Integrative Transkriptom-weite Assoziationsstudie und Mendelsche Randomisierung identifizieren LYNX1 und MS4A14 als therapeutische Ziele für Osteomyelitis

Summary

Diese Studie integriert Transkriptom-weite Assoziationsanalyse und Mendelsche Randomisierung, um systematisch Medikamentenziele für Osteomyelitis zu identifizieren. Anhand genetischer Datenbanken identifizierten die Autoren LYNX1 und MS4A14 als Schlüsselkandidatengene, heben kritische molekulare Signalwege hervor und informieren präzise therapeutische Strategien zur Behandlung von Knocheninfektionen.

Abstract

Osteomyelitis ist eine schwere Infektionskrankheit, die durch eine starke Entzündung von Knochen und Knochenmark gekennzeichnet ist und überwiegend durch bakterielle Krankheitserreger wie Staphylococcus aureus (S. aureus) verursacht wird. Allerdings werden die aktuellen Behandlungsregime erheblich durch das Auftreten von Antibiotikaresistenzen und wiederkehrenden Infektionen behindert, verursacht durch eine robuste Biofilmbildung und intrazelluläre bakterielle Persistenz. Daher besteht ein dringender Bedarf, neuartige therapeutische Ziele jenseits konventioneller Antimikrobieller zu identifizieren. Ein integrativer, rechnergestützter Ansatz, der eine transkriptomweite Assoziationsstudie (TWAS) mit einer zusammenfassenden Mendelschen Randomisierungsanalyse (SMR) kombiniert, wurde angewandt, um systematisch kausale Suszeptibilitätsgene zu identifizieren, die der Osteomyelitis zugrunde liegen. Großflächige genetische Varianten wurden als instrumentelle Variablen genutzt, um die Genexpression über Gewebe hinweg vorherzusagen und so die Erforschung kausaler Zusammenhänge zwischen diesen Zielgruppen und dem Krankheitsrisiko zu ermöglichen. Der integrative Rahmen identifizierte LYNX1 und MS4A14 als wichtige Kandidatengene und potenzielle therapeutische Ziele. Konkret war LYNX1 mit einer erhöhten Anfälligkeit für Osteomyelitis assoziiert, während MS4A14 potenzielle schützende Eigenschaften aufwies. Diese Ergebnisse heben die regulatorische Rolle dieser Gene in der Immunantwort des Wirts und der entzündlichen Modulation während einer Knocheninfektion hervor. Diese Studie überbrückt die Lücke zwischen genomweiten Assoziationsergebnissen und biologischer Interpretation, fördert das Verständnis der genetischen Grundlage der Osteomyelitis und unterstützt die Entwicklung gezielter Präzisionsmedizin-Strategien zur Verbesserung der Wirtsabwehr und Überwindung therapeutischer Resistenz.

Introduction

Osteomyelitis ist eine schwere Infektionskrankheit, die durch eine starke Entzündung von Knochen und Knochenmark gekennzeichnet ist. Sie wird häufig durch bakterielle Invasion ausgelöst, wobei Staphylococcus aureus (S. aureus) ein häufiger Erreger bei akuten und chronisch hämatogenen Erscheinungen^{ist 1,2}. Während S. aureus prominent ist, ist Osteomyelitis oft polymikrobiell, und die Ausrottung von S. aureus allein löst die Infektion nicht immer aufgrund des Bestehens nicht kultivierbarer Mikroorganismen und dynamischer Biofilm-Interaktionen ^3,4. Bei anfälligen Wirten wenden Krankheitserreger komplexe Ausweichstrategien ein, darunter intrazelluläre Persistenz in Makrophagen und die Bildung dichter Biofilme. Diese Biofilme, bestehend aus extrazellulärer DNA, Polysacchariden und spezialisierten Proteinen, bilden beeindruckende physikalische Barrieren, die den Immunabwehren des Wirts widerstehen und die Durchdringung konventioneller antimikrobieller Mittel^{einschränken.} Folglich beinhaltet die klinische Behandlung zwar typischerweise eine aggressive chirurgische Debridation und eine verlängerte Antibiotikatherapie, aber das Vorhandensein widerstandsfähiger Biofilme und polymikrobieller Gemeinschaften verringert die Wirksamkeit der Behandlung erheblich, was zu verlängerter Morbidität und wiederkehrenden Infektionen führt ^7,8. Die Aufklärung der molekularen Architektur, die den Wirts-Pathogen-Interaktionen zugrunde liegt, bleibt entscheidend für die Identifizierung neuer therapeutischer Ziele⁹.

Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben das Verständnis der Osteomyelitis vorangebracht, indem sie mehrere genetische Loci identifiziert haben, die mit der Krankheitsanfälligkeit^{assoziiert sind}. Aufgrund strenger Mehrfachtest-Schwellenwerte sowie Beschränkungen in statistischer Stärke und Stichprobengröße bleiben jedoch viele kritische Loci, die die Osteomyelitis-Anfälligkeit beeinflussen, wahrscheinlich unentdeckt⁷. Darüber hinaus bleibt die Interpretation der GWAS