan wurden vom Tierversuchsausschuss der Medizinischen Universität Kunming am 06.2022 zur Genehmigung genehmigt (Genehmigungsnummer: Kmmu20220652). Alle Versuchspläne wurden gemäß den "Richtlinien für Tierversuche der Medizinischen Universität Kunming" durchgeführt. Die Liste aller in dieser Studie verwendeten Materialien ist in der Materialtabelle aufgeführt.

VORSICHT: Aufgrund der hohen Toxizität von Acon wurden alle Vorbereitungs- und Verabreichungsverfahren gemäß den institutionellen Sicherheitsvorschriften durchgeführt. Das Personal, das mit Acon umging, trug geeignete persönliche Schutzausrüstung, darunter Handschuhe, Laborkittel und Masken, und die Vorbereitungsverfahren wurden mit geeigneten Vorsichtsmaßnahmen durchgeführt, um das Expositionsrisiko zu minimieren. Die Tiere wurden während und nach der Verabreichung von Acon genau auf Anzeichen schwerer Toxizität und Belastung überwacht, und humane Endpunkte wurden bei Bedarf angewendet, um das Leiden zu minimieren. Biologische Abfälle und Acon-kontaminierte Materialien wurden gemäß den institutionellen Biosicherheitsvorschriften entsorgt.

Tierbehandlung

Erwachsene männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten (2 Monate alt, 230 g) wurden im SPF-Tierversuchsgebäude des Versuchszentrums der Kunming Medical University aufgezogen. Die Fütterungsbedingungen aller SD-Ratten wurden entsprechend den Fütterungsanforderungen der SPF-Ratten behandelt. Sie wurden adaptiv eine Woche lang aufgezogen und vor dem Experiment 12 Stunden gefastet. Acon wurde in einem 0,05 M Acetatpuffer (Acet) aufgelöst, und die SD-Ratten wurden nach dem Prinzip der Zufallskontrolle in 4 Gruppen eingeteilt: Gruppe 1 (Acon-1 mg) verabreicht 1 mg/kg Acon mittels Gavage; Gruppe 2 (Acon-2 mg) verabreicht 2 mg/kg Acon intragastrisch; Gruppe 3 (Acet), verabreicht 2 ml 0,05 M Acetat, gepuffert durch den Intragastr; und Gruppe 4 (Kontrolle, keine Behandlung angewendet). Die Proben wurden 1, 3 und 6 Stunden nach intragastrischer Verabreichung entnommen. Insgesamt wurden 36 Ratten untersucht, davon 3 pro Gruppe bei 1 Stunden, 3 Stunden und 6 Stunden. Zu jedem festgelegten Zeitpunkt wurden erstmals EKG-Aufnahmen durchgeführt. Anschließend wurden Ratten betäubt und Blutproben für eine serumbiochemische Analyse entnommen. Nach der Blutentnahme wurden die Ratten geopfert und das Herzgewebe schnell entfernt. Teile des Myokardgewebes wurden für eine histologische Analyse (HE- und Masson-Färbung) fixiert, während die übrigen Gewebe für die Proteinexpressionsanalyse mittels Western Blotting gespeichert wurden. In Experimenten, bei denen die JNK1/2-Aktivatoren und Inhibitoren getestet werden, werden SD-Ratten nach dem Prinzip der Zufallskontrolle in 5 Gruppen eingeteilt: Die Modellgruppe erhielt 2 mg/kg intragastrisches Acon, die Inhibitorgruppe erhielt zunächst eine intraperitoneale Injektion von 6 mg/kg SP600125²², gefolgt von 2 mg/kg Acon durch Gavage 2 Stunden später. Die Agonistengruppe erhielt zunächst eine intraperitoneale Injektion von 0,1 mg/kg Anisomycin (Anis)^23,24, gefolgt von 2 mg/kg Acon durch Gavage zwei Stunden später. Die DMSO-Gruppe erhielt eine intraperitoneale Injektion von 2 ml 0,8 % DMSO-Cosolvent-Mischlösung. Die Kontrollgruppe erhielt keine Behandlung. Insgesamt wurden 15 Ratten untersucht. Alle Färbungsergebnisse wurden blind analysiert, um Beobachtungsfehler zu minimieren. Während des experimentellen Zeitraums wurden die Ratten kontinuierlich auf Überlebensstatus und Anzeichen schwerer Toxizität nach der Verabreichung von Aconitin überwacht. Die Sterblichkeit wurde an jedem festgelegten Beobachtungszeitpunkt (1 Sth, 3 Stunden und 6 Stunden) erfasst. Der Tod wurde definiert als das vollständige Stillstand von Atmung und Herzschlag. Tiere mit schwerer Belastung, darunter anhaltende Atemnot, Verlust des Aufrichtreflexes, Unfähigkeit zu gehen oder sterbender Zustand, galten als humane Endpunkte erreicht und wurden sofort unter Tiefbetäubung eingeschläfert, um das Leiden zu minimieren. Die Anzahl der Todesfälle für jede Rattengruppe (Tabelle 1–4).

Ratten-Elektrokardiogramm (EKG) Nachverfolgung

Die Ratten in jeder Gruppe wurden EKG-Nachverfolgungen unterzogen. Die spezifische Methode war wie folgt: Nach der Anästhesie durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital in einer Dosis von 30 mg/kg. Die Ratten waren auf dem Rücken auf dem Tierversuchskonsole fixiert. Der Computer wurde an das biologische Signalerfassungs- und Analysesystem des BL-420N angeschlossen, und der EKG-Kabelstecker wurde in den 3-Kanal-Eingangsanschluss des BL-420N-Systems eingesetzt. Nadeln wurden subkutan in die Innenseite des rechten Vorderglieds, des rechten Hintergliedmaßes und des linken Hintergliedmaßes der Ratten eingesetzt. Die Nadeln wurden vor dem Eingriff in 75 % Alkohol getränkt und sterilisiert, wobei darauf geachtet wurde, dass die Nadeln nicht in die Muskeln eingeführt wurden. Die Elektrodenclips des EKG-Leitdrahts wurden dann an die Stifte jedes Gliedmaßes angeschlossen. Der Stromschalter und die Systemsoftware des biologischen Signalerfassungs- und Analysesystems BL-420N wurden eingeschaltet. Kanal 3 wurde für die Signalaufnahme ausgewählt, und der Signaltyp wurde als Rat-EKG eingestellt. Die Parameter wurden wie folgt gesetzt: Abtastrate, 1 kHz; Reichweite 2,0 mV; Zeitkonstante (Hochpassfilterung), 200 ms (0,80 Hz); Tiefpassfilterung, 100 Hz; Scangeschwindigkeit, 200,0 ms/div; und der 50-Hz-Notch-Filter wurde ausgeschaltet. Das EKG von Lead II wurde aufgezeichnet, und es wurden Veränderungen im EKG beobachtet. Nachdem das EKG stabil geworden war, wurden 3 Minuten lang überwacht und aufgezeichnet, und die Daten wurden von Gruppen für die spätere Analyse gespeichert. Nach der EKG-Aufnahme wurden die Elektrodenclips und Pins entfernt und die Ratten in ihre Käfige zurückgebracht. Die Ratten wurden warm gehalten und ihre Atmung bis zur vollständigen Erholung von der Narkose überwacht, um erstickungsbedingten Tod zu verhindern. Basis-EKG-Aufnahmen wurden am ersten Tag vor jeder Behandlung durchgeführt. Am zweiten Tag wurde den Ratten Acon mittels intragastrischer Gavage verabreicht, und EKG-Aufzeichnungen wurden anschließend 1, 3 und 6 Stunden nach der Verabreichung mit demselben Verfahren durchgeführt.

