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Forschungsartikel
Diese Studie bestätigte die therapeutische Wirkung des Shengxian Quyu-Abkoks auf Herzinsuffizienz durch Tierversuche. Ultraleistungs-Flüssigchromatographie–Massenspektrometrie und Netzwerkpharmakologie-Analysen identifizierten potenzielle therapeutische Ziele und Mechanismen.
Der Shengxian Quyu-Abkok (SXQY) wurde als potenzielle therapeutische Strategie für Herzinsuffizienz (HF) vorgeschlagen, aber seine therapeutischen Mechanismen sind unklar. Diese Studie untersuchte die therapeutischen Effekte und zugrunde liegenden Mechanismen von SXQY bei HF. Ein Rattenmodell von HF wurde durch transversale Aortenverengung (TAC) indusert und mit SXQY behandelt. Die Herzfunktion wurde mittels transthorakaler Echokardiographie bewertet, und Myokardstruktur sowie Fibrose wurden mittels Hämatoxylin und Eosin sowie der Masson-Trichromfärbung untersucht. Serumproben wurden mittels ungezielter Metabolomik unter Verwendung ultraleistungsfähiger Flüssigkeitschromatographie–Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Bluteingehende Komponenten wurden auf Ziele abgebildet, und sich überschneidende HF-bezogene Ziele wurden mittels Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk-(PPI)-Netzwerkanalyse analysiert, gefolgt von Gene Ontology und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Analysen. SXQY verbesserte signifikant die Herzfunktion bei TAC-Ratten, was sich an einem verringerten inneren Durchmesser des linken ventrikulären Diastole und der linken ventrikulären hinteren Wand in der Diastole sowie einer erhöhten Fraktion der linkventrikulären Ejektion zeigte, und linderte Myokardhypertrophie, Entzündung und Fibrose. Insgesamt wurden 563 Bluteintrittsverbindungen identifiziert (367 Prototypen und 196 Metaboliten), wobei 5 Schlüsselwirkstoffe in der Datenbank Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology identifiziert wurden, die 63 Zielgruppen entsprechen. Die Netzwerkanalyse ergab 44 überlappende Gene, wobei Formononetin, Timosaponin, BII und Sinensetin Kernkomponenten und PTGS2, PPARG und HSP90AA1 Hub-Ziele sind. Die PPI-Analyse identifizierte zudem wichtige Gene, darunter ESR1, PTGS2, PPARG, HSP90AA1, JUN und 15 weitere Gene. Die KEGG-Analyse zeigte, dass SXQY hauptsächlich über Ca2+, Phosphatidylinositol 3-Kinase–Protein-Kinase B, zyklisches Adenosinmonophosphat sowie entzündungs- und hormonbezogene Wege wirkt. Zusammenfassend übt SXQY Schutzwirkungen gegen HF aus, indem es die Herzfunktion verbessert und die Myokardremodellierung durch Multikomponenten-, Multitarget- und Multipathway-Mechanismen abschwächt.
Herzinsuffizienz (HF) ist ein klinisches Syndrom, das durch eine beeinträchtigte ventrikuläre Füllung und Auswurffähigkeit aufgrund kardialer struktureller oder funktioneller Anomalien gekennzeichnet ist, was zu einer Vielzahl klinischer Anzeichenund Symptome führt. Als Endstadium verschiedener Herzerkrankungen beeinträchtigt HF erheblich die Lebensqualität der Patienten und führt zu hoher Sterblichkeit sowie häufigen Wiederaufnahmen im Krankenhaus, wodurch sowohl Familien als auch Gesellschaft eine erhebliche Krankheitsbelastung entstehen 2,3. In der klinischen Behandlung bildet die Pharmakotherapie für HF das Fundament und das Fundament der Behandlung und umfasst hauptsächlich wichtige Arzneimittelklassen wie Diuretika, Renin-Angiotensin-Systemhemmer, Betablocker, Mineralokortikoidrezeptorantagonisten und Natrium-Glukose-Cotransporter-2-Inhibitoren 3,4,5,6 . Obwohl diese Medikamente die Prognose von Patienten mit HF teilweise verbessert haben, bringen sie jeweils bestimmte Einschränkungen und Nebenwirkungen mit sich, wie Elektrolytstörungen, Bradykardie und Harnwegsinfektionen7. Daher verdienen pharmakologische Therapien für HF weiterhin weitere Untersuchungen.
Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) hat umfangreiche klinische Erfahrung in der langfristigen Behandlung von HF gesammelt. Mit Schwerpunkt auf ganzheitlicher Regulation und multizielreicher Intervention bietet sie einen unverwechselbaren Ansatz zur Behandlung8. In den letzten Jahren haben mehrere randomisierte kontrollierte Studien (RCTs) die therapeutische Wirksamkeit chinesischer Kräuterrezepturen für HF 9,10,11,12,13,14,15 nachgewiesen. Shengxian Quyu Decoction (SXQY) hat bereits mit rigorosen RCTs begonnen, um ihre therapeutische Wirksamkeit zu bestätigen, aber ihre spezifischen therapeutischen Mechanismen erfordern noch weitere und umfassendere Untersuchungen16. Netzwerkpharmakologie, als aufkommende Disziplin, die Systembiologie, Polypharmakologie und computergestützte Analyse integriert, bietet ein mächtiges Werkzeug zur Aufklärung der ganzheitlichen Wirkmechanismen chinesischer Kräuterformeln 17,18,19. Daher verwendet diese Studie eine integrierte Strategie, die ungezielte Metabolomik und Netzwerkpharmakologie kombiniert, um blutabsorbierte Komponenten von SXQY zu identifizieren und dessen potenzielle therapeutische Mechanismen aufzuklären. Diese Arbeit zielt darauf ab, eine Grundlage für die weitere klinische Anwendung von SXQY zu schaffen.
