Ein umfassendes Rattenmodell zur Bewertung von Lebertransportwegen durch gleichzeitige lymphatische und blutgefäßige Probenahme

Zusammenfassung

Dieses experimentelle Protokoll beschreibt ein hepatisches Lymphkanal-Rattenmodell, das eine direkte und quantitative Beurteilung des lebhaften lymphatischen und vaskulären Abflusses ermöglicht. Das Modell ermöglicht die gleichzeitige Probenahme von hepatischer Lymphe und systemischem Blut, um den Lebertransport, den Stoffwechsel und die Immunsignalübertragung zu untersuchen und so Studien zur Pharmakokinetik und der leberspezifischen Biologie zu unterstützen.

Zusammenfassung

Die Leber ist ein zentrales metabolisches und immunologisches Zentrum, das Nährstoffe, Xenobiotika und zirkulierende Immunmediatoren verarbeitet. Substanzen erreichen die Hepatozyten und andere Leberzellen über die sinusförmigen Kapillaren, die Blut aus dem Darm über die Pfortvene und aus dem systemischen Kreislauf über die Leberarterie aufnehmen. Das Plasmafiltrat aus den sinusförmigen Kapillaren fließt in den Raum von Disse, wo es sich metabolisch umwandeln, an der Immunüberwachung teilnehmen oder in lymphatische Gefäße fließen kann, um hepatische Lymphe zu bilden. Die Entnahme von Leberlymphe und Blut kann eine detaillierte Analyse des Lebertransports, der Stoffwechselprozesse und der Immunaktivität ermöglichen. Ein chirurgisches Rattenmodell, das eine gleichzeitige Probenahme von Leberlymphabfluss und systemischem Blut durch drei verschiedene Kanulationsstellen ermöglicht, wird beschrieben: Leber-Lymphgang, Halsschlagader und Halsvene. Hepatische Lymph- und arterielle Kanülen ermöglichen eine kontinuierliche Probenahme, während die Jugularvenenkanüle zur kontinuierlichen Hydratation und Flüssigkeitsunterstützung oder zur venösen Blutentnahme verwendet werden kann, was einen Vergleich zwischen arteriellem und venösem Blut ermöglicht. Eine erfolgreiche Kanüle führt zu lebhaften Lymphflussraten von etwa 0,1 mL/h bei anästhesierten Ratten, was eine kontinuierliche Lymphentnahme von bis zu 8 Stunden ermöglicht, während gleichzeitig arterielle und venöse Blutproben durchgeführt werden. Dieses System ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen systemischem arteriellem Blut und dem lymphatischen Ausfluss der Leber, was eine umfassende Untersuchung des Lebertransports und der Clearance sowie der metabolischen und immunen Signalwege ermöglicht. Um das Modell weiter zu erweitern, kann am Ende des Eingriffs eine terminale Probenahme der Leberarterie und der Pfortvene durchgeführt werden, um einen direkten Vergleich von Leberzufluss, -abfluss und Lymphdrainage zu ermöglichen. Letztlich bieten diese Techniken eine vielseitige Plattform zur Bewertung lebberischer Prozesse, einschließlich Pharmakokinetik der Arzneimittel, Nährstofffluss und -stoffwechsel sowie leberspezifische Reaktionen unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen.

Einleitung

Die Leber ist ein zentrales metabolisches und immunologisches Organ, das für die Nährstoffverarbeitung, xenobiotische Entgiftung und Immunüberwachung verantwortlich ist. Die Leber ist das größte lymphproduzierende Organ im Körper. Studien an großen Säugetieren legen nahe, dass sie 25–50 % des gesamten Lymphflusses ^1,2 ausmacht. Bei Nagetieren zeigen Kanulationsuntersuchungen, dass etwa 10–20 % des gesamten thorakalen Lymphflusses aus der Leber ^3,4 stammen. Hepatische Lymphe entsteht aus Plasma, das über das fenestrierte Endothel der sinusförmigen Kapillaren im Leberparenchym gefiltert wird. Dieses Filtrat sammelt sich im Raum von Disse, einem interstitiellen Kompartiment zwischen Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen. Das Filtrat durchquert dann den Raum von Mall in portale lymphatische Kapillaren, die sich zu Sammelgefäßen versammeln, die zum hepatischen Hilum und Cisterna Chyli ^5,6 abfließen.

Das hepatische lymphatische System ist anatomisch in portale, subkapsulare und sublobulare Netzwerke^{unterteilt 6,7}. Jüngste volumetrische Bildgebungsstudien zeigen, dass hepatische Lymphatics ein stark verzweigtes Netzwerk bilden, abhängig vom Vaskcular Endothelial Growth Factor C (VEGF-C), das größtenteils auf die Portalbahnen beschränkt ist. Dieses Netzwerk besteht überwiegend aus lymphatischen Kapillaren, die rückwärts zur Pfortvene abfließen. Andererseits sind die subkapsularen und sublobulären Lymphatika, die entlang der Leberoberfläche bzw. in den zentralen Venenregionen verteilt sind, zusätzliche Entwässerungswege. Die humane postmortale Bildgebung hat zudem ein dichtes lymphatisches Gefäßnetzwerk entlang der Lebervenen gezeigt, was darauf hindeutet, dass periportale und hepatische venöse Lymphatika gemeinsam den Leberlymphabfluss^regulieren.

Die hepatische Lymphe stellt ein plasmaabgeleitetes Ultrafiltrat dar, das sowohl metabolische als auch immune Prozesse^{widerspiegelt 9,10}. Biochemische Analysen zeigen, dass hepatische Lymphe Albumin, Lipoproteine, Zytokine und Metaboliten enthält, die aus der hepatischen Parenchymalaktivität ^3,4,6 abgeleitet sind, was mit dem allgemeinen proteomischen Profil der Lymphflüssigkeit in anderen Geweben übereinstimmt¹⁰. Frühe Studien zeigten, dass die hepatische Lymphe unterschiedliche Lipoproteinklassen enthält, wobei High-Density-Lipoproteine (HDL) eine dominante Fraktion darstellen, was mit der zentralen Rolle der Leber bei der HDL-Synthese und -Remodellierung¹¹ übereinstimmt. Bemerkenswert ist, dass neuere Arbeiten gezeigt haben, dass die hepatische Lymphe im Vergleich zur mesenterikalen Lymphe mit HDL- und Cholesterinestern angereichert ist, was ihren deutlichen Beitrag zum Lipidtransport und zum umgekehrten Cholesterintransport^hervorhebt. Darüber hinaus dient die hepatische Lymphe als immunologischer Kanal, der Immunmediatoren, antigenpräsentierende Zellen und extrazelluläre Vesikel transportiert, die hepatische Mikroumgebungen mit der systemischen Immunität^{verbinden 9}.

Veränderungen in der Leberlymphbildung und -drainage sind zentrale Merkmale der Lebererkrankung. Bei Zirrhose und portaler Hypertonie führt erhöhter sinusförmiger Druck zu einer mehrfachen Erhöhung der Lymphproduktion, was zu Lymphangiektasie, Fibrose und Aszites führt, sobald die Drainagekapazität überschritten wird. Chronische Leberschäden fördern zudem die VIGF-C/VEGFR-3-abhängige Lymphangiogenese, wobei übermäßige oder abweichende lymphatische Umstrukturierung zu Leberentzündung, Ödem und Lipidansammlung^{beiträgt 9,12}. Darüber hinaus wurde bei metabolischer Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung (MASLD) und hepatozellulärem Karzinom eine erhöhte lymphatische Dichte der Leberfunktion mit dem Krankheitsverlauf und der Metastasierung korreliert^13,14.