Hämatoxylin- und Eosin-(HE)-Färbung und Masson-Färbung

Die Herzen wurden auf der horizontalen kurzen Achse geschnitten, und das Herzgewebe aus dem Herzapex der SD-Ratten wurde gesammelt und bei 4 % Polyformaldehyd bei Raumtemperatur für 24 Stunden fixiert. Die fixierten Gewebe wurden dehydriert, mit Xylol gereinigt und in Paraffinwachs eingebettet. Anschließend wurden Schnitte (4 μm dick) gemäß Standardverfahren mit HE- und Masson-Färbung gefärbt. Bei der HE-Färbung wurde eine Hämatoxylin-Färbung für 2 Minuten durchgeführt, dann wurden die Proben 1 Minute in warmem Wasser eingeweicht und anschließend 30 Sekunden lang Eosinfärbung durchgeführt. Bei der Masson-Färbung färben Sie 5 Minuten mit Weigert-Eisenhämatoxylinlösung, dann 3–5 Minuten mit Masson-Blau-Lösung und schließlich 1–2 Minuten mit Anilinblau-Lösung. Die Objektträger wurden unter einem gewöhnlichen optischen Mikroskop beobachtet. Für jeden Abschnitt wurden fünf nicht überlappende mikroskopische Felder zufällig mit derselben Vergrößerung ausgewählt, wobei große Gefäße und offensichtliche Artefakte vermieden wurden. Der Kollagenvolumenanteil (CVF) wurde mit ImageJ gemäß Gleichung (1) berechnet:

(1)

Enzymgekoppelter Immunsorbent-Test (ELISA)

Nach der Aufnahme des EKG wurden die Ratten mit Natriumpentobarbital betäubt, und anschließend wurde eine Mittellinien-Laparotomie durchgeführt, um venöses Blut zu entnehmen. Blutproben wurden durch Punktion der unteren Vena cava mit einer Einweg-Venen-Blutnadel entnommen. Das Blut wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert, und das Supernatant wurde nach der Zentrifugation bei 1000 × g für 20 Minuten gesammelt. Die Konzentrationen von CK-MB, AST, LDH, cTn-1 und h-FABP wurden mit einem ELISA-Testkit bestimmt. Die ELISA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die optischen Dichtewerte (OD) jedes Bohrlochs wurden bei 450 nm mittels eines Mikroplattenlesers bestimmt.

Westliche Blotting-Analyse

Das Gesamtprotein wurde mit einem Proteinextraktions-Set aus Herzgeweben extrahiert. Ein BCA-Protein-Assay-Kit wurde verwendet, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Das gesamte Protein (das zu testende Proteinvolumen betrug 10 μL) wurde mit einer 10%igen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und auf die PVDF-Membran übertragen, wobei 5 % Magermilch für 30 Minuten blockiert wurde. Anschließend wurde die Membran über Nacht mit JNK1/2 (1:500), p-JNK1/2 (1:1000) und GAPDH (1:4000) primären Antikörpern inkubiert. Am nächsten Tag wurden alle Membranen dreimal mit PBST gewaschen und anschließend mit dem entsprechenden sekundären Antikörper (1:5000) für 1 Stunde inkubiert. Schließlich wurden verbesserte chemilumineszenzhaltige Reagenzien zur Signaldetektion verwendet; die Entwicklungslösung wurde gleichmäßig tropfenweise auf die PVDF-Membranstreifen aufgetragen und 10 Sekunden lang inkubiert, gefolgt von Belichtung, Entwicklung und Bildgebung. Die Intensität des Western-Blot-Bands wurde mit der ImageJ-Software gemessen.

Molekulare Andockungsvalidierung

Die SDF-3D-Molekularstruktur von Aconitin wurde aus der PubChem-Datenbank heruntergeladen, und die SDF-Struktur wurde mit der OpenBabel-Software in eine mol2-Struktur umgewandelt. Die höchstauflösenden und längsten PDB-Proteinstrukturen von JNK1 und JNK2 wurden aus den Datenbanken Uniprot und Protein Data Bank heruntergeladen. Hydrierung, Ligandentfernung und vollständige Wasserstoffaddition wurden an makromolekularen Proteinen durchgeführt, während die vollständige Wasserstoffaddition und Elektronenbelastung an kleinen Molekülverbindungen durchgeführt und Torsionsbrücken gesetzt wurden. Molekulare Andockungsexperimente wurden über AutoDock Vina durchgeführt, bei der Bindungsaffinitäten ≤ -7,0 kcal/mol als Hinweis auf starke Liganden-Protein-Interaktionen definiert wurden. PyMol wurde verwendet, um die 3D-Struktur des Andockungskomplexes zu visualisieren, und Discovery Studio wurde verwendet, um die 2D-Struktur des Andockkomplexes zu visualisieren.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander wiederholt. GraphPad Prism 8 wurde verwendet, um alle Daten statistisch zu analysieren und grafisch darzustellen. Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Der t-Test der Schüler wurde für Vergleiche zwischen zwei Gruppen verwendet. Für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen zum gleichen Zeitpunkt oder Zeitverlaufsanalysen innerhalb derselben Gruppe wurde einseitig ANOVA verwendet. p < 0,05 wurde als statistisch signifikante²⁵ angesehen.