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Alle experimentellen Verfahren wurden vom Komitee für Tierethik und Tierschutz des China–Japan Friendship Hospital (Genehmigungsnummer zryhyy21-23-01-09) geprüft und genehmigt und gemäß den Prinzipien von Ersatz, Reduzierung und Verfeinerung durchgeführt, um den Einsatz und das Leiden von Tieren zu minimieren. Forscher, die Datenerhebung und -analyse (einschließlich Echokardiographiemessungen und histologischer Beurteilung) durchführten, waren für die Gruppenzuweisung blind.
Vorbereitung der SXQY-Probe
SXQY besteht aus folgenden pflanzlichen Bestandteilen: Astragalus membranaceus (Huangqi) (30 g), Codonopsis pilosula (Dangshen; 20 g), Cornus officinalis (Shanyurou; 15 g), Sparganium stoloniferum (Sanleng; 12 g), Curcuma zedoaria (Erzhu; 15 g), Cimicifuga heracleifolia (Shengma; 10 g), Bupleurum chinense (Chaihu; 10 g), Platycodon grandiflorus (Jiegeng; 10 g), Anemarrhena asphodeloides (Zhimu; 15 g) und Leonurus japonicus (Yimu; 15 g), mit einem Gesamtruhrgewicht von 152 g pro Rezept. Alle Kräutermaterialien wurden vom Department of Pharmacy des China–Japan Friendship Hospital gekauft und von einem leitenden Apotheker nach standardisierten pharmakognistischen Identifikationsmethoden authentifiziert. Klinisch wird SXQY in einer Dosis von einem Rezept (152 g) pro Tag verabreicht. Bei einem durchschnittlichen Erwachsenenkörpergewicht von 70 kg beträgt die entsprechende menschliche Dosierung 2,17 g (rohes Kraut)/kg. Basierend auf der Normalisierung der Körperoberfläche zwischen Menschen und Ratten wurde die entsprechende Rattendosis auf 13,67 g (rohes Kraut)/kg berechnet. Für die Zubereitung der Dekoktion wurde ein Rezept SXQY 1 Stunde lang in destilliertem Wasser in einem Verhältnis von 10 ml pro Gramm roher Kräuter (w/v, basierend auf dem ursprünglichen Lösungsmittelvolumen ohne Anpassung nach dem Einweichen) eingeweicht, anschließend mit einem elektrischen Heizmantel gekocht und bei 100°C unter kontinuierlichem Kochen 1 Stunde gehalten. Der Extrakt wurde anschließend durch Gaze (200–300 μm Porengröße) gefiltert. Der Rückstand wurde dann zweimal unter identischen Bedingungen extrahiert. Die gesammelten Filtrate wurden unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer bei 60 °C auf ein Endvolumen von 111 mL konzentriert, was eine Konzentration von 1,37 g (Rohstoff)/mL ergab. Der konzentrierte Abzug wurde erneut durch Gaze (200–300 μm Porengröße) gefiltert, bei 4°C gelagert und innerhalb von 24–48 Stunden verwendet. Zur Verabreichung wurde die Lösung direkt verwendet, und das Gavagevolumen wurde anhand der Konzentration von 1,37 g/ml berechnet, was zu einem Verabreichungsvolumen von etwa 10 mL/kg führte, um die Zieldosis von 13,67 g/kg zu erreichen.
Tiermodell
Achtzehn 8 Wochen alte männliche Sprague–Dawley (SD) Ratten wurden in einer standardisierten klimatisierten Umgebung (23°C ± 2°C, 50 ± 5 % relative Luftfeuchtigkeit und ein 12-Stunden-Licht/Dunkelzyklus) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser untergebracht. Die Tiere wurden zufällig drei Gruppen (n = 6 pro Gruppe) mithilfe einer Zufallszahlentabelle zugeteilt: eine Scheingruppe (Sham), eine transversale Aortenverengungsgruppe (TAC) und eine mit SXQY behandelte Gruppe (SXQY). Ratten in den mit TAC und SXQY behandelten Gruppen wurden durch Einatmen von Isofluran (Induktion 4 %, Erhaltungsphase 2 %) betäubt und in Rückenlage auf ein thermostatisch gesteuertes Heizkissen gelegt, das bei 37 °C gehalten wurde. Eine ausreichende Anästhesie wurde durch das Fehlen reflexartiger Reaktionen auf den Pfotenkniff, eine stabile Atemfrequenz und das Fehlen spontaner Bewegungen bestätigt. Eine ophthalmische Salbe wurde auf beide Augen aufgetragen, um das Hornhauttrocknen zu verhindern. Nach der endotrachealen Intubation wurden die Tiere an einen Beatmungsgerät für kleine Tiere angeschlossen, mit einem Gezeitenvolumen von 4–6 mL pro 200 g Körpergewicht, einer Atemfrequenz von 70 Atemzügen pro Minute und einem Inspirations-Atmungsverhältnis von 1:1.
