Isolierung und Charakterisierung von Stammzellen-abgeleiteten Exosomen aus Zahnpulpa über Zellgänge hinweg

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen standardisierten Arbeitsablauf zur Isolierung und Charakterisierung von Dentalpulpa-Stammzellen (DPSC)-abgeleitete Exosomen über Passagen hinweg, was eine reproduzierbare Bewertung der Exosomenqualität und funktionellen Aktivität für regenerative Anwendungen ermöglicht.

Zusammenfassung

Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs) stellen eine zugängliche und klinisch relevante Quelle für mesenchymale Stammzellen dar, und ihre abgeleiteten Exosomen haben sich als vielversprechende bioaktive Vesikel für zellfreie Anwendungen in der Gewebetechnik und regenerativen Medizin erwiesen. Reproduzierbare und standardisierte Methoden zur Isolierung und funktionellen Validierung von DPSC-abgeleiteten Exosomen bleiben jedoch begrenzt, insbesondere hinsichtlich der Variabilität, die während der Zellexpansion über die Durchgänge eingeführt wird. Hier beschreiben wir einen umfassenden, standardisierten, kitbasierten Arbeitsablauf zur Isolierung und Reinigung von Exosomen aus DPSC-konditionierten Mediums, der mit der routinemäßigen Laborpraxis kompatibel ist. Diese Methode ermöglicht eine konsistente Rückgewinnung intakter Vesikel, die sich für morphologische, molekulare und funktionelle Charakterisierung mit gängig verfügbaren Techniken eignen. Die Exosomenidentität wird anhand von Morphologie, Größenverteilung und Markerexpression bewertet, während die biologische Aktivität mit einem definierten in-vitro-antiinflammatorischen Test bewertet wird. Um passagebezogene Effekte zu untersuchen, werden Exosomen, die aus verschiedenen DPSC-Passagen stammen, mit dieser funktionalen Anzeige verglichen, was einen praktischen Rahmen zur Bewertung der Konsistenz während der Zellexpansion bietet. Durch die Integration von Isolation, Reinigung, Charakterisierung und funktionaler Validierung in einem einzigen Arbeitsablauf bietet dieses Protokoll einen reproduzierbaren und skalierbaren Ansatz zur Erzeugung funktional validierter DPSC-abgeleiteter Exosomen für Biomaterialforschung und regenerative Anwendungen.

Einleitung

Exosomen, die aus mesenchymalen Stammzellen gewonnen werden, dienen als entscheidende Vermittler der interzellulären Kommunikation und zeigen ein bedeutendes therapeutisches Potenzial in den Bereichen Tissue Engineering und regenerative Medizin. Exosomen sind Vesikel mit einem Durchmesser von 30–150 nm, die in der Lage sind, bioaktive Moleküle abzuliefern und verschiedene Funktionen in Empfängerzellen wie Proliferation, Differenzierung und Immunantwort ^1,2 zu regulieren. Unter den verschiedenen mesenchymalen Stammzellquellen (MSC) sind Zahnpulpa-Stammzellen (DPSC) besonders interessant, da sie leicht zugänglich sind, ihre robuste Proliferationskapazität, das geringe tumorenartige Risiko und minimale ethische Bedenken ^3,4,5. Exosomen, die aus DPSCs (DPSC-Exos) gewonnen werden, enthalten ein vielfältiges Repertoire funktionaler Fracht, darunter Proteine, mRNAs und MikroRNAs, wodurch sie viele der biologischen Eigenschaften ihrer Elternzellen erhalten können. Frühere Studien haben gezeigt, dass DPSC-Exos Angiogenese, neuronale Reparatur, Knochenregeneration und entzündungshemmende Reaktionen fördern können. Über ihre Rolle in der Gewebetechnik hinaus werden Exosomen zunehmend als wichtige Regulatoren in der Onkogenese und Krebstherapie anerkannt, wo sie zur Tumor-Mikroumwelt-Remodellierung, Arzneimittelresistenz und Immunumgehung^beitragen. MSC-abgeleitete Exosomen, einschließlich der von DPSCs, besitzen inhärente Tumorhoming-Fähigkeiten und immunmodulatorische Eigenschaften und positionieren sie als vielversprechende Träger der nächsten Generation für gezielte Anti-Krebs-Medikamente oder als zellfreie Immuntherapeutika. Durch die Umgehung mehrerer Einschränkungen zellbasierter Therapien haben sich DPSC-Exos als vielversprechender azellulärer bioaktiver Bestandteil für regenerative^{Anwendungen etabliert}.

Trotz dieser Vorteile bleibt die Umsetzung der DPSC-Exo-Forschung in reproduzierbare experimentelle oder klinische Anwendungen eine Herausforderung. Eine wesentliche Einschränkung ist das Fehlen einheitlicher und standardisierter Protokolle zur Isolierung und Reinigung von Exosomen. Derzeit verwendete Ansätze umfassen Ultrazentrifugation¹³, Ultrafiltration, Präzipitation, Größenausschlusschromatographie und Immunaffinitätserfassung ^14,15. Unter diesen Methoden bietet die polymerbasierte Niederschlagung praktische Vorteile, darunter hohe Durchsatzleistung, Kompatibilität mit einer Vielzahl von Probenvolumina und betriebliche Einfachheit, was sie für Studien mit großen Probenzahlen oder Skalierungsanforderungen 16,17,18 geeignet macht. Vergleichende Analysen verschiedener Isolationsmethoden, insbesondere hinsichtlich Proteinausbeute und Partikel-zu-Protein-Verhältnis, sind in der Literatur umfangreich dokumentiert¹⁹. Der Einfluss der DPSC-Durchgangsnummer auf die Eigenschaften und biologische Aktivität abgeleiteter Exosomen wurde jedoch nicht ausreichend behandelt, was eine wichtige Lücke bei der Standardisierung und Qualitätskontrolle der DPSC-Exo-Produktion darstellt.

Um diese technischen Einschränkungen zu beheben, präsentiert diese Studie ein standardisiertes, kitbasiertes Protokoll zur Isolierung und Reinigung von Exosomen aus DPSC-konditionierten Mediums. Zusätzlich zur physikalischen und molekularen Charakterisierung beinhaltet das Protokoll einen funktionellen Test, um die entzündungshemmende Wirkung von Exosomen aus verschiedenen DPSC-Passagen zu bewerten, was eine vergleichende Bewertung der passageabhängigen Konsistenz in Exosomenqualität und -funktion ermöglicht. Der Arbeitsablauf ist für eine einfache Implementierung in Laboren konzipiert, die mit standardisierten Zellkultur- und molekularbiologischen Einrichtungen ausgestattet sind. Es setzt auf kommerziell erhältliche Bausätze, um interexperimentelle Variabilität zu reduzieren, und kann leicht skaliert werden, um unterschiedlichen experimentellen Anforderungen gerecht zu werden. Um die Variabilität von Spender zu Spender zu minimieren, werden DPSCs aus einzelnen Zähnen isoliert und unabhängig erweitert, anstatt aus mehreren Spendern zusammengeführt zu werden. Dieses Protokoll ist besonders nützlich für Forscher, die funktionell validierte, von DPSC abgeleitete Exosomen für nachgelagerte Anwendungen erzeugen möchten, einschließlich Wundheilung, Knochengewebetechnik und Immunmodulationsstudien, bei denen Batch-zu-Batch-Konsistenz unerlässlich ist. Insgesamt bietet es einen praktischen und standardisierten Rahmen zur Herstellung von DPSC-abgeleiteten Exosomen für den Einsatz in der Gewebetechnik und der Forschung in regenerativer Medizin.

Protokoll

Diese Studie wurde gemäß den Grundsätzen der Helsinkier Erklärung durchgeführt und von den institutionellen Ethikkomitees genehmigt. Humanes Zahnpulpagewebe wurde aus verworfenen dritten Backenzähnen oder kieferorthopädischen Prämolaren gewonnen, die im Ningbo Stomatologiekrankenhaus gemäß institutionellen ethischen Richtlinien (Protokoll Nr. NBKQYY2025LS-04; Genehmigungsdatum: 30. Mai 2025). Menschliches Hautgewebe wurde aus weggeworfenen Vorhautproben gewonnen, die während routinemäßiger Beschneidungsverfahren in der Urologieabteilung des Affiliated People's Hospital der Ningbo-Universität entnommen wurden, gemäß den institutionellen ethischen Richtlinien (Protokoll Nr. 2024104; Genehmigungsdatum: 30. Oktober 2024). Vor der Probenentnahme wurde eine schriftliche informierte Zustimmung von allen Spendern oder deren gesetzlichen Vormündern eingeholt.

1. Isolierung von Exosomen aus Zahnpulpa-Stammzellen

1. Isolation, Kultur und Identifikation von DPSCs
   1. Probenentnahme und -transport
      1. Entnehmen Sie intakte menschliche dritte Molaren von Spendern im Alter von 18–25 Jahren oder Prämolaren von Spendern im Alter von 12–16 Jahren nach kieferorthopädischer Extraktion.
      2. Setzen Sie die gezogenen Zähne sofort in vorgekühlte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 100 U/mL Penicillin-G und 100 μg/mL Streptomycin.
      3. Proben werden bei 4 °C ins Labor transportiert und innerhalb von 6 Stunden nach der Extraktion verarbeitet.
   2. Dentalpulpa-Exposition und Gewebedissoziation
      1. 30 Sekunden lang in 70 % Ethanol eintauchen; dreimal gewaschen mit 1× PBS mit 3 % P/S (je 30 Sekunden). Entfernen Sie vorsichtig restliche Zahnfleisch- und Parodontalgewebe von der Zahnoberfläche mit steriler Schere oder einem Skalpell.
      2. Wickeln Sie den Zahn in sterile Mullbinde und knacken Sie dann vorsichtig die Krone mit einem sterilisierten Hammer, um die Pulpakammer freizulegen.
      3. Trennen Sie das Pulpagewebe vorsichtig vom Dentin und zerkleinern es mit sterilen chirurgischen Klingen in kleine Fragmente (<1 mm³).
      4. Die Gewebefragmente werden in ein 1,5 mL Zentrifugenrohr übertragen, das eine Verdauungslösung aus 2,5 mg/mL Dispase II und 2,5 mg/mL Kollagenase Typ I enthält.
      5. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C Inkubator für 30–45 Minuten mit sanftem Rühren.
         HINWEIS: Die Dauer der enzymatischen Verdauung wurde anhand des Volumens und des Homogenisierungsgrads des Zahnpulpagewebes bestimmt.
   3. Verdauungsabbruch und primäre Zellkultur
      1. Stoppen Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie eine gleiche Menge Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) hinzufügen, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS).
      2. Zentrifugiere die Zellsuspension bei 200 × g für 5 Minuten, um die Zellen und Gewebefragmente zu pelletieren.
      3. Entsorge das Supernatant und suspendiere das Pellet in 1 ml vollständigem Kulturmedium (α-MEM mit 20 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin).
      4. Säen Sie die resuspendierten Zellen aus und explantieren Sie sie in eine 60-mm-Kulturschale und fügen Sie vollständiges Kulturmedium zu einem Endvolumen von 5 ml hinzu.
      5. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5 % CO₂ enthält.
   4. Zellpflege und Subkultur
      1. Erneuern Sie das Kulturmedium alle 2–3 Tage.
      2. Überwachen Sie die Zellen täglich.
         HINWEIS: Primäre DPSCs wandern typischerweise von Gewebeexplants und erreichen innerhalb von 7–14 Tagen eine 80–90%ige Konfluenz.
      3. Bei der Subkultur werden Zellen mit 0,05 % Trypsin-Ethylendiamine-Tetraessigsäure (EDTA) abgetrennt, wenn sie eine 80–90%ige Konfluenz erreichen.
         VORSICHT: Trypsin ist ein Reizstoff. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe und Schutzbrillen.
      4. Passagezellen im Verhältnis 1:3 mit dem vollständigen Kulturmedium (mit 20 % FBS).
      5. Verwenden Sie DPSCs an den Passagen 2, 4 und 6 für alle nachgeschalteten Exosomenisolations- und Funktionstests.
   5. Charakterisierung von DPSCs mittels Durchflusszytometrie
      1. DPSCs am gewünschten Durchgang mit 0,05 % Trypsin-EDTA ablösen, mit vollständigem Kulturmedium neutralisieren und die Zellsuspension aufsammeln.
      2. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und entsorge den Supernatant. Das Zellpellet in PBS wieder suspendieren und die Zellen zählen. Stellen Sie die Zelldichte auf etwa 1 × 10⁶ Zellen/mL an.
      3. Aliquot 100 μL der Zellsuspension in jedes Durchflusszytometrierohr. Inkubieren Sie die Zellen mit fluorchromkonjugierten Antikörpern gegen CD44, CD90, CD105, CD45, CD19 und CD14 bei einer Verdünnung von 1:100 in PBS für 30 Minuten bei 4 °C im Dunkeln.
      4. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml PBS in jede Röhre geben, gefolgt von einer Zentrifugation mit 300 × g für 5 Minuten. Entsorgen Sie das Supernatant vorsichtig und suspendieren Sie das Zellpellet in 300–500 μL PBS zur Analyse.
      5. Fügen Sie geeignete Isotyp-Kontrollantikörper in abgestimmten Konzentrationen für jedes Fluorochrom ein, um Hintergrundkorrektur und Gating zu ermöglichen.
      6. Analysieren Sie Proben mit einem Durchflusszytometer mit geeigneten Lasern und Filtern für die ausgewählten Fluorochrome. Erhalte mindestens 10.000 Ereignisse pro Probe.
      7. Führen Sie Datenanalysen mit Flowzytometrie-Software durch. Zunächst werden lebensfähige Zellen auf Basis von Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) gesperrt, um Trümmer auszuschließen. Dann tragen Sie Singlet-Gating auf, um Doublets zu entfernen.
      8. Bestimmung der Markerexpression durch Vergleich der Fluoreszenzintensität mit entsprechenden Isotyp-Kontrollen, um positive und negative Populationen zu definieren.
2. Isolierung und Reinigung von DPSC-Exos
   1. Herstellung des konditionierten Mediums
      1. Kultivieren Sie DPSCs in einer 10-cm-Kulturschale, bis sie 70–80 % Konfluenz erreichen.
      2. Entferne das verbrauchte Medium und wasche die Zellmonoschicht dann vorsichtig zweimal mit vorgewärmtem PBS.
      3. Fügen Sie 10 ml vollständiges Medium hinzu, ergänzt mit 10 % exosomenarmem FBS.
      4. Inkubieren Sie die Kultur weiter bei 37 °C, bis die Zellkonfluenz 90–100 % erreicht (ein Prozess, der üblicherweise über 24 Stunden dauert).
   2. Sammlung konditionierter Medien
      HINWEIS: Halten Sie alle folgenden Schritte auf Eis oder bei 4 °C.
      1. Übertragen Sie das konditionierte Medium in ein Zentrifugenrohr.
      2. Zentrifugieren Sie das Medium bei 4 °C und 3.000 × g für 10 Minuten, um Zellen und große Ablagerungen zu entfernen.
      3. Übertragen Sie das Überstandsmittel vorsichtig in ein neues Zentrifugenrohr, ohne das Pellet zu stören.
      4. Zentrifugiere den Überstandsstoff bei 4 °C und 10.000 × g für 10 Minuten, um kleinere Partikel und apoptotische Körper zu pelletieren.
      5. Filtern Sie das Überstandsmittel durch einen 0,22 μm Spritzenfilter in ein sauberes 50-mL-Zentrifugenrohr.
      6. Verarbeiten Sie das geklärte Medium sofort zur Exosomen-Isolierung oder Aliquot und lagern Sie es bei -80 °C.
         HINWEIS: Das geklärte, konditionierte Medium kann mehrere Monate bei -80 °C gelagert werden. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen.
   3. Exosomenisolierung durch polymerbasierte Präzipitation
      1. Taue das klarisierte, konditionierte Medium auf Eis, falls es gefroren war.
      2. In einem sterilen Rohr auf Eis wird das Medium mit einer Exosomenkonzentrationslösung bei einem Volumenverhältnis von 4:1 kombiniert (z. B. 20 mL Medium: 5 mL Lösung). Wirbeln Sie die Mischung für 1 Minute, um die Homogenität zu gewährleisten.
      3. Lassen Sie die Mischung 16–18 Stunden ungestört bei 4 °C, um eine Exosom-Niederschlagung zu ermöglichen.
         HINWEIS: Die Brutzeit kann entsprechend verlängert werden, um den Ertrag potenziell zu steigern, sollte aber 24 Stunden nicht überschreiten.
      4. Zentrifugiere das Gemisch bei 4 °C und 10.000 × g für 75–80 Minuten, um die Exosomen zu pelletieren. Saugen Sie vorsichtig ein und entsorgen Sie das Überlagermittel, ohne das Pellet zu stören.
      5. Zentrifugiere das Rohr erneut bei 4 °C und 10.000 × g für 2 Minuten. Entfernen Sie alle Restüberlagerstoffe mit einer Pipette.
      6. Das Exosomenpellet in 1x PBS wieder suspendieren (200 μL PBS pro 20 mL konditioniertes Medium).
      7. Übertragen Sie die Resuspension in ein neues 1,5-mL-Zentrifugenrohr und zentrifugieren Sie bei 4 °C und 12.000 × g für 2 Minuten, wobei das Überlagerungsmittel erhalten bleibt, das mit Exosomenpartikeln angereichert wird (bei Bedarf wiederholt).
   4. Reinigung von Exosomen
      1. Tragen Sie die Exosomensuspension auf eine Exosomenreinigungsfiltersäule auf, die in einem Sammelrohr angebracht ist.
      2. Zentrifugieren Sie die Säule bei 4 °C und 3.000 × g für 10 Minuten.
      3. Sammeln Sie die Durchflussflüssigkeit vom Boden des Sammelrohrs auf. Diese Flüssigkeit enthält die gereinigten Exosomen.
   5. Speicherung gereinigter Exosomen
      1. Aliquot die gereinigte Exosomensuspension in Einwegvolumen, die für nachgelagerte Experimente geeignet sind.
      2. Lagern Sie die Aliquots bei -80 °C.
         HINWEIS: Aliquoting ist entscheidend, um wiederholte Gefroren-Tau-Zyklen zu vermeiden, die die Integrität der Exosomen und die biologische Aktivität beeinträchtigen können.
   6. Charakterisierung und Identifikation von DPSCs-Exo
      1. Morphologische Analyse mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wie in den Schritten 1.2.6.2–1.2.6.6.6 beschrieben.
      2. Verwenden Sie eine Pipette, entnehmen Sie 10 μL der vorbereiteten Exosomen-Suspensionsprobe und lassen Sie sie auf vorgefertigten Parafilm fallen. Lege das Formvar/kohlenstoffbeschichtete Kupfergitter, die Filmseite nach unten zeigt, auf den Tröpfchen, sodass er 10–15 Minuten natürlich adsorbieren kann.
      3. Verwenden Sie einen Filterpapierstreifen, um überschüssige Flüssigkeit abzuziehen, und lassen Sie ihn kurz an der Luft trocknen.
      4. Verwenden Sie eine Pipette, entnehmen Sie 10 μL 2% Phosphotungstische Säurelösung und lassen Sie sie auf den Parafilm fallen. Kehren Sie das Gitter, das den Adsorptionsschritt abgeschlossen hat, so um, dass seine Filmseite zur Färbungslösung zeigt, und lassen Sie es 3–5 Minuten einwirken.
      5. Verwenden Sie einen Filterpapierstreifen, um überschüssige Flüssigkeit abzuweichen und das Gitter unter einer Glühlampe trocknen zu lassen.
      6. Beobachten und nehmen Sie Bilder mit einem Transmissionselektronenmikroskop auf.
      7. Führen Sie Größenverteilungs- und Konzentrationsanalyse durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) wie in den Schritten 1.2.6.8–1.2.6.12 beschrieben durch.
      8. Spülen Sie die Probekammer dreimal mit ultrareinem Wasser.
      9. Kalibrieren Sie das Instrument mit Standard-100-nm-Polystyrolperlen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach erfolgreicher Kalibrierung werden Sie mit den Messungen fortfahren.
      10. Spülen Sie die Probekammer mit 1× PBS ab.
      11. Verdünne die Exosomenprobe in 1× PBS (1:500 Verdünnung) und lade sie in die Probenkammer. Überwachen Sie die Teilchenbewegung in Echtzeit mit der Instrumentensoftware.
      12. Sammeln Sie Daten und erstellen Sie den entsprechenden Analysebericht.
      13. Identifizieren Sie die Proteinmarker durch Western-Blot-Analyse wie in den Schritten 1.2.6.14–1.2.6.24 beschrieben.
      14. Exosomenproben werden mit einem exosomenspezifischen Protein-Lysepuffer analysiert und die Proteinkonzentration mit einem Bicinchoninsäure-(BCA)-Test quantifiziert.
      15. Bereite Auflösungs- und Stapelgels vor. Lade pro Lane gleiche Mengen Protein und gib 5 μL Proteinmarker zu jedem Gel.
      16. Führen Sie Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 80 V durch, bis die Farbstofffront das auflösende Gel erreicht, dann auf 120 V erhöhen und fortsetzen, bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.
      17. Schneiden Sie eine Polyvinylidenfluorid-(PVDF)-Membran auf die passende Größe und aktivieren Sie sie, indem Sie sie 5 Minuten lang in Methanol einweichen.
      18. Bereiten Sie einen Transferpuffer vor, der aus 25 mM Tris-Base, 192 mM Glycin und 20 % (v/v) Methanol (pH = 8,3) besteht. Gleiche alle Transferkomponenten im Transferpuffer aus.
      19. Setzen Sie das Transfersandwich in folgender Reihenfolge von Kathode bis Anode zusammen: Schwamm – Filterpapier – Gel – PVDF-Membran – Filterpapier – Schwamm. Entferne alle Luftblasen und führe einen Proteintransfer mit einem konstanten Strom von 300 mA durch.
      20. Nach dem Transfer spülen Sie die PVDF-Membran kurz mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween20 (TBST) und blockieren Sie mit 5 % fettarmer Milch 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur und sanftem Schütteln.
      21. Inkubieren Sie die Membran mit primären Antikörpern (z. B. Anti-CD63 und Anti-TSG101), die über Nacht bei 4 °C in 5 % fettarmer Milch mit sanftem Schütteln verdünnt werden. Wasche die Membran dreimal mit TBST für jeweils 5 Minuten.
      22. Inkubieren Sie mit dem entsprechenden sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 30 Minuten, gefolgt von drei Waschen mit TBST (jeweils 5 Minuten).
      23. Frische Elektrochemilumineszenz-(ECL)-Arbeitslösung (Mischung von Lösungen A und B im Verhältnis 1:1), Anwendung auf die Membran und Signalerkennung mit einem chemilumineszenzbildenden System.

2. Isolierung und Kultur der menschlichen primären Hautepidermalen Keratinozyten

1. Probenentnahme und -transport
   1. Entnehmen Sie Vorhautgewebeproben von gesunden männlichen Spendern im Affiliated People's Hospital der Ningbo Universität.
   2. Setzen Sie das entfernte Vorhautgewebe sofort in 4 °C PBS, ergänzt mit 100 U/mL Penicillin-G und 100 μg/mL Streptomycin.
   3. Proben bei 4 °C ins Labor transportieren und innerhalb von 6 Stunden verarbeiten.
2. Aseptische Vorbereitung und Gewebefragmentierung
   1. Das Gewebe in 70 % Ethanol für 30 Sekunden bis 3 Minuten eintauchen.
      HINWEIS: Passen Sie die Eintauchzeit für die anfängliche Desinfektion an die Gewebegröße an.
   2. Mit steriler Schere oder einem Skalpell wird subkutanes Fett und Bindegewebe aus der gewaschenen Gewebeprobe seziert und entfernt.
   3. Zerkleinern Sie es in kleine Fragmente (Fragmentgröße <1 mm³) mit sterilen chirurgischen Klingen.
      HINWEIS: Das Zerkleinern von 3–4 Gewebeproben benötigt in der Regel weniger als 15 Minuten. Gib beim Hacken eine kleine Menge PBS hinzu, wenn das Gewebe trocken wirkt.
   4. Übertragen Sie den gehackten Gewebeschlamm in ein 50-mL Zentrifugenrohr, das eine Verdauungslösung aus 2,5 mg/mL Kollagenase Typ I und 2,5 mg/mL Dispase II enthält. Fügen Sie pro Stück gehacktes Gewebe 10–20 ml Verdauungslösung hinzu.
   5. Inkubieren Sie die Mischung 60 Minuten lang in einem 37 °C Inkubator. Halten Sie eine sanfte Bewegung bei 80 × g aufrecht oder bewegen Sie den Schlauch alle 20 Minuten kräftig von Hand.
3. Sekundärverdauung und DNase-Behandlung
   1. Gib 0,25 % Trypsin-EDTA zur Verdauungsmischung im Volumenverhältnis von 1:5. Inkubieren Sie das Rohr bei 37 °C für 25 Minuten mit sanftem Rühren.
      VORSICHT: Trypsin ist ein Reizstoff. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe und Schutzbrillen.
   2. Fügen Sie der Mischung eine DNase-I-Lösung (10 mg/mL) in einem Verhältnis von 10 μL pro mL des gesamten Verdauungsvolumens hinzu. Inkubieren Sie bei 37 °C für 5 Minuten mit sanftem Rühren.
4. Verdauungsabbruch und primäre Zellkultur
   1. Stoppen Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie ein gleiches Volumen DMEM hinzufügen, ergänzt mit 10 % FBS.
   2. Triturieren Sie die Mischung gründlich, indem Sie etwa 20 Mal auf und ab pipetten, um die Gewebefragmente zu dissoziieren. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 100 μm Zellsieb in ein neues 50-mL Zentrifugenrohr.
   3. Zentrifugiere die Zellsuspension bei 200 × g für 5 Minuten, um die Zellen und Gewebefragmente zu pelletieren.
   4. Entsorge das Supernatant und suspendiere das Pellet in 1 ml vollständigem Kulturmedium (α-MEM mit 20 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin).
   5. Säen Sie die resuspendierten Zellen aus und explantieren Sie sie in eine 10 cm große Kulturschale und fügen Sie ein vollständiges Kulturmedium zu einem Endvolumen von 6 ml hinzu.
   6. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 %_CO2.
      HINWEIS: Ergänzen Sie Keratinozytenkulturen mit Y-27632 bei einer Endkonzentration von 5 μM während der Kultur.
5. Zellpflege und Subkultur
   1. Erneuern Sie das Kulturmedium alle 2–3 Tage.
   2. Überwachen Sie die Zellen täglich.
      HINWEIS: Primäre epidermale Keratinozyten der Haut wandern typischerweise von Gewebeexplants und erreichen innerhalb von 10-14 Tagen eine 80-90%ige Konfluenz.
   3. Bei der Subkultur werden Zellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA abgetrennt, wenn sie eine 80–90 % Konfluenz erreichen.
      VORSICHT: Trypsin ist ein Reizstoff. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe und Schutzbrillen.

3. Funktionelle Überprüfung der entzündungshemmenden Funktion von Exosomen aus verschiedenen Durchgängen

1. Zellsäung und Vorbereitung
   1. Säe epidermale Keratinozyten mit einer Dichte von 1,5 × 10⁵ Zellen pro Bohrloch in eine 12-Well-Platte. Geben Sie jedem Brunnen 1 ml Complete Medium zu und kultivieren Sie die Zellen für 24 Stunden.
   2. Wenn die Zellkonfluenz etwa 70 % erreicht, aspirieren Sie das Medium vorsichtig und waschen Sie die Zellmonoschicht zweimal vorsichtig mit vorgewärmtem 1× PBS.
2. Entzündungsstimulation und Exosomenbehandlung
   1. Induzieren Sie ein psoriasiformes zelluläres Modell, stimulieren Sie die Zellen mit der proinflammatorischen Zytokinmischung "M5" (mit IL-1α, IL-17A, IL-22, Oncostatin M und TNF-α, jeweils mit einer Endkonzentration von 10 ng/mL).
   2. Für die Behandlungsgruppen ko-inkubieren Sie die stimulierten Zellen mit DPSC-Exos (50 μg pro Bohrloch).
   3. Für die Negativkontrollgruppe (NC) sollte anstelle von Exosomen ein entsprechendes Volumen PBS hinzugefügt werden.
      HINWEIS: Führen Sie alle Stimulationen und Behandlungen in einem Medium ohne Y-27632 durch, um mögliche Störungen der entzündlichen Signalwege zu vermeiden.
3. Probenentnahme und qRT-PCR-Analyse (funktionaler Vergleich zwischen den Passagen)
   1. Entnehmen Sie die Zellen und extrahieren Sie RNA nach 24 Stunden Behandlung.
   2. Analysieren Sie die Expression des wichtigsten Entzündungsmarkers IL-23A.
      1. Vergleichen Sie die inhibitorischen Effekte auf die IL-23A-Expression bei Exosomenbehandlungsgruppen, die aus verschiedenen Passagen (P2, P4 und P6) abgeleitet wurden, mit qRT-PCR, um passageabhängige Veränderungen der Exosomenfunktion zu bewerten.
      2. Führen Sie qRT-PCR unter folgenden Zyklusbedingungen durch: erste Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 10 Sekunden und Annealing/Extension bei 60 °C für 30 Sekunden.
      3. Führen Sie eine Schmelzkurvenanalyse von 65 °C bis 95 °C durch, um die Spezifität der Verstärkung zu bestätigen.
         HINWEIS: Primer-Sequenzen: Human-IL-23A (vorne: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3', Rückwärts: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'); Human-H36B4 (vorwärts: 5'-GCAATGTGTGCCGTGTGTCTGTGT-3', rückwärts: 5'-GCCTTGACKTTTTTCAGCAAG-3')

Ergebnisse

Identifikation und Charakterisierung von Zahnpulpa-Stammzellen
Primäre Zahnpulpa-Stammzellen (DPSCs), die mit dem beschriebenen Protokoll isoliert wurden, zeigten stabiles Wachstum und typische mesenchymale Morphologie während der in-vitro-Expansion. Wie in Abbildung 1 dargestellt, zeigten DPSCs an den Passagen 2, 4 und 6 eine homogene Population spindelförmiger, fibroblastähnlicher Zellen, ohne erkennbare mor...

Diskussion

Das in dieser Studie beschriebene standardisierte Protokoll bietet einen reproduzierbaren Rahmen für die Isolierung von Zahnpulpa-Stammzellen (DPSC), die Produktion von DPSC-abgeleiteten Exosomen (DPSC-Exos) und die funktionelle Validierung dieser Vesikel über mehrere Zellgänge. Die folgende Diskussion hebt wichtige prozedurale Überlegungen, Optimierungsstrategien, methodische Einschränkungen und die breitere Relevanz dieses Arbeitsablaufs für die Forschung der regenerativen Medizin herv...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung	Gibco	25300054	Aufgrund seiner Verdauungskraft wird Trypsin weit verbreitet für Zelldissoziation, routinemäßige Zellkultur-Durchgänge und primäre Gewebedissoziation eingesetzt.
100 mm Zell- und Gewebekulturschüssel	Biofil	TCD010100	Oberflächenbehandelt/unbehandelt steril & Nicht-pyrogen DNase/RNase-frei
100 nm PS-Perlen	Thermo Fisher	3100A	Vor der Durchführung von Nanopartikel-Tracking-Analysen (NTA)-Experimenten muss das Instrument mit einem Standard mit einer genau bekannten Partikelgröße (100 nm) kalibriert werden.
15-mL Bulk-Konische Zentrifugenröhre	KIRGEN	KG2611	Steril, frei von RNase/Dnase und pyrogen
200-Mesh Formvar-kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter	Zhongjing  Wissenschaftlich  Instrumente	AZH200	Unterstützt Exosomenproben für TEM-Bildgebung. Die Formvar-Kohlenstoffbeschichtung verbessert die Haftung und Leitfähigkeit der Probe, während das 200-Gitter-Gitter ausreichend offene Fläche für gleichmäßige Partikelverteilung und stabile Bildgebung bietet.
37 & Grad; C-Inkubator	Thermowissenschaftlich	51032877	Der 37-Grad-CO2-Inkubator bietet eine ideale In-vitro-Umgebung.
50-mL Bulk-Konische Zentrifugenröhre	KIRGEN	KG2811	Steril, frei von RNase/Dnase und pyrogen
Anti-CD63-Antikörper [MX-49.129.5]	Abcam	ab193349	Anti-CD63-Antikörper [MX-49.129.5] (ab193349) ist ein monoklonaler Maus-Antikörper, der CD63 in  nachweist; Western Blot, Durchflusszytometrie (Intra), Durchflusszytometrie, IHC-P, ICC/IF. Geeignet für  Mensch.
Anti-TSG101-Antikörper [EPR7130(B)]	Abcam	ab125011	Der Anti-TSG101-Antikörper [EPR7130(B)] (ab125011) ist ein monoklonaler Kaninchenantikörper, der TSG101 in  nachweist; Western Blot, Durchflusszytometrie (Intra), Durchflusszytometrie, IHC-P, ICC/IF. Geeignet für  Mensch, Maus, Ratte.
Automatisierter Zellzähler	Countstar	IC1000	Automatisierter Zellzähler für schnelle, präzise Zellzählung
BCA-Protein-Assay-Kit	Beyotime	P0012	Haben eine gute lineare Beziehung im Konzentrationsbereich von 50 - 2000 & mu; g/ml.
Tischzentrifuge	BIORIDGE	TD5	Tischzentrifuge für schnelle und effiziente Probentrennung im Labor
Biologischer Sicherheitsschrank	Thermowissenschaftlich	1379	Der biologische Sicherheitsschrank ist ein steriles Eindämmungsgerät, das Bediener, Proben und Umwelt vor Biohazards schützt, indem es luftgetragene Krankheitserreger filtert und Kreuzkontamination während der mikrobiologischen Arbeit verhindert.
Zellkulturplatte, 12-Well	Eppendorf	0030721110	Gewebekultur behandelt, mit Deckel, flachem Boden Steril, frei von nachweisbaren Pyrogenen, RNase & DNase, Mensch & BACT. DNA Nicht-zytotoxisch
Zellkulturplatte, 96-Well	NEST	701001 0714B	Behandelte Gewebekultur, Polystyrol, nicht-pyrogen, steril
Zellenspeicherung	NCM	C40100	Serumfreies, tierisches Eiweißfreies Zellgefriermedium
Kollagenase, Typ I, Pulver	Gibco	17100017	Kollagenase ist eine Protease, die die Bindung zwischen einer neutralen Aminosäure (X) und Glycin in der Sequenz Pro-X-Gly-Pro spaltet, die häufig in Kollagen vorkommt.
Dispase II, Pulver	Gibco	17105041	Dispase II (neutrale Protease) ist eine Aminoendo-Peptidase, die die N-terminalen Peptidbindungen unpolarer Aminosäurereste hydrolysiert.
Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium	Gibco	C11995500BT	[+]4,5 g/L D-Glukose [+]L-Glutamin [+]110 mg/L Natriumpyruvat
Evo M-MLV Reverse Transkriptions-Kit	AG	AG11707	Ein spezielles Reverse-Transkriptionsreagenz für Echtzeit-RT-PCR. Es nutzt die Evo M-MLV Reverse-Transkriptase mit starker Verlängerungsfähigkeit, was eine effiziente Synthese von cDNA innerhalb kurzer Zeit ermöglicht.
Exosomenkonzentrationslösung	Umibio	UR52111	Exosomen aus dem Zellsupernatanten extrahieren
Exosom erschöpftes fetales Rinderserum	Umibio	UR50202	Das exosomfreie fetale Rinderserum wurde gewonnen, indem das steril gesammelte gesunde fetale Rinderserum gefiltert wurde, und ≥ 99 % der endogenen Exosomen im fetalen Rinderserum wurden entfernt. Es hatte vor der Verarbeitung die gleiche Zellwachstumsrate und Morphologie wie das fetale Rinderserum.
Fetales Rinderserum, qualifiziert, Australien	Gibco	10099141	Hämoglobinwert:  ≤ 30 mg/dL (Spiegel routinemäßig ≤ 25 mg/dL)
Human-H36B4	Sangon Biotech	SB002	Vorwärts: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTCTGTGT-3'; Rückwärts: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3'
Human-IL-23A	Sangon Biotech	SB002	Stürmer: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAC-3'; Rückwärts: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTC-3'
Invertiertes biologisches Mikroskop	Leica	DMI1	Beobachten Sie direkt die lebenden Zellen oder Gewebe, die an den Wänden von Behältern wie Kulturflaschen und Petrischalen haften.
Mindestessentielles Medium	Gibco	C12571500BT	[+]L-Glutamin [+]Ribonukleoside [+]Desoxyribonukleosiden
NcmSpin Rapid RNA Extraction Kit	NCM	M5106	Dieses Kit kann schnell Gesamt-RNA aus bis zu 3.000.000 Zellen und bis zu 10 mg Gewebe extrahieren.
Penicillin-Streptomycin	NCM	C100C5	Enthält 10.000 Einheiten/ml Penicillin und 10.000 Mikrogramm/ml Streptomycin. Es wurde gefiltert, um Bakterien zu entfernen, und kann direkt zur Zellkultur verwendet werden. Es verhindert effektiv eine bakterielle Kontamination der Zellen.
PerfectStart Green qPCR SuperMix	TransGen	AQ601-02-V2	Ein fluoreszierender Farbstoff, der an die Nebenrille aller doppelsträngigen DNA bindet und bei der Anregung grünes Licht abgibt. Während der PCR-Amplifikation integriert es sich in neu amplifizierte DNA, was zu einer erhöhten Fluoreszenz führt. Während des Denaturierungsschritts trennen sich die DNA-Stränge, wodurch der Farbstoff freigesetzt wird und das Fluoreszenzsignal deutlich abfällt.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Viva Zellbiowissenschaften	C3582-0500	Seine Funktion besteht darin, den pH-Wert des Mediums im physiologischen Bereich zu halten und das osmotische Druckgleichgewicht innerhalb und außerhalb der Zelle aufrechtzuerhalten.
Phosphotungstische Säure	Solarbio	G1870	Verwendet als Negativfarbe für die TEM-Probevorbereitung.
SW Schüttelnde Wasserbäder	Julabo	(DIN 12876-1)I	Arbeitstemperaturbereiche von +20 bis +99,9 °C; C
Spritzenfilter, 0,22 μ m/33 mm, PES	Beyotime	FF362	DNase/RNase-frei niedrige Proteinbindung nicht-pyrogen einzeln gewickelt
Transmissionselektronenmikroskop (TEM)	HITACHI	HT7700	Verwendet für hochauflösende Bildgebung der Nanopartikelmorphologie, einschließlich Exosomen. Betrieb mit einer Beschleunigungsspannung von 80 Zoll; 100 kV, um negativ gefärbte Proben zu visualisieren und Partikelgröße, Form und strukturelle Integrität zu bestätigen.
ZetaView_Particle Metrix	Teilchenmetrix	PMX-120	Verwendet zur Messung der Partikelgröße, Konzentration, des Zeta-Potenzials und der Fluoreszenzeigenschaften von Nanopartikeln.