Ergebnisse

EKG-Ergebnisse von Ratten nach Acon-Gavage

Frühere Studien haben gezeigt, dass die toxischen Effekte von Aconitin in der frühen Phase auftreten, typischerweise innerhalb weniger Stunden nach der^{Verabreichung 26,27}. Um das frühe Auftreten und Verlauf akuter Kardiotoxizität innerhalb dieses Zeitfensters zu erfassen, wählten wir daher drei Zeitpunkte: 1 Uhr, 3 Stunden und 6 Stunden für die Experimente. Die Ergebnisse des Elektrokardiogramms zeigten, dass nach 1 Stunden, 3 Stunden und 6 Stunden Acon-Wirkung in der Kontrollgruppe und der Acet-Gruppe keine Arrhythmien mehr auftraten und die EKG-Veränderungen nicht offensichtlich waren. Ratten in der Acon-1mg-Gruppe hatten vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen bzw. vorzeitige ventrikuläre Bigemininie, vorzeitige ventrikuläre Triplet, kurzzeitige ventrikuläre Tachykardie, monomorphe ventrikuläre Tachykardie, bidirektionale ventrikuläre Tachykardie und eine oder mehrere ventrikuläre Arrhythmien. Ratten der Acon-2-mg-Gruppe entwickelten vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen, eine oder mehrere ventrikuläre Arrhythmien, darunter vorzeitige ventrikuläre Bigemini, kurzzeitige ventrikuläre Tachykardie und bidirektionale ventrikuläre Tachykardie (Abbildung 1, ergänzende Abbildungen 1–2). Acon fördert pathologische Myokardinschäden und erhöht die Kollagenfärbung im Myokardgewebe der Ratte.

Das Myokardgewebe wurde mittels HE-Färbung untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe und der Acet-Gruppe nach 1, 3 Stunden und 6 Stunden Acon-Behandlung das Myokardgewebe der SD-Ratten in der Acon-1-mg-Gruppe eine partielle Riss der Myokardinmuskelfasern aufwies, eine ungeordnete Anordnung der Myokardinzellen aufwies, das Myokardininterstitium vergrößert ist und im Myokardinterstitium Ödem auftritt, Die meisten Myokardzellen sind geschwollen, die Kerne sind tief gefärbt und kondensiert, eine große Anzahl von Myokardzellen degeneriert, und im Myokardialfaserzytoplasma (durch Pfeile angezeigt) bilden sich runde Vakuolen. Die Muskelfaserstreifen im Myokardgewebe der SD-Ratten der Acon-2-mg-Gruppe waren unklar oder verschwanden; Die Anordnung der Muskelbündel war locker und ungeordnet, die intermuskulären Räume waren vergrößert, viele Zellkerne tief gefärbt, Nuklearpyknose, interzelluläres Ödem und die Myokardzellen waren geschwollen und degeneriert. Das Zytoplasma der Myokardinfasern zeigte runde Vakuolen (dargestellt durch Pfeile) (Abbildung 2A, ergänzende Abbildung 3A, ergänzende Abbildung 4A).

Eine Masson-Färbung wurde durchgeführt, um die Kollagenablagerung im Myokardgewebe zu bewerten. In den Kontroll- und Acet-Gruppen wiesen die Kardiomyozyten eine normale Morphologie auf, mit minimaler Kollagenablagerung im myokardialen Interstitium. In der Acon-1-mg-Gruppe wurden leichte Zunahmen des blau gefärbten Kollagens in einigen interstitiellen Bereichen beobachtet. In der Acon-2-mg-Gruppe waren ausgedehntere, blau gefärbte Regionen diffus im Myokardgewebe verteilt, begleitet von einer desorganisierten Myofilamentanordnung und einer Störung der normalen Herzstruktur. Das Ausmaß der Kollagenfärbung in der Acon-2-mg-Gruppe war größer als in der Acon-1-mg-Gruppe. Quantitative Analysen zeigten, dass der Kollagenvolumenanteil (CVF) sowohl in den Acon-1-mg- als auch in den Acon-2-mg-Gruppen im Vergleich zur Kontroll- und Acet-Gruppe signifikant erhöht war (n = 3 Ratten pro Gruppe, Einweg-ANOVA, p < 0,05). Bemerkenswert ist, dass der CVF-Wert seinen höchsten Wert in der Acon-2-mg-Gruppe 6 Stunden nach intragastrischer Verabreichung erreichte (Abbildung 2B, ergänzende Abbildung 3B, ergänzende Abbildung 4B). Angesichts der kurzen Beobachtungsperiode (1–6 Stunden) spiegeln diese Befunde eher akute interstitielle Veränderungen wie Ödeme oder Veränderungen der Kollagenfärbungsmuster wider als eine etablierte Myokardialfibrose. Außerdem gab es keinen signifikanten Unterschied im Herzgewicht zwischen den Gruppen nach 1 Sth, 3 Stunden und 6 Stunden nach Acon-1 mg oder Acon-2 mg Behandlung (Tabelle 5).

Acon fördert kardiale Enzyme und kardiale Proteinwerte im venösen Blut von Ratten

Zur Bewertung von Acon-induzierten Myokardschäden maßen wir Serumspiegel von Herzverletzungsmarkern, darunter CK-MB, AST, LDH, cTn-I und h-FABP. Im Vergleich zu den Kontroll- und Acet-Gruppen zeigten die Acon-1 mg- und Acon-2-mg-Gruppen signifikant erhöhte Spiegel von CK-MB, AST, LDH, cTn-I und h-FABP nach 1, 3 Stunden und 6 Stunden (n = 3 Ratten pro Gruppe, Einweg-ANOVA, p < 0,05). Außerdem waren zu gleichen Zeitpunkten die Zunahmen dieser Marker in der Acon-2-mg-Gruppe ausgeprägter als in der Acon-1-mg-Gruppe (p < 0,05) (Abbildung 3).

Ergebnisse des molekularen Andockens

Um die Wirkung von Acon auf den Signalweg von Myokardschäden bei Ratten weiter zu untersuchen, nutzten wir molekulare Docking, um Acon-bezogene Signalwegproteine zu identifizieren. Die Andockergebnisse zeigten, dass Acon durch mehrere nicht-kovalente Wechselwirkungen stabil an die aktiven Taschen von JNK1 und JNK2 binden konnte. In JNK1 bildete Aconitin mit ALA267 und SER299 zwei konventionelle Wasserstoffbrücken, mit Bindungsabständen von 2,0 Å bzw. 2,1 Å, was auf starke gerichtete Wechselwirkungen hinweist, die zur Ligandenverankerung beitragen. Darüber hinaus wurden umfangreiche van-der-Waals-Interaktionen zwischen Aconitin und umgebenden Resten beobachtet, was eine enge räumliche Komplementarität innerhalb der Bindungstasche ermöglichte. Hydrophobe Wechselwirkungen, einschließlich Alkyl/π-Alkyl-Wechselwirkungen mit ILE304, stabilisierten den Liganden innerhalb der hydrophoben Mikroumgebung weiter. Kohlenstoff-Wasserstoff-Brücken wurden ebenfalls identifiziert, wodurch ein kooperatives Wechselwirkungsnetzwerk entsteht, das die Bindung von Liganden unterstützt (Abbildung 4A–C). In JNK2 bildete Aconitin eine konventionelle Wasserstoffbrücke mit LEU302 (2,1 Å), die als zentrale Verankerungswechselwirkung diente. Ähnlich wie bei JNK1 trugen van-der-Waals-Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen und Kohlenstoff-Wasserstoff-Brücken gemeinsam zur Stabilisierung des Liganden-Protein-Komplexes bei (Abbildung 4D–F). Die Andockungsergebnisse für die getesteten Verbindungen werden als Bindungswerte (kcal/mol) angegeben und in Tabelle 6 dargestellt. Insgesamt bot Wasserstoffbrückenbindungen Spezifität und Verankerung, hydrophobe Wechselwirkungen verbesserten die Einbettung und Bindungsaffinität von Liganden, und van-der-Waals-Interaktionen trugen zur Gesamtstabilität des Komplexes bei. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Aconitin stabile Komplexe sowohl mit JNK1 als auch mit JNK2 bilden kann, was sein Potenzial als Zielmittel unterstützt.