Alle chirurgischen Eingriffe wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Chirurgische Instrumente wurden durch Autoklavierung sterilisiert, und der Operationsbereich wurde durch Rasieren und Desinfektion mit Povidon-Jod gefolgt von 70 % Ethanol vorbereitet. Nach der Vorbereitung der chirurgischen Stelle wurde ein Schnitt in die linke thorakale Haut gemacht, und die Muskeln pectoralis major und minor wurden stumpf zerschnitten, um die Rippen freizulegen. Ein horizontaler Schnitt von etwa 1,0 cm wurde im zweiten bis dritten Zwischenrippenraum neben dem linken Brustkorbrand angelegt. Blutgefäße und Faszie wurden stumpf getrennt, und der Thymus wurde vorsichtig zurückgezogen, um den Aortenbogen vollständig freizulegen.
Der Aortenbogen wurde vorsichtig zwischen der rechten Innominatisarterie und der linken gemeinsamen Halsschlagader mit sterilen, gebogenen Zangen angehoben, und eine 2-0-Seidennaht wurde darunter geführt. Eine stumpf gebogene 16-Gauge-Nadel (Außendurchmesser 1,6 mm) wurde manuell modifiziert, indem die Spitze abgestumpft und vor der Verwendung auf eine passende Krümmung gebogen wurde, gefolgt von einer Sterilisation mit Autoklavierung. Die vorbereitete, stumpf gebogene Nadel wurde dann parallel zum Aortenbogen positioniert, danach wurde die Naht eng um die Aorta und die Nadel gebunden. Die Nadel wurde sofort entfernt, um eine standardisierte Verengung zu schaffen, und der Thymus wurde neu positioniert. Nach Bestätigung des Ausbleibens aktiver Blutungen wurden die Brustwand und Haut in mehreren Schichten geschlossen. Postoperativ wurde die mechanische Beatmung etwa 10 Minuten fortgesetzt, bis die spontane Atmung wiederhergestellt wurde, was sich durch eine stabile und regelmäßige Atemfrequenz sowie die Fähigkeit zur spontanen Atmung ohne ventilatorische Unterstützung zeigt. An diesem Punkt wurde der Endotrachealschlauch entfernt. Schein-operierte Tiere unterzogen sich denselben chirurgischen Eingriffen, nur dass der Aortenbogen nicht ligatiert wurde.
Nach der Operation wurde die Schnittstelle desinfiziert und die Tiere in saubere Erholungskäfige gesetzt, um das Infektionsrisiko zu verringern. Die Ratten wurden dann zur Rettung und zur routinemäßigen Unterbringung in die Tiereinrichtung zurückgebracht. Die Analgesie wurde mit Buprenorphin (0,05 mg/kg, subkutan) verabreicht. Ratten wurden alle 12 Stunden während der ersten 72 Stunden auf Anzeichen von Schmerzen, Belastung oder chirurgischen Komplikationen beobachtet, darunter eingeschränkte Beweglichkeit, Piloerektion, abnormale Haltung, schwere Atmung oder Wunddehiszenz.
Drei Tage nach der Operation wurden die Ratten der mit SXQY behandelten Gruppe oral mit 1 ml/100 g Körpergewicht des SXQY-Abkoks für 9 Wochen behandelt. Inzwischen erhielten Ratten in den Sham-betriebenen und TAC-Gruppen ein gleiches Volumen (1 ml/100 g Körpergewicht) destilliertes Wasser durch Gavage.
Transthorakale Echokardiographie
Am Ende der Behandlungsphase wurde in allen Gruppen eine transthorakale Echokardiographie durchgeführt. Die Ratten wurden durch Einatmen von Isofluran betäubt und auf einer speziellen Bildgebungsplattform in Rückenposition gebracht. Der vordere Brustkorb wurde sorgfältig rasiert und mit einer großzügigen Schicht Ultraschallgel überzogen. Die Ultraschallbildgebung wurde mit einem hochauflösenden Ultraschallsystem für kleine Tiere durchgeführt, das mit einem Hochfrequenzwandler (18–40 MHz) im B- und M-Modus ausgestattet war. Der Wandler wurde sanft auf der gelbedeckten Fläche positioniert, mit einer Tiefeneinstellung von 12,29 mm und einer Verstärkung von 22 dB; Der Fokus wurde angepasst, um die Bildqualität zu optimieren. Bilder und Videoschleifen wurden für die anschließende quantitative Analyse aufgenommen. Der innere Innendurchmesser des linken ventrikulären Endediastols (LVIDd) und die Dicke der hinteren Wand des linken Ventrikels an der Enddiastole (LVPWd) wurden gemessen, und die linksventrikuläre Auswurffraktion (LVEF) wurde mit der Teichholz-Formel auf Basis von M-Mode-Messungen berechnet. Für jeden Parameter wurden die Messungen über 3–5 aufeinanderfolgende Herzzyklen gemittelt. Alle echokardiographischen Aufnahmen und Analysen wurden von einem zertifizierten Operator mit formaler Ausbildung in Echokardiographie gemäß standardisierten echokardiographischen Protokollen durchgeführt.
Probenentnahme und -verarbeitung
Nach dem Ultraschall wurden die Ratten mit Isofluran betäubt. Die Tiere wurden in die Rückenlage gelegt, und die Brusthöhle wurde geöffnet, um das Herz freizulegen. Die Herzen wurden schnell entfernt, in kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung ausgespült und entlang der sagittalen Ebene durchschnitten. Herzgewebe wurde sofort in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C für 24 Stunden fixiert, gefolgt von einer Dehydrierung durch eine graduierte Ethanolserie (70 %, 80 %, 90 %, 95 % und 100 %) für jeweils 1 Stunde pro Schritt, wobei das Gewebe allmählich durchsichtig wurde, ohne dass es merklich schrumpfte. Die Proben wurden mit Xylol entfernt, bei 60°C 3 Stunden lang mit geschmolzenem Paraffin infiltriert und bei Raumtemperatur (RT; 20°C–25°C) erstarrt. Paraffin-eingebettete Herzgewebeblöcke wurden geschnitten und mit einer Dicke von 4–6 μm mit einem Mikrotom durchschnitten. Abschnitte wurden in einem Wasserbad mit 45 °C geschwommen, auf Glasrutschen montiert und über Nacht bei 37 °C–40 °C getrocknet. Die Objektträger wurden bei RT unter niedriger Luftfeuchtigkeit aufbewahrt und innerhalb einer Woche zur histologischen Färbung verwendet.
