Eine optimierte Methode zur Isolierung des weiblichen Harnröhrenepithels für Einzelzell- und Immunfluoreszenzanalyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine optimierte Methode zur Isolierung der epithelialen Schleimhaut der adulten weiblichen Maus-Harnröhre für nachgelagerte Analysen, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunfärbung und Organoidkultur. Methoden führten zu angereicherten, lebensfähigen Harnröhrenepithelzellen, wie die Flowzytometrieanalyse, Whole-Mount-Bildgebung und effiziente Organoidbildung belegen.

Zusammenfassung

Die Harnröhre, die mit Epithelzellen ausgekleidet ist, dient als Kanal für den Urinabfluss aus dem Körper. Die epithheliale Auskleidung der Harnröhre besteht aus unterschiedlichen Zelltypen mit Gensignaturen, die auf eine Rolle in der antimikrobiellen und immunen Abwehr hinweisen. Residente Makrophagen, die in der Harnröhrenepithelschicht eingebettet sind, stellen einen transkriptionell eigenständigen Subtyp dar, der angeblich eine Rolle in der Immunüberwachung und Antigenpräsentation hat. Harnkrankheitserreger steigen die Harnröhre hinauf und erreichen die Blase. Eine Untersuchung der Harnröhrenepithelschleimhaut und der zugehörigen Immunzellen wird Aufschluss über die Abwehrmechanismen des Wirts im unteren Harntrakt geben. Ein zentrales Ziel dieses Protokolls ist es, optimierte Methoden zur Zerlegung der weiblichen Maus-Harnröhre und zur Isolierung der Epithelschleimhaut für nachgelagerte Analysen bereitzustellen. Das Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Isolierung von Epithelgewebe aus der weiblichen Maus-Harnröhre durch sanfte enzymatische und mechanische Trennung. Nach der epithelialen Isolation werden Methoden zur sanften enzymatischen Verdauung isolierter Harnröhrenepithel und zugehöriger Immunzellen beschrieben, um hoch lebensfähige Einzelzell-Suspensionen zu erhalten. Das Protokoll beschreibt außerdem Methoden zur Durchflusszytometrieanalyse der isolierten urethralen Epithelzellen der Maus und der epithelial assoziierten Immunzellen. Zusätzlich werden hier Methoden zur Erzeugung geschichteter 3D-Harnröhrenepithelorganoide aus isolierten Epithelzellen vorgestellt. Das Protokoll beschreibt außerdem eine optimierte Methode zur ganzheitlichen Immunfärbung der Harnröhrenepithelplatten, mit der die Morphologie und molekularen Strukturen des Maus-Harnröhrenepithels und der zugehörigen Immunzellen beobachtet werden können. Insgesamt ermöglichen die hier beschriebenen Methoden zur Isolierung und Einzelzellverdauung von Maus-Harnröhrenepithelzellen nachgelagerte Analysen, einschließlich Immunfärbung, Durchflusszytometrie, Organoid-Generierung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung.

Einleitung

Der untere Harnweg der Maus (LUT) besteht aus zwei Teilen: der Blase und der Harnröhre. Während der embryonalen Stadien entwickeln sich die Strukturen des LUT aus der Kloake, einer vorübergehenden, endoderm-abgeleiteten Struktur, die sich im kaudalen Hinterdarm befindet. Der ventrale Teil der Kloake, der urogenitale Sinus, bildet vorne die Blase und die Harnröhre^{hinten 1}. Die Schleimhaut der Blase ist gut erforscht. Es bildet eine enge Barriere gegen Urinbestandteile durch apikale kristalline Plaques, die aus Uroplakin-Proteinen ^2,3,4 bestehen. Während die Blasenschleimhaut ein Übergangsepithel ist, zeigt die Harnröhre Unterschiede in der Epithelstruktur vom Blasenhals bis zur distalen Harnröhrenöffnung. Zusätzlich zeigt die Harnröhre sexuellen Dimorphismus in den Epithelstrukturen und der zellulären Architektur. Die männliche Maus-Harnröhre besteht aus Übergangsepithel am Blasenhals, gefolgt von säulenförmigem und geschichtetem Epithel. Die weibliche Maus-Harnröhre ist am Blasenhals von Übergangsepithel und mehrschichtigem geschichtetem, nicht-plattenepithelartigem Epithel ausgekleidet, das von kleinen Gängen durchsetzt ist, die in sekretorischen Drüsen am distalen^{Ende enden}.

Frauen sind anfälliger für Harnwegsinfektionen (HWI), die hauptsächlich durch uropathogene Bakterien verursacht werden, die aus dem Darm durch die Harnröhre aufsteigen und die Blase^infizieren. Die Harnröhre ist die erste Oberfläche im LUT, die mit aufsteigenden Harnkrankheitserregern in Kontakt kommt. Die Funktion der Harnröhrenepithelzellen, insbesondere ihre Rolle als aktive immunologische Barriere, wurde bisher wenig erforscht. Neuere Arbeiten derselben Gruppe lieferten eine räumliche Karte der erwachsenen weiblichen Maus-Harnröhre⁵ mit Einzelzellauflösung. Es identifizierte eine dreifache Harnröhrenauskleidung mit basalen, intermediären und apikalen Zellen. In der epitihelialen Schleimhaut sind seltene neuroendokrine Zellen ^5,7 eingestreut. Gegen die Mitte der Harnröhre verzweigen sich kleine Kanäle vom Hauptstamm der Harnröhre und enden in Clustern sekretorischer Drüsen, die im stromalen Kompartiment der Harnröhre eingebettet sind. Transkriptomische Daten zeigten, dass die Epithelzellen in der Harnröhre immunmodulatorische und antimikrobielle Gene exprimieren, die die Abwehr des Wirts beeinflussen^könnten. Die Untersuchung der Eigenschaften und Eigenschaften von Harnröhrenepithelzellen in Bezug auf ihr Abwehrpotenzial und ihre immunmodulatorischen Funktionen kann neuartige Strategien zur Bekämpfung von Harnwegsinfektionen bieten.

Die Nutzung der Maus zur Untersuchung des Harnröhrenepithels ermöglicht zeitliche Studien und die Untersuchung des sexuellen Dimorphismus. Aufgrund der Ähnlichkeiten der Maus mit dem Menschen hinsichtlich der zellulären Struktur von Blase und Harnröhre¹ wurde die Maus umfangreich zur Untersuchung der embryonalen Entwicklung des unteren Harnwegs ^1,8,9 eingesetzt. Mäuse wurden auch in transurethralen Instillationsmodellen verwendet, um Harnwegsinfektionen durch Harnwegserreger zu untersuchen 10,11,12. Das untere Harnwegsgewebe ist bei Patienten schwer zugänglich, es sei denn, sie unterziehen sich einer Resektion wegen Krebs oder anderer Erkrankungen. Eine Quelle für konstantes, gesundes menschliches Gewebe ist schwer zugänglich, und die Maus bietet ein nützliches Modell zur Untersuchung von Geweben im unteren Harntrakt für Studien zur Gewebehomöostase, Reparatur und Reaktion auf entzündliche Verletzungen. Die weibliche Maus- und die menschliche Harnröhrenschleimhaut bestehen beide aus Übergangsepithel am Blasenhals und einem geschichteten, nicht-plattepithelartigen, nicht keratinisierten Epithel am distalen Ende. Das Plattenepithel ist am distalen Ende der menschlichen weiblichen Harnröhre zu beobachten, obwohl Variabilität in der weiblichen Harnröhrenschleimhaut des Menschen ab ^5,13 Jahren beobachtet wird. Obwohl keine Vergleiche der Harnröhrenschleimhaut auf Transkriptomebene zwischen der menschlichen und der Maus-Harnröhre durchgeführt wurden, stellt die Maus ein nützliches Modell dar, um epitheliale Musterbildung, epithelial-Immun-Interaktionen und die Reaktion auf Infektionen in der Harnröhre zu erfassen.

In dieser Studie beschreiben die Autoren Methoden zur Dissektion der vollwertigen Harnröhre erwachsener weiblicher Maus, zur Isolierung des Harnröhrenepithels und zur sanften enzymatischen Verdauung zur Herstellung einzelzelliger Suspensionen. Dies ist das erste detaillierte Protokoll zur Isolierung und Verdauung des weiblichen Harnröhrenepithelgewebes der Maus. Das optimierte Protokoll liefert eine angereicherte Einzelzellpopulation von Epithelzellen, die für verschiedene nachgelagerte Analysen genutzt werden kann. Wie in der Studie dargestellt, haben die Autoren eine Durchflusszytometrie an einer Einzelzell-Suspension von Harnröhrenepithelzellisolaten durchgeführt, die das Vorhandensein lebensfähiger Einzelzellen, überwiegend epithelartiger Natur, nachweist. Darüber hinaus sind diese Epithelzellen in der Lage, in 3D-Kulturen Organoide zu erzeugen, die der geschichteten Maus-Harnröhrenschleimhaut ähneln. Die Autoren zeigen außerdem eine Ganz-Montage-Färbung von Harnröhrenepithelblättern, um die Assoziation von epithelassoziierten Immunzellen, insbesondere Makrophagen, mit urethralen Epithelzellen zu untersuchen. Die in diesem Artikel beschriebenen Methoden unterstützen die Forschung zur Harnröhrenschleimhaut und ihrer Rolle in der Immunabwehr.