Acon reguliert das JNK-Phosphorylierungsniveau hoch

Um die Wirkung von Acon auf den JNK-Signalweg im Myokardgewebe weiter zu untersuchen, wurde die Expression der JNK1/2-Phosphorylierung mittels Western Blotting bewertet. Im Vergleich zu den Kontroll- und Acet-Gruppen zeigten die Acon-1 mg- und Acon-2-mg-Gruppen signifikant erhöhte Werte von p-JNK1/2 (n = 3 Ratten pro Gruppe, Einweg-ANOVA, p < 0,05). Außerdem war der Phosphorylierungsgrad von JNK1/2 in der Acon-2-mg-Gruppe signifikant höher als in der Acon-1-mg-Gruppe (p < 0,05) (Abbildung 5A). Innerhalb der Acon-2-mg-Gruppe zeigten Vergleiche verschiedener Zeitpunkte, dass die p-JNK1/2-Spiegel signifikant nach 1 Uhr, 3 Stunden und 6 Stunden erhöht waren, wobei der höchste Wert bei 6 Stunden beobachtet wurde (n = 3 Ratten pro Gruppe, Einweg-ANOVA, p < 0,05) (Abbildung 5B). Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die Acon-2-mg-Gruppe bei 6 Stunden für weitere Experimente ausgewählt.

Der JNK-Inhibitor lindert myokardiale pathologische Schäden und Kollagenfärbungen im Myokardgewebe der Ratten

Um die regulatorische Rolle des JNK-Signalwegs weiter zu bewerten, wurden die Expressionsniveaus von p-JNK1 und p-JNK2 im Myokardgewebe mittels Western Blotting bewertet. Im Vergleich zu den Kontroll- und DMSO-Gruppen zeigte die Acon-Gruppe signifikant erhöhte Expressionsniveaus von p-JNK1 und p-JNK2 (n = 3 Ratten pro Gruppe, Einweg-ANOVA, p < 0,05). Im Vergleich zur Acon-Gruppe zeigte die Acon+SP600125-Gruppe signifikant verringerte Werte von p-JNK1 und p-JNK2 (n = 3 Ratten pro Gruppe, Einweg-ANOVA, p < 0,05). Im Gegensatz dazu zeigte die Acon+SP600125-Gruppe im Vergleich zur Acon+-Gruppe signifikant erhöhte Expressionsniveaus von p-JNK1 und p-JNK2 (n = 3 Ratten pro Gruppe, Einweg-ANOVA, p < 0,05) (Abbildung 6).

Die Auswirkungen von Anis und SP600125 auf Myokardschäden wurden weiter untersucht. Die Ergebnisse der HE-Färbung zeigten, dass im Vergleich zur Acon-Gruppe das interstitielle Ödem des Myokardgewebes in der Acon+SP600125-Gruppe reduziert war, die Schwellung einiger Kardiomyozyten verschwand und das Zellcytoplasma einheitlich war. Der Muskelraum ist voll, der intermuskuläre Raum wird dünner, einige Myokardfasern sind eng und geordnet angeordnet, eine kleine Anzahl von Zellkernen ist tief gefärbt, und das Zytoplasma der Myokardialfasern zeigt kleine runde Vakuolen, wodurch die myokardiale pathologische Schädigung gelindert wird. Im Vergleich zur Acon+SP600125-Gruppe hatte die Acon+Anis-Gruppe durchbrochene Herzfasern, vergrößerte Muskellücken, lose und ungeordnete Myokardfasern, geschwollene und degenerierte Myokardzellen, tief gefärbtes Kernchromatin und interzelluläres Ödem (Abbildung 7A).

Eine Masson-Färbung wurde durchgeführt, um die Kollagenfärbung im Myokardgewebe zu beurteilen. In der Acon+SP600125-Gruppe wurden im Myokardinterstitium mäßig blau gefärbte Bereiche beobachtet. Im Vergleich zur Acon-Gruppe war die Kollagenvolumenfraktion (CVF) in der Acon+SP600125-Gruppe signifikant reduziert, was auf eine Abschwächung der durch Aconitin induzierten interstitiellen Veränderungen hinweist. Im Gegensatz dazu wurden in der Acon+Anis-Gruppe im Myokardinterstitium ausgedehntere, blau gefärbte Kollagenbereiche im Myokardinterstitium beobachtet, im Vergleich zur Acon+SP600125-Gruppe, begleitet von einem signifikanten Anstieg des CVF (n = 3 Ratten pro Gruppe, Einweg-ANOVA, p < 0,05) (Abbildung 7B). Außerdem gab es keinen signifikanten Unterschied im Herzgewicht zwischen den Gruppen (Tabelle 5). Angesichts der kurzen Beobachtungsperiode (1–6 Stunden) spiegeln diese Veränderungen eher akute interstitielle Veränderungen wie Ödeme oder Veränderungen der Kollagenfärbungsmuster wider als auf etablierte Myokardifibrose. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SP600125 die durch Aconitin induzierte Myokardverletzung lindert, während Anisomycin unter diesen experimentellen Bedingungen die Myokardschädigung weiter verschlimmert.

Der JNK-Inhibitor lindert die Expression von Herzenzymen und Herzproteinen im Rattenserum

Die ELISA-Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zur Acon-Gruppe die Expressionen von CK-MB, AST und LDH in der Acon+SP600125-Gruppe signifikant reduziert waren, während die Expressionen von CK-MB, AST und LDH nach der Wirkung von Anis (n = 3 Ratten pro Gruppe, Einweg-ANOVA, p < 0,05) zunahmen. Außerdem war im Vergleich zur Acon-Gruppe die Expression von cTn-I und h-FABP in der Acon-+SP600125-Gruppe signifikant reduziert (n = 3 Ratten pro Gruppe, Einweg-ANOVA, p < 0,05). Im Vergleich zur Acon+SP600125-Gruppe war die Expression von cTn-I und h-FABP in der Acon+-Anis-Gruppe signifikant erhöht (n = 3 Ratten pro Gruppe, Einweg-ANOVA, p < 0,05) (Abbildung 8A–8B).