Trotz der zentralen physiologischen und klinischen Rolle der Leberlymphe bleibt sie in experimenteller Forschung wenig erforscht und wenig erforscht, hauptsächlich aufgrund technischer Herausforderungen bei der Isolierung reiner hepatischer Lymphe. Thorakale und mesenterische Lymphsammlungsmodelle wurden häufiger beschrieben, bieten jedoch nur indirekte Einblicke in hepatische Transportmechanismen. Eine Einschränkung auf diesem Gebiet wurde durch die Entwicklung eines Ratten-Leberlymphkanülmodells behoben, das eine direkte Sammlung von Leberlymphe⁴ ermöglichte. Mit diesem Ansatz wurde gezeigt, dass die meiste lymphatische Aufnahme intravenös verabreichter therapeutischer Proteine in Leber und Mesenterium stattfindet. Diese Erkenntnisse heben die hepatische Lymphe als einen Schlüsselweg für den makromolekularen Austausch zwischen Blut und Lymphsystem hervor, mit wichtigen Auswirkungen auf die Pharmakokinetik und die Verteilung biologischer Therapeutika⁴.

Um verbleibende Lücken zu überbrücken, beschreibt die vorliegende Studie ein umfassendes Rattenmodell, das eine gleichzeitige Probenahme von Leberlymphe und systemischem Blut mittels Kanüle des Leberlymphkanals, der Halsschlagader und der Halsvene ermöglicht. Dieser Ansatz ermöglicht eine Echtzeitbewertung des Stofftransports über und des Austauschs zwischen den interstitialen und systemischen Kompartimenten der Leberstoffe und bietet eine robuste experimentelle Basis zur Untersuchung des Lebertransports, des Stoffwechsels, der Immunsignalgebung und der Arzneimittelverteilung unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Das Modell umfasst außerdem eine optionale terminale Probenahme der Leberarterie und der Portvene, um einen direkten Vergleich von Leberzufluss, -abfluss und Lymphdrainage zu ermöglichen.

Abbildung 1. Schematisch des Mehrfachkanülisierungsmodells für gleichzeitige lymphatische und Blutprobennahme. Ein umfassendes Kanulationsmodell, das gleichzeitige Probenahmen aus der Halsschlagader, der Halsvene, der Leberarterie, dem Leber-Lymphgang und der Pfortvene zeigt. (A) Die Halsschlagader wird für intermittierende Blutproben kanüliert. (B) Die äußere Jugularvene wird für eine kontinuierliche Kochsalzinfusion kanuliert, um die Hydratation zu erhalten und Flüssigkeitsverlust während der Probenahme auszugleichen. (C) Die gemeinsame Leberarterie, die parallel zum Leberlymphkanal verläuft, wird für eine Endblutentnahme kanüliert. (D) Der hepatische Lymphgang wird für eine kontinuierliche Lymphentnahme kanüliert. (E) Die Pfortader wird durch Nadelstich für eine terminale Blutprobe erreicht. Die in (A), (B) und (D) gezeigten Verfahren werden vor der Endprobe durchgeführt, gefolgt von (C) Leberarterienproben und anschließend (E) Portvenenproben. Abkürzungen: EJV, externe Jugularvene; CA, Halsschlagader; SVC, obere Vena cava; IVC, untere Vena cava; Ao, Aorta; CHA, gewöhnliche Leberarterie; HL, Leber-Lymphgang; ML, mesenteriale Lymphgänge; SMA, arterie superior mesentericus; PV, Torader. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren mit Tieren wurden vom Animal Ethics Committee des Monash Institute of Pharmaceutical Sciences überprüft und genehmigt (Ethics ID #46283) und wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien des Australian and New Zealand Council for the Care of Animals in Research and Teaching (ANZCCART) sowie dem Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (National Health and Medical Research Council, Australien)¹⁵.

Tiermodelle: Männliche oder weibliche ausgezüchtete Albino-Rattus norvegicus oder Sprague–Dawley (SD) Ratten mit einem Gewicht von 250–350 g wurden verwendet. Die Tiere wurden von lizenzierten Lieferanten von Labortieren (Monash Animal Research Platform) bezogen und in einzeln belüfteten Käfigen unter kontrollierter Temperatur (22 ± 2 °C) und einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus untergebracht, mit freiem Zugang zu Futter und Wasser vor den Experimenten. Die Tiere wurden mindestens eine Woche vor der Operation akklimatisiert, um stressbedingte physiologische Unterschiede zu minimieren.

Ein Modell der Leber-Lymphgang-, Halsschlagader- und Jugularvenen-Kultäter-Modelle, das eine gleichzeitige Entnahme von Leberlymphe und systemischem Blut ermöglicht, wird beschrieben. Eine optionale terminale Probenahme der Leberarterie und der Pfortvene kann unter Anästhesie zur vergleichenden Analyse des Lebereinflusses und des lymphatischen Ausflusses durchgeführt werden. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitungen am Tag vor der Operation

1. Befestigen Sie die Ratte über Nacht, falls dies für das spezifische experimentelle Protokoll erforderlich ist. Sorgen Sie jederzeit für freien Zugang zu Wasser.
2. Bereiten Sie sterile Kochsalzlösung für eine intravenöse Infusion während der Lymphentnahme vor. Bestimmen Sie das erforderliche Volumen basierend auf der Entnahmezeit (typischerweise 3–5 Stunden) und einer empfohlenen Infusionsrate von 1,5–3,0 mL/h, um Flüssigkeitsverlust durch Lymph- und Blutabnahme sowie physiologische Verluste wie Urinausscheidung auszugleichen.
3. Bereiten Sie drei Polyethylenkanülen für den Leber-Lymphgang, die Halsschlagader und die Halsvenen-Kanüle wie folgt vor:
   1. Leber-Lymphgang
      1. Schneiden Sie eine Kanüle mit 0,8 mm Außendurchmesser (O.D.) und 0,5 mm Innendurchmesser (I.D.) auf 30–35 cm. Stellen Sie sicher, dass die Länge das Sammeln ohne Spannung ermöglicht.
      2. Schrägen Sie die Einführungsspitze etwa um 45° mit einer sterilen chirurgischen Klinge, um das Einsetzen zu erleichtern.
   2. Halsschlagader
      1. Schneiden Sie eine 0,8 mm O.D., 0,5 mm I.D.-Kanüle auf 20–30 cm durch. Markieren Sie etwa 2–2,5 cm vom Innenende, um die Einsatztiefe anzuzeigen.
   3. Jugularvene
      1. Schneiden Sie eine 0,8 mm O.D., 0,5 mm I.D. oder 0,96 mm O.D., 0,58 mm I.D.-Kanüle auf 50 cm oder länger. Markiere 1–1,5 cm vom inneren Ende für die Einstichtiefe. Stellen Sie sicher, dass die Länge die Infusionspumpe ohne Spannung erreichen kann.
4. Bereiten Sie eine Antikoagulanslösung vor, die entweder 0,1 % EDTA in sterilem Wasser oder 20 IU/mL Heparin in steriler Kochsalzlösung enthält.
5. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit einer Antikoagulanslösung und befestigen Sie eine 25-mm-Nadel an den 0,8-mm-O.D.-Kanülen oder eine 23g-Nadel an die 0,96-mm-O.D.-Kanülen.
6. Spülen Sie jede Kanüle mit etwa dem Dreifachen ihres inneren Volumens, wobei keine Luftblasen zurückbleiben.
7. Halten Sie die Kanülen über Nacht mit Antikoagulans gefüllt und mit der angeschlossenen Nadel und Spritze verstopft. Das Voreinweichen mit einem Antikoagulans minimiert die Gerinnungsbildung.
8. Bereite Sammelröhrchen für Blut und Lymphe vor. Fügen Sie eine Antikoagulanzlösung hinzu, um nach der Probenentnahme eine Endkonzentration von 1 mg/mL EDTA oder 10 IU/mL Heparin zu erreichen.