Protokoll

Alle Studien an Mäusen wurden mit Zustimmung des Institutional Animal Ethics Committee (INS-IAE 2022/01(R 1 M2)) und des Institutional Biosafety Committee (inStem/G-141(3)-22/DBJ) am BRIC-Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine in Bengaluru durchgeführt. Weibliche CD-1- oder C57BL6/J-Mäuse im Alter von 6 bis 12 Wochen, die im Animal Care and Resource Centre (ACRC) des National Centre for Biological Sciences (NCBS), Bangalore Life Sciences Cluster (BLiSC), untergebracht sind, wurden für diese Studie verwendet. Mäuse wurden unter spezifischen, pathogenfreien Bedingungen in einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus mit ad libitum Nahrung und Wasser untergebracht.

Alle verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Dissektion und Sammlung der erwachsenen weiblichen Maus-Harnröhre

1. Eliminieren Sie die Maus mit_CO2 , bis die Maus aufhört zu atmen. Durchführung der zervikalen Verrenkung als Methode der sekundären Euthanasie.
2. Legen Sie die Maus in eine Rückenlage und sprühen Sie 70 % Ethanol auf, um das Haar am Bauchraum zu benetzen (Abbildung 1A).
3. Heben Sie die Haut am Bauchbereich mit einer Pinzette an und machen Sie einen vertikalen Schnitt zum Unterkörper hin, der an der äußeren Harnröhrenöffnung endet (Abbildung 1B und 1C).
4. Identifizieren Sie die Blase und heben Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette an. In manchen Fällen kann es mit Urin gefüllt sein. Drücken Sie die Blase vorsichtig zwischen den Pinzetten zusammen, um sie zu entleeren.
   HINWEIS: Die Blase erscheint als knollige Struktur.
5. Fett und Bindegewebe um die Blase werden mit einer kleinen Federschere getrimmt, um die schmetterlingsförmige Struktur freizulegen, wo sich die beiden Schambeine an der Symphyse des Schambeins treffen (Abbildung 1D). Die Harnröhre verläuft unter der Symphyse der Schambeinhöhle.
6. Schneiden Sie an der Schamsymphyse, indem Sie sie mit einer Pinzette anheben und mit einer kleinen Federschere aufschneiden (Abbildung 1E). Entfernen Sie die Schambeinfragmente, sodass die Harnröhre von der Blase nach unten verlaufen kann (Abbildung 1F).
   HINWEIS: Die Harnröhre erscheint als dünnes rotes Röhrchen, das auf der ventralen Oberfläche der Scheidenwand liegt (Abbildung 1G).
7. Ziehen Sie die Blase vorsichtig aus der Körperhöhle mit einer feinen Pinzette nach oben und führen Sie eine kleine Federschere zwischen Harnröhre und Scheidenwand, um die Harn- und Fortpflanzungstrakte zu trennen.
8. Halten Sie eine leichte Spannung auf der Blase, während Sie entlang der Rückseite der Harnröhre schneiden, um sie von der Scheidenwand zu trennen (Abbildung 1H–J). Schneiden Sie bis zur distalen Harnröhrenöffnung, um die durchgehende Maus-Harnröhre (1,2–1,5 cm lang) zu erhalten (Abbildung 1K und 1L).
9. Trennen Sie die Harnröhre von der Blase, indem Sie einen einzelnen Schnitt am Blasenhals machen.

2. Isolierung des Harnröhrenepithelgewebes

HINWEIS: Das Protokoll zur Isolierung von Epithelblättern aus der Harnröhre wurde aus einem Protokoll zur Isolierung des Endometriumepithels¹⁴ modifiziert und optimiert. Abbildung 2 zeigt Schritte zur Isolierung der Harnröhrenepithelschichten aus dem umliegenden stromalen Kompartiment (Abbildung 2A).

1. Übertragen Sie die dissektionierten Harnstoffe in eine sterile Petrischale mit frischer 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, Ca und Mg frei, Details in ergänzender Tabelle 1).
   HINWEIS: Es wird empfohlen, in diesem Stadium 4–5 Harnstoffe zur Epitheltrennung und zur Verdauung einzelliger Zellen zu sammeln.
2. Unter einem Seziermikroskop schneiden Sie Fett und Bindegewebe rund um die Harnröhre mit einer feinen Zange und einer kleinen Federschere (Abbildung 2B).
3. Schneiden Sie jede Harnröhre quer in zwei gleich große Stücke und legen Sie sie auf ein 100-Mikron-Nylon-Sieb (Abbildung 2C–G).
4. Waschen Sie die Gewebe, indem Sie 1 ml 1x HBSS (Ca und Mg-frei) über die Gewebe geben.
5. Transferiere Gewebestücke in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr (MCT) (Abbildung 2H), das 1 ml 1 % Trypsin enthält (1 % Trypsin, w/v bis 1x sHBSSa, Details in ergänzender Tabelle 2).
6. Verdauen Sie das Gewebe durch 15–30 Minuten Inkubation auf einem Proberotator (30 U/min) bei 4 °C.
7. Nach der Inkubation werden die Röhren ab 4 °C entfernt. Gib MgCl₂ (1 M MgCl₂, Fond in 1x HBSS) zu einer Endkonzentration von 10 mM und DNase I (10 mg/mL DNase I, Fond in 1x PBS) zu einer Endkonzentration von 10 μg/mL im selben Tube wie die Gewebestücke.
8. Das Röhrchen wird in einen 37 °C Hybridisierungsofen auf einem Proberotator überführt, um dort 15–30 Minuten zu inkubieren.
   HINWEIS: Die Inkubationszeiten für Trypsin bei 4 °C und 37 °C können je nach nachgelagerter Anwendung angepasst werden. Es ist vorzuziehen, 15-minütige Inkubationszeiten für die Ganzmontage-Färbung und 30-minütige Inkubation für die Einzelzellverdauung zu verwenden.
9. Übertragen Sie das Gewebe in ein 1,5 ml MCT mit 10 % Schafserum in 1x HBSS (frei von Ca und Mg), um die Trypsinaktivität zu dämpfen.
10. Übertragen Sie Harnröhrengewebe in ein neues Rohr mit eiskaltem 1x HBSS (frei von Ca und Mg). Dann in eine sterile Petrischale mit eiskalten 1x HBSS übergeben.
11. Mit zwei Feinzapfen wird das Epithel aus der Harnröhre herausgedrückt. Halten Sie ein Ende des Harnröhrenstücks mit einer Zange fest.
12. Mit der anderen Hand drückst du das Harnröhrenstück zwischen die Zinken der Pinzette und führst es über die gesamte Länge des Stücks, um das Epithel herauszudrücken. Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Harnröhrenfragmente in der Schale, um das Epithel zu isolieren (Abbildung 2I–J).
    HINWEIS: Bei der mechanischen Trennung wird eine dünne Schicht transparenten Epithelgewebes aus dem Lumen der Harnröhre extrudiert. Das Harnröhrenepithel lässt sich als dünne, blattartige Gewebefragmente identifizieren, die heller (transparent) erscheinen als das stromale Gewebe. Epithelisolate sollten dünne, transparente Gewebestücke sein, die in eine Petrischale zum Zerkleinern übergeben werden können. Gewebeisolate sollten nicht vollständig abgebaut werden. Wenn Gewebestücke vollständig zerlegt sind, kann die Trypsin-Inkubationszeit verkürzt werden.