DATENVERFÜGBARKEIT:

Alle in dieser Studie verwendeten Rohdaten sind in den dem Manuskript beigefügten Zusatzdateien verfügbar.

Abbildung 1: Elektrokardiogramm-Darstellung einer Arrhythmie bei Ratten (nach 6 Stunden Acon-Wirkung). Von oben nach unten die Kontrollgruppe, die Acet-Gruppe, die Acon-1-mg-Gruppe und die Acon-2-mg-Gruppe. Arten von Arrhythmien bei Acon-1mg-A-gavage und Acon-2 mg-A-gavage (in der Reihenfolge des Auftretens von oben nach unten): Acon-1mg-A-gavage: vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen; vorzeitige ventrikuläre Bigemini; bidirektionale ventrikuläre Tachykardie. Acon-2 mg-A-Gavage: vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen; vorzeitige ventrikuläre Bigemini; Kurzer Ausbruch ventrikulärer Tachykardie. Abkürzungen; B-gavage = Vor Acon Gavage; A-Gavage = Nach Acon-Gavage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Myokardialschäden und Kollagenfärbungen im Myokardgewebe der Ratte, angezeigt durch HE- und Masson-Färbung. (A) Die pathologischen Veränderungen im Myokardgewebe der Ratten wurden durch HE-Färbung erkannt (der gelbe Pfeil zeigt die runden Vakuolen an, die durch beschädigte Kardiomyozyten gebildet werden); Scale Bar = 100 μm. (B) Kollagenfärbung im Myokardgewebe der Ratten wurde durch Masson-Färbung nachgewiesen; Skala = 50 μm. Mittelwert ± SD, n = 3. Alle P-Werte wurden mittels unabhängiger Einweganalyse der Varianz berechnet. *p < 0,05, **p < 0,01. 40x und 400x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Die Werte von CK-MB, AST, LDH, cTn-I und h-FABP im Rattenserum deuteten auf Myokardschäden hin. (A–F). Die Werte von CK-MB, AST, LDH, cTn-I und h-FABP wurden mit ELISA-Kits gemessen. Mean±SD, n = 3. Alle p-Werte wurden mittels unabhängiger Einweganalyse der Varianz berechnet. *p < 0,05, **p < 0,01. Abkürzungen; CK-MB = Kreatin-Kinase-MB; AST = Aspartat-Aminotransferase; LDH = Laktatdehydrogenase; cTn-I = Herztroponin I; h-FABP = Herztyp-Fettsäurebindungsprotein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Ergebnisse des molekularen Andockens von Acon mit dem JNK-Signalweg. (A–B) und (D–E) Die 2D-Wechselwirkungsdiagramme von Acon mit dem JNK1/2-Protein. (C) und (F) Die 3D-Wechselwirkungsdiagramme von Acon mit dem JNK1/2-Protein. Abkürzungen; JNK = c-Jun N-terminale Kinase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Acon reguliert das Phosphorylierungsniveau des JNK hoch. (A–B) Die Expressionsniveaus von p-JNK1/2 und JNK1/2 im Myokardgewebe der Ratten wurden durch Western-Blotting nachgewiesen. Mittelwert ± SD, n = 3. Alle p-Werte wurden mittels unabhängiger Einweganalyse der Varianz berechnet. *p < 0,05, *p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Der JNK-Inhibitor hemmt die Acon-induzierte JNK-Phosphorylierung. Die Expressionsniveaus von p-JNK1/2 und JNK1/2 im Myokardgewebe der Ratten wurden durch Western-Blotting nachgewiesen. Mittelwert ± SD, n = 3. Alle p-Werte wurden mittels unabhängiger Einweganalyse der Varianz berechnet. *p < 0,05, **p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: JNK-Inhibitor lindert myokardiale pathologische Schäden und Kollagenfärbungen bei Ratten. (A) Die pathologischen Veränderungen im Myokardgewebe der Ratten wurden durch HE-Färbung erkannt (der gelbe Pfeil zeigt die runden Vakuolen, die durch geschädigte Kardiomyozyten gebildet wurden); Skala = 100 μm. (B) Kollagenfärbung im Myokardgewebe der Ratten wurde durch Masson-Färbung nachgewiesen; Skala = 50 μm. Mean±SD, n = 3. Alle p-Werte wurden mittels unabhängiger Einweganalyse der Varianz berechnet. *p < 0,05, **p < 0,01. 40 und 400x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8: Der JNK-Inhibitor reguliert die Spiegel von CK-MB, AST, LDH, cTn-I und h-FABP im Rattenserum. (A–B) Die Werte von CK-MB, AST, LDH, cTn-I und h-FABP-Expression wurden durch ELISA-Testkits nachgewiesen. Alle p-Werte wurden mittels unabhängiger Einweganalyse der Varianz berechnet. Mean±SD, n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Abkürzungen; CK-MB = Kreatinkinase-MB; AST = Aspartat-Aminotransferase; LDH = Laktatdehydrogenase; cTn-I = kardiales Troponin I; h-FABP = Herztyp-Fettsäurebindungsprotein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

	Steuerung	Acet	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Ratten	9	9	9	9
Zahl der Rattentodesfälle	0	0	0	0

Tabelle 1: Anzahl der Rattentodesfälle nach 1 Stunde Akon-Aktion. 1 Stunde nach der Verabreichung von Acon starben keine Ratten in der Kontrollgruppe, der Acet-Gruppe, der Acon-1-mg-Gruppe und der Acon-2-mg-Gruppe. (Die Anzahl der Tiere, die schließlich in die Analyse pro Gruppe einbezogen wurden, betrug 3, und tote Ratten wurden nicht ersetzt).

	Steuerung	Acet	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Ratten	9	9	9	9
Zahl der Rattentodesfälle	0	0	0	0

Tabelle 2: Anzahl der Rattentode nach 3 Stunden Acon-Aktion. 3 Stunden nach der Verabreichung von Acon starben keine Ratten in der Kontrollgruppe, der Acet-Gruppe, der Acon-1-mg-Gruppe und der Acon-2-mg-Gruppe. (Die Anzahl der Tiere, die schließlich in die Analyse pro Gruppe einbezogen wurden, betrug 3, und tote Ratten wurden nicht ersetzt).