2. Vorbereitungen unmittelbar vor der Operation

1. Spülen Sie alle Kanülen mit einem Antikoagulans, um die Öffnung zu bestätigen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
2. Anästhesie in der Ratte mit 5 % Isofluran in Sauerstoff bei 1 L/min in einer Induktionskammer induzieren.
3. Überwachen Sie die Atmung und stellen Sie sicher, dass die Frequenz auf etwa 1,5 Atemzüge pro Sekunde (ca. 90 Atemzüge/min) gesunken ist, was auf eine ausreichende Anästhesietiefe hinweist.
   VORSICHT: Isofluran ist ein flüchtiges Anästhetikum und sollte in einem richtig belüfteten Anästhetikumsystem oder Abzugshaube verwendet werden, um die berufliche Exposition zu minimieren.
4. Übertragen Sie die Ratte auf eine beheizte OP-Platte (37 °C) und halten Sie die Anästhesie mit 1–3 % Isofluran in Sauerstoff, die mit 0,4–0,6 L/min über einen Nasenkegel abgegeben wird.
5. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe durch das Fehlen von Hornhaut- und Zehenkneifreflexen. Betäuben Sie die Narkose während des gesamten chirurgischen Eingriffs und der Lymphabnahme.
   HINWEIS: Kontinuierliche Anästhesie ist unerlässlich, um Schmerzen während der Operation zu vermeiden und ein Verrutschen der Kanüle durch Bewegung zu verhindern.
6. Chirurgische Bereiche rasieren, einschließlich des rechten Bauchquadranten (Mittellinie bis rechte Flanke, etwa 2 cm unterhalb des Rippenbogens) und des rechten oder linken Schlüsselbeinsbereichs.
7. Desinfizieren Sie alle chirurgischen Bereiche mit 0,5 % Chlorhexidin, gefolgt von 70 % Ethanol.

3. Kanulierung der Halsschlagader

HINWEIS: Die Karotisarterienkanulierung kann vor oder nach der Kanulation der Jugularvene durchgeführt werden.

1. Behalten Sie die gleiche dorsale Position und den Halsschnitt bei.
2. Legen Sie eine kleine Stütze (z. B. 3 ml Spritze) unter den Hals, um die Halsschlagader anzuheben.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist optional.
3. Trennen Sie die Halsmuskeln, um die Halsschlagader etwa 1 cm unter der Hautoberfläche freizulegen.
4. Isolieren Sie die Arterie mit einer gebogenen Iriszange. Identifizieren und trennen Sie vorsichtig den angrenzenden Vagusnerv, um Schäden am Nerv zu verhindern.
5. Legen Sie gerade Graefe-Pinzetten unter die Arterie, um den Blutfluss zu blockieren, und fädeln Sie zwei 4-0-Seidennähte darunter. Binden Sie die proximale (kraniale) Naht fest zu.
6. Mach einen kleinen Schnitt auf der Arterienoberfläche.
7. Heben Sie die Gefäßklappe vorsichtig mit der Spitze der Linsenzange an, um das Gefäßlumen für die Kanüleeinführung zu stabilisieren.
8. Setzen Sie die Kanüle in die vordefinierte 2–2,5 cm Tiefe ein. Erwarten Sie einen leichten Rückfluss; Bei übermäßigem Aufwand verschließen Sie erneut und reinigen, bevor Sie fortfahren.
   VORSICHT: Vaskuläre Einstiche und Kanüle sind mit scharfen Instrumenten verbunden und sollten vorsichtig durchgeführt werden, um Unfallverletzungen zu vermeiden.
9. Überprüfen Sie die korrekte Platzierung, indem Sie vorsichtig ein kleines Volumen Blut entnehmen und eine antikoagulante Lösung ohne Widerstand oder subkutane Schwellungen wieder in die Kanüle einbringen.
10. Sichern Sie die Kanüle mit Nähten und schließen Sie das äußere Ende mit einem Stopfen ab.
11. Der Eingriff kann kurz nach der Halsschlagader-Kanüle unterbrochen werden, während die Anästhesie aufrechterhalten wird.
12. Schließen Sie die Wunde am Hals mit sterilen Nähten. Ein Überblick über die Isolierung der Halsschlagader und die erfolgreiche Kanulierung der Halsschlagader ist in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2: Cannulation der Halsschlagader. (A) Die paarigen Halsmuskeln, die die Halsschlagader flankieren (orangefarbene Pfeile). Die Speicheldrüse (blaue Pfeile) ist schädelförmig eingebogen. (B) Die freiliegende Halsschlagader befindet sich etwa 1 cm unter der Hautoberfläche. Die Speicheldrüse (blaue Pfeile) ist schädelförmig eingebogen. (C) Chirurgische Einrichtung vor dem Einsetzen der Kanüle, wobei eine Verschluss des Blutflusses mit geraden Graefe-Pinzetten und zwei Seidennähten zur Isolierung der Arterie mit abgeknüpftem oberen Ende gezeigt wird. (D) Etwa 2 cm der Kanüle werden erfolgreich in die Halsschlagader eingeführt (gelbe Pfeile). Die Karotisarterienkanüle wird durch die grünen Pfeile angezeigt. (E) Die erfolgreiche Kanulierung der Halsschlagader wurde durch das Abnehmen von Blut in die Kanüle bestätigt. (F) Drei Nähte (Größe 4-0) sind um die Halsschlagader und Kanüle zur Sicherung gebunden (violette Pfeile). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Kanüle der Halsvene

1. Positioniere die Ratte in dorsaler Rückenlehnung mit ausgestrecktem Hals und leicht nach links gedrehtem Kopf.
2. Identifizieren Sie die Vene Jugularis oberhalb des Schlüsselbeins anhand ihrer Lage und sichtbaren Durchblutungs. Machen Sie einen 1–1,5 cm langen schrägen Schnitt vom Schlüsselbein zur Luftröhre.
3. Sezieren Sie das subkutane Gewebe stumpf, um die Vene freizulegen.
4. Trennen Sie die Vene von dem umgebenden Bindegewebe mit einer gebogenen Iriszange. Überprüfen Sie die Isolation, indem Sie die Pinzette unter die Vene führen.
5. Setzen Sie an jedem Ende des freiliegenden Segments zwei 4-0 Seidennähte unter die Vene. Binden Sie die Schädelnaht (obere Naht) fest, um den Blutfluss zu blockieren.
6. Um den Rückfluss zu verhindern, legen Sie gerade Graefe-Zangen unter die Vene und legen Sie die Griffe auf eine Spritze oder eine Stütze.
7. Machen Sie einen kleinen (~1 mm) Schnitt auf der Oberseite der Vene, ein Drittel entlang des isolierten Segments mit einer Irisschere.
8. Heben Sie die Gefäßklappe vorsichtig mit der Spitze der Linsenzange an, um das Gefäßlumen für die Kanüleeinführung zu stabilisieren.
9. Führen Sie die Kanülespitze mit einer Iriszangelei in den Schnitt ein und schieben Sie sie auf die vorab markierte Tiefe (1–1,5 cm) vor.
10. Lösen Sie die Verschlusskapsel, sobald die Kanüle stabilisiert ist, um den Blutfluss zu ermöglichen.
    HINWEIS: Halten Sie einen stabilen Griff, um einen venösen Rückfluss zu verhindern. Wenn eine Blutung auftritt, verschließen Sie sofort wieder und reinigen Sie das Feld, bevor Sie fortfahren.
11. Überprüfen Sie die korrekte Platzierung, indem Sie vorsichtig ein kleines Volumen Blut entnehmen und eine antikoagulante Lösung ohne Widerstand oder subkutane Schwellungen wieder in die Kanüle einbringen.
12. Sichern Sie die Kanüle mit Nähten sowohl am proximalen als auch am distalen Ende.
13. Verschließen Sie vorübergehend den äußeren Schlauch, entfernen Sie die Spritze und schließen Sie die Kanüle mit einem Stopfen ab.
14. Decken Sie den Schnitt mit Mull ab, die mit warmer Kochsalzlösung befeuchtet wird, bis die Karotisarterien-Kanüle vollständig ist. Repräsentative Bilder der Isolierung und Kanulation der Jugularvene sind in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 3: Kanulation der Jugularvene. (A) Die Vene der Halsschlagader (schwarz gepunkteter Kontur) befindet sich direkt unter der Haut oberhalb des Schlüsselbeins. Die etablierte Karotisarterienkanüle kann in der Nähe der Jugularvene (grüne Pfeile) beobachtet werden. (B) Die Vena Jugularis wird mit zwei Seidennähten isoliert; das obere Ende wird abgeknüpft. (C) Etwa 1 cm der Kanüle wird erfolgreich in die Jugularvene eingeführt (gelbe Pfeile). Die Venenkanüle der Drosselvene wird durch die blauen Pfeile angezeigt; Die Karotisarterienkanüle wird durch die grünen Pfeile angezeigt. (D) Drei Nähte (Größe 4-0) werden um die Halsvene und Kanüle zur Sicherung gebunden (violette Pfeile). Erfolgreiche Kanulation der Jugularvene bestätigt durch glatte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