3. Verdauung zur Einzelzellensuspension

1. Übertragen Sie isolierte Epithelstücke in eine sterile Petrischale mit einer kleinen Kunststoff-Transferpipette oder einer 200-μL-Pipettenspitze. Zerkleinern Sie das Epithel in kleine Fragmente mit einer kleinen Federschere in einem Tropfen 1x HBSS, der direkt zu den Fragmenten hinzugefügt wird (Abbildung 2K).
   HINWEIS: Stromalgewebestücke, die nach der Epitheltrennung verbleiben, können mit derselben Methode wie das isolierte Epithel verdaut werden.
2. Transferiere die gehackten Stücke mit einer Pipette auf ein 2 ml MCT mit 1,5 ml vorgewärmter (37 °C) Accutase-Verdauungslösung. Die Accutase-Verdauungslösung enthält Folgendes: Accutase, 10 μM Rocki Y-27632 und 100 μg/mL DNase I.
3. Das Rohr mit Gewebe und Verdauungslösung wird in einen Probenrotator in einem 37 °C Hybridisationsofen übertragen. Inkubiere 1 Stunde.
   HINWEIS: Der Inhalt der Tube kann vor dem Fortschreiten auf eine erfolgreiche Verdauung überprüft werden. Erfolgreiche Verdauung: Das gehackte Gewebe ist gut in der Accutase-Lösung verteilt, mit nur wenigen sichtbaren Stücken nach der Inkubation. Fehlgeschlagene Verdauung: Große Gewebestücke sind nach der Inkubation in Accutase-Lösung noch vorhanden. Das Gewebe muss so fein wie möglich gehackt werden, um eine erfolgreiche Verdauung zu gewährleisten.
4. Nach 1 Stunde wird der gesamte Inhalt des 2 mL MCT in ein 5 mL Zentrifugenrohr übertragen und 2 ml Waschpuffer hinzugefügt (1x PBS ohne Ca und Mg, mit 1% Rinderserumalbumin).
5. Drehen Sie die Federung bei 600 x g für 5 Minuten in einer 4 °C-Zentrifuge mit schwenkbarem Schaufelrotor.
6. Saugen Sie das Supernatant mit sanftem Vakuum ab und suspendieren Sie das Pellet in 1 ml Waschpuffer mit einer 1 ml-Pipette mit Filterspitze.
7. Mit der Pipettspitze brechen Sie das Pellet durch Pipettieren auf- und ab, bis die Klumpen kleiner werden. Führen Sie die Federung mit 4 Schlägen durch eine 23 1/2-Gauge-Nadel, die an eine 1-mL-Spritze angeschlossen ist, gefolgt von 4–6 Stößen durch eine 26 1/2-Gauge-Nadel, die an einer 1-mL-Spritze angeschlossen ist.
   HINWEIS: Der Durchgang durch eine Nadel mit kleiner Gauge ist erforderlich, um eine einheitliche Einzelzellsuspension zu erhalten und eine Zellklumpung zu verhindern. Obwohl dieser Schritt Scherstress und Zelltod verursachen kann, haben die Autoren die Anzahl der Stiche mit Nadel und Spritze optimiert, um eine einzige Suspension ohne übermäßigen Zelltod zu ermöglichen. Das Überspringen dieses Schrittes führt zu einem großen Anteil an verklumpten Zellen, was die nachgelagerte Analyse wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung und die Durchflusszytometrie erschwert.
8. Fügen Sie 1 ml Waschpuffer hinzu, um die Oberfläche eines 30-Mikron-Vortrennfilters zu benetzen, der über einem 5-mL-Rohr angebracht ist. Verwenden Sie die Spritze, die mit der 26 1/2-Gauge-Nadel verbunden ist, um 1 ml der Zelllösung durch das Sieb zu übertragen.
9. Fügen Sie 1 ml zusätzlichen Waschpuffer in die Röhre mit den Zellen und nehmen Sie diese Lösung dann mit der Spritze auf und leiten Sie sie durch den Filter. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 600 x g für 5 Minuten bei 4 °C mit einem schwingbaren Eimerrotor.
10. Aspirieren Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet in 100 μL Waschpuffer und fügen Sie 100 μL 1x rote Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer hinzu. Die Suspension genau 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann 4 ml Waschpuffer hinzufügen und das Pellet wieder suspendieren.
    HINWEIS: Die Lyse der roten Blutkörperchen wird empfohlen, um Blutzellen aus der Suspension der Harnröhrenepithelzellen zu entfernen. Obwohl dieser Schritt nur einen geringen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Epithelzellen haben könnte, verwendete das Protokoll einen 0,5-fach verdünnten roten Blutrochen-Lysepuffer und eine 3-minütige Inkubation, um den Zellverlust zu minimieren und die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.
11. Entnehmen Sie Zellen durch Zentrifugation bei 600 x g für 5 Minuten bei 4 °C mit einem schwingbaren Eimerrotor.
12. Aspirieren Sie das Überstandsmittel und suspendieren Sie das Pellet in 50–200 μL Waschpuffer entsprechend der Pelletgröße.
    HINWEIS: Die Pelletgröße aus Geweben, die aus 4–5 gesammelten Proben der Harnröhrenepithelproben der Maus gewonnen wurden, ist klein, aber mit dem Auge sichtbar. Es ist unerlässlich, die Zellen mit einem schwingenden Eimerrotor zu zentrifugieren, sodass sich das Pellet am Boden des Rohrs sammelt und nicht an der Seite verteilt wird. Die Forscher haben eine Zellausbeute von 28.000–34.000 lebenden Zellen pro Maus-Harnröhrenepithel festgestellt.
13. Übertragen Sie 5 μL Aliquot von Zellen auf ein 0,5 mL MCT und fügen Sie 5 μL Trypanblau hinzu. Mischen und laden Sie mit dem Hämozytometer, um Ertrag und Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen.

4. Durchflusszytometrieanalyse von urethralepithelialen Einzelzell-Isolaten

1. Aliquot 100.000 Gesamtzellen in einem 5-mL Zentrifugenrohr zur Durchführung einer fluoreszierenden Immunfärbung einzelner Zellen aus dem urethralen Epithel- oder Stromalkompartiment zur Durchflusszytometrie. Erhöhe das Volumen im Röhrchen auf 4 ml mit 1x PBS.
   HINWEIS: Um zuverlässige Ergebnisse mit Durchflusszytometrie zu erzielen, werden mindestens 50.000 Zellen pro Probe empfohlen.
2. Lassen Sie die Zellsuspension bei 500 x g für 5 Minuten bei 4 °C mit einem schwingenden Schaufelrotor abdrehen.
3. Entsorge das Supernatant und suspendiere das Pellet in 50 μL 1x PBS.
4. Fügen Sie 50 μL 2x Ghost-Farbstoff Violet 450 (1 μL Ghost-Farbstoff in 500 μL 1x PBS) zur Zellsuspension hinzu, um 100 μL 1x Ghost-Farbstofflösung zu erhalten.
   HINWEIS: Ghost Dye V450 ist ein amin-reaktiver Viabilitätsfarbe, der verwendet werden kann, um zwischen lebensfähigen und nicht-lebensfähigen Zellen in Flowzytometrie-Anwendungen zu unterscheiden.
5. Fügen Sie 5 μL Fc-Rezeptor-Blockierungslösung (Anti-Maus CD16/32) pro 100 μL Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist erforderlich, um die Bindung von Immunglobulin an Fc-Rezeptoren zu blockieren.
6. Inkubieren Sie die Zellsuspension auf Eis für weitere 25 Minuten.
7. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf 5 mL mit einem Zellfärbepuffer (1x PBS, 0,02 % (w/v) Natriumazid und 1 % (w/v) BSA, siehe ergänzende Tabelle 3). Drehen Sie mit 500 x g für 5 Minuten bei 4 °C mit einem schwingbaren Schaufelrotor. Entsorgen Sie das Überlagerungsmittel und suspendieren Sie das Zellpellet in 100 μL Zellfärbungspuffer.
   HINWEIS: Natriumazid ist hochgiftig. Vermeiden Sie Kontakt mit Haut, Augen und Kleidung. Verwenden Sie beim Umgang geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA).
8. In 100 μL Zellsuspension werden 5 μL konjugierte primäre Antikörper hinzugefügt: Anti-CD326/EPCAM (kennzeichnet Epithelzellen), Anti-F4/80 (kennzeichnet murine Makrophagen) und Anti-CD45 (pan-immuner Marker) bei einer Verdünnung von 1:20. Die Zellsuspension 30 Minuten auf Eis ausbrüten.
9. Verdünnen Sie die Zellsuspension auf 5 mL mit einem Zellfärbepuffer und drehen Sie dann mit einem Schaukelrotor für 500 x g für 5 Minuten bei 4 °C herunter. Aspiratieren Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in 500 μL Zellfärbungspuffer.
10. Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 35-Mikron-Nylon-Sieb auf Filterkappen-Sortierröhren. Legen Sie die Schläuche bis zur weiteren Analyse auf Eis.
11. Führen Sie die erste Einrichtung und Leistungsprüfung am Zytometer durch.
12. Stellen Sie die Spannungen mit unverfärbten und vollständig gefärbten Proben ein. Vergütung mit Bead Controls durchführen und zur Übernahme übergehen.
    HINWEIS: Experimente mit mehr als einem Fluorophor erfordern eine Kompensation. Bereiten Sie die notwendigen Vergütungskontrollen vor. Für jedes im Experiment verwendete Fluorophor benötigen Sie einzeln gefärbte Kontrollen (d. h. Kompensationsperlen). Die Kompensation kann gemäß den Einstellungen der Durchflusszytometer-Software automatisch durchgeführt werden. FMO-Kontrollgruppen (Fluoreszenz minus eins) werden empfohlen, um zwischen positiven und negativen Zellpopulationen für einen bestimmten Fluorophor zu unterscheiden. Bereiten Sie FMOs vor, indem Sie alle Fluorophore in die Probe aufnehmen, außer dem, für den kontrolliert wird.
13. Stellen Sie die Gatter mit FMO-Steuerungen (Fluoreszenz minus eins) ein und nehmen Sie 50.000 Ereignisse pro Probe auf.