	Steuerung	Acet	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Ratten	9	9	9	9
Zahl der Rattentodesfälle	0	0	4	4

Tabelle 3: Anzahl der Rattentode nach 6 Stunden Acon-Aktion. 6 Stunden nach Acon-Verabreichung starben 4 von 9 Ratten in der Acon-1-mg-Gruppe, und 4 von 9 Ratten starben in der Acon-2-mg-Gruppe. (Die Anzahl der Tiere, die schließlich in die Analyse pro Gruppe einbezogen wurden, betrug 3, und tote Ratten wurden nicht ersetzt).

	Steuerung	DMSO	Acon	Acon + SP600125	Acon + Anis
Ratten	9	9	9	9	9
Zahl der Rattentodesfälle	0	0	3	1	3

Tabelle 4: Anzahl der Rattentode nach Anis und SP600125 Aktion. Die Zahl der Rattentode variierte je nach Behandlungsgruppe: In der Acon-2-mg-Gruppe starben 3 von 9 Ratten; in der Acon+SP600125-Gruppe starb 1 von 9 Ratten; und in der Acon-+-Anis-Gruppe starben 3 von 9 Ratten. (Die Anzahl der Tiere, die schließlich in die Analyse pro Gruppe einbezogen wurden, betrug 3, und tote Ratten wurden nicht ersetzt).

Gruppe	Herzgewicht (g)
Steuerung	0,71 ± 0,03
Acet	0,73 ± 0,02
Acon-1 mg (1 H)	0,73 ± 0,06
Acon-2 mg (1 H)	0,75 ± 0,02
Acon-1 mg (3 H)	0,71 ± 0,04
Acon-2 mg (3 H)	0,77 ± 0,03
Acon-1 mg (6 st.)	0,72 ± 0,03
Acon-2 mg (6 H)	0,77 ± 0,02
DMSO	0,70 ± 0,03
Acon + SP600125	0,74 ± 0,03
Acon + Anis	0,75 ± 0,04

Tabelle 5: Das Herzgewicht von Ratten. Es gab keinen signifikanten Unterschied im Herzgewicht zwischen den Gruppen.

Ligand	JNK1	JNK2
Acon	-7,8 Kcal/mol	-8,41 Kcal/mol

Tabelle 6: Ergebnisse der molekularen Andockungsstudien. Die Andockwerte zwischen Acon und JNK1 liegen bei -7,8 Kcal/mol, und die Andockwerte zwischen Acon und JNK2 bei -8,41 Kcal/mol.

Ergänzende Abbildung 1: Elektrokardiogramm-Darstellung einer Arrhythmie bei Ratten (nach 1 Stunde Akon-Wirkung). Von oben nach unten die Kontrollgruppe, die Acet-Gruppe, die Acon-1-mg-Gruppe und die Acon-2-mg-Gruppe. Arten von Arrhythmien bei Acon-1mg-A-Gavage und Acon-2 mg-A-Gavage (in der Reihenfolge des Auftretens von oben nach unten): vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen; vorzeitige ventrikuläre Bigemini; vorzeitiges ventrikuläres Triol; kurze, ventrikuläre Tachykardie; monomorpher ventrikulärer Herzschlag Tachykardie; bidirektionale ventrikuläre Tachykardie. Acon-2 mg-A-Gavage: Bidirektionale ventrikuläre Tachykardie. Abkürzungen; B-gavage = Vor Acon Gavage; A-Gavage = Nach Acon-Gavage. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Elektrokardiogramm-Darstellung einer Arrhythmie bei Ratten (nach 3 Stunden Akon-Wirkung). Von oben nach unten die Kontrollgruppe, die Acet-Gruppe, die Acon-1-mg-Gruppe und die Acon-2-mg-Gruppe. Arten von Arrhythmien bei Acon-1mg-A-Gavage und Acon-2 mg-A-Gavage (in der Reihenfolge des Auftretens der Arrhythmie von oben nach unten): Vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen; kurze Ausbrüche ventrikulärer Tachykardie; bidirektionale ventrikuläre Tachykardie. Acon-2 mg-A-Gavage: Vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen; bidirektionale ventrikuläre Tachykardie. Abkürzungen; B-gavage = Vor Acon Gavage; A-Gavage = Nach Acon-Gavage. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Acon fördert Myokardschäden und Kollagenfärbung nach 1 Stunde Acon-Wirkung. (A) Die pathologischen Veränderungen im Myokardgewebe der Ratten wurden durch HE-Färbung erkannt (Hinweis: Der gelbe Pfeil zeigt die runden Vakuolen, die durch geschädigte Herzmyozyten gebildet wurden); Skala = 100 μm. (B) Fibrose im Myokardgewebe der Ratten wurde durch Masson-Färbung nachgewiesen; Skala = 50 μm. Mittelwert ± SD, n = 3. Alle p-Werte wurden mittels unabhängiger Einweganalyse der Varianz berechnet. *p < 0,05, **p < 0,01, 40x und 400x. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Acon fördert Myokardschäden und Kollagenfärbung nach 3 Stunden Acon-Wirkung. (A) Die pathologischen Veränderungen im Myokardgewebe der Ratten wurden durch HE-Färbung erkannt (der gelbe Pfeil zeigt die runden Vakuolen, die durch beschädigte Kardiomyozyten gebildet wurden); Skala = 100 μm. (B) Kollagenfärbung im Myokardgewebe der Ratten wurde durch Masson-Färbung nachgewiesen; Skala = 50 μm. Mittelwert ± SD, n = 3. Alle p-Werte wurden mittels unabhängiger Einweganalyse der Varianz berechnet. *p < 0,05, **p < 0,01. 40x und 400x. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Acon kann Arrhythmien und Myokardialschäden auslösen; die zugrunde liegenden Mechanismen der durch Acon-induzierten Herzschädigung sind jedoch unklar. In dieser Studie wurde ein Rattenmodell für akute Acon-Vergiftung mit Myokardinschädigung erfolgreich etabliert. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Aktivierung des JNK-Signalwegs einen zentralen nachgelagerten Mechanismus bei Myokardschäden darstellen könnte, die durch akute Acon-Vergiftung induziert werden. Konkret waren die Phosphorylierungswerte von JNK1/2 bei Ratten mit Acon-induzierten Arrhythmien und Myokardialschäden signifikant erhöht. Darüber hinaus hat die Hemmung des JNK-Wegs die durch akute Acon-Vergiftung verursachten Myokardschäden teilweise umgekehrt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung des JNK-Weges eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Aconitin-induzierten Myokardschäden spielt.