5. Kanüle des Leber-Lymphkanals

1. Positioniere die Ratte in dorsaler Liegende unter einem chirurgischen Mikroskop.
2. Machen Sie einen 4–5 cm langen horizontalen Hautschnitt von der Mittellinie bis zur rechten Flanke, etwa 1,5–2 cm unterhalb des Brustkorbs (Abbildung 4A, B).
3. Ziehe die Haut zurück und mache passende Schnitte in den äußeren und inneren schrägen Bauchmuskeln.
4. Kauterisiere oder ligiere alle großen Blutgefäße, um übermäßigen Blutverlust zu verhindern.
5. Organe werden vorsichtig mit salzhaltigen Wattestäbchen neu positioniert: Die Leber zum Zwerchfell, den Magen nach links und den Dünndarm nach unten bewegen.
6. Halten Sie die Organe mit salzlösunggetränkter Mullbinde zurückgezogen. Die Schnittstelle und die Organposition sind in Abbildung 4C dargestellt.
7. Identifizieren Sie den Leber-Lymphkanal (Durchmesser ~0,6 mm) anhand etablierter anatomischer Orientierungspunkte. Der Gang verläuft parallel zur und leicht kaudal zur Leberarterie, liegt medial zur rechten Niere und angrenzend an die untere Vena cava.
8. Beobachten Sie das Erscheinungsbild des Leber-Lymphkanals. Sie erscheint typischerweise durchsichtig und schmal.
9. Unterscheide den Leber-Lymphgang vom mesenterischen Lymphgang, der größer ist und aufgrund des Chylomikron-Gehalts meist undurchsichtig oder weiß erscheint. Der mesenterische Lymphkanal kann daher als anatomisches Orientierungszeichen dienen, um die Identifizierung des kranial gelegenen hepatischen Lymphkanals zu unterstützen.
10. Entfernen Sie das Bindegewebe, das über dem Lymphgang und der Höhlenvene liegt, mit einer geraden Graefe-Pinzette.
11. Schaffen Sie einen Durchgang unter der Höhlenvene, indem Sie gerade Graefe-Zangen durch das Fettbett unter der rechten Niere führen. Vorwärts, bis die Spitzen auf der gegenüberliegenden Seite unter der Vena cava parallel zum Leber-Lymphkanal herauskommen.
12. Greifen Sie das äußere Ende der vorbereiteten Kanüle mit der geraden Graefe-Zangelei und ziehen Sie sie durch den Tunnel, der unter der Vena cava entstanden ist, bis die Spitze auf der gegenüberliegenden Seite herauskommt.
13. Mit der Halsted-Mosquito-Hemostat-Zange biegen Sie die Spitze einer 25G-Nadel auf etwa 90°. Stechen Sie mit der gebogenen Nadel den Leber-Lymphgang auf der rechten Seite (am nächsten zum Operator).
    VORSICHT: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit scharfen Nadeln während einer Lymphkanalpunktion, um unbeabsichtigte Verletzungen zu vermeiden.
14. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle mit einer Antikoagulanslösung ohne Luftblasen gefüllt ist. Führen Sie das abgeschrägte Ende etwa 2 mm in den Kanal ein.
15. Beobachten Sie das äußere Ende der Kanüle für den Lymphfluss (~ 100 μL/h). Wenn kein Durchfluss festgestellt wird, stellen Sie die Kanüle ein oder setzen Sie sie wieder ein.
16. Sobald der Lymphfluss bestätigt ist, wird die Kanüle verstopft, bevor Sie einen kleinen Tropfen veterinärklebrigen Kleber auftragen, um die Einstichstelle zu sichern. Nach dem Trocknen überprüfen Sie den Lymphfluss durch den Schlauch.
17. Binde entfernen und Organe an ihre ursprünglichen Positionen zurückbringen.
18. Platzieren Sie das Sammelrohr mit der Antikoagulanslösung unter den Ausgang der Kanüle. Bestätigen Sie, dass die Lymphe tropfweise in den Eileiter fließt.
19. Schließen Sie die Bauchwand, indem Sie die inneren schrägen, äußeren schrägen und Hautschichten nacheinander nähen. Die Identifikation und erfolgreiche Kanüle des Leber-Lymphkanals sind in Abbildung 5 dargestellt.
    HINWEIS: Nach erfolgreicher Leber-Lymphkanalkanulation kann der Eingriff kurzzeitig unterbrochen werden, während Anästhesie und Flüssigkeitszufuhr aufrechterhalten werden, bevor mit der Lymphentnahme begonnen wird.

Abbildung 4: Exposition des Leber-Lymphkanals. (A) Anatomisches Orientierungszeichen, das 1,5–2 cm unterhalb des rechten Brustkorbs für den Schnitt anzeigt. (B) Schnitt durch Haut und Bauchmuskeln, wodurch die inneren Organe freigelegt werden. (C) Organe werden neu positioniert, um den Leber-Lymphkanal freizulegen. Die Leber ist zum Zwerchfell verlagert, der Magen links vom Tier, und der Dünndarm ist nach unten eingebettet. Der hepatische Lymphkanal befindet sich zwischen der Leberarterie (grüner Pfeil) und der Mesenterienarterie (blauer Pfeil). L: Leber; SI: Dünndarm; IVC: untere Vena cava; RK: rechte Niere. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Identifizierung und Kanulation des hepatischen Lymphkanals. (A) Die lymphatischen und arteriellen Strukturen können nach der Neupositionierung der Organe und vor der Entfernung des umliegenden Bindegewebes beobachtet werden. Die Leberarterie (grüne Pfeile) befindet sich kranial in Bezug auf den benachbarten Leber-Lymphkanal (gelbe Pfeile). Der mesenteriale Lymphkanal (violette Pfeile) befindet sich oberhalb der mesenterischen Arteria (schwarz gepunkteter Kontur). Diese Strukturen verlaufen senkrecht zur unteren Vena cava. IVC: untere Vena cava; RK: rechte Niere. (B) Der hepatische Lymphkanal (gelbe Pfeile) ist nach der Entfernung des umliegenden Bindegewebes deutlich sichtbar. Der hepatische Lymphkanal verläuft parallel zur Leberarterie (grün gepunkteter Umrand) und kraniell in Bezug auf den mesenterischen Lymphkanal (violette Pfeile) und die mesenterische Arteria (schwarz gepunktete Umrandung). (C) Die Kanüle (weiße Pfeile) wird über die kleine Punktion im Lymphgang (orange Pfeile) in den Leber-Lymphkanal (gelbe Pfeile) eingeführt. Der mesenteriale Lymphkanal (blaue Pfeile) ist sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