Hämatoxylin- und Eosin-(HE)-Färbung
Paraffin-eingebettete Schnitte wurden wie folgt verarbeitet. Die Schnitte wurden zunächst durch Immersion in Xylol I, II und III jeweils 5 Minuten deparaffinisiert, gefolgt von der Befeuchtung durch eine Reihe von wasserfreiem Ethanol I und II sowie gradierten Ethanollösungen (95 %, 90 %, 80 %, 70 % und 50 %) jeweils 5 Minuten lang und schließlich in destilliertem Wasser ohne sichtbare Wachsrückstände gespült. Die Abschnitte wurden dann 5 Minuten lang mit Harris-Hämatoxylin gefärbt und 1–2 Minuten unter fließendem Leitungswasser abgespült. Die Differenzierung erfolgte etwa 1–2 Sekunden lang in einer sauren Alkohollösung, wobei der Endpunkt durch visuelle Inspektion bestimmt wurde, wenn der Hintergrund blass erschien, während die Kernfärbung klar definiert blieb. Darauf folgte das Bläuen in Wasser bei 37°C–45°C und das Abspülen mit destilliertem Wasser. Anschließend wurden die Abschnitte 40 Sekunden lang mit alkohollöslichem Eosin gekonterfärbt, mit destilliertem Wasser gewaschen, durch graduiertes Ethanol dehydriert, mit Xylol gereinigt und schließlich mit neutralem Harz montiert.
Masson-Färbung
Paraffin-eingebettete Abschnitte wurden sequentiell in Xylen I, II und III jeweils 5 Minuten deparaffinisiert, gefolgt von der Befeuchtung durch wasserfreies Ethanol I und II sowie graduierte Ethanollösungen (95 %, 90 %, 80 %, 70 % und 50 %) jeweils 5 Minuten lang und schließlich in destilliertem Wasser abgespült. Die Schnitte wurden 1 Sekunde lang in 0,5 % Essigsäure (vorgekühlt auf 4 °C) eingetaucht, anschließend 10 Minuten mit der Fuchsinlösung aus einem kommerziellen Masson's Trichrom-Färbungsset, anschließend 5 Minuten Differenzierung in Phosphomolybdic-Säure und Gegenfärbung mit Anilinblau für 3 Minuten. Alle Reagenzien bestanden aus demselben kommerziellen Bausatz und wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Nach der Färbung wurden die Abschnitte dreimal in Essigsäure vorgekühlt, auf 4 °C (ca. 30 s pro Spülung) abgekühlt, durch Ethanol dehydriert, in Xylol gereinigt und mit neutralem Harz montiert.
Serumprobenentnahme für die Metabolomik-Analyse
Sechs acht Wochen alte männliche SD-Ratten wurden unter denselben Bedingungen wie im oben genannten in vivo Experiment untergebracht. Die Tiere wurden zufällig einer mit SXQY behandelten Gruppe und einer Kontrollgruppe für das Fahrzeug (destilliertes Wasser; n = 3 pro Gruppe) mithilfe einer computergenerierten Randomisierungsmethode zugeordnet. Ratten der SXQY-Gruppe erhielten oral SXQY in einer Dosis von 1 mL/100 g Körpergewicht, während die Kontrollgruppe des Fahrzeugs ein gleiches Volumen destilliertes Wasser erhielt. Nach sieben Tagen täglichen Gavage wurde die letzte Dosis am siebten Tag verdoppelt. Nach der letzten Verabreichung wurden die Tiere 12 Stunden gefastet. Die Ratten wurden mit Isofluran betäubt, bis der Verlust des Pedalrückzugsreflexes als Indikator für eine ausreichende Anästhesie bestätigt wurde. Blutproben wurden aus dem retro-orbitalen venösen Plexus mittels steriler Kapillarröhren entnommen und sofort in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren ohne Antikoagulans übertragen. Das Vollblut durfte dann 1 Stunde auf RT stehen und bei 1000 × g 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um Serum zu erhalten. Wenn eine klare Trennung zwischen der oberen transparenten Serumschicht und dem Gerinnsel erschien, wurde das überlagerte Serum vorsichtig aspiriert und in saubere Mikrozentrifugenröhren übertragen. Serumproben wurden bei −80°C gelagert, bis die bluteinströmenden Komponenten analysiert wurden.