Die Haupttodesursache durch akute Acon-Vergiftung ist Kardiotoxizität. Frühere Studien haben gezeigt, dass nach der Acon-Behandlung Myokardinfasern bei Ratten degeneriert und ungeordnet wurden, die Kernfärbung sich vertiefte, Neutrophilinfiltrationen auftraten und²⁸ runde Vakuolen auftraten. Das stimmt mit den Forschungsergebnissen überein. Die HE-Färbung zeigte, dass das Myokardgewebe in der Acon-behandelten Gruppe pathologische Veränderungen aufwies, darunter eine ungeordnete Muskelanordnung, Verbreiterung der Muskellücken und Riss der Muskelfasern. Unter normalen Bedingungen finden sich außerdem die kardialen Enzyme CK-MB, AST, LDH und die kardialen Proteine cTn-I und h-FABP in sehr geringen Mengen im Serum²⁹. Wenn Myokardzellen geschädigt werden, werden diese Marker in großen Mengen ins Blut freigesetzt:^{30, 31, 32, 33.}

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass CK-MB, AST, LDH, cTn-I und h-FABP im venösen Serum von Ratten der Acon-Gavage-Gruppe zu jedem Beobachtungszeitpunkt unterschiedlich stark zunahmen. Das Ausdrucksniveau ist nach 6 Stunden bei der intragastrischen Verabreichung am höchsten. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Studien^überein. Sie fanden heraus, dass Acon Schäden an den H9C2-Kardiomyozyten der Ratten verursachte und die AST-Werte erhöhte. Frühere Studien nutzten Acon unterdessen, um Myokardschäden bei Ratten zu induzieren und so die Wirkung von Gegengiften auf Myokardischäden^{zu untersuchen 35}. Sie stellten fest, dass die Werte von LDH und CK-MB im Serum von Ratten mit Myokardialschäden erhöht waren. Kurz gesagt zeigen die experimentellen Ergebnisse der Gelenkerkennung von Myokardschädigungsmarkern, dass das Rattenmodell der durch akute Acon-Vergiftung induzierten Myokardschäden erfolgreich 1, 3 und 6 Stunden nach intragastrischer Verabreichung von 1–2 mg/kg Acon etabliert werden kann. Der Modellierungseffekt von 2 mg/kg Acon nach intragastrischer Verabreichung von 6 Stunden ist der beste und erfüllt die Anforderungen nachfolgender Experimente.

Studien haben gezeigt, dass die Wirkung von Acon auf Na^+- und Ca-2^+-Ionenkanäle zu einer Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration führt, was den P38-MAPK-Signalweg weiter aktiviert und anschließend die JNK-Kaskadenreaktion 36,37,38 auslöst. JNK-Aktivierung fördert^{Myokardschäden 39,40}. Dies stimmt mit den Ergebnissen dieses Experiments überein. In dieser Studie stellten wir fest, dass Acon die Phosphorylierung von JNK1/2 in Kardiomyozyten förderte und den JNK-Signalweg aktivierte. Dies deutet darauf hin, dass die JNK-Aktivierung eine nachgeschaltete Signalantwort darstellen könnte, die zu Aconitin-induzierten Myokardschäden beiträgt. Die molekularen und pharmakokinetischen Mechanismen, die der Stimulation der JNK1/2-Phosphorylierung durch Acon zugrunde liegen, erfordern jedoch weitere Untersuchungen.

Studien haben gezeigt, dass bei einer großen Phosphorylierung von JNK1/2 der JNK-Signalweg aktiviert wird, was wiederum die unkontrollierte Expression von Genen im Kern der Kardiomyozyten vermittelt und den Zellzyklus stört. Die Hemmung des JNK-Signalwegs kann Myokardschäden^{lindern 41,42}. In den HE-Ergebnissen kann der JNK-Signalweginhibitor SP600125 die durch Acon induzierten pathologischen Veränderungen im Myokardgewebe signifikant reduzieren. Frühere Studien zeigten zugleich, dass in einem Rattenmodell eines akuten Myokardinfarkts, der durch Koronararterienligation induziert wird, blau gefärbte Kollagenfasern und Kollagenablagerungen im Myokardgewebe deutlich erhöht waren, begleitet von einer Aktivierung des JNK-Signalwegs. Die Behandlung mit traditionellen Granulaten der chinesischen Medizin reduzierte die myokardiale Kollagenablagerung durch Hemmung des JNK-Signalwegs^43,44.

Bei Ratten mit diabetischer Myokardschädigung waren der Kollagenfasergehalt (blaue Färbung) und der Kollagenvolumenanteil (CVF) signifikant erhöht. Gleichzeitig wurde der JNK-Signalweg aktiviert. Es wurde berichtet, dass niedrig dosiertes Ethanol die Aktivierung des JNK-Signalwegs hemmt und dadurch den Anstieg der Kollagenfaserablagerung und CVF im Myokardgewebe^{der Ratten 45} abschwächt. In der vorliegenden Studie zeigte die molekulare Andockanalyse, dass Aconitin durch mehrere nicht-kovalente Wechselwirkungen mit JNK1 und JNK2 interagieren kann; Diese Ergebnisse sollten jedoch als unterstützende Belege betrachtet werden und stellen keinen direkten Beweis für physiologische Bindung dar. Darüber hinaus zeigten In-vivo-Experimente, dass Acon als Stressor die Phosphorylierung von JNK1/2 hochregulierte und so den JNK-Signalweg aktivierte. Diese Aktivierung war mit einer erhöhten Kollagenablagerung (blaue Färbung) und erhöhtem CVF im Myokardgewebe der Ratten verbunden, was letztlich zu Myokardschäden führte. Die Zugabe des JNK-Inhibitors SP600125 jedoch die toxischen Effekte von Acon signifikant gehemmt und den Anstieg des CVF-Werts des Myokardgewebes verringert. Myokardiale Schäden stören die normale Integrität der kardialen Myozytenmembran und den Verlust des intrazellulären Inhalts in den extrazellulären Raum, was sich in erhöhten Spiegeln von Myokardenzymen im Blut äußert^46,47. Diese Ergebnisse zeigten, dass der Anstieg der Myokardenzymwerte im Rattenblut auch darauf hindeutete, dass Acon Myokardschäden verursachte. Gleichzeitig hemmten JNK-Inhibitoren die Ausschüttung von Myokardenzymen, was darauf hindeutet, dass JNK-Inhibitoren die durch Acon verursachten Myokardschäden teilweise lindern könnten.