6. Postoperative Phase

1. Unmittelbar nach erfolgreicher Leber-Lymphkanulation wird die Rehydratation durch die Injektion steriler Kochsalzlösung mit 1,0–2,0 mL/h durch die Venenkanüle der Jugularvene eingeleitet.
2. Halten Sie die Infusion während der gesamten Lymphentnahme aufrecht. Alternativ kann die Rehydrierung über eine Magen- oder Duodenalkanüle erfolgen, sodass die Jugularvenenkanüle bei Bedarf für venöse Blutproben reserviert werden kann.
3. Halten Sie das Tier während der gesamten Entnahme unter Narkose auf einer erhitzten OP-Platte (37 °C).
4. Überwachen Sie während des gesamten Experiments die Atemfrequenz und die Anästhesietiefe, indem Sie Atemmuster und Reflexreaktionen beobachten, während die Isofluran-Anästhesie über einen Nasenkegel aufrechterhalten wird.
5. Die Hydration wurde durch kontinuierliche Kochsalzlösung (1,0–2,0 ml/h) über die Jugularvenenkanüle aufrechterhalten.
6. Um physiologische Störungen zu minimieren, wurde das vor der terminale Probenahme entnommene Gesamtvolumen des Blutes gemäß institutionellen Tierethikrichtlinien auf <10 % des geschätzten zirkulierenden Blutvolumens begrenzt.
7. Sammeln Sie die hepatische Lymphe kontinuierlich in antikoagulantenhaltige Röhren. Ersetzen Sie die Sammelröhrchen stündlich oder nach Bedarf.
8. Sammeln Sie arterielle Blutproben zu festgelegten Zeitpunkten:
   1. Verschließen Sie vorübergehend den äußeren Schlauch und befestigen Sie eine leere Spritze.
   2. Nehmen Sie Blut ab, bis der Schlauch gefüllt ist.
   3. Ersetzen Sie die Spritze durch eine neue für die Probenentnahme und entnehmen Sie zu jedem festgelegten Zeitpunkt etwa 100–200 μL arterielles Blut.
   4. Spülen Sie die Kanüle nach jeder Entnahme mit einer Antikoagulanslösung.
   5. Versiegeln Sie die Kanüle mit einem Stopfen.
9. Nach Abschluss der Probenentnahme wird entweder mit der Endentnahme der Leberarterie und der Pfortvene fortgeführt oder die Ratte human mit Natriumpentobarbiton (>100 mg/kg) über die Karotis- oder Halsspradelkanüle getötet.

7. Terminale Probenahme der Leberarterie und der Pfortvene

1. Nach Abschluss der Lymph- und Blutentnahme wird eine tiefe Anästhesie aufrechterhalten und eine stabile Atmung gewährleistet, bevor mit der terminalen vaskulären Probenahme fortgesetzt wird.
2. Öffnen Sie den Bauchschnitt vorsichtig wieder, um die obere Bauchhöhle freizulegen.
3. Ziehen Sie die Leber vorsichtig zum Zwerchfell, Magen nach links und Dünndarm zurück und verwenden Sie mit salzhaltiger Mullbinde, um den kanülierten Leber-Lymphgang freizulegen.
4. Identifizieren Sie die Leberarterie, die parallel und kaudal zum Leber-Lymphkanal verläuft.
   HINWEIS: Die Arterie wirkt kleiner und blasser als die Pfortvene und zeigt einen pulsierenderen Fluss.
5. Bereiten Sie eine 0,61 mm O.D., 0,28 mm I.D. Polyvinylkanüle vor, vorgefüllt mit einer Antikoagulantlösung und frei von Luftblasen.
6. Mit einer gebogenen Iris-Zange isolieren Sie ein kurzes Segment der Leberarterie und legen Sie eine 4-0-Seidennaht darunter.
7. Heben Sie die Arterie vorsichtig an und setzen Sie eine zweite Naht distal zur ersten. Binden Sie die distale Naht, um den Rückfluss zu kontrollieren, während die proximale Naht für spätere Schließung offen bleibt.
8. Mit einer feinspitzen Mikroschere wird ein kleiner querer Schnitt (etwa 0,5 mm) in der Arterienwand zwischen den Nähten gemacht.
9. Heben Sie die Gefäßklappe vorsichtig mit der Spitze der Dumont-Pinzette an, um das Gefäßlumen für die Kanüleneinführung zu stabilisieren.
10. Stecken Sie das abgeschrägte Ende der Polyvinylkanüle in die Öffnung ein und schieben Sie etwa 2–3 mm vor.
11. Sichern Sie die Kanüle, indem Sie die proximale Naht sowohl um das Gefäß als auch die Kanüle binden.
12. Überprüfen Sie die korrekte Platzierung, indem Sie den pulsierenden Blutfluss in die Kanüle beobachten oder eine kleine Menge leuchtend rotes arterielles Blut vorsichtig aspirieren.
13. Sammeln Sie 0,5–1 ml Blut in ein voretikettiertes Rohr mit Antikoagulans.
14. Nach der Entnahme ziehen Sie die Kanüle heraus und erzielen Sie eine Hämostase, indem Sie beide Nähte festziehen. Die Leberarterienexposition und das Verfahren zur Kanulierung sind in Abbildung 6 dargestellt.
15. Identifizieren Sie die Pfortvene, die medial und senkrecht zur Leberarterie verläuft. Die Pfortvene hat einen größeren Durchmesser und eine dunklere Färbung im Vergleich zur Leberarterie.
16. Setzen Sie eine 23G- oder 25G-Nadel auf eine 1-mL-Spritze, die mit einer Antikoagulanslösung vorgespült ist.
17. Führen Sie die Nadel mit dem Abschrägen nach oben in die Pfortader in einem flachen Winkel (ca. 20°–30°) ein, um Gefäßkollaps oder Risse zu vermeiden.
18. Atmen Sie vorsichtig das erforderliche Blutvolumen ab.
19. Da die Pfortvenenpunktion terminal ist, töten Sie das Tier unmittelbar nach der Probenentnahme human, indem >100 mg/kg Natriumpentobarbiton über die Karotis- oder Halssprahlenkanüle verabreicht wird, während das Tier unter Tiefnarkose bleibt. Die Position der Portalader und die Methode der terminalen Probenahme sind in Abbildung 7 dargestellt.
    VORSICHT: Natriumpentobarbiton ist eine kontrollierte Substanz und sollte gemäß institutionellen Vorschriften und geeigneten Sicherheitsvorschriften behandelt und verabreicht werden.
20. Bestätigen Sie den Tod durch Einstellung der Atmung und Herzaktivität vor der Entsorgung des Kadavers gemäß dem Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (NHMRC)¹⁵ und den ANZCCART-Richtlinien.

