Robuste Isolation und multiplexierte Identifikation zirkulierender seltener Zellen mittels kontinuierlicher zentrifugaler Mikrofluidik und Hydrogel-Immunzytochemie

Zusammenfassung

Diese Studie präsentiert einen kontinuierlichen zentrifugalen mikrofluidischen Workflow für eine effiziente Isolierung und Identifikation zirkulierender seltener Zellen. Das System ermöglicht eine präzise Flüssigkeitssteuerung und minimiert den Zellverlust, sodass mehrere CRC-Untertypen, einschließlich CTCs und cCAFs, gleichzeitig analysiert werden, um die Diagnosegenauigkeit zu verbessern.

Zusammenfassung

Zirkulierende seltene Zellen (CRCs), darunter zirkulierende Tumorzellen (CTCs) und zirkulierende krebsassoziierte Fibroblasten (cCAFs), sind vielversprechende Biomarker für die Krebsdiagnose und -prognose. Ihre extrem geringe Häufigkeit und phänotypische Heterogenität machen jedoch effiziente Isolation und multiparametrische Analyse technisch herausfordernd. Hier präsentieren wir einen kontinuierlichen zentrifugalen mikrofluidischen Workflow für die sequentielle Isolierung und Identifikation von CRCs aus Vollblut. Die Kartusche besteht aus fünf miteinander verbundenen Kammern mit steuerbaren Ventilen, die eine präzise Handhabung von Dichtegradienten, Medium und Blutschichten während der Zentrifugation ermöglichen. Basierend auf einer zuvor validierten Anreicherungsplattform integriert der aktuelle Arbeitsablauf hydrogelbasierte Zellimmobilisierung mit multiplexierter Immunzytochemie, um die nachgelagerte Identifizierung und Charakterisierung mehrerer CRC-Subtypen, einschließlich CTCs und cCAFs, zu unterstützen. Nach der Isolierung werden die Zellen in einer Hydrogelmatrix immobilisiert, um die Zellretention während wiederholter Immunfärbung und bildgebender Analyse zu unterstützen. Mit diesem Workflow wurden sowohl CTCs als auch cCAFs aus derselben Stichprobe identifiziert, was die Machbarkeit einer integrierten Analyse mehrerer zirkulierer seltener Zellpopulationen innerhalb eines einzigen Flüssigkeitsbiopsie-Workflows demonstriert. Diese Plattform bietet einen praktischen und reproduzierbaren Ansatz für die nachgelagerte Charakterisierung seltener Zellen in Anwendungen der Flüssigkeitsbiopsie.

Einleitung

Zirkulierende seltene Zellen (CRCs) sind definiert als Zellen, die im Blutkreislauf mit extrem niedrigen Frequenzen im Vergleich zu normalen Blutkomponenten wie roten Blutkörperchen, weißen Blutkörperchen und Blutplättchen existieren. CRCs stammen aus verschiedenen Quellen, wie Nebenprodukten biologischer Prozesse, Geweberemodellierung, Wundheilung oder vaskulärer Verletzungen. Repräsentative Beispiele sind zirkulierende Endothelzellen, zirkulierende fetale Zellen, Megakaryozyten, Erythroblasten und verschiedene Vorläufer- oder Stammzellen ^1,2. Obwohl das blozt Vorhandensein von CRCs nicht zwangsläufig einen pathologischen Zustand widerspiegelt, deuten erhöhte Werte häufig auf abnormale physiologische oder pathologische Zustände^{hin 3,4}. Dementsprechend liefert die empfindliche Detektion und Charakterisierung von CRCs wertvolle Einblicke in dynamische physiologische und pathologische Prozesse, die im Körper stattfinden.

Unter CRC-Subtypen sind zirkulierende Tumorzellen (CTCs) und zirkulierende krebsassoziierte Fibroblasten (cCAFs) wichtige Biomarker für Krebs. CTCs liefern direkte Hinweise auf die Verbreitung von Tumorzellen und werden umfassend untersucht⁵. Veränderungen in der CTC-Enumeration stehen oft im Zusammenhang mit frühzeitiger Erkennung, Prognose und Überwachung der therapeutischen Antwort⁶. Parallel dazu repräsentieren cCAFs stromale Komponenten, die in den Blutkreislauf abgegeben werden, was die Interaktionen der Tumormikroumgebung und die Bildung der prämetastatischen Nische⁷ widerspiegelt. Im Vergleich zu CTCs bleibt die Forschung zu cCAFs jedoch begrenzt, und ihr klinischer Nutzen wird erst erforscht.