Mehrere Einschränkungen dieser Studie sollten anerkannt werden. Erstens war die Stichprobengröße zu jedem Zeitpunkt relativ klein (n = 3 pro Gruppe), was die statistische Stärke der Analysen einschränken kann, und vor der Bestimmung der Stichprobengröße wurde keine formale Leistungsanalyse durchgeführt. Außerdem wurden nur ein einziger Aconitin-Dosisbereich und relativ kurze Beobachtungsperioden (1–6 Stunden) bewertet, was die Bewertung langfristiger pathologischer Veränderungen und Dosis-Response-Beziehungen einschränkte. Zweitens, obwohl die erhöhte Phosphorylierung von JNK1/2 und die pharmakologische Intervention auf die Beteiligung des JNK-Signalwegs an Aconitin-induzierten Herzschäden hindeuteten, wurden die vorgelagerten Mechanismen, die Aconitin-Exposition mit JNK-Aktivierung verbinden, nicht vollständig untersucht. Aconitin ist dafür bekannt, vor allem spannungsgesteuerte Na⁺-Kanäle und die intrazelluläre^Ca-2⁺-Homöostase zu beeinflussen, was zur nachgelagerten JNK-Aktivierung beitragen kann. Allerdings wurden verwandte Signalereignisse, darunter oxidativer Stress und Kalziumüberlastungswege, in der vorliegenden Studie nicht direkt untersucht. Drittens lieferte die molekulare Andockungsanalyse nur unterstützende Belege für potenzielle Wechselwirkungen zwischen Aconitin und JNK1/2 und stellte keine direkte physiologische Bindung dar. Es wurde keine zusätzliche experimentelle Validierung durchgeführt, wie etwa Oberflächenplasmonresonanz oder Pull-down-Assays. Darüber hinaus wurden nur JNK1/2 untersucht, während die mögliche Rolle von JNK3 bei Aconitin-induzierter Kardiotoxizität unklar bleibt. Schließlich wurde nach SP600125 oder Anisin-Intervention keine elektrokardiographische Untersuchung durchgeführt. Daher bedarf weitere Untersuchungen, ob die Regulierung des JNK-Wegs direkt Aconitin-induzierte ventrikuläre Arrhythmien beeinflusst.

Zusammenfassend aktiviert Acon den JNK-Signalweg, was sich durch eine erhöhte Phosphorylierung von JNK1/2 zeigt, die zu Myokardschäden beitragen kann, wie eine erhöhte Kollagenablagerung und erhöhte Freisetzung kardialer Enzyme im Myokardgewebe der Ratte. Da Aconitin-induzierte Kardiotoxizität mehrere vorgelagerte Ereignisse umfasst, darunter Na⁺-Kanalaktivierung,^Ca-2⁺-Überlastung und oxidativen Stress, könnte die Aktivierung des JNK-Weges ein zentrales nachgelagertes Signalereignis sein, das zu Myokardialschäden beiträgt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4 % Paraformaldehyd	Wuhan Service-bio Co., Ltd.	HJ203501	Gewebefixierung
Aconitin (Acon)	Chengdu DeSiTe Biological Technology Co., Ltd.	DRK-0335-960330	Toxische Verbindung für das Gavage-Modell
Anilinblau-Lösung	Beijing Solarbio Co., Ltd.	G1350	Masson-Färbung
Anisomycin (Anis)	MedChemExpress Co., Ltd.	153154	JNK-Pfadaktivator/-steuerung
AST ELISA-Trikot	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E13023r	Erkennung kardialer Enzyme
AutoDock Vina	Open Source	N/A	Molekulare Andockung
BCA-Protein-Assay-Kit	Sangon Biotech (Shanghai, China)	Nicht spezifiziert	Proteinquantifizierung
Zentrifuge	Dongguan cnzcn Co., Ltd.	TD5M-WS	1000 & mal; g Zentrifugation
Chem3D-Software	PerkinElmer	N/A	Ligandenenergieminimierung
CK-MB ELISA-Kit	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E14403r	Erkennung kardialer Enzyme
cTn-I ELISA-Kit	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E08594r	Nachweis kardialer Proteine
Einwegnadel für venöse Blutentnahme	KINDLY Co., Ltd.	https://www.kdlchina.cn/specimen-collection/220.html	Blutentnahme
Verbessertes Chemilumineszenz-(ECL)-Reagenz	Millipore Co., Ltd.	21302A4	Western Blot Visualisierung
Eosin	Beijing Solarbio Co., Ltd.	20200905	H& E-Färbung
GraphPad Prism 8	GraphPad Software, Inc.	N/A	Statistische Analyse
Hämatoxylin	Wuhan Service-bio Co., Ltd.	CR2203066	H& E-Färbung
h-FABP ELISA-Kit	Wuhan Huamei Biotechnology Co., Ltd.	CSB-E16184r	Nachweis kardialer Proteine
ImageJ Software	Nationale Gesundheitsinstitute (NIH)	N/A	Westliche Blot-Quantifizierung
JNK1/2 Primärantikörper	HuaAn Biotechnologie (Hangzhou, China)	ET1609-42	Westlich-Blot-Antikörper
LDH ELISA-Kit	Shanghai Enzymgebundene Biotechnologie	ml003416	Erkennung kardialer Enzyme
Masson-Blau-Lösung	Beijing Solarbio Co., Ltd.	20220303	Masson-Färbung
Mikroplattenleser	Thermo Fisher Scientific	ME001000C	ELISA OD-Messung (450 nm)
Optisches Mikroskop (Olympus C33)	Olympus (Tokio, Japan)	C33	Histologische Bildgebung
Paraffinwachs	Leica  Co., Ltd.	2110068	Gewebeeinbettung
PBST-Puffer	Meilunbio Co., Ltd.	MA0015-Apr-27G2	Waschpuffer
p-JNK1/2 Primärantikörper	HuaAn Biotechnologie (Hangzhou, China)	ET1601-28	Phosphorylierter JNK-Antikörper
Proteindatenbank (PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	Proteinstrukturquelle
Proteinextraktions-Set	Sangon Biotech (Shanghai, China)	C510003-0050	Gewebeproteinextraktion
PubChem-Datenbank	NIH	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov	Ligandstrukturquelle
PVDF-Membran	Millipore Co., Ltd.	R1PB81493	Westliche Blot-Transfermembran
PyMOL	Schrö dinger, Inc.	https://pymol.org/	Andockvisualisierung
SDS-PAGE Gel (10 %)	Beijing Solarbio Co., Ltd.	817X031	Proteinelektrophorese
Magermilchpulver	Beijing Solarbio Co., Ltd.	http://www.solarbio-hd.com/solarbiohd-Products-23261665/	Blockierendes Reagenz (5 %)
Natrium-Pentobarbital	Thermo Fisher Scientific Inc.	57-33-0	Anästhesie für Tierbehandlungen
SP600125 (JNK-Inhibitor)	MedChemExpress Co., Ltd.	112518	JNK-Signalweginhibitor
SPF Tierhaltungseinrichtung	Kunming Medizinische Universität	N/A	Unterbringungsbedingungen
Sprague-Dawley-Ratten (männlich, 2 Monate, ~230 g)	Beijing Huafukang Biological Technology Co., Ltd.	http://www.hfkbio.com/	Versuchstiere (n = 51)
Weigert-Eisenhämatoxylin	Guangzhou Wexis Co., Ltd.	18092001	Masson-Färbung
Xylen	Tianjin Tjhxsj Co., Ltd.	20220208	Gewebebeseitigung