Abbildung 6: Identifizierung der Leberarterie und Kanulation. (A) Exposition der Leberarterie (grüne Pfeile). Die Leberarterie befindet sich neben dem mesenterischen Lymphkanal (schwarz gepunkteter Umrand) und senkrecht zur unteren Vena cava. IVC: untere Vena cava; L: Leber. (B) Isolierung der Leberarterie mittels gebogener Pinzette. (C) Erfolgreiches Einsetzen (violette Pfeile) der 0,61 mm × 0,28 mm langen Polyvinylkanüle (orangefarbene Pfeile) in die Leberarterie (grüne Pfeile), gesichert mit 4-0 Seidennähten für die terminale arterielle Blutprobennahme. Der mesenteriale Lymphkanal (schwarz gepunkteter Umriss) ist sichtbar. PV: Portalvene. (D) Nachdem die Kanüle gesichert ist, wird die Öffnung der Kanüle durch Blutentnahme in die Kanüle bestätigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Identifizierung der Pfortader und terminale Probenahme. (A) Die Pfortvene (angezeigt durch die 25G-Nadel) liegt zwischen der Leberarterie (weiß gepunkteter Umrand) und dem Gallengang (schwarz gepunkteter Umrand). Die Pfortvene erscheint größer und dunkler als die Leberarterie und wird unter Tiefenbetäubung zur Endblutentnahme erreicht. PV: Torvene; IVC: untere Vena cava; L: Leber; SI: Dünndarm; RK: rechte Niere. (B) Erfolgreiches Einführen der 25G-Nadel in die Pfortvene (schwarz gepunkteter Umrand) zur Endvenenblutentnahme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

Der im Protokollabschnitt beschriebene chirurgische Ansatz ermöglicht eine klare Identifikation des Leber-Lymphkanals, der medial zur rechten Niere liegt und parallel zu Zöliakie- und Leberarterien verläuft, wie zuvor berichtet⁴. Repräsentative Anatomie und Kanüle sind in Abbildung 5 dargestellt. Eine erfolgreiche Kanüle wird durch das sofortige Auftreten von klarer bis leicht trüber Lymphflüssigkeit bestätigt, frei von milchiger Chylomikron-Kontamination, was auf eine minimale Vermischung mit mesenterieller Lymphe hindeutet. Diese Beobachtung stimmt mit den berichteten Eigenschaften der Leberlymphe³ überein. Die Identifizierung der Leberlymphe basierte auf ihrer anatomischen Lage relativ zur Leberarterie und der unteren Vena cava sowie an ihrem charakteristischen klaren Aussehen, im Gegensatz zum typischerweise undurchsichtigen oder milchigen Erscheinungsbild der mesenterischen Lymphe.

Der hepatische Lymphfluss sollte während des gesamten Entnahmezeitraums stabil bleiben, mit einer durchschnittlichen Rate von etwa 0,1 mL/h ^3,4,11. Der hepatische Lymphfluss bleibt typischerweise für etwa 2–3 Stunden nach der Kanüle unter narkosierten Bedingungen am stabilsten, obwohl längere Sammelperioden (bis zu ~6–8 Stunden) unter optimalen experimentellen Bedingungen möglich sein können. Die repräsentativen Lymphflusswerte, die in früheren Studien⁴ berichtet wurden, sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Der hepatische Lymphfluss ist im Allgemeinen niedriger als bei mesenterialen und thorakalen Lymphgängen bei narkosierten Ratten.

Lymphatische Stellen (bewusster Zustand)	Mittlere Lymphflussrate (mL/h)
Thoraxlymphe (bewusst)	1,74 ± 0,33
Thoraxlymphe (betäubt)	0,65 ± 0,10
Mesenterische Lymphe (betäubt)	0,45 ± 0,11
Leberlymphe (narkosiert)	0,12 ± 0,02

Tabelle 1: Mittlere Lymphflussraten (mL/h) durch thorakale, mesenteriale und hepatische Lymphkanalkanüllen bei bewussten und narkosierten Ratten. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM für n = 3–5 Ratten dargestellt. Angepasst aus Tabelle 3 in Yadav et al. (2018)⁴.

Repräsentative Ergebnisse, die den lymphatischen Transport von Makromolekülen veranschaulichen, sind in Abbildung 8 dargestellt. Diese Beispiele zeigen, wie das Modell zur Bewertung der lymphatischen Erholung nach intravenöser Verabreichung therapeutischer Makromoleküle verwendet werden kann, darunter etwa 60 kDa pegyliertes Interferon α2a (IFN-PEG40), etwa 31 kDa pegyliertes Interferon α2b (IFN-PEG12) und das monoklonale Antikörper Trastuzumab, was darauf hindeutet, dass die Leber ein Hauptort der Extravasation und des lymphatischen Zugangs für makromolekulare Therapien^ist.

Abbildung 8: Lymphatische Wiederherstellung intravenös verabreichter makromolekularer Therapeutika in thorakaler, mesenterialer und hepatischer Lymphe. Gesamtprozentsatz der Dosis, der in thorakaler, mesenterischer und hepatischer Lymphe nach intravenöser Verabreichung von PEGylierten Interferonen unterschiedlicher Molekulargröße (IFN-PEG12 und IFN-PEG40) und eines monoklonalen Antikörpers (Trastuzumab) wiedergefunden wurde. Die Daten zeigen den mittleren ± SEM der Dosiserholung über 8 Stunden. Angepasst aus Yadav et al. (2018)⁴. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Das Modell ermöglicht zudem eine detaillierte Lipoprotein-Profilierung der Leberlymphe³. Repräsentative Analysen der Lymphlipidzusammensetzung sind in Abbildung 9 dargestellt. Im Vergleich zur thorakalen und mesenterialen Lymphe weist die hepatische Lymphe einen deutlich geringeren Gesamtfettgehalt auf, aber die Proteinkonzentrationen, die mit denen anderer Lymphquellen vergleichbar sind. Die Lipoproteinanalyse der Leberlymphe hebt die einzigartige Rolle der Leber beim Lipidtransport und beim umgekehrten Cholesterintransport hervor. Repräsentative Daten zur Lipidzusammensetzung sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Hepatische Lymphe HDL ist mit Cholestylesterylestern angereichert, mesenterische Lymphe HDL ist überwiegend triglyzeridreich, und thorakale Lymphe HDL enthält einen relativ höheren Phospholipidgehalt. Diese Zusammensetzungsunterschiede deuten auf unterschiedliche Rollen jeder lymphatischen Quelle im Lipidstoffwechsel und -transport hin.

	%wt/wt
Brüche	Phospholipid	Freies Cholesterin	Cholesterylester	Triglyzerid
Mesenteriale Lymphe
D-HDL	20 ± 3	1 ± 0	5 ± 1	16 ± 1
L-HDL	21 ± 4	2 ± 0	8 ± 2	23 ± 5
Leberlymphe
D-HDL	24 ± 1	3 ± 0	12 ± 3	8 ± 1
L-HDL	23 ± 1	6 ± 1	13 ± 2	14 ± 2
Thoraxlymphe
D-HDL	25 ± 1	1 ± 0	7 ± 0	11 ± 3
L-HDL	29 ± 1	2 ± 0	11 ± 1	11 ± 0
Plasma
D-HDL	29 ± 2	2 ± 0	20 ± 3	2 ± 0
L-HDL	36 ± 6	2 ± 0	18 ± 3	4 ± 1

Tabelle 2: Lipidzusammensetzung von Dichte (D-HDL) und leichten (L-HDL) hochdichten Lipoproteinfraktionen, isoliert aus mesenterischer, leberer und thorakaler Lymphe sowie Plasma. Die Werte geben den Prozentsatz nach Gewicht (% Wt/Wt) von Phospholipid, freiem Cholester, Cholesterester und Triglyzerid im Verhältnis zum gesamten Lipidanteil an. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM präsentiert. Angepasst aus Tabelle 1 in Gracia et al. (2020)³.