Beispiel-Vorbehandlung für die Metabolomik-Analyse
Serumproben wurden nach der Entfernung aus der −80°C-Lagerung auf Eis aufgetaut und kurzzeitig mit Wirbeln (10 Sekunden) vermischt, um die Homogenität zu gewährleisten. Ein Aliquot von 100 μL Serum wurde in ein 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr übertragen, gefolgt von der Zugabe von 500 μL Extraktionslösungsmittel (20 % Acetonitril–Methanol mit 2-Chloro-L-Phenylalanin als internem Standard bei einer Endkonzentration von 1 μg/mL), um die Proteinausfällung zu induzieren. Das Gemisch wurde 3 Minuten lang energisch vortexiert und bei 12.000 × g 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Ein 470 μL großer Teil des entstehenden Supernatanten wurde in ein neues Rohr übertragen und mit einem Stickstoffverdampfer unter niedrigem, kontrolliertem Stickstoffstrom bis zur Trockenheit verdampft. Nach der Rekonstitution in 200 μL 70 % Methanol-Wasser-Methanol und 1 Minute Wirbeln wurden die Proben bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, und 180 μL des geklärten Supernatants wurden in Autosampler-Phiolen für die Flüssigchromatographie–Tandem-Massenspektrometrie-(LC-MS/MS)-Analyse übertragen.
Ein Aliquot von 200 μL SXQY-Probe wurde anschließend in ein voretikettiertes 1,5 mL Zentrifugenrohr übertragen. Die interne Standardextraktionslösung wurde jeder Probe mit einem Volumenverhältnis von 1:1 (v/v) zugesetzt. Die Mischung wurde 15 Minuten vortexgemischt und bei 12.000 × g 3 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der resultierende Supernatant wurde sorgfältig gesammelt und durch eine 0,22 μm mikroporöse Membran gefiltert, wodurch ein transparentes Filtrat ohne sichtbare Partikel entstand. Das Filtrat wurde in Autosampler-Fläschchen übertragen und bei 4°C vor der Ultra-Performance LC-MS/MS (UPLC–MS/MS)-Analyse gelagert.
Erstellung interner Standardlösungen
Die innere Standardlösung (2-Chlor-L-Phenylalanin) wurde hergestellt, indem 1 mg des Referenzstandards in 1 mL von 70 % (v/v) methanol-Wasser gelöst wurde, was eine Konzentration von 1.000 μg/mL ergab. Diese Standardlösung wurde weiter mit demselben Lösungsmittel verdünnt, um eine funktionierende interne Standardlösung mit einer Endkonzentration von 1 ppm zu erhalten, die frisch vorbereitet, bei 4°C gelagert und innerhalb von 48–72 Stunden verwendet wurde.
UPLC–MS/MS-Bedingungen
Die chromatographische Trennung erfolgte mit einem UPLC-System, das mit einem Tandem-Massenspektrometer gekoppelt war. Die Trennung erfolgte auf einer C18-Säule, die bei 40 °C gehalten wurde, mit einer Durchflussrate von 0,35 mL/min und einem Einspritzvolumen von 4 μL. Die mobile Phase bestand aus ultrareinem Wasser mit 0,1 % (v/v) Ameisensäure (A) und Acetonitril mit 0,1 % (v/v) Ameisensäure (B). Die Gradientenelution wurde wie folgt angewendet: 5 % B bei 0,0 Minuten; linear stieg es auf 25 % B bei 2,0 Minuten, 35 % B bei 3,0 Minuten, 60 % B bei 5,0 Minuten und 99 % B bei 6,0 Minuten; 1,5 Minuten lang bei 99 % B gehalten; kehrte nach 7,6 Minuten auf 5 % B zurück; und das Gleichgewicht bei 5 % B bis 10,0 Minuten.
Die massenspektrometrische Detektion erfolgte mit einem hochauflösenden Massenspektrometer, das mit einer Elektrosprüh-Ionisationsquelle ausgestattet war, die in positiven und negativen Ionenmodi arbeitete. Die Sprühspannungen wurden im positiven Modus auf 3500 V und im negativen Modus auf 3200 V eingestellt. Das Mantelgas und das Hilfsgas wurden auf 30 bzw. 5 beliebige Einheiten (instrumentendefiniert) eingestellt. Die Temperatur des Ionentransferrohrs und die Verdampfertemperatur wurden bei 320°C bzw. 300°C gehalten. Vollständige MS-Scans wurden über einen m/z-Bereich von 84–1250 mit einer Auflösung von 35.000 mit einem automatischen Gewinnkontrollziel (AGC) von 1,0 × 106 aufgenommen, gefolgt von datenabhängiger MS/MS-Erfassung (Top 10) mit einer Auflösung von 17.500, einem AGC-Ziel von 2,0 × 105 und einem Isolationsfenster von 1,0–1,5 m/z. Gestufte normalisierte Kollisionsenergien von 30, 40 und 50 wurden angewendet. Die Top 10 der intensivsten Vorläuferionen wurden für die Fragmentierung ausgewählt, mit einer dynamischen Ausschlussdauer von 3 Sekunden.
Rohdatenverarbeitung
Rohdaten der Massenspektrometrie wurden mit ProteoWizard in das mzML-Format umgewandelt. Um die analytische Zuverlässigkeit zu gewährleisten, wurden gesammelte Qualitätskontrollproben (QC) hergestellt, indem gleiche Mengen aller Serumproben gemischt wurden. QC-Proben wurden in regelmäßigen Abständen (eine QC-Injektion alle 5–10 Analyseproben) während der UPLC–MS/MS-Analyse injiziert, um die Instrumentstabilität, die Konsistenz der Retentionszeit und die Signalreproduzierbarkeit zu überwachen. Die Reproduzierbarkeit wurde anhand der relativen Standardabweichung der Spitzenintensitäten in QC-Proben bewertet.
Peak-Detektion, Korrektur der Retentionszeit und Peak-Ausrichtung wurden mit dem XCMS-Paket durchgeführt. Merkmale mit einer fehlenden Rate von mehr als 50 % in jeder Gruppe wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Die Signal-Drift-Korrektur wurde anschließend auf Spitzenbereiche angewandt, wobei eine auf Support Vector Regression (SVR) basierende Normalisierungsmethode verwendet wurde, die in der R-Statistiksoftware mit QC-basierter Modellierung implementiert wurde, um Signaldrift über den analytischen Lauf zu korrigieren.
Die Metabolitenidentifikation erfolgte durch Abgleich der korrigierten Merkmale mit einer internen Referenzstandardbibliothek (die etwa 5.000 Verbindungen mit MS1- und MS2-Spektraldaten enthält; proprietär und nicht öffentlich verfügbar) sowie öffentlich zugänglichen spektralen Datenbanken wie Human Metabolome Database (HMDB), Metabolite and Tandem Mass Spectrometry Database (METLIN), MassBank und Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS). basierend auf genauer Massenabstimmung, Ausrichtung der Retentionszeit und MS/MS-Spektralähnlichkeit. Die Massenanpassung erfolgte mit einer Toleranz von ±25 ppm für Vorläuferionen (MS1) und Fragmentionen (MS2), mit einer Retentionszeittoleranz von ±6 s. Für die Bibliothekssuche wurde eine Toleranz von ±25 ppm auf Vorläuferionen (Q1) und ±50 ppm auf MS/MS-Fragmente angewendet, mit einem Mindestwert von 0,3 für MS/MS. Für die nicht-zielgerichtete Identifikation wurden nur Metaboliten mit einem umfassenden Identifikationswert über 0,5 erhalten. Der Endwert wurde als gewichtete Summe aus Fragment (0,1), Vorwärts- (0,3) und Rückwärtspunkten (0,6) berechnet. Die in positiven und negativen Ionisationsmodi gewonnenen Daten wurden auf Verbindungsebene zusammengeführt. Für doppelte Anmerkungen wurde der Eintrag mit der höchsten Identifikationssicherheit und der höchsten Punktzahl ausgewählt. Die finalisierten Annotationen wurden in eine Metaboliten-Annotationsdatei zusammengefasst.
Kriterien zur Identifizierung absorbierter Verbindungen
Absorbierte Prototypbestandteile wurden als Verbindungen definiert, die im SXQY-Extrakt und in der SXQY-behandelten Gruppe mit entsprechenden Retentionszeiten innerhalb einer Toleranz von ±0,1 Minuten nachgewiesen wurden. Zusätzlich mussten diese Verbindungen eine Spitzenfläche in der SXQY-behandelten Gruppe aufweisen, die mindestens doppelt so groß war wie in der Fahrzeugkontrollgruppe oder in den Kontrollproben fehlen.
Absorbierte Metaboliten wurden anhand anderer Kriterien identifiziert. Diese Verbindungen wurden im SXQY-Extrakt nicht nachgewiesen, waren jedoch in der mit SXQY behandelten Gruppe vorhanden. Ihre massenspektrometrischen Eigenschaften mussten mit charakteristischen Stoffwechseltransformationen übereinstimmen, einschließlich Hydroxylierung (Δm/z = +15,9949 Da) und Demethylierung (Δm/z = −14,0157 Da). Außerdem musste die Spitzenfläche in der SXQY-behandelten Gruppe mindestens doppelt so hoch sein wie in der Fahrzeugkontrollgruppe, basierend auf normalisierten Spitzenbereichen nach der Signaldriftkorrektur, oder das entsprechende Signal musste in den Fahrzeugkontrollproben nicht nachweisbar sein.
Abruf absorbierter, verbindungsbezogener Gene
Bluteinflusskomponenten wurden in der Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph; abgerufen im Januar 2026)20 untersucht. Die in TCMSP dokumentierten Verbindungen wurden als bioaktive Bestandteilskandidaten auf Basis festgelegter pharmakokinetischer Schwellenwerte für orale Bioverfügbarkeit ≥ 30 % und Arzneimittelähnlichkeit ≥ 0,1821 getestet. Die vermuteten Ziele, die den behaltenen Verbindungen entsprechen, wurden anschließend abgerufen, und alle Zielidentifikatoren wurden mit Hilfe der UniProt-Datenbank22 auf offizielle Gensymbole standardisiert.
Abruf krankheitsbezogener Ziele und Schnittgene
HF-bezogene Gene wurden aus der GeneCards-Datenbank (https://www.genecards.org/; Zugriff im Januar 2026) unter Verwendung des Suchbegriffs "Herzinsuffizienz" gesammelt, und Gene mit einem Relevanzscore ≥ 10 wurden für eine weitere Analyse ausgewählt. Die HF-bezogenen Ziele wurden anschließend mit zusammengesetzten Zielen aus TCMSP mit der Weishengxin-Plattform identifiziert (https://www.bioinformatics.com.cn; Zugriff im Januar 2026). Die überlappenden Gene wurden als Schnittziele definiert und für den späteren Aufbau von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI) sowie für Analysen der funktionellen Anreicherung verwendet.
Netzwerkaufbau und funktionale Anreicherungsanalysen
Die PPI-Analyse der identifizierten Ziele erfolgte mit der STRING-Datenbank (http://cn.string-db.org/; abgerufen im Januar 2026)23, wobei die Art auf Homo sapiens gesetzt wurde und eine Konfidenzwertschwelle von ≥0,7 erreicht wurde. Die Interaktionsdaten wurden in das Cytoscape-Visualisierungstool für die Netzwerkvisualisierung importiert. Topologische Analysen wurden mit dem NetworkAnalyzer-Plugin im Visualisierungstool durchgeführt, und Hub-Gene wurden mit dem CytoHubba-Plugin24,25 identifiziert. Die Genontologie-(GO)-Anreicherungsanalyse wurde an den Schnittzielen durchgeführt, einschließlich der Kategorien biologischer Prozess (BP), zellulärer Komponente (CC) und molekularer Funktion (MF). GO-Begriffe mit einem P-Wert < 0,05 wurden als signifikant betrachtet, und die zehn besten angereicherten Begriffe jeder Kategorie wurden für Visualisierung26 ausgewählt. Die Schnittziele wurden zudem der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Signalanreicherungsanalyse mit dem clusterProfiler-Paket in der statistischen Software unterzogen. Wege mit einem P-Wert < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen, und die 20 wichtigsten angereicherten Signalwege wurden für die Visualisierung ausgewählt. Diese Signalwege wurden anschließend verwendet, um ein Ziel-Weg-Interaktionsnetzwerk27 zu konstruieren.
Statistische Analyse
Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Normalität der Datenverteilung wurde mit dem Shapiro–Wilk-Test bewertet, und die Homogenität der Varianz wurde vor der Analyse mit dem Levene-Test oder dem Brown-Forsythe-Test bewertet. Statistische Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mittels Einweg-Varianzanalyse durchgeführt, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test mit GraphPad Prism. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
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Transthorakale Echokardiographie
Die echokardiographische Analyse zeigte eine ausgeprägte kardiale Remodellierung und Funktionsstörung bei TAC-Ratten (Abbildung 1). Im Vergleich zu Sham-Kontrollen erhöhte TAC signifikant LVIDd und LVPWd, während LVEF deutlich verringert war. Bemerkenswert ist, dass die Verabreichung von SXQY diese pathologischen Veränderungen teilweise rückgängig machte, was sich in einer signifik...
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SXQY wird seit über zwei Jahrzehnten umfassend in der klinischen Praxis eingesetzt und zeigt eine Wirksamkeit bei der Behandlung verschiedener Herz-Kreislauf-Erkrankungen. In letzter Zeit wurde die Anwendung auf Patienten mit Herzinsuffizienz mit reduzierter Auswurffraktion und leicht reduzierter Auswurffraktion16 ausgeweitet. In der vorliegenden Studie wurde durch TAC-Chirurgie ein Rattenmodell erstellt, um pathologische Veränderungen von HF nachzuahmen, und inzw...
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Die Autoren berichten von keinem Interessenkonflikt in dieser Arbeit.
Wir danken dem Animal Experimental Center of China–Japan Friendship Hospital für die Unterstützung bei der Tierpflege und chirurgischen Eingriffen.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2-Chlor-L-Phenylalanin | Aladdin | C105993-1g | Interner Standard; ≥ 98% |
| Acetonitril (LC-MS-Qualität) | Aladdin | A120771-1L | Extraktionslösungsmittel |
| Essigsäure | Solarbio | G1340 | Masson-Flecken; Vorgekühlt auf 4 °C; C |
| Autosampler-Phiolen | Agilent | 5190-9590 | Für LC-MS/MS-Sample-Laden |
| Buprenorphin | Cerilliant | B-044S | Analgetikum |
| C18-Spalte (1,8 & mu; m, 2,1 mm & mal; 100 mm) | Gewässer | 176001125 | ACQUITY Premier HSS T3-Kolumne |
| Kapillarröhren, steril | Fisherbrand | 22-362-566 | Retro-orbitale Blutentnahme |
| Zentrifuge (gekühlt) | KUBOTA | N61196-F000 | Für Serum- und Probenverarbeitung |
| clusterProfiler-Paket | Bioleiter | — | R-Paket für die KEGG-Anreicherungsanalyse; v4.0.2 |
| Gebogene Pinzette, steril | HL-SQX | HL-JP | Manipulation des Aortenbogens |
| Cytoscape-Software | NHGRI | NIH NHGRI U24 HG012107 | Version 6.4.1 |
| Dedizierte Bildgebungsplattform | Fujifilm VisualSonics | VisualSonics Vevo 1100 Ultraschallbildgebungssystem | Tierpositionierung während der Echokardiographie |
| Destilliertes Wasser | N/A | N/A | Zubereitung und Fahrzeugsteuerung |
| Elektrische Heizmantel | Midea | WK2102 | Abkock-Kochen |
| Endotrachealrohr | CWE Inc., USA | SAR-1000 | Endotracheale Intubation; Die in dieser Studie verwendete Endotrachealröhre war in die Beatmungskonfiguration integriert und war kein separates oder eigenständiges Gerät |
| Ethanol (absolut) | Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd. | 64-17-5 | Dehydrierung und Sterilisation |
| Ameisensäure | Aladdin | O930702 | Mobilphasenadditiv |
| Gaze | Solarbio | YA0720 | Absuktionsfiltration; 200– 300 μ m Porengröße |
| GeneCards-Datenbank | GeneCards | — | Krankheitsbezogene Zielabrufung; abgerufen im Januar 2026 |
| GNPS-Datenbank | Universität von Kalifornien, San Diego | — | Spektraldatenbank; Version 1.3.16, Daten archiviert im Dezember 2025 |
| GraphPad Prism Software | GraphPad-Software | — | Version 10.1.2; SCR_002798 |
| Heizpolster (thermostatisch) | Physitemp | HP-4M | Gehalten bei 37 & Grad; C |
| Hämatoxylin und Eosin (H& E) Fleckenset | Solarbio | G1120 | Histologische Färbung |
| Hochfrequenzwandler | VisualSonics | Vevo F2 | 18 &Ndash; 40 MHz |
| Hochauflösendes Massenspektrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exaktiv | Q Exaktives HF-X |
| Hochauflösendes Ultraschallsystem für kleine Tiere | Fujifilm VisualSonics | VisualSonics Vevo 1100 Ultraschallbildgebungssystem | Vevo 2100 |
| HMDB-Datenbank | Wishart Forschungsgruppe / Das Metabolomics Innovation Centre, University of Alberta | — | Spektraldatenbank; HMDB aktuelle Version 5.0; Version 5.0; Januar 2022 |
| Interne Referenz-Standardbibliothek | METWARE | — | Zusammensetzung der hauseigenen Referenzstandardbibliothek: Die Bibliothek enthält insgesamt 5.000 Verbindungen und enthält sowohl MS1-(Vor-)Informationen als auch MS2-(Fragmentierungs-)Spektraldaten. Verfügbarkeitserklärung: Das Bibliotheksdatenformat ist .txt. Speicherbedingung: Die Datenbank wird auf dem internen Server des Unternehmens gespeichert. Zugriffsberechtigungen: Diese selbstgebaute Standardbibliothek ist eine proprietäre interne Spektralbibliothek des Unternehmens. Es wird ausschließlich zur Metabolitenidentifikation, Ergebnisverifizierung und Qualitätsnachverfolgbarkeit innerhalb der kontrollierten analytischen Arbeitsabläufe des Unternehmens verwendet. Die Bibliothek ist nicht öffentlich zum Download verfügbar. Clients können Annotationsergebnisse, Trefferinformationen und notwendige Feldbeschreibungen erhalten, die auf Basis dieser Bibliothek generiert werden. |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | Injektionsanästhetikum |
| Flüssigkeitschromatographiesystem (UPLC) | SCIEX | ExionLC AD | ExionLC AD |
| MassBank-Datenbank | MassBank-Konsortium; Massenspektrometrie-Gesellschaft Japans / MassBank Europa | — | Spektraldatenbank; Version 2024.06; Daten archiviert im Dezember 2025 |
| Masson' s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | Histologische Färbung |
| Membranfilter (0,22 & mu; m) | Beyotime | FF362 | Polyethersulfon (PES) |
| METLIN-Datenbank | Das Scripps-Forschungsinstitut / Siuzdak-Labor | RRID: SCR_010500 | Spektraldatenbank; Diese Datenbank liefert keine feste jährliche Versionsnummer; Daten, die 2023 heruntergeladen wurden |
| Methanol (LC-MS-Qualität) | Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd. | 67-56-1 | Extraktionslösungsmittel |
| Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 mL) | Corning Life Sciences (Wujiang) Co., Ltd. | MCT-150-C | Probenverarbeitung |
| Mikrotome | Leica | DSC1 | Gewebeschnitte |
| Neutrales Harz | Solarbio | G8590 | Verschlussmontage |
| Stickstoffverdampfer/Gasquelle | Organomation | N-EVAP | Probentrocknung |
| Augensalbe | Aladdin | 08-03-8009 | Augenschutz während der Anästhesie |
| Paraffin | Solarbio | YA0010 | Gewebeeinbettung |
| Paraformaldehyd (4 %) | Solarbio | P1110 | Gewebefixierung |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | DU YOU YOU | DYP1021 | Tissuewaschen |
| Phosphomolybdsäure | Solarbio | G1340 | Masson-Färbung |
| Povidone– Jod | Solarbio | IP3800 | Chirurgische Desinfektion |
| ProteoWizard-Software | ProteoWizard-Stiftung | — | Version 3.0.19254 |
| R-Software | R-Stiftung | — | Version 4.2.2 |
| Rotationsverdampfer | QINGDAO JINGCHENG INSTRUMENT CO., LTD | JC-2LZF | Koktionskonzentration unter reduziertem Druck |
| Seidennaht (2-0) | FULAN | NL30RH26A-76 | Aortenverengung |
| Beatmungsgerät für kleine Tiere | CWE Inc., USA | SAR-1000 | Mechanische Beatmung |
| Sprague & Dash; Dawley-Ratten (männlich, 8 Wochen) | SPF Bio Co., Ltd. | — | RGD_70508; Führerscheinnummer. SCXK(jing)2024-0001 |
| STRING-Datenbank | STRING-Konsortium | — | Proteinwechselwirkungsanalyse; abgerufen im Januar 2026 |
| Unterstützung von Vektorregressions-Normalisierungspaket/-skript | MetNormalizer | — | Korrektur von Signaldrift; v1.3.02 |
| TCMSP-Datenbank | TCMSP | — | Compound- und Zielrückgewinnung; abgerufen im Januar 2026 |
| UniProt-Datenbank | UniProt-Konsortium | — | Standardisierung von Gensymbolen |
| Ultraschallgel | MAGNAFLUX | 25-912 | Echokardiographie |
| Ultrareines Wasser | Im Labor vorbereitet | — | Mobilphasenlösungsmittel |
| Vortex-Mixer | Yalin | VM-ST | Sample-Mischen |
| Wasserbad | Julabo | PURA22 | Abschnitt, der bei 45 & Grad schwimmt; C |
| Weishengxin-Plattform | Weishengxin | — | Zielschnittanalyse; abgerufen im Januar 2026 |
| XCMS-Software | R-Stiftung | — | Version 3.16.1 |
| Xylen | Aladdin | X775162 | Deparaffinisierung |