5. Kultur der urethralen epithelialen Organoide

HINWEIS: Für maus-urethrale Epithelorganoide folgen Sie den Protokollen, Abschnitt 3, Verdauung zur Einzelzellsuspension, Schritte 3.1 bis 3.11. um Einzelzell-Suspensionen zu erhalten.

1. Setzen Sie das Pellet der Harnröhrenepithelzelle in 50–100 μL organoiden Expansionsmedien wieder auf (Details in ergänzender Tabelle 4). Bestimmen Sie die Zelllebensfähigkeit und Zellanzahl, indem Sie auf einem Hämozytometer zählen.
2. Bereiten Sie eine 1:4-Mischung aus Zellsuspension (1 Teil) und Cultrex (4 Teile) vor, mit einer Endkonzentration von 5000 Zellen in 25 μL. Fügen Sie 3 Tröpfchen 25 μL-Zellsuspension (5000 Zellen/Tröpfchen) zu jeder Welle einer 12-Wellen-Platte hinzu.
   HINWEIS: Pipette Cultrex immer vorsichtig mit einer abschneidenden Spitze, um Blasen zu vermeiden.
3. Bringen Sie die Platte für 15 Minuten in einen 37 °C Inkubator (5 % CO2_{), um} die Tröpfchen zu verfestigen.
4. Überlagern Sie die Tröpfchen mit 800 μL organoidem Expansionsmedium, sanft von den Seiten des Brunnens, und übertragen Sie die Platte zurück in den Inkubator.
   HINWEIS: Ein Medienwechsel ist alle zwei Tage erforderlich. Ersetzen Sie das verbrauchte Medium durch 800 μL frisches Organoid-Expansionsmedium.
5. Machen Sie an jedem Tag von Tag 0 bis 6 Bilder der Organoide mit einem umgekehrten Mikroskop mit 4x–20x Vergrößerung.

6. Histologie der Harnröhrenorganoide und Immunfärbung

VORSICHT: Xylol ist ein hochentzündliches Lösungsmittel. Verwenden Sie geeignete PSA, um die Chemikalie zu handhaben. Sammeln Sie gebrauchtes Xylol als organisches Lösungsmittelabfall. Entsorgen Sie über genehmigte Programme für gefährliche chemische Abfälle. Formalin ist giftig und verursacht Haut-, Augen- und Atemreizungen. Vermeiden Sie Hautkontakt und Einatmen. Verwenden Sie geeignete PSA, um die Chemikalie zu handhaben. Entsorgen Sie über institutionelle Entsorgungssysteme für gefährliche chemische Abfälle. Das Protokoll zur Einbettung der Harnröhrenorganoide in Paraffinblöcke wurde von einem Protokoll zur Einbettung von endometrialen^{Organoiden 14} modifiziert und optimiert.

1. Am 6. Tag der Organoidkultur entsorgen Sie das verbrauchte Medium und waschen Sie die Organoide mit 1x HBSS bei Zimmertemperatur. Geben Sie 1,5 ml neutral-gepuffertes Formalin (10 %) für 15 Minuten in die Brunnen.
2. Entsorge das Fixativ und gib 1,5 ml Hämatoxylin für 10 Minuten in die Brunnen. Entsorge den Beiz und wasche zweimal mit 1x HBSS.
3. Gib 1 ml 2 % UltraPure Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 1x HBSS in jede Mulde mit 3 Tröpfchen und lasse die Agarose bei Zimmertemperatur 15 Minuten fest machen.
4. Entferne die Agarose vorsichtig aus dem Brunnen mit dem flachen Ende eines dünnen Pfannenwenders, damit die Cultrex-Tropfen ebenfalls abgenommen werden.
5. Übertragen Sie die Agarose-Scheibe in eine Gewebekassette und dehydrieren Sie sie in 70 % Ethanol für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit ständigem Rühren.
6. Weiter dehydriert in unterschiedlichen Ethanolkonzentrationen und Dauern: 90 % Ethanol für 30 Minuten, 100 % Ethanol für 30 Minuten, 100 % Ethanol für 60 Minuten, 100 % Ethanol für 90 Minuten.
7. Abtupfen Sie überschüssiges Ethanol ab und reinigen Sie es 45 Minuten lang mit Xylol bei Raumtemperatur und ständigem Rühren. Wiederhole den Xylol-Clearing-Schritt 60 Minuten lang.
8. Abtupfen Sie das überschüssige Xylol ab und übertragen Sie es über Nacht auf einschleusendes Paraffinwachs (65 °C).
9. Geben Sie eine dünne Schicht Einbettwachs auf die Basis einer Metall-Einbettform und legen Sie die Agarose-Scheibe darüber. Entferne die Form aus dem Schlittenwärmer und überdecke sie schnell mit Einbettwachs durch die Lamellen des Kassettenbodens. Lass es bei Zimmertemperatur erstarren.
10. Organoid-Paraffinblöcke auf einem Mikrotom schneiden, um 5-μm-Schnitte zu erhalten. Platziere Abschnitte auf positiv geladenen Objektträgern.
11. Hämatoxylin-Eosin-Färbung
    1. Backfolien bei 60 °C, deparaffinisieren mit Xylol und durch eine Reihe von Ethanolwäschen (Xylol 1 Min, 100 % Ethanol 1 Min, 95 % Ethanol 1 Min, 75 % Ethanol 1 Min)
    2. Wasche die Rutschen im Leitungswasser und brüte 3 Minuten mit Gills Hematoxylin Nr. 2 aus. Platzieren Sie Folien unter einen Leitungswasserstrahl, um eine blaue Farbe zu entwickeln.
    3. Inkubieren Sie Objektträger in 95 % Ethanol für 1 Minute, gefolgt von einer 0,25 % Eosinlösung für 1 Minute. Waschrutscher im Leitungswasser, bis das Wasser klar ist.
    4. Dehydrieren (95 % Ethanol 1 Min, 100 % Ethanol 1 Min) und mit Xylol (1 Min) klarmachen, bevor es mit schnell härtendem Montagemedium montiert wird.
12. Immunfärbung von Paraffinschnitten
    1. Backen Sie 5 μm Paraffinstücke in einem Hybridisierungsofen bei 60 °C für 1–2 Stunden.
    2. Entwachs-Objektträger, indem man ihn 6 Minuten lang in Xylol in einem Folien-Färbeglas eintaucht.
    3. Rehydrieren Sie 100 %, 95 %, 75 % Ethanol in destilliertem Wasser jeweils 6 Minuten lang. Dann Wasche ich die Folien 5 Minuten lang in destilliertem Wasser.
    4. Gib die Objektträger in eine quadratische Pyrex-Schale mit 0,01 m Zitronensäure (in destilliertem Wasser) Antigenentnahmelösung und decke die Schale mit Frischhaltefolie ab. Führen Sie eine Antigenentnahme durch Mikrowellen-Aktivität mit hoher Leistung für 20 Minuten durch.
    5. Kühlen bis lauwarm für 20 Minuten und 5 Minuten in PBS abspülen. Ziehen Sie eine hydrophobe Barriere um Gewebeschnitte und fügen Sie 100 μL pro Abschnitt Pferdeblockierpuffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit sanftem Schaukeln hinzu (siehe Ergänzende Tabelle 5 zur Vorbereitung des Pferdeblockpuffers).
    6. Primäre Antikörperlösung im Pferdeblockierungspuffer herstellen, indem Sie primäre Antikörper mit geeigneter Verdünnung (1:100–1:200) hinzufügen. Fügen Sie jedem Abschnitt 100 μL primäre Antikörperlösung hinzu. Inkubationsrutschen über Nacht bei 4 °C mit sanftem Schaukeln.
       HINWEIS: Die Organoide wurden immunfärbt mit Antikörpern gegen Keratin 5/KRT5 (basalepithelialer Marker), P63 (basalepithelialer Marker), KRT4 (intermediärer/suprabasaler epithelialer Marker) und KRT13 (intermediärer/suprabasaler epithelialer Marker).
    7. Nach der nächtlichen Inkubation Waschfolien in PBS 4 x 5 Minuten bei Zimmertemperatur mit sanftem Schaukeln.
       HINWEIS: Alle weiteren Schritte sollten in einer lichtgeschützten Box bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
    8. Sekundäre Antikörperlösung im Pferdeblockierungspuffer vorbereiten, wobei fluoreszierend markierte sekundäre Antikörper mit einer Verdünnung von 1:500 hinzugefügt werden. Inkubiere die Folien 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur und sanftem Schaukeln.
    9. Wasch-Folien in PBS 4 x 5 Minuten bei Zimmertemperatur mit sanftem Schaukeln.
       HINWEIS: Optionaler Schritt: Verwenden Sie Autofluoreszenz-Abschreckungskits, um das Autofluoreszenzsignal abzuschrecken.
    10. Inkubiere mit 300 nM DAPI-Lösung für 5 Minuten bei sanftem Schaukeln. Waschen Sie in PBS für 2 x 5 Minuten bei Zimmertemperatur mit sanftem Schaukeln.
    11. Montage mit Anti-Fade-Befestigungslösung (90 % Glycerol, 0,2 % n-Propylgallat in 1x PBS). Bildabschnitte auf einem Breitfeld-Fluoreszenzmikroskop.
        HINWEIS: Die Belichtungseinstellungen der Kamera für jedes Fluorophor müssen so angepasst werden, dass das Signal-Rausch-Verhältnis maximiert wird und gleichzeitig eine Pixelsättigung vermieden wird. Verwenden Sie dieselben Belichtungseinstellungen bei der Abbildung von Organoiden, die in einer bestimmten Sitzung gefärbt wurden.