CTCs und cCAFs können komplementäre biologische Informationen in der Flüssigkeitsbiopsie liefern, da CTCs die Verbreitung von Tumorzellen und metastatische Merkmale widerspiegeln, während cCAFs stromale Remodellierung und mit der Tumormikroumgebung assoziierte Progressionssignale darstellen können. Eine gleichzeitige Analyse dieser beiden zirkulierenden seltenen Zellpopulationen kann daher ein umfassenderes Verständnis des Krebsverlaufs unterstützen als die Analyse einer der beiden Populationen allein. Ihr klinischer und translationaler Nutzen ist jedoch erheblich eingeschränkt durch ihre extreme Seltenheit im peripheren Blut, das Fehlen allgemein akzeptierter cCAFs-Marker und die signifikante Heterogenität der Markerexpression zwischen Zellsubpopulationen, was zusammen eine zuverlässige Identifizierung erschwert. Daher ist es entscheidend, den Zellverlust während der Anreicherung und Identifikation zu minimieren, um eine robuste und zuverlässige Analyse zu gewährleisten. Darüber hinaus ist eine umfassende Charakterisierung der funktionellen und markerbezogenen Diversität von CTCs und cCAFs unerlässlich, um ihre Rolle bei Metastasen aufzuklären und die Entwicklung klinisch sinnvoller Biomarker ^8,9 zu entwickeln.

Hier stellen wir eine Methode zur gleichzeitigen Isolierung von cCAFs und CTCs^10,11 vor, kombiniert mit Multimarker-Identifikation mittels Hydrogel-Kapselung seltener Zellen (ICC)¹². Aktuelle CRC-Isolationsmethoden haben oft technische Einschränkungen, darunter Zellverlust während der mehrstufigen Verarbeitung, eingeschränkter Einfang phänotypisch heterogener Zellen und Selektionsfehler, die mit markerabhängigen Anreicherungsstrategien verbunden sind. Im Gegensatz dazu basiert die in dieser Studie verwendete kontinuierliche zentrifugale Mikrofluidikplattform auf einem umfassenden Anreicherungsrahmen, wodurch die Abhängigkeit von konventionellen Positivselektionsmarkern reduziert wird. Die analytische und workflow-Leistung der zugrunde liegenden Anreicherungsplattform wurde in unseren früheren Studien^{beschrieben 9}.

Aufbauend auf dieser validierten Plattform konzentriert sich die vorliegende Studie auf die Integration von hydrogelbasierter Zellimmobilisierung und multiplexierter Immunzytochemie, um die umfassende Isolierung und Identifizierung mehrerer zirkulierer seltener Zellpopulationen, einschließlich CTCs und cCAFs, in einem einheitlichen Arbeitsablauf zu ermöglichen. Durch die Kombination von Anreicherung, stabiler Zellretention und wiederholter färbungskompatibler Analyse bietet dieses Protokoll einen praktischen Rahmen für eine integrierte Seltenzellanalyse aus Flüssigkeitsbiopsieproben.

Protokoll

Alle Verfahren mit menschlichen Blutproben von Patienten und gesunden Spendern wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB) des Severance Hospital durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Review Board des Severance Hospital (IRB Nr. 4-2013-0059) genehmigt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Gerätevorbereitung

1. Drück den Powerschalter , um das Instrument einzuschalten.
2. Schalte den Laser-Interlock-Schalter ein und schalte dann den Laser-Power-Schalter ein.
3. Starte die Betriebssystemsoftware und prüfe, dass das System normal initialisiert.
4. Über die Haupt-Softwareoberfläche wählen Sie Gerätebetrieb und wählen Sie das voreingestellte Protokoll für Standard-EDTA-Vollblutproben.

2. Gerätebetrieb – 1.^Schritt

HINWEIS: Details zu den Einlasspositionen und der Kartuschenstruktur sind in Abbildung 1A dargestellt.

1. Vom Einlass 6 geben Sie 2 mL Reagenz A (Dichtegradientenmedium) in die Anfangskammer.
2. Vom Einlass 8 aus fügen Sie 875 μL Reagenz A in die Entlastungskammer ein.
3. Befestigen Sie die Kartusche auf das Scheibengestell und sorgen Sie für die Zentrifugation für die richtige Ausbalancierung.
4. Drücke den Türknopf am CTCeptor, um die Halterung zu öffnen, dann montiere das Disc-Rack am CTCeptor und befestige es mit den Befestigungsschrauben.
5. Drücken Sie die Tür-Taste , um die Halterung zu schließen, und führen Sie den Dreh-Abwärts-Schritt mit der CTCeptor-Software durch (etwa 30 Sekunden).
6. Nachdem bestätigt wurde, dass Reagenz A in den unteren Teil der Anfangskammer übertragen wurde, lösen Sie die Befestigungsschrauben und entfernen Sie das Scheibengestell vom Instrument, während die Patrone montiert bleibt.