Abbildung 9: Protein- und Lipidzusammensetzung der mesenterischen, lebhaften und thorakalen Lymphe. Proportionaler Proteingehalt und Gesamtlipid in mesenterischer, hepatischer und thorakaler Lymphe. Der Lipidgehalt umfasst Phospholipide (PL), Triglyzeride (TG), Cholesterylester (CE) und freies Cholesterin (FC), ausgedrückt als Prozentsatz des Lipidgewichts relativ zum Gesamtgewicht von Protein und Lipid. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM präsentiert. Adaptiert nach Gracia et al. (2020)³. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Die Kanulation des hepatischen Lymphkanals ist ein technisch anspruchsvolles Verfahren, selbst für erfahrene Mikrochirurgen. Mehrere wichtige Schritte können die Wahrscheinlichkeit verbessern, die Integrität der Lymphkanäle zu erhalten und einen stabilen Lymphfluss zu erreichen. Bei der Identifizierung und Isolierung des Leber-Lymphkanals (Protokollschritte 5.7-5.10) besteht der erste Schritt darin, das Bindegewebe und das Fett über dem mesenterischen Lymphgang und der Vena cava in der Nähe des Leber-Lymphkanals zu entfernen. Der hepatische Lymphkanal ist im Vergleich zum dickeren und undurchsichtigeren mesenterischen Lymphkanal durchsichtig und fragil und kann leicht gerissen werden, wenn man direkt anfasst. Der mesenterische Lymphkanal dient als nützliches anatomisches Orientierungspunkt, da die Entfernung des darüber liegenden Gewebes den oberen Leber-Lymphgang offenbart. Da der hepatische Lymphkanal häufig Knicke oder Krümmungen aufweist, sollte der Bediener einen Kanülpunkt entlang eines geraden Segments auswählen und die Kanüle parallel zum natürlichen Verlauf des Kanals ausrichten, um das Risiko von Verschluss oder Risse zu minimieren (Schritt 5.11–5.14).

Die Kanüle selbst ist der entscheidendste Erfolgsfaktor. Nach dem Durchstich des Kanals (Schritt 5.13) kann der intraluminale Zugang visuell bestätigt werden, indem die Spitze der Pinzette in die Öffnung eingeführt und sichergestellt wird, dass nur eine Gefäßwand das Instrument überlagert. Das Erscheinungsbild zweier gegenüberliegender Wände deutet auf eine durchgehende Perforation hin. Sobald der intraluminale Zugang bestätigt ist, kann die Kanüle im gleichen Winkel sanft entlang des Kanals vorgeschoben werden. Es sollte darauf geachtet werden, benachbarte Gefäße nicht zu schädigen, da Blutungen ins Feld Blut in die Lymphansammlungskannule einführen können, die Probe kontaminieren und das Risiko der Gerinnselbildung erheblich erhöhen. Nach Aufbau des Lymphflusses (Schritt 5.15) sollte das Sammelende der Kanüle verschlossen und veterinärmedizinischer Kleber vorsichtig aufgetragen werden, um zu verhindern, dass er in das Lumen eindringt. Die Kanüle muss ebenfalls auf Luftblasen überprüft werden, da eingeschlossene Luft den Gegendruck erhöht und den Lymphfluss behindern kann. Da die hepatische Lymphe bei niedrigem Antriebsdruck erzeugt wird, sollte das Sammelende der Kanüle immer unterhalb der Operationsstelle positioniert werden, um die Drainage durch die Schwerkraft zu erleichtern.

Eine erfolgreiche Leber-Lymphkanal-Kanüle wird durch den sofortigen Beginn des Lymphflusses angezeigt. Nach Etablierung fließt die hepatische Lymphe typischerweise mit etwa 0,1 mL/h und ist für mehrere Stunden stabil. Die Durchflussrate kann je nach Anatomie, Physiologie und experimentellen Bedingungen des Tieres variieren. Beispielsweise wurde in diesem Protokoll Lymphe unter Isoflurananästhesie aufgenommen. Die Isoflurananästhesie kann physiologische Parameter beeinflussen, die für die lymphatische Funktion relevant sind, und experimentelle Bedingungen mit Anästhesie sollten daher bei der Interpretation der Lymphbildungsraten¹⁶ berücksichtigt werden. Die Kanüle des hepatischen Lymphkanals erfordert eine Laparotomie und eine empfindliche mikrochirurgische Manipulation der abdominalen lymphatischen Gefäße, daher ist eine Lymphentnahme bei bewussten Ratten in diesem Modell nicht machbar. Frühere Studien, die den Lymphtransport unter narkosen und bewussten Bedingungen oder mit unterschiedlichen Anästhesieregimen verglichen haben, haben gezeigt, dass Anästhesie die absoluten Lymphflussraten nur geringfügig beeinflussen kann, aber das gesamte lymphatische Transportmuster nicht wesentlich^{verändert 4}. Daher sollten die in diesem Modell erhaltenen Lymphflusswerte im Kontext anästhesisierter experimenteller Bedingungen interpretiert werden.

Eine allmähliche Verringerung oder Stopp des Blutflusses während der Entnahme wird meist durch Gerinnselbildung in der Kanüle verursacht, die durch Blutkontamination oder Fibrinablagerung verursacht wird. Der Durchfluss kann manchmal wiederhergestellt werden, indem man die Kanüle lokalisiert und vorsichtig mit einer feinen Zange zusammenkneift, um das Gerinnsel mechanisch zu fragmentieren, oder indem man vorsichtig durch das Sammelende der Kanüle aspiriert, um die Verstopfung zu lösen. Wenn die Verstopfung auf den äußeren Bereich beschränkt ist, kann die Kanüle proximal zum Gerinnsel durchtrennt und mit einem sterilen Silikonanschluss wieder mit frischem Schlauch verbunden werden. Wenn sich das Gerinnsel an der Kanülstelle bildet, ist in der Regel eine Wiederkanüle erforderlich. In solchen Fällen kann die Entfernung des Klebstoffs mit großer Sorgfalt versucht werden, um einen Riss des Kanals oder der angrenzenden Blutgefäße zu vermeiden. Vor erneuter Kanulation muss eine Hämostase erreicht werden, da schon geringfügiges Blutversickern in die Kanüle die Gerinnung im niederdruckigen Leberlymphsystem deutlich fördert.

Physiologische Faktoren beeinflussen ebenfalls den Lymphfluss und die Öffnung. Der hepatische Lymphfluss bei Ratten ist von Natur aus langsamer als der mesenteriale oder thorakale Gangfluss, selbst unter basalen Bedingungen ^17,18. Außerdem kann Vollnarkose den Lymphfluss in anderen lymphatischen Kreisläufen im Vergleich zu bewussten, frei bewegenden Ratten^reduzieren. Da eine hepatische Lymphkanüle eine Anästhesie und eine Laparotomie erfordert, tragen diese Faktoren wahrscheinlich zu den relativ niedrigen Durchflussraten und der erhöhten Gerinnungstendenz bei längeren Entnahmen bei. Die Aufrechterhaltung der Flüssigkeitszufuhr über die Vene Jugularis oder die Magen-Darm-Kanüle während der Entnahme hilft, den Lymphfluss zu stabilisieren und die Gerinnselbildung zu reduzieren. In diesem Modell ist der stabile Leberlymphfluss typischerweise für 2–3 Stunden erreichbar, danach kann der Fluss abnehmen und Gerinnung ist wahrscheinlicher. Unter optimalen experimentellen Bedingungen kann die Lymphansammlung jedoch über längere Zeiträume aufrechterhalten werden, mit einer maximalen Dauer von bis zu ~8 Stunden, die⁴ Stunden gemeldet werden.

Die Einbeziehung von Leberarterien- und Pfortvenenproben (Abbildung 6 und Abbildung 7) erweitert die Anwendbarkeit des Modells, indem sie einen direkten Vergleich zwischen Leberzufluss, lymphatischem Ausfluss und systemischem Kreislauf ermöglicht. Dieser terminale Probenahmeschritt ermöglicht die gleichzeitige Beurteilung des leberbewehrten mikrovaskulären Transports und der interstitiellen Räumung innerhalb eines einzelnen Tieres. Solche Vergleiche liefern wertvolle Einblicke in die Verteilung von gelösten Stoffen zwischen den lebergefäßen und lymphatischen Kompartimenten, insbesondere bei großen Makromolekülen oder lipophilen Verbindungen, die von interstitieller Diffusion abhängig sind.