7. Umfassende Immunfärbung isolierter Harnröhrenepithelplatten

HINWEIS: Für die Ganzmontage-Immunfärbung folgen Sie Protokoll, Abschnitt 2, Isolierung des Harnröhrenepithelgewebes, Schritte 2.1 bis 2.12. um Harnröhrenepithelblätter zu erhalten.

1. Übertragen Sie das Epithelgewebe vorsichtig mit einer Transferpipette oder einer 200-μL-Pipettenspitze in einen Brunnen einer 24-Wellen-Gewebekulturschale mit 500 μL 10 % neutralem gepuffertem Formalin. Versiegeln Sie den Tellerdeckel mit Paraffin und inkubieren Sie ihn 20 Minuten auf einer Schaukel bei 4 °C.
   HINWEIS: Führen Sie alle Schritte im selben Brunnen durch, um den Verlust des Epithelgewebes zu vermeiden.
2. Aspiriere das Formalin vorsichtig aus dem Brunnen. Führen Sie eine Spülung mit 500 μL 1x PBS durch und inkubieren Sie 5 Minuten auf einer Wippe bei Zimmertemperatur. Wiederhole denselben Waschschritt noch einmal.
3. Fügen Sie 500 μL Permeabilisierungslösung mit 1x PBS + 1 % Triton X-100 in das Bohrloch ein. Den Deckel des Tellers mit Parafilm abschließen und 2 Stunden bei 4 °C mit sanftem Schaukeln inkubieren.
4. Aspirieren Sie die Permeabilisierungslösung vorsichtig aus dem Brunnen.
5. Blockieren Sie durch Inkubation von Geweben in einem 500 μL Pferdeblockpuffer, der zusätzlich 1 % Triton X-100 enthält (Rezept für Pferdeblockpuffer ist in ergänzender Tabelle 5 angegeben). Versiegeln Sie den Deckel des Gerichts mit Parafilm und bebrüten Sie es über Nacht bei 4 °C mit sanftem Schaukeln.
6. Bereiten Sie eine primäre Antikörperlösung in einem Pferdeblockierungspuffer vor, der zusätzlich 1 % Triton X-100 enthält, indem Sie Primärantikörper mit geeigneter Verdünnung (1:100–1:200) hinzufügen. Aspirieren Sie blockierende Lösung und fügen Sie 500 μL primäre Antikörperlösung hinzu: Anti-CDH1 (Epithelzellmarker) und Anti-F4/80 (Maus-Makrophagemarker). Den Deckel mit Parafilm abschließen und 48–72 Stunden bei 4 °C mit sanftem Schaukeln inkubieren.
7. Aspiriere vorsichtig die primäre Antikörperlösung und wasche dreimal mit 1x PBS für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur und sanftem Schaukeln.
8. Bereiten Sie sekundäre Antikörperlösungen im Pferdeblockierungspuffer mit zusätzlich 1 % Triton X-100 vor, indem Sie sekundäre Antikörper mit geeigneter Verdünnung (1:500) hinzufügen.
9. Fügen Sie 500 μL sekundäre Antikörperlösung in das Bohrloch ein, decken Sie die Platte mit Alufolie ab und inkubieren Sie 4–6 Stunden bei Raumtemperatur auf einer Kippe.
10. Aspiriere vorsichtig die sekundäre Antikörperlösung und wasche dreimal mit 1x PBS für jeweils 30 Minuten bei Zimmertemperatur.
    HINWEIS: Die DAPI-Färbung kann durchgeführt werden, indem Gewebe mit verdünnter DAPI-Lagerlösung (300 nM Endkonzentration) für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wird. Wasche die Taschentücher mit 1x PBS (2x 5 Minuten) bei Zimmertemperatur auf einer Schaukel.
11. Übertragen Sie das Epithelgewebe vorsichtig auf einen Glasträger oder eine Bildgebungsschale und fügen Sie eine Antifade-Montagelösung hinzu (90 % Glycerol, 0,2 % n-Propylgallat in 1x PBS).
12. Bildgewebe mit einem Leuchtstoffmikroskop.
    HINWEIS: Angesichts der Dicke der Probe empfehlen die Autoren eine Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop, das optisches Schneiden ermöglicht. In dieser Studie verwendeten die Autoren ein Breitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit Apotome-Optik, um unscharfes Licht zu entfernen und Z-Stacks zu erhalten. Bild-Z-Stacks wurden erstellt, um dendritische Projektionen von epithelassoziierten Makrophagen zu visualisieren.

Ergebnisse

Sektion und Entnahme der Harnröhre der adulten weiblichen Maus

Im ersten Teil dieser Studie geben die Autoren ein detailliertes Protokoll für die Dissektion der weiblichen Maus-Harnröhre vor. Aufgrund ihrer Anhechtung an der ventralen Vaginalwand und der Lage unter der Schambhaarsymphyse ermöglicht die hier angegebene Methode eine saubere Zerlegung der vollständigen weiblichen Harnröhre (Abbildung 1).

Isolierung des Harnröhrenepithelgewebes und Durchflusszytometrieanalyse für Einzelzell-Isolate

Die Verdauung von Trypsin führt zu einer einfachen Trennung der epithelialen Auskleidung der Harnröhre vom umgebenden Stroma. Epithelschichten mit höherer Transparenz als das Stromalgewebe können nach der Trennung beobachtet werden (Abbildung 2). Die getrennten Epithelplatten führten bei der enzymatischen Verdauung zu einzelligen Suspensionen. Einzelzellen, die aus dem Harnröhrenepithel isoliert wurden, zeigen durch Trypan-Blau-Ausschluss auf einem Hämozytometer (Abbildung 2L) und Durchflusszytometrie mit Viabilitätsfarbemitteln zum Gate von lebenden Zellen eine durchgehend hohe Via>bilität (Abbildung 3, Ergänzungsakte 1).

Die Autoren führten Flusszytometrie durch, um die Epithelzellanreicherung durch Einzelzell-Suspensionen des Harnröhrenepithels zu bewerten. Um die Zelllebensfähigkeit zu überprüfen, wurde die Zellsuspension mit einem leben/toten Marker, dem aminreaktiven Geisterfarbstoff V450, gefärbt. Die Autoren beobachteten konsequent eine Zelllebensfähigkeit von >80 % beim Leben/Toten-Marker. Der Live/Dead-Marker ermöglichte das Ausschalten von Trümmern und toten Zellen während der Strömungsanalyse. Sie färbten Proben mit einem Epithelzellmarker (CD326/EPCAM), einem Makrophagenmarker (F4/80) und einem Immunzellmarker (CD45), um die Zusammensetzung der mit dieser Methode isolierten Zellen zu erfassen. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie zeigten, dass die Autoren eine angereicherte Epithelzellpopulation aus dem weiblichen Harnröhrenepithel der Maus isoliert hatten. In beiden unabhängigen Experimenten erreichte die Gruppe 80–90 % der EPCAM-positiven Epithelzellen nach Gating auf lebenden Zellen. Die Autoren beobachteten außerdem ~1,30 % der CD45+-Immunzellen in der Epithelpräparate. Makrophagen, die mit der Epithelschleimhaut assoziiert sind, machten ~1,18 % der lebenden Zellen aus dem epithelialen Kompartiment aus. Die Durchflusszytometrieanalyse von Einzelzellsuspensionen aus Epithelplatten zeigt eine minimale stromale Kontamination (5–6 %), die laut ihrer vorherigen Studie^meist auf das vaskuläre Endothel zurückgeführt wird. Ergänzende Datei 1 zeigt Ergebnisse der Durchflusszytometrie für Einzelzellpräparate aus den epithelialen und stromalen Kompartimenten. Im Vergleich zur 80–90 % Anreicherung der aus dem epithelialen Kompartiment isolierten Epithelzellen zeigte das stromale Kompartiment auch 40–50 % der Epithelzellen, die aus den kurzen Gängen und dem Drüsepithel stammen, die sich vom Harnröhrenlumen in das umgebende Stroma erstrecken (Abbildung 3, Supplementary File 1).