3. Gerätebetrieb – 2^{. Schritt}

1. Vor der Handhabung von Blutproben führen Sie alle Verfahren in einem zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank durch und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, Laborkittel und Augenschutz, gemäß den institutionellen Biosicherheitsrichtlinien.
2. Nachdem die Patrone aus dem Instrument entfernt ist, werden 3 ml Blut durch Einlass 6 in die Anfangskammer injiziert.
3. Montiere das Disc-Rack am CTCeptor und befestige es mit den Befestigungsschrauben.
4. Führen Sie den Schritt zur Entfernung der Rotkörperchen mit der CTCeptor-Software durch (ca. 40 Minuten). Während dieses Schrittes trennt die Zentrifugation Plasma, RBCs und periphere Blutmononuklearzellen (PBMCs) innerhalb der Kartusche, und der PBMC-haltige Anteil wird zur nächsten Kammer für die anschließende Leukozytendepletion übertragen.
5. Nach Abschluss der Entfernung der Rotkörperzellen wird das Scheibengestell vom Instrument entfernt.

4. Gerätebetrieb – 3.^Schritt

1. Desinfizieren Sie den Arbeitsbereich sorgfältig, um die Sterilität zu erhalten.
2. Wirbel das Reagenz B (Leukozyten-Isolationsperlen), um eine homogene Suspension zu gewährleisten.
3. Bereiten Sie den Waschpuffer vor, indem Sie Ca²⁺/Mg²⁺-freie DPBS mit 0,1 % BSA und 2 mM EDTA (pH 7,4) mischen.
4. Übertragen Sie das gewünschte Volumen des Reagens B in ein 1,5-mL-Rohr (zum Beispiel 50 μL pro Kartusche).
5. Fügen Sie den Waschpuffer auf das Fünffache des Reagens B hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipetten.
6. Stellen Sie das Rohr für 1 Minute auf einen magnetischen Halter, damit die Perlen in Reagenz B sich sammeln können, und entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstandsmittel.
7. Hängen Sie die Perlen im Waschpuffer wieder auf ein Volumen, das dem ursprünglichen Volumen der Perle entspricht.
8. Lagern Sie die Perlen bis zur Verwendung bei 4 °C.
9. Unmittelbar vor der Verwendung werden 50 μL der vorbereiteten Perlen mit 50 μL DPBS gemischt und 100 μL der Mischung in Einlass 7 gegeben.
10. Montiere das Disc-Rack am CTCeptor und befestige es mit den Befestigungsschrauben.
11. Führen Sie den Schritt zur Entfernung der weißen Blutkörperchen mit der CTCeptor-Software durch (ca. 50 Minuten). In diesem programmierten Schritt werden die geladenen Leukozyten-Isolationsperlen durch Schütteln mit der PBMC-haltigen Fraktion vermischt, um die Bindung von Perlen-WBC zu fördern, gefolgt von zentrifugationsbasierter Entfernung des perlengebundenen WBC-Anteils.
12. Nach Abschluss des Entfernens der weißen Blutkörperchen wird das Disc-Rack vom Instrument entfernt.

5. Probenbergung

1. Führen Sie eine Pipettenspitze in Auslass 9 der Endkammer ein und suspendieren Sie den Inhalt erneut, bevor Sie die gesammelte Probe in ein 15-ml-Rohr umleiten.
2. Injizieren Sie 2 ml DPBS in Auslass 9, spülen Sie die Kammer gründlich durch Pipettieren und übertragen Sie die Waschflüssigkeit auf dasselbe 15-mL-Rohr.
3. Wiederhole den Waschschritt zweimal.
4. Stellen Sie das Volumen der gesammelten Flüssigkeit im 15-mL-Rohr mit DPBS auf 14 mL ein, schließen Sie den Schlauch ab und mischen Sie vorsichtig durch Inversion.
5. Zentrifugiere das Rohr bei 380 × g für 4 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Entfernen Sie vorsichtig das Überlagerungsmittel, lassen Sie etwa 1 ml übrig, und verwenden Sie die verbleibende Suspension für die nachgelagerte Analyse.