Trotz dieser Herausforderungen bleibt das Modell der hepatischen Lymphkanüle eine wertvolle und informative Technik. Die Leber trägt einen bedeutenden Anteil zum gesamten Lymphfluss des Körpers bei, und die hepatische Lymphe enthält Proteine und andere Bestandteile, die aus der hepatischen Zwischenflüssigkeit stammen. Durch die Entnahme von Lymphen, die direkt aus der Leber abfließen, ermöglicht dieses Modell die Analyse von Molekülen und Zellen, die die Leber verlassen, bevor sie durch mesenterische und systemische Lymphe im Thoraxgang verdünnt werden. Die biochemische Analyse der Leberlymphe liefert Einblicke in den hepatischen interstitiellen Stoffwechsel und die Lipidtransportprozesse^12,20. Dies ergänzt Informationen aus dem portalen oder systemischen Blut, das die Auswirkungen des Leberstoffwechsels und des extrahepatischen Austauschs integriert. Wichtig ist, dass diese Konfiguration, die hepatische Lymphe, Halsschlagaderarterie- und Jugularvenen-Kanulationen kombiniert, eine dynamische Beurteilung der gelösten Stoffgradienten zwischen Leberefflux und vaskulärem Einfluss ermöglicht und so einen umfassenderen Überblick über den Lebertransport und -beseitigung bietet.

Frühere Studien mit diesem Modell zeigen, dass die Leberlymphentnahme die Bewertung der lymphatischen Rückgewinnung makromolekularer Therapeutika und den Vergleich des Stofftransports zwischen hepatischer Lymphe und systemischer Zirkulation ermöglicht. Zusammen bieten Leberlymphcannulation, gleichzeitige Gefäßprobenentnahme und biochemische Profilierung eine robuste experimentelle Grundlage zur Untersuchung der hepatischen mikrovaskulären und interstitiellen Dynamiken. Das Modell ermöglicht eine gleichzeitige Bewertung des Lebertransports, des Stoffwechsels, der Lipidverarbeitung und der Immunsignalübertragung und kann angepasst werden, um Veränderungen unter pathophysiologischen Bedingungen wie MASLD oder Leberentzündung zu untersuchen.

Zusammenfassend bietet dieses verfeinerte chirurgische Modell, das den Zugang zur hepatischen lymphatischen, leberarteriellen und portalen Venen integriert, einen umfassenden und reproduzierbaren Ansatz zur Untersuchung der Lebertransportwege. Es ermöglicht einen direkten Vergleich von Gefäßzufluss, interstitieller Ausflüsse und Lymphdrainage, was Studien unterstützt, die mechanistische Einblicke in leberspezifischen Transport, Stoffwechsel und pharmakokinetische Prozesse liefern. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, hepatische Lymphe zu entnehmen, eine einzigartige Gelegenheit, den Transport von Immunzellen und Antigenen aus der Leber zu untersuchen, was wertvolle Einblicke in die Überwachung des hepatischen Immunsystems, Entzündungen und Toleranzmechanismen bietet.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antikoagulanslösung (EDTA 0,1%)	Invitrogen	AM9261	Verhindert die Gerinnselbildung in Kanülen und gesammelten Proben
Antikoagulanslösung (Heparin 20 IE/ml)	Pfizer	00409-2723-01	Verhindert die Gerinnselbildung in Kanülen und gesammelten Proben
Chlorhexidin (0,5%)	McFarlane Medical	12120-OR	Verwendet für die Desinfektion des Operationsbereichs
Sammelröhrchen (Mikrozentrifuge)	Greiner Bio-One	616201	Verwendet für Lymph- und Blutsammlung
Wattegaz	Winc Australia	18874125	Verwendet für Organmanipulation und Feuchtigkeitserhaltung
Wattestäbchen	Pacific Laboratory	1005199	Verwendet für Organrepositionierung während der Operation
Gekröpfte Iris-Pinzette	Macquarie Medical Systems	TTP5002-5	Verwendet für Gefäßisolation und Gewebemanipulation
Dumont-Pinzette	Fine Science Tools	11251-35	Verwendet zum Öffnen und Stabilisieren des Gefäßlumens der Leberarterie für die Kanüleninsertion
Ethanol (70%)	Ajax	AJA214-2.5PL	Verwendet für die Desinfektion des Operationsbereichs
Halsted-Moskito-Hämostat-Pinzette	Fine Science Tools	13009-12	Verwendet zum Biegen der 25G-Nadel für die Punktion des Hepatic-Lymphkanals
Erhitzte Operationsauflage (37 °C)	Ratek	IC-WT1	Hält die Körpertemperatur während der Operation
Induktionskammer	Darvall	1859	Verwendet für die anfängliche Anästhesieinduktion
Infusionspumpe	Adelab Scientific	NE-300	Liefert kontrollierte Kochsalzlösung über Kanüle
Iris-Schere	Stark Medical	E-AC985-11	Verwendet für Haut- und Muskelschnitte
Isofluran	Provet Pty Ltd	ISOF07	Inhalationsanästhetikum zur Einleitung und Aufrechterhaltung der Anästhesie
Kelman-McPherson-Linsenpinzette	ProSciTech	TY-1301	Verwendet zum Öffnen und Stabilisieren des Gefäßlumens der Jugularvene und der Karotisarterie für die Kanüleninsertion
Nadel (23G × 1")	Livingstone	DN23GX1.0LV	Verwendet für die Punktion der Pfortader und Blutentnahme
Nadel (25G × 1")	Livingstone	DN25GX1.0LV	Verwendet für die Kanülenspülung und Punktion des hepatischen Lymphkanals
Nasenkegel-Anästhesiesystem	Darvall	7885	Erhält die Anästhesie während der Operation
Sauerstoffversorgung mit Durchflussmesser	BOC	400NE	Trägergas für Isofluran-Anästhesie
Polyethylenkanüle (0,8 mm Außendurchmesser, 0,5 mm Innendurchmesser)	Microtube Extrusions	PE8050	Verwendet für die Kanülierung der Karotisarterie, Jugularvene und des hepatischen Lymphkanals
Polyvinylkanüle (0,61 mm Außendurchmesser, 0,28 mm Innendurchmesser)	Microtube Extrusions	PIV6128	Verwendet für die Kanülierung der Leberarterie
Seidenfäden (4-0)	SMI AG	SM8015	Verwendet zum Fixieren von Gefäßen und Kanülen
Natriumpentobarbital	Lyppard Australia Pty Ltd	LETH250	Verwendet für die Euthanasie (>100 mg/kg)
Sterile Kochsalzlösung (0,9% NaCl)	FreeFlex	K690531	Verwendet zur Rehydrierung und Spülung
Gerade Graefe-Pinzette	Fine Science Tools	11150-10	Verwendet für die Feinisolation von Gefäßen
Operatives Mikroskop	Zeiss	Stemi 2000-CS	Verwendet für die Visualisierung während der Kanülierung des hepatischen Lymphkanals
Sterile chirurgische Klingen (für Skalpelleinsatz)	Livingstone	SBLDCL15	Verwendet zum Anspitzen von Kanülenspitzen während der Vorbereitung
Spritze (1 ml)	Terumo	19032-TE	Verwendet zum Spülen von Kanülen
Spritze (3 ml)	Terumo	19048-TE	Verwendet für die Blutentnahme
Spritze (30 ml)	Terumo	19034-TE	Verwendet für die Kochsalzlösungsinfusion
Vannas-Schere	Fine Science Tools	91500-09	Verwendet für vaskuläre Schnitte
Veterinärer Gewebekleber	3M	1469SB	Verwendet zum Fixieren der hepatischen Lymphkanalkanüle