Kultur der urethralen epithelialen Organoide, Histologie und Immunfärbung

Die Autoren zeigen außerdem, wie einzelne aus der Harnröhre isolierte Epithelzellen lebensfähig sind und Organoide in einer 3D-Matrix bilden können, und beobachteten das Organoidwachstum aus einzelnen Harnröhrenepithelzellen bis Tag 6 in Kultur (Abbildung 4B–G). Sie führten eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H&E) durch, um die Histologie der Organoide zu beobachten (Abbildung 4H–J). Die Autoren beobachteten zwei unterschiedliche Morphologien der urethralen epithelialen Organoide, von denen eine groß und hohl war, während der andere Typ kleiner und fest war. In beiden Fällen waren die Organoide stratifizierte und recapitulierte Marker, die in der epithellialen Auskleidung der weiblichen Harnröhre exprimiert wurden, darunter KRT5 und P63 für die Basalschicht sowie KRT4 und KRT13 für die suprabasale/intermediären Zellschichten (Abbildung 4K–N), ergänzende Abbildung 1). Die Unterschiede in der Organoidbildungskapazität zwischen der proximalen und der distalen Harnröhre wurden untersucht. Organoide, die aus der proximalen Harnröhre erzeugt wurden, hatten einen höheren Anteil an hohlen Organoiden, während Organoide aus der distalen Harnröhre feste Kugeln bildeten (Abbildung 4O–P). Zusätzlich beobachteten sie Unterschiede in der organoidbildenden Effizienz in Epithelzellen, die aus den proximalen und distalen Teilen der Harnröhre isoliert wurden. Das distale Harnröhrenepithel bildete Organoide mit höherer Effizienz als das proximale Harnröhrenepithel mit derselben anfänglichen Samendichte (5000 Zellen/Tröpfchen) (Abbildung 4Q–S).

Ganzmontage-Immunfärbung isolierter Harnröhrenepithelplatten

Die Forscher präsentieren außerdem eine optimierte Methode zur ganzheitlichen Färbung der weiblichen Harnröhrenepithelplatten. Hier färbten sie Epithelplatten mit zwei Markern: F4/80 für Makrophagen und E-Cadherin/CDH1, um Epithelzell-Zell-Übergänge zu markieren (Abbildung 5). Die Gewebe wurden mit einem Zeiss Axio Observer 7 Mikroskop mit optischer Schnittsektion von Apotome 3 abgebildet. Epithelplatten zeigen eine starke Markierung mit dem CDH1-Antikörper. Ganzhaltige Präparate von Harnröhrenepithel, die mit Antikörpern gegen F4/80 markiert waren, zeigten, dass Makrophagen eine Laube aus Dendriten in der Epithelschleimhaut bildeten. Makrophagen konnten beobachtet werden, wie sie dendritische Prozesse zwischen den Epithelzellen der Harnröhre aussenden. Insgesamt zeigen die Ergebnisse den Nutzen der hier beschriebenen Protokolle zur Untersuchung der epithelialen Auskleidung der weiblichen Maus-Harnröhre.

Abbildung 1: Mausdissektion zur weiblichen Harnröhrensammlung. (A) Die Maus in Rückenlage legen und den Bauch mit 70% EtOH besprühen. (B–C) Öffnen Sie den Bauch, indem Sie die Haut anheben und einen vertikalen Schnitt machen. (D) Fett und Bindegewebe abschneiden, um die schmetterlingsförmigen Schambeinen freizulegen, die an der (Arrow in Black) Schamsymphyse verbunden sind. (E) Schneide die Schamsymphyse ab. (F) Sobald die Schambeine entfernt sind, kann man die Harnröhre sehen, wie sie von der Blase nach unten verläuft (mit einer schwarz gestrichelten Linie umrandet). (G) Ziehe die Blase vorsichtig mit der Pinzette hoch. Die Harnröhre ist als dünnes rotes Rohr deutlich sichtbar. (H–I) Ziehe die Blase aus der Körperhöhle nach oben. Benutze Spannung auf der Blase, um die Harnröhre von der ventralen Scheidenwand zu trennen. Führen Sie die Schere zwischen Harnröhre und Scheidenwand, um Harn- und Fortpflanzungstrakte zu trennen. (J–K) Lösen Sie das distale Ende der Harnröhre, das an der Haut befestigt ist. (L) Bild eines dissektionierten weiblichen Mausunteren Harnwegs (FLUT), mit Blase und Harnröhre. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Isolierung des Harnröhrenepithels und Herstellung einer Einzelzell-Suspension. (A) Schematische Darstellung der enzymatischen Verdauung und der mechanischen Trennung der epithelialen und stromalen Kompartimente der Harnröhre, gefolgt von einer Einzelzellverdauung. (B) Entfernen Sie das überschüssige Fett aus den weiblichen unteren Harnwegen. (C–F) Schneiden Sie die Harnröhre vom Blasenhalsbereich ab, um Harnröhre von der Blase zu trennen. Dann schneidet man die Harnröhre mit einer feinen Schere in zwei Hälften. (G) Waschen Sie Harnröhrenstücke mit einer 1x-HBSS-Lösung, indem Sie über einen 100-Mikron-Filter führen. (H) Transplantieren der Harnröhrengewebefragmente in eine 1%ige Trypsinlösung. Inkubiere auf einem Proberotator im Kühlraum. Gib MgCl₂ und DNase I in dieselbe Tube. Inkubieren Sie bei 37 °C in einem Hybridisierungsofen auf einem Proberotator. (I–J) Isolieren Sie das Epithel, indem Sie vorsichtig mit einer feinen Zange entlang der Länge des Harnröhrenfragments zusammendrücken. (K) Das Gewebe wird mit feiner Schere in kleine Fragmente gehackt. Das gehackte Epithelgewebe wird in eine Accutase-Verdauungslösung übertragen und bei 37 °C in einem Hybridisationsofen auf einem Proberotator inkubiert. (L) Epithelzellen zählen und die Lebensfähigkeit mit Trypanblau und einem Hämozytometer bewerten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Durchflusszytometrie zur Bestimmung einzelzelliger Suspensionen aus Harnröhrenepithel- und Stromakompartimenten. Die Durchflusszytometrie wurde an Einzelzellpräparaten der zusammengepoolten Maus-Harnröhre (A), Epithel- und (B) Stromal-Kompartimente durchgeführt. Lebende Zellen wurden verschlossen, um tote Zellen auszuschließen, die mit Ghost Dye V450 gefärbt waren. Lebende Zellen wurden auf CD45 (pan-immuner Marker), CD326/EPCAM (pan-epithelialer Marker) und F4/80 (muriner Makrophage-Marker) Expression untersucht. Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente, die an einem Pool von 5–6 Mäusen pro Experiment durchgeführt wurden, um epitheliale und stromale Proben zu erzeugen. Abkürzungen; SSC-A = Seitenstreu-Peak-Fläche; FITC = Fluorescein-Isothiocyanat; APC = Allophycocyanin; PE = Phycoerythrin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Histologie und Immunfärbung der urethralen Epithelorganoide. (A) Schaltplan, der den Arbeitsablauf für die Erzeugung von Harnröhrenepithelorganoiden zeigt. (B–G) Repräsentative Hellfeldmikroskopographien von urethralen Epithelorganoiden (UEOs), die aus einzelnen Zellen an verschiedenen Tagen der in-vitro-Expansion erzeugt wurden. Repräsentative Hellfeldbilder von (H) hohlen und (I) soliden urethralen Epithelorganoiden (UEOs), gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (H&E). (J) Quantifizierung von Organoidtypen, erzeugt über drei unabhängige Experimente. Die Fehlerleiste stellt den Standardfehler des Mittelwerts dar. Repräsentative Bilder von (K) hohlen und (L) soliden urethralen epithelialen Organoiden (UEOs), immungefärbt mit den epithelialen Markern KRT13 (suprabasaler Epithelmarker), KRT5 (basaler Epithelmarker) und P63 (basaler Epithelmarker). Bilder, die einzelne fluoreszierende Kanäle zeigen, sind in K', K'', K''', L',L'' und L''' dargestellt. Repräsentative Bilder von (M) hohlen und (N) soliden urethralen epithelialen Organoiden (UEOs), immungefärbt mit den epithelialen Markern KRT4 (suprabasaler epithelialer Marker) und KRT5 (basaler Epithelmarker). Bilder, die einzelne fluoreszierende Kanäle zeigen, sind in M', M'', N' und N dargestellt. (O) Schematisch der Dissektion der proximalen und distalen Harnröhre. (P) Quantifizierung von Organoidtypen, die aus der proximalen und distalen Harnröhre über zwei unabhängige Experimente erzeugt werden. Repräsentative Hellfeldmikroskopaufnahmen von Organoiden der Harnröhrenepithel (UEOs) am Tag 6, die aus dem Epithel isoliert aus der (Q) proximalen und (R) distalen Harnröhre erzeugt wurden. Daten der Organoide, die aus der vollständigen Harnröhre erzeugt wurden, sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente, die mit einem Pool von 3–5 Mäusen pro Experiment durchgeführt wurden. (S) Daten von Organoiden, die aus der proximalen und distalen Harnröhre erzeugt wurden, sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente, die mit einem Pool von 3–4 Mäusen pro Experiment durchgeführt wurden. Kerne, die mit DAPI (blau) gekennzeichnet sind. (Skalenbalken, 100 μM). Schaltpläne erstellt mit BioRender und Adobe Illustrator. Erstellt in BioRender. Binoy Joseph, D. (2026) https://BioRender.com/jvf17v7 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Ganzmontierte Immunfärbung der Harnröhrenepithelplatten. (A) 10-Mikron-Gefrorenschnitt der adulten weiblichen Maus-Harnröhre in optimalem Schneidmedium, mit Immunfärbung für den Mausmakrophagenmarker F4/80 (in Rot) und das Epithelprotein E-Cadherin/CDH1 (in Grün). (A') steht für das in Sicht der Einlage in (A) vergrößerte. (B) Schematisches Diagramm, das Schritte zur ganzheitlichen Färbung isolierter Harnröhrenepithelplatten zeigt. Eine umfassende Immunfärbung der isolierten weiblichen Harnröhren-Epithelschleimhaut wurde mit Antikörpern gegen den Maus-Makrophagemarker F4/80 (rot) und das epitheliale Protein E-Cadherin/CDH1 (in Grün) durchgeführt. (C) Repräsentatives Bild der zusammengeführten Ansicht. (D) Orthogonale maximale Intensitätsprojektion des roten Kanals mit Makrophagenorganisation. (E–F) Zoomt auf das Epithel und die zugehörigen Makrophagen. Weißtonenbar, 50 μM. Graustufenbar, 500 μM. Die Daten sind repräsentativ für 2 unabhängige Experimente, die an einem Pool von 4–5 Mäusen durchgeführt wurden. Schaltpläne erstellt in BioRender und Adobe Illustrator. Erstellt in BioRender. Binoy Joseph, D. (2026) https://BioRender.com/tjh9opk Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Tabelle 1: Zubereitung von 1x HBSS (ohne Ca, Mg).Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Zubereitung von 1x sHBSSa und 1 % Trypsinlösung.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Vorbereitung eines Zell-/Flussfärbungspuffers.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 4: Vorbereitung von Organoid-Expansionsmedien für urethrale epitheliale Organoide.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 5: Vorbereitung des Pferdeblockpuffers.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 1: Zellzählungen für das Durchflusszytometrie-Experiment, das an einzelnen Zellen aus den Harnröhrenepithel- und Stromalkompartimenten aus zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt wurde.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Vergleich des Harnröhrenepithels der adulten weiblichen Maus mit den Organoiden der Harnröhrenepithel. Repräsentative Bilder von (A) adulten weiblichen Harnröhrenepithelepithelen, (B) hohlen Harnröhrenepithelorganoiden und (C) soliden urethralen Epithelorganoiden (UEOs), immungefärbt mit den epithelialen Markern KRT13 (suprabasaler Epithelmarker), KRT5 (basaler Epithelmarker) und P63 (basaler Epithelmarker). Bilder, die einzelne fluoreszierende Kanäle zeigen, sind in A', A'', A''', B', B'', B''', C', C''' und C''' dargestellt. Repräsentative Bilder von (D) adulten weiblichen Harnröhrenepithelepithels, (E) hohlen harnröhrenepithelialen Organoiden und (F) soliden urethralen epithelialen Organoiden (UEOs), immungefärbt mit den epithelialen Markern KRT4 (suprabasaler Epithelmarker) und KRT5 (basaler Epithelmarker). Bilder, die einzelne fluoreszierende Kanäle zeigen, sind in D', D'', E', E'', F' und F dargestellt. Daten repräsentativ für 3 unabhängige Experimente mit einem Pool von 3–4 Mäusen pro Experiment. Kerne, die mit DAPI (blau) gekennzeichnet sind. (Skalenbalken, 100 μM). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Epithelbarrieren im Körper sind für die Abwehr des Wirts von entscheidender Bedeutung. Dies sind spezialisierte Kompartimente mit mehreren Epithelzelltypen und zugehörigen residenten Immunzellen. Epithelbarrieren verändern sich im Laufe der Entwicklungszeit und übernehmen die Genexpression der Wirtsverteidigung, oft als Reaktion auf Mikrobiota oder Umweltexpositionen. Defekte an der Epithhelintegrität oder der Genexpression können die Abwehr des Wirts^{beeinflussen 15}. Es ist unerlässlich, das Epithelgewebe isoliert zu untersuchen, um transkriptomische Signaturen zu verstehen sowie um Zell-zu-Zell-Kontakte und die Epithelintegrität zu untersuchen. Derzeit wurden keine Methoden im Detail beschrieben, die für die Isolierung des Harnröhrenepithelgewebes aus der weiblichen Maus optimiert sind. Während das Blasenepithel nur durch mechanische Trennung¹⁶ isoliert werden kann, befindet sich das Harnröhrenepithel im Stromalrohr der Harnröhre und erfordert eine Kombination aus enzymatischer und mechanischer Trennung, um das epithheliale Gewebe zu isolieren.

Hier präsentieren die Autoren eine optimierte Methode zur Isolierung von Epithelblättern aus dem Harnröhrenlumen weiblicher Mäuse. Die Methode kann zur Erzeugung hoch lebensfähiger Einzelzell-Suspensionen von Harnröhrenepithelzellen für nachgelagerte Anwendungen wie Durchflusszytometrie, Organoidkultur und Immunfärbung verwendet werden. Die Kompatibilität dieser Methode mit Einzelzell-RNA-Sequenzierungsworkflows wurde zuvor von derselben Gruppe⁵ demonstriert. Mit Modifikationen und weiterer Optimierung kann das hier vorgestellte Protokoll angepasst werden, um epitheliale Gewebe aus anderen röhrenförmigen Organen für nachgelagerte Anwendungen zu extrahieren.

Die wichtigsten Schritte im Protokoll beinhalten eine sorgfältige Zerlegung der vollwertigen Harnröhre der adulten weiblichen Maus, was die Untersuchung regionaler Unterschiede entlang der proximal-distalen Achse ermöglicht. Anschließend nutzt das Protokoll eine sanfte enzymatische Verdauung, um die epitheliale Auskleidung der Harnröhre vom umgebenden Stroma zu lösen. Die enzymatische Verdauung lockert das Epithelgewebe, um eine mechanische Trennung zu ermöglichen, indem das Harnröhrenrohr vorsichtig zwischen den Pinzetten zusammengedrückt wird, um das Epithelgewebe freizusetzen. Die Forscher haben den Zeitpunkt der Trypsinverdauung sorgfältig optimiert, um die Isolierung des Harnröhrenepithels mit hoher Lebensfähigkeit (> 80 %) als Folien für die Immunfärbung oder für die nachgelagerte Einzelzellisolierung zu ermöglichen (Abbildung 3, Supplementary File 1). Die Einzelzellverdauung des Harnröhrenepithels zeigte 80–90 % der Epithelzellen in urethralen Epithelisolaten. Aus einer früheren Studie ergaben die Autoren, dass nicht-epitheliale Zellen in dieser Vorbereitung größtenteils aus epithelassoziierten Immunzellen und vaskulärem Endothel⁵ bestehen. Die derzeitige Methode zur Einzelzell-Isolierung liefert hochwertige Einzelzell-Suspensionen für nachgelagerte Anwendungen wie Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, indem Zellklumpen durch mechanische Zerstörung durch dünne Nadelaspiration und Entfernung der roten Blutkörperchen durch sanfte Lyse eliminiert werden.

Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode verwendet werden kann, um kompartimentspezifische Immunzellen anzureichern (Abbildung 3). Epithel, das aus der proximalen und distalen Harnröhre isoliert ist, kann ebenfalls separat untersucht werden. Darüber hinaus zeigten die Autoren, dass isolierte Epithelzellen zur Bildung von Harnröhrenorganoiden verwendet werden können, die zuvor nicht beschrieben wurden (Abbildung 4). Diese Ergebnisse zeigen auch regionale Variabilität der Organoid-Erzeugungskapazität in der weiblichen Harnröhre. Während die jüngsten Studien des Autors Unterschiede in der epithelialen Genexpression und der Organisation von Immunzellen in der weiblichen Maus-Harnröhre⁵ gezeigt haben, zeigt die aktuelle Studie, dass proximale Harnröhrenepithelzellen weniger Organoide bilden als das aus der distale Harnröhre isolierte Epithelzellen (Abbildung 4). Eine Einschränkung dieser räumlichen Abgrenzung in proximale und distale Harnröhre besteht darin, dass es zum Zeitpunkt der Dissektion keinen anatomischen Orientierungspunkt gibt, der zur Unterscheidung zwischen diesen beiden Bereichen verwendet werden kann. In dieser Studie haben die Autoren die Länge der Harnröhre halbiert, um proximale und distale Kompartimente zu erhalten. Die hier beschriebene Epithelisolationsmethode kann verwendet werden, um die Unterschiede in der Genexpression und zellulärer Zusammensetzung zwischen dem proximalen und distalen Harnröhrenepithel weiter zu charakterisieren.

Obwohl das hier vorgestellte optimierte Protokoll zugänglich und reproduzierbar ist, erfordern einige Schritte Übung und sorgfältige Kalibrierung. Insbesondere erfordert die hier gezeigte Dissektionsmethode eine sorgfältige Extraktion des Harnröhrenröhrchens unterhalb der Symphyse pubis, wobei die gesamte Länge der Harnröhre erhalten bleibt. Außerdem muss darauf geachtet werden, nach der Dissektion jegliches vaginales Gewebe, das an der dorsalen Harnröhrenwand haftet, zu entfernen. Das um den Blasenhals vorhandene Fett sollte vorsichtig entfernt werden, um eine Adipozytenkontamination bei nachgelagerten Anwendungen wie der Einzelzell-RNA-Sequenzierung zu reduzieren. Außerdem sollte die Verdauung von Trypsin bei jeder Enzymcharge sorgfältig optimiert werden, um eine gleichmäßige Verdauung zu gewährleisten. Eine Überverdauung des Gewebes kann zum Verlust der Zelllebensfähigkeit führen. Die Autoren haben die Zeit für die Trypsinverdauung sorgfältig optimiert und ein Zeitfenster von 15–30 Minuten für die Inkubationsschritte bei 4 °C und 37 °C angegeben. Dies kann je nach verwendeter Enzymcharge weiter optimiert werden. Es ist außerdem entscheidend, Gewebe in kleine Stücke zu zerkleinern, um eine effiziente Einzelzellverdauung zu gewährleisten. Die Autoren haben Accutase für die weitere Einzelzellverdauung verwendet, da es zu einer sanften Dissoziation führt. Im Falle einer Verringerung der Zelllebensfähigkeit kann die Zeit für die Accutase-Inkubation verkürzt werden. Zusätzlich haben die Autoren einen Rock-Inhibitor in die Accutase-Verdauungsmischung aufgenommen, um das Überleben der Zellen zu verbessern. Die DNase-Verdauung wird empfohlen, um die Zellverklumpung zu reduzieren, indem extrazelluläre DNA, die von toten und sterbenden Zellen freigesetzt wird, verdaut wird. Die Autoren empfehlen außerdem den Einsatz eines RBC-Lysepuffers, um die Kontamination roter Blutkörperchen zu reduzieren, die nachgelagerte Ergebnisse wie Flowzytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung beeinträchtigen würde.

Eine Einschränkung der hier vorgestellten Epithelisolationsmethode ist, dass sie für die weibliche Maus-Harnröhre optimiert wurde. Die männliche Maus-Harnröhre ist anatomisch komplexer und weist eine wechselnde Epithelarchitektur von der proximalen zur distalen Harnröhre auf. Außerdem kann die Methode nur die Epithelzellen isolieren, die das Harnröhrenlumen auskleiden. Harnröhrensekretorische Drüsen, die über kurze Epithelkanäle mit dem Harnröhrenlumen verbunden sind, können nicht isoliert werden, da sie im stromalen Gewebe eingebettet sind. Stattdessen werden diese epithelialen Strukturen im stromalen Kompartiment angereichert, das nach der Isolierung der Harnröhrenepithelhaut verbleibt (Abbildung 3).

Trotz dieser Einschränkungen hat diese Methode wichtige Einblicke in die urethrale Epithelarchitektur ermöglicht und ermöglicht weitere Untersuchungen epitheliassoziierter Immunzellen durch die Visualisierung epitheliassoziierter Makrophagen in situ. Die Methode wurde bereits als kompatibel mit Einzelzell-RNA-Sequenzierungs-Workflows zur Identifizierung der zellulären Heterogenität im Harnröhrenepithel und den zugehörigen Immunzellen^nachgewiesen. Zusätzlich ermöglicht die Fähigkeit, das Epithel aus der proximalen und distalen Harnröhre zu isolieren, Studien zur Erfassung räumlicher Unterschiede in der Harnröhre. Bedeutsam ist, dass die Verdauungsmethode der epithelialen Zellen lebensfähige Einzelzellen liefert, die urethrale epitheliale Organoide erzeugen können, die nützlich sind, um Wirts-Pathogen-Interaktionen und die epitheliale Biologie der Harnröhre zu untersuchen. Insgesamt erweitern diese Methoden das Werkzeugkasten, um tiefere Untersuchungen der Biologie der Harnröhrenepithelialität zu ermöglichen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
#5 fine forceps
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128
10X HBSS	Sigma Aldrich	H4641
12-well plate	Corning	3513
30-micron pre-separation filter	Miltenyi Biotec	130-041-407
A83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Accutase	Sigma Aldrich	SCR005
Adobe Illustrator	Adobe		Zum Erstellen von Abbildungstafeln
Adobe Photoshop	Adobe		Zum Erstellen von Abbildungstafeln
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Antibiotic/antimycotic	Sigma Aldrich	A5955
Anti-CD326 (EpCAM)	Invitrogen	17-5791-82	1:20 Verdünnung, für Durchflusszytometrie
Anti-CD45	Tonbo	35-0451-U100	1:20 Verdünnung, für Durchflusszytometrie
Anti-CDH1 (Rabbit)	Cell Signalling Technology	3195S	1:200 Verdünnung
Anti-F4/80	Tonbo	50-4801-U100	1:20 Verdünnung, für Durchflusszytometrie
Anti-F4/80 (Rat)	Invitrogen	14-4801-82	1:200 Verdünnung
Anti-Keratin 13 (Rabbit)	Abcam	ab92551	1:200 Verdünnung
Anti-Keratin 4 (Mouse)	Abcam	ab9004	1:200 Verdünnung
Anti-Keratin 5 (Chicken)	Biolegend	905904	1:800 Verdünnung
Anti-Keratin 5 (Rabbit)	Cell Signaling Technology	71536	1:200 Verdünnung
Anti-p63 (Mouse)	Biocare medical	CM163A	1:200 Verdünnung
Axioobserver 7	Zeiss	431007-9904-000
B27 supplement	Invitrogen	12587010
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Genetix	PG-2330
CD-1 Mice	Charles River, USA	Crl:CD1(ICR)
Cultrex BME	R&D systems	3445-005-01
DAPI solution	Sigma Aldrich	D5942
D-Glucose	Qualigens	Q15405
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Himedia	MB058
di-Sodium Hydrogen Ortophosphate (Na2HPO4)	Qualigens	Q15825
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
Donkey anti-Chicken IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	703-545-155	1:500 Verdünnung
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	715-545-151	1:500 Verdünnung
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	715-585-151	1:500 Verdünnung
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	711-585-152	1:500 Verdünnung
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	711-605-152	1:500 Verdünnung
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	1:500 Verdünnung
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	712-585-153	1:500 Verdünnung
EGF	PeproTech	AF-315-09
Eosin	Himedia	GRM938
Ethanol	Supelco	1.00983
Eukitt mounting media	Sigma Aldrich	3989
FGF10	PeproTech	450-61
Filter cap sorting tubes	Falcon/Corning	352235
Ghost Dye™ Violet 450	Tonbo biosciences	13-0863-T100
Glutamax	Invitrogen	35050061
Glycerol anhydrous	Merck	DA1P692899
Hematoxylin	Polysciences	24243
HEPES	Gibco	15630080
Horse serum	Gibco	26050088
Kaluza Analysis	Beckman Coulter	Kaluza Analysis 2.4	Analyse von Durchflusszytometriedaten
Magnesium chloride (MgCl2)	Qualigens	Q15535
Mouse TruStain FcX (anti-mouse CD16/32 )	Biolegend	101320
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	AF-250-38
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130
Paraffin wax	Qualigens	Q19215
Potassium chloride (KCl)	Qualigens	Q13305
Potassium dihydrogen orthophosphate (KH2PO4)	Qualigens	19465
Primocin	Invivogen	ant-pm-05
RBC Lysis Buffer (10X)	Tonbo biosciences	TNB-4300-L100
Retinoic acid	Sigma Aldrich	R2625
Rocki  (Y-27632)	Cell Signalling Technology	13624S
R-spondin 1	PeproTech	315-32