6. Identifikation von CRCs

1. Zur Herstellung des prä-hydrogelhaltigen Polymers mischen Sie Ca^2⁺/Mg^2⁺-freie DPBS, Hydrogel-Pellicle-Immunzytochemie (HypICC) Lösung A (Präpolymer) und Photoinitiator im Verhältnis 80:20:1.
2. Mischen Sie 870 μL CRC-Suspension mit 270 μL Pre-Hydrogel-Polymer.
3. Das Gemisch wird in die HypICC-Kammer übertragen und bei 500 × g für 5 Minuten zentrifugiert, damit sich die Zellen in der Plattform absetzen können.
4. Stecken Sie den Dickenregler in die HypICC-Kammer, um die Hydrogeldicke einzustellen.
5. Bestrahlen Sie die Probe mit UV-Licht (365 nm) für 20–30 Sekunden von unten, um die Hydrogelschicht zu vernetzen.
6. Entferne den Dickenregler und wasche die hydrogel-umschlossenen Zellen dreimal mit DPBS.
7. Die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 10 Minuten bei Zimmertemperatur fixieren und dann die Proben dreimal mit DPBS waschen, jeweils 10 Minuten.
8. Permeabilisiere die Zellen mit 0,05 % Triton X-100 für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Proben dreimal mit DPBS, jeweils 10 Minuten.
9. Blockiere die Proben mit 2 % BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
10. Inkubieren Sie die Proben über Nacht mit primären Antikörpern bei 4 °C.
11. Wasche die Proben fünfmal mit DPBS, 20 Minuten pro Wasch.
12. Färben Sie die Kerne mit Hoechst für 10 Minuten bei Zimmertemperatur, dann waschen Sie die Proben dreimal mit DPBS, jeweils 10 Minuten.
13. Bei Bedarf kann die sekundäre Antikörperinkubation unter denselben nächtlichen Bedingungen wie die primäre Antikörperinkubation durchgeführt werden.
14. Führen Sie fluoreszenzmikroskopische Bildgebung durch und identifizieren Sie CRCs.

7. Multiplex-Immunfärbung von CRCs

1. Nach der Immunfärbung und Bildgebung können CRCs nach dem Abschrecken eine weitere Antikörperfärbung durchlaufen.
2. Bereiten Sie eine Abschrecklösung mit 4,5 % H₂O₂ und 24 mM NaOH in PBS vor.
3. Entferne das DPBS aus der HypICC-Kammer und gib die Abschrecklösung hinzu.
4. Inkubieren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur unter weißem Licht mit Schütteln.
5. Ersetzen Sie die Abschrecklösung und inkubieren Sie weitere 1 Stunde unter denselben Bedingungen.
6. Wasche die Proben viermal mit DPBS für 10 Minuten pro Wasch.
7. Starten Sie das Immunfärbungsverfahren ab dem Blockierungsschritt mit 2 % BSA.

Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt ein Bild einer einzelnen Kartusche, die für die Isolierung seltener Zellen verwendet wird. Die Kartusche besteht aus fünf einzelnen Kammern, die durch Mikrokanäle und steuerbare Ventile verbunden sind, die den Flüssigkeitsfluss regulieren. Die Struktur der Patrone ist wie folgt: (1) eine Plasmakammer, die Plasma sammelt, das von Vollblut getrennt ist; (2) eine Anfangskammer, in der Vollblut in Plasma-, rote Blutkörperchen- und PBMC-Schicht...

Diskussion

CRCs sind wichtige Biomarker mit potenziellem Wert sowohl für die Krebsdiagnose als auch für die Prognose. Um den klinischen Nutzen der CRC-Analyse zu verbessern, ist es jedoch wichtig, ein breiteres Spektrum phenotypisch vielfältiger CRC-Populationen zu erfassen und eine parallele multiparametrische Charakterisierung¹³ zu unterstützen. Darüber hinaus zeigen zunehmende Evidenzen in der Onkoimmunologie, dass Immunkomponenten und das Tumormikroumfeld eine entscheide...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 mL Konischer Röhrchen	SPL	50015
16% Formaldehyd (w/v), methanolfrei	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure Esel Anti-Ziege IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
Bovines Serumalbumin	GenDepot	A0100-010
CD45 Antikörper	Biolegend	304060
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	Diskkartusche
CTCD-Rack	CTCELLS	CTDR-CM3	Disk-Rack
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S Reagenz A	CTCELLS	CTR-S1001	Dichtegradientenmedium
CTR-S Reagenz B	CTCELLS	CTR-S1002	Leukozytenisolierungsperlen
FAP Antikörper	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
HypICC Photoinitiator	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC Lösung A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC Einheit	CTCELLS	CTH-V01	HypICC-Kammer
Latexhandschuh	Ansell	93743080
Magnetständer			Im eigenen Haus mit einem 3D-Drucker gefertigt
Manuelles Pipettieren  (0,5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manuelles Pipettieren  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Manuelles Pipettieren  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manuelles Pipettieren  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manuelles Pipettieren  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
Pancytokeratin Antikörper	Invitrogen	53-9003-82
PBS (phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung)	Welegene	LB001-02
SMA Antikörper	Invitrogen	PA5-18292
Pipettenspitze, 10 µL	TipOne	9104020333
Pipettenspitze, 1250 µL	TipOne	9104020740
Pipettenspitze, 200 µL	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
Vollblut			Bei 4-8 °C aufbewahren, indem es in EDTA gesammelt wird
β Aktin Antikörper	abcam	ab8226