Nachweis von Sexualhormonen im menschlichen Tränenfilm mittels enzymgebundener Immunsorbent-Assays

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte enzymgebundene Immun-Sorbent-Methode (ELISA) zur Nachweisung und Quantifizierung von 17β-Estradiol und Testosteron in menschlicher Tränenflüssigkeit, die über Mikrokapillarröhrchen gesammelt wird. Dieser Ansatz ermöglicht eine minimalinvasive Messung der Tränenhormonspiegel.

Zusammenfassung

Der Tränenfilm ist eine komplexe, mehrschichtige Flüssigkeit, die für die Erhaltung der Augenoberfläche, die visuelle Klarheit sowie den Schutz vor Krankheitserregern und Umweltbelastungen unerlässlich ist. Es besteht hauptsächlich aus Lipiden, wässriger Flüssigkeit, löslichen Proteinen und Mucinen und dient nicht nur zur Schmierung und zum Schutz des Auges, sondern dient auch als wertvolles diagnostizielles Medium für Augenerkrankungen wie trockene Augenerkrankungen (DED). Sexualhormone, darunter Androgene und Östrogene, sind dafür bekannt, die Zusammensetzung von Tränenfilmen zu beeinflussen, aber die Messung dieser Hormone in Tränenflüssigkeit ist durch geringes Probenvolumen und technische Herausforderungen eingeschränkt. Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Anpassung kommerziell verfügbarer enzymgebundener Immunsorbent-Assay-Kits (ELISA), um 17β-Estradiol und Testosteron in Basalrisen, die mit Mikrokapillarröhrchen gesammelt werden, zu erkennen und zu quantifizieren. Der Arbeitsablauf umfasst optimierte Probenentnahme-, Verdünnungs- und Assay-Vorbereitungsstrategien, um die Analyse von Rissproben mit geringem Volumen zu ermöglichen. Das Protokoll demonstriert die Machbarkeit und Reproduzierbarkeit des Hormonnachweises in Tränenflüssigkeit mit angepassten ELISA-Methoden. Repräsentative Ergebnisse stammen aus zusammengefassten Pilotproben und sollen die Assay-Leistung und nicht biologische Unterschiede veranschaulichen. Dieser Ansatz könnte zukünftige Studien unterstützen, die Tränenflüssigkeit als Matrix für die Hormonmessung in der Forschung an Augenoberflächen untersuchen.

Einleitung

Der Tränenfilm spielt eine entscheidende Rolle beim Schutz, Nähren und Schmieren der Augenoberfläche¹. Er ist etwa 2–5,5 μm dick und 3–10 μL groß, mit einer Umsatzrate von 1–2 μL pro Minute bei gesundem^{Auge 2,3}. Die Tränendrüsen sekretieren die wässrige Komponente der Tränen, reich an Wasser, Elektrolyten, Proteinen und antimikrobiellen Faktoren, während die meibomischen Drüsen Lipide produzieren, die die Verdunstung des Tränenfilms verlangsamen, und die konjunktivalen Kelchzellen geben Mucine frei, die die Schmierung der Augenoberfläche^{unterstützen 4}. Die Tränenproduktion erfolgt auf zwei Hauptarten: 1) Basalsekretion, die einen stabilen Tränenfilm auf einer gesunden Augenoberfläche aufrechterhält, und 2) Reflexsekretion, die durch Reize wie Reizungen, Emotionen oder helles Licht ausgelöst wird. Die biochemische Zusammensetzung unterscheidet sich zwischen den beiden, was letztlich die Methode zur Entnahme von Tränen für die Analyse^{beeinflussen kann 5,6}. Basalrisse enthalten im Allgemeinen höhere Konzentrationen von Proteinen und Lipiden, die die Stabilität des Tränenfilms und die Hornhautgesundheit unterstützen, während Reflexrisse tendenziell ein höheres wässriges Volumen haben und stärker verdünnt werden, um Reizstoffe zu spülen und die^{Augenoberfläche zu schützen.}

Da Tränen Entzündungen modulieren, gegen Krankheitserreger schützen und der avaskulären Hornhaut^{Nährstoffe liefern}, sind sie zu einem Schwerpunkt^{der Biomarkerforschung} geworden. Tränen bieten eine minimalinvasive und relativ kostengünstige Alternative zur Blutentnahme zur Überwachung physiologischer Veränderungen, insbesondere solche, die in der Nähe der Krankheitsstelle^{auftreten 8}. Um diese Daten genau zu erfassen, ist eine ordnungsgemäße Sammlung unerlässlich¹⁰. Glas-Mikrokapillarröhren werden häufig zur Probenentnahme von Basalrisen verwendet, da sie eine Entnahme mit minimaler Reizung und Tränenverdünnung^ermöglichen. Diese Methode minimiert das Risiko, das Reflexriss zu stimulieren, was die Zusammensetzung des Risses^{verändern kann, indem} das Rohr sorgfältig positioniert wird, um Kontakt mit der bulbären Bindehaut und dem Lidrand zu vermeiden. Mit diesem Ansatz können Forscher unverdünnte Basalrisse erhalten, die den physiologischen Zustand der Augenoberfläche widerspiegeln. Dies stellt sicher, dass die Probe ein zuverlässiges Medium zur Quantifizierung sensibler Analyte wie Sexualhormone^10,12 bleibt. Das begrenzte erreichte Volumen stellt jedoch analytische Herausforderungen für nachgelagerte biochemische Analysen dar. Die Basalrissensammlung mit Mikrokapillarröhrchen ergibt typischerweise einige Mikroliter pro Probe, was die Kompatibilität mit Standardtests einschränkt.

Die menschliche Augenoberfläche wird zunehmend als Zielgewebe für Sexualhormone^13,14 anerkannt. Belege dafür umfassen den Nachweis von mRNA-Transkripten für Androgenrezeptoren (AR), Östrogenrezeptoren (ER) und Progesteronrezeptoren (PR) in den Acinarzellen der Tränen- und Meibomdrüse sowie in den Epithelzellen der Hornhaut, der Bindehaut, der Bindehaut- und Bindehautzelle¹⁵. Darüber hinaus wurden mRNAs, die steroidogene Enzyme codieren, in diesen Geweben identifiziert, was auf die Fähigkeit hindeutet, Steroidvorläufer lokalⁱⁿ biologisch aktive Sexualhormone umzuwandeln. Dies deutet auf die Möglichkeit einer in situ Hormonsynthese an der Augenoberfläche hin und wirft die entscheidende Frage auf, ob diese Hormone in nachweisbaren Mengen in den Tränenfilm ausgeschieden werden.

Aktuelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Sexualhormone ein integraler Bestandteil der Aufrechterhaltung der Homöostase der Augenoberfläche sind, obwohl die genauen molekularen Mechanismen weiterhin untersucht werden^13,14. Androgene wie Testosteron scheinen die Lipidsekretion zu stimulieren und Entzündungen zu unterdrücken; Folglich ist ein Androgenmangel weithin als Ursache für verdunstungsbedingte trockene Augen^anerkannt 13,14,17. Im Gegensatz dazu ist die Rolle der Östrogene nuancierter und kontextabhängig 13,14,18. Während sie an der Modulation der Tränenzusammensetzung und des Volumens beteiligt sind, sind Östrogenschwankungen, wie sie während der Menopause, Schwangerschaft oder bei der Anwendung von oralen Verhütungsmitteln auftreten, häufig mit einer beeinträchtigten wässrigen Sekretion, verminderter Stabilität des Tränenfilms und einer Entzündung der Augenoberfläche^19,20 verbunden. Daher stellen Personen, die diese hormonellen Ungleichgewichte erleben, eine Population mit erhöhtem Risiko für die Entwicklung einer Trockenaugenerkrankung (DED^{) dar.}

Trotz dieser Belege bleibt die Überwachung des hormonellen Status bei DED-Patienten eine Herausforderung. Konkret ist noch nicht geklärt, ob systemische Serumhormonspiegel die lokalen Hormonwerte im Auge²¹ genau widerspiegeln. Diese Unterscheidung ist entscheidend, da gezeigt wurde, dass Augengewebe Sexualhormonrezeptoren und steroidogene Enzymexpression besitzen, die die lokale Synthese und den Stoffwechsel von Sexualsteroiden^{unterstützen}. Diese intrakrine Kapazität deutet darauf hin, dass die lokalen Hormonkonzentrationen im Tränenfilm signifikant von den zirkulierenden Serumwerten¹³ abweichen können. Daher ist eine direkte Messung der Hormonkonzentration in der Tränenflüssigkeit notwendig, um lokale hormonelle Auswirkungen auf die Augenoberfläche besser zu verstehen. Solche Messgrößen sind jedoch technisch anspruchsvoll, da das geringe Volumen an Tränenproben zur Analyse vorhanden ist. Fortschrittliche analytische Techniken wie Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) wurden verwendet, um Hormone in Blut- und Tränenflüssigkeiten mit hoher Empfindlichkeit zu quantifizieren, aber diese Methode erfordert spezialisierte Instrumentierung und technisches Fachwissen, das für alle Forscher möglicherweise nicht leicht zugänglich ist^21,22.

Der enzymgebundene Immunsorbent-Test (ELISA) ist eine weit verbreitete Technik zur Detektion und Quantifizierung von Proteinen, Antikörpern und Hormonen. Für die Analyse kleiner Moleküle wie Sexualsteroide verwendet dieses Protokoll ein kompetitives Bindungsformat. Bei dieser Methode konkurriert das nicht markierte Hormon in der Tränenprobe mit einem enzymmarkierten Hormonanalog um eine begrenzte Anzahl von Antikörperbindungsstellen. Aufgrund dieser Konkurrenz ist die Signalintensität, gemessen als optische Dichte, umgekehrt proportional zur Konzentration des Hormons in der Probe; Effektiv deutet ein niedrigeres Signal auf eine höhere Konzentration des Zielhormons^23,24 hin.

ELISA bietet mehrere praktische Vorteile für gezielte Quantifizierung. Sie ist kosteneffizient und technisch zugänglich und ermöglicht die Implementierung in Standardlaborumgebungen ohne spezielle Instrumentierung. Darüber hinaus ermöglicht ELISA Hochdurchsatz-Screening in 96-Well-Plattenformaten mit minimaler Probenvorbereitung und bietet sowohl Zeiteffizienz als auch hohe Reproduzierbarkeit²³. Kommerziell erhältliche ELISA-Kits sind jedoch typischerweise für Bioproben mit höherem Volumen wie Serum oder Plasma optimiert, und ihre Leistung in Rissproben mit geringem Volumen ist nicht klar definiert. Um diese Einschränkung zu beheben, integriert das Protokoll optimierte Probenverdünnungs- und Handhabungsstrategien, um den Hormonnachweis innerhalb des Sensitivitätsbereichs des Tests zu ermöglichen.

In dieser Studie präsentieren wir ein visualisiertes Protokoll, das kommerziell erhältliche ELISA-Kits für den Nachweis und die Quantifizierung von 17β-Estradiol und Testosteron in einer mit Glas-Mikrokapillarröhren gesammelten Tränenprobe mit geringem Volumen anpasst. Dieses Protokoll legt Wert auf praktische Modifikationen bei der Probenentnahme, Handhabung und Testvorbereitung, um eine reproduzierbare Hormonmessung aus begrenzten Tränenvolumen zu ermöglichen. Diese Arbeit konzentriert sich darauf, einen praktikablen Arbeitsablauf zur Anwendung der bestehenden ELISA-Methodik auf die Analyse von Rissflüssigkeiten zu etablieren. Dieser Ansatz könnte als Grundlage für zukünftige Studien dienen, die lokale Hormonspiegel an der Augenoberfläche untersuchen.

Protokoll

Diese Studie wurde vom Indiana University Institutional Review Board (IRB#1908362633) genehmigt, und die schriftliche informierte Zustimmung wurde von allen Teilnehmern vor der Probenentnahme eingeholt.

1. Tear Film Sammlung

1. Zubereitung
   1. Bestimmen Sie das zu sammelnde Tränenvolumen und berücksichtigen Sie, dass für die statistische Zuverlässigkeit der ELISA-Ergebnisse zwei Replikate benötigt werden.
   2. Bereiten Sie ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr für die Lagerung von Tränenfilmen vor.
   3. Wählen Sie geeignete Mikrokapillarröhren aus, um Tränen aufzufangen. Ich empfehle, mit 3,33 μL oder 5 μL zu beginnen und auf kleinere Größe umzusteigen, wenn man von einem geringeren Volumen an Rissen an der Augenoberfläche sammelt.
   4. Bereiten Sie eine mit dem Mikrokapillarröhren-Kit gelieferte Gummi-Quetschbirne vor, um den Transfer der Tränenflüssigkeit in ein Mikrozentrifugenrohr zu erleichtern.
2. Tränensammlung
   1. Weisen Sie den Teilnehmer an, geradeaus oder leicht nach oben zu schauen.
   2. Setzen Sie vorsichtig die Mikrokapillarröhrenöffnung in den Rissmeniskus in der Nähe der lateralen Kanthus, um Basalrisse aufzufangen.
   3. Minimieren Sie den Kontakt mit der bularen Bindehauthaut und dem Lidrand, um reflexartige Risse so weit wie möglich zu vermeiden.
   4. Fülle die Tube mit Rissen, bis sie voll ist.
   5. Wenn mehrere Abnahmesitzungen erforderlich sind, planen Sie Sitzungen innerhalb von 24 Stunden und zu ähnlichen Tageszeiten an, um die Schwankungen der Hormonspiegel zu minimieren.
3. Tränenspeicherung
   1. Verschließen Sie das Loch oben auf der Gummi-Quetschlampe, führen Sie dann das Mikrokapillarrohr in die Lampe ein, während Sie das offene Ende prompt in das Mikrozentrifugenrohr legen, damit die Tränen aus dem Mikrokapillarröhrchen fließen. Zusätzliches Zusammenpressen der Kugel kann erforderlich sein, um möglichst viel von der Tränenprobe aus dem Mikrokapillarröhrchen zu entfernen.
   2. Schließen Sie die Kappe des Mikrozentrifugenrohrs, um Verdunstung zu verhindern.
   3. Drehen Sie das Rohr mit einer Mikrozentrifugenanlage auf der Werkbank bei 2.000 × g für 3–5 Sekunden, sodass die Probe vor der Lagerung am Boden des Rohrs bleibt.
   4. Vor der Analyse bei -80 °C lagern, um die Analytstabilität zu erhalten.

2. Testosterontest

1. Erstelle Testosteron-Standards, folge dem Protokoll
   1. Befolgen Sie das Kit-Protokoll, stellen Sie sicher, dass Reagenzien und Geräte zur Erstellung von Testosteron-Standards, Kontrollen und Proben verfügbar sind.
   2. Rekonstituiert das Testosteron standardmäßig mit deionisiertem oder destilliertem Wasser, um eine Grundstückslösung von 100 ng/mL zu erhalten. Sorgen Sie für eine vollständige Wiederherstellung und lassen Sie es mindestens 15 Minuten stehen.
   3. Bereiten Sie am Tag des Experimentierens einen Testosteronstandard vor.
   4. Bereiten Sie 6 Mikrozentrifugenröhren für den Standard vor, wobei 900 μL Kalibratorverdünner in das 10 ng/mL Rohr und 400 μL in die übrigen Röhren eingegeben werden.
   5. Pipettiere 100 μL Grundlösung in das erste Rohr (10 ng/mL Rohr), vermische gründlich und wechsle die Pipettenspitze für den nächsten Transfer.
   6. Pipettieren Sie 200 μL des ersten Rohrs (10 ng/mL Tube) in das nächste Rohr (3,33 ng/mL), vermischen Sie gründlich, wechseln Sie die Pipettenspitze für den nächsten Transfer und wiederholen Sie den Schritt bis zum letzten Rohr (0,041 ng/mL).
   7. Hinweis: Nach Abschluss aller Schritte sollte es 7 Schwerpunkte von Standards geben. Der Kalibratorverdünner dient als Nullstandard (0 ng/mL). Jeder vorbereitete Standard reicht mehr als ausreichend für zwei Replikationen.
2. Vorbereitung auf Testosteronkontrollen: Niedrige, mittlere und hohe Konzentration
   1. Jedes Fläschchen mit dem im Analysezertifikat (COA) des Kontrollsets angegebenen Volumen deionisierten oder destillierten Wassers neu zusammenstellen
   2. Verdünnen Sie jede Kontrolle vor der Verwendung im Assay zweifach im Kalibratorverdünner
3. Bereite Proben vor
   1. Entferne Tränenproben bei -80 °C und lege sie zum Auftauen auf Eis.
   2. Sobald die Proben vollständig aufgetaut sind, zentrifugieren Sie die Tränenproben kurz, um sicherzustellen, dass alle Proben 3–5 Sekunden lang bei Raumtemperatur am Boden der Röhren liegen.
   3. Mischen Sie 20 μL Probe mit 80 μL Kalibratorverdünner, um ein Gesamtvolumen von 100 μL pro Replikat zu erhalten.
   4. Planen Sie zwei Replikate für das Experiment zur Zuverlässigkeit und unspezifische Bindungswellen (NSB) für die Hintergrundkontrolle.
   5. Hinweis: Jede Probe wird in doppelten Bohrlöchern analysiert. Daher sind pro Teilnehmer 40 μL Tränenprobe erforderlich, um den Test durchzuführen, wobei mit 160 μL Kalibratorverdünner gemischt wird, um ein Gesamtvolumen von 200 μL zu erhalten.
4. Prüfverfahren
   1. Bereiten Sie alle Reagenzien, Arbeitsstandards, Rissproben und Kontrollen vor.
   2. Entferne die überschüssigen Bohrlöcher aus dem Mikroplattenrahmen und setze sie bei 4 °C in die Trockenmittelverpackung zurück.
   3. Fügen Sie jedem Bohrloch 50 μL Primärantikörperlösung (blau gefärbt) hinzu, ohne für NSB-Bohrungen vorgesehene Bohrlöcher. Decken Sie die Platte mit Alufolie ab.
   4. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 1 Stunde auf einem horizontalen orbitalen Mikroplattenschüttler (0,12" Umlaufbahn), der auf 500 ± 50 U/min oder auf der nächstgelegenen verfügbaren Einstellung eingestellt ist.
   5. Bereite einen ausreichenden Waschpuffer für insgesamt 8 Waschgänge vor, 400 μL/Brunnen/Waschgang (4 Waschgänge vor und 4 Waschgänge nach dem 3-Stunden-Inkubationsschritt).
   6. Saugen Sie den Inhalt jedes Brunnens ab und waschen Sie die Platte viermal mit einem Waschpuffer.
   7. Fügen Sie 100 μL Kalibratorverdünner zu den NSB-Bohrlöchern hinzu und null Standardbohrungen.
   8. Fügen Sie 100 μL Standard-, Kontroll- und vorbereitete Tear-Proben zu den vorgesehenen Bohrlöchern hinzu.
   9. Gib 50 μL des Testosteronkonjugates zu jedem Brunnen und vermische gründlich durch Pipetten.
   10. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur 3 Stunden auf einem horizontalen orbitalen Mikroplattenschüttler (0,12"-Umlaufbahn), eingestellt auf 500 ± 50 U/min oder auf der nächstgelegenen verfügbaren Einstellung.
   11. Jeden Mal absaugen und viermal mit einem Waschpuffer waschen.
   12. Bereiten Sie die Substratlösung unmittelbar vor der Anwendung vor, indem Sie Farbreagenz A und Farbreagenz B im Verhältnis 1:1 mischen. Teile pro Bohrloch 200 μL zu. Vollständige Aspiration des restlichen Waschpuffers vor dem Hinzufügen des Substrats.
   13. Fügen Sie innerhalb von 15 Minuten nach der Vorbereitung 200 μL Substratlösung zu jedem Brunnen hinzu. Inkubiere 30 Minuten bei Zimmertemperatur auf der Arbeitsplatte. Schützen Sie vor Licht, indem Sie sie mit Alufolie abdecken.
   14. Gib 50 μL Stoplösung in jede Mulde in derselben Reihenfolge wie die Substratlösung hinzu. Rühren Sie sie gründlich und die Farbe sollte sich von Blau zu Gelb ändern.
   15. Messen Sie die optische Dichte bei 450 nm und 560 nm innerhalb von 30 Minuten nach dem Hinzufügen der Stop-Lösung mit einem Mikroplattenleser.
   16. Hinweis: Die Herstelleranweisung empfiehlt eine Referenzwellenlänge von 540 nm oder 570 nm. In diesem Protokoll wurde eine Wellenlänge von 560 nm als nächstmögliche Option am Mikroplattenleser verwendet, um Hintergrundsignalkorrektur und optische Unvollkommenheiten zu gewährleisten.
5. Berechnung
   1. Subtrahiert die bei 560 nm (Referenzwellenlänge) gemisse optische Dichte von der optischen Dichte bei 450 nm.
   2. Subtrahieren Sie die mittlere NSB-Optische Dichte von jeder einzelnen Messung von Standards, Proben und Kontrollen und berechnen Sie dann den Durchschnitt der doppelten Messungen.
   3. Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie die Daten mit einem vier-Parameter-logistischen (4PL)-Modell anpassen.
   4. Bestimmen Sie die Testosteronkonzentrationen, indem Sie Probenwerte aus der Standardkurve interpolieren.
   5. Passen Sie die berechneten Konzentrationen an, indem Sie einen Verdünnungsfaktor von 5 anwenden, um die 1:5-Probenverdünnung zu berücksichtigen.
   6. Verifizieren Sie die Messung durch Berechnung des Variationskoeffizienten (CV) zwischen Replikaten, der 20 % nicht überschreiten darf.
      1. Hinweis: %CV = (SD/Mittelwert) × 100

3. Estradiol-Assay

1. Bereite Estradiolstandards, Kontrollen und Proben vor
   1. Befolgen Sie das Kit-Protokoll, stellen Sie sicher, dass Reagenzien und Ausrüstung zur Vorbereitung von Normen, Kontrollen und Proben zur Verfügung stehen.
   2. Lassen Sie alle Reagenzien und Materialien vor der Verwendung Raumtemperatur erreichen.
   3. Bereiten Sie am Tag des Experiments frisches Reagenz vor.
   4. Standards und Steuerung sind einsatzbereit. Aliquot nur die Menge, die für den aktuellen Test erforderlich ist, um die Verunreinigung zu minimieren und wiederholte Temperaturschwankungen während der Handhabung zu begrenzen.
   5. Stellen Sie sicher, dass sechs Standards (Nr. 0–5) erstellt werden, wobei Standard 0 0 pg/ml darstellt, und eine Kontrollprobe mit dem Kit einfügt.
   6. Tauen Sie die gefrorenen Proben ab -80 °C auf, indem Sie sie auf Eis legen.
   7. Drehen Sie die Tearproben herunter, um sicherzustellen, dass alle Proben am Boden des Röhrchens liegen.
2. Prüfverfahren
   1. Entfernen Sie die überschüssigen Bohrungen aus der Mikroplatte und legen Sie sie bei 4 °C in die Trockenmittelverpackung zurück.
   2. Fügen Sie 20 μL Standards, Kontrollen und Proben in die Bohrungen hinzu.
   3. Hinweis: Jeder Standard und jede Probe sollte mit 2 Replikaten geprüft werden.
   4. Um eine homogene Verteilung zu gewährleisten, mischen Sie alle Standards, Kontrollen und Proben unmittelbar vor dem Pipettieren in die Brunnen gründlich.
   5. Fügen Sie 160 μL 17-Beta-Estradiol-HRP-Konjugat in die Testbohrungen hinzu.
   6. Lass einen leeren Brunnen für das Substrat leer.
   7. Decken Sie den Brunnen vor dem Einlegen in den Inkubator mit Alufolie ab. Die Lösung in den Brunnen kann zur Alufolie verdunsten.
   8. Inkubieren Sie bei 37 °C für 2 Stunden.
   9. Bereite während der Inkubationszeit einen Waschpuffer aus 10-facher Waschlösung vor.
   10. Nach Abschluss der Inkubation wird die Alufolie entfernt und die Flüssigkeit aus den Bohrlöchern aspiriert.
   11. Wasche jeden Brunnen dreimal mit Wash Buffer. In jedem Waschgang > 5 Sekunden einweichen.
   12. Gib 100 μL TMB-Substratlösung in alle Brunnen.
   13. Decke den ganzen Teller mit Alufolie ab und brüte genau 30 Minuten bei Raumtemperatur.
   14. Fügen Sie 100 μL Stop-Lösung in alle Brunnen in derselben Reihenfolge und mit derselben Rate wie die zuvor hinzugefügte TMB-Substratlösung hinzu.
   15. Schüttelt man die Mikroplatte sanft, verändert sich das Reagenz von Blau zu Gelb.
   16. Messen Sie die Absorption bei 450 nm innerhalb von 30 Minuten nach dem Zufügen der Stop-Lösung.
3. Berechnung
   1. Subtrahieren Sie die Absorption des Blankwells von den Messwerten aller Standards, Proben und Steuerungen, um Hintergrundsignale und optische Unvollkommenheiten zu korrigieren.
   2. Berechnen Sie den Durchschnitt der doppelten Messungen.
   3. Erzeugen Sie eine Bestfit-Standardkurve unter Verwendung einer Vier-Parameter-Logistik (4PL).
   4. Bestimmen Sie die Estradiolkonzentration durch Interpolation von Probenwerten aus der Standardkurve...
   5. Verifizieren Sie die Messung durch Berechnung des Variationskoeffizienten (CV) zwischen Replikaten, der 20 % nicht überschreiten darf.
      1. Hinweis: %CV = (SD/Mittelwert) × 100.

4. Datenanalyse mit R und RStudio

1. Installieren Sie R und RStudio und installieren Sie die erforderlichen Pakete, die in der Materialübersicht aufgeführt sind, bevor Sie die Datenanalyse durchführen.
2. Importieren Sie optische Dichtemessungen für Standards, Kontrollen und Proben in die Analysesoftware.
3. Die Daten werden vorverarbeitet, indem eine Wellenlängenkorrektur wie im Assay angegeben angewendet wird. Dann subtrahiert man leere oder NSB-Werte und berechnet den Durchschnitt der doppelten Messungen.
4. Passen Sie eine Standardkurve mit einem logistischen (4PL)-Regressionsmodell mit vier Parametern an, wobei Konzentration die unabhängige Variable und die optische Dichte die Antwortvariable ist.
5. Führen Sie Kurvenanpassung in R mit der drm()-Funktion aus dem drc-Paket durch, wobei das Modell als fct = LL.4() für die 4PL-Regression angegeben ist, wobei Konzentrations- und optische Dichtedaten als Eingabe dienen.
6. Verifizieren Sie die Qualität der Kurvenanpassung (z. B. R² > 0,99 oder akzeptable Goodness-of-Passing), bevor Sie die Probenkonzentrationen interpretieren.
7. Berechnen Sie die Hormonkonzentrationen durch inverse Vorhersage mittels der ED()-Funktion basierend auf der angepassten Standardkurve, wobei die effektive Dosis entsprechend den optischen Dichtewerten der Probe anhand des angepassten Modells angegeben wird.
8. Stellen Sie die berechneten Konzentrationen an, indem Sie den entsprechenden Verdünnungsfaktor anwenden (z. B. ×5 für eine 1:5-Verdünnung).
9. Berichte die endgültigen Hormonkonzentrationen in den entsprechenden Einheiten (z. B. ng/mL oder pg/mL), stellen Sie die Konsistenz mit der Standardkurve sicher, und exportieren Sie die verarbeiteten Daten zur weiteren Analyse oder Visualisierung.

Ergebnisse

Pilot-Tear-Filmstudie

Insgesamt wurden 20 Frauen (45–63 Jahre alt) in diese Studie eingeschlossen. Die DED-Klassifizierung basierte auf Symptomen und mindestens einem klinischen Anzeichen von DED. Konkret hatten alle DED-Teilnehmer einen Ocular Surface Disease Index (OSDI)-Wert > 12 und mindestens ein Auge mit entweder einer Fluorescein-Tränenbruchzeit (TBUT) von < 5 Sekunden oder einem Hornhaut-Fluorescein-Färbungswert (CFSS) von > 3 (NEI-Ska...

Diskussion

Tränenentnahme und -analyse ermöglichen einen einfachen Zugang zur wissenschaftlichen Beurteilung der Augenoberflächengesundheit und zur Identifizierung potenzieller Biomarker^10,22. Unser Protokoll beschreibt die erfolgreiche Anpassung häufig verwendeter ELISA-Methoden zur Analyse von Tränenfilmproben auf Sexualhormone. Wir entwickelten diese Methode, um die primäre Einschränkung der Rissenanalyse zu beheben, nämlich das relativ ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
17 beta Estradiol ELISA Kit	Abcam	ab108667
Aluminiumfolie	Reynolds Wrap	10900000154	Jede verfügbare Aluminiumfolie für die Küche zum Schutz von Reagenzien vor Licht
Mikrokapillarrohr 3,33 µL	Drummond	1-000-0033	Inklusive Quetschperle für Flüssigkeitstransfer
Mikrokapillarrohr 5 µL	Drummond	1-000-0050	Inklusive Quetschperle für Flüssigkeitstransfer
Mikrozentrifugegerät	Benchmark Scientific	C1012
Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL	Fisher	05-408-129
Mikroplatten-Reader	Promega	GM3000
Orbitaler Mikroplatten-Shaker	Labnet International Inc.	S2030-1000-B
R Programmiersprache	Posit Software, PBC (ehemals RStudio Inc.)	R Version 4.5.1	Laden Sie die R-Sprache vor Rstudio über https://cran.r-project.org/ herunter
RStudio Software	Posit Software, PBC (ehemals RStudio Inc.)	RStudio 2023.06.1 Build 524 „Mountain Hydrangea“	https://posit.co/downloads/
R-Pakete „drc“, „ggplot2“, „patchwork“, „ggpp“, „dplyr“, „readr“, „tidyr“, „writexl“	Posit Software, PBC (ehemals RStudio Inc.)		Installieren Sie das Paket in Rstudio
Testosteron-Kontrollkit	R&D Parameter	QC165	Getrennt vom ELISA-Kit (KGE010) erhältlich
Testosteron-ELISA-Kit	R&D Parameter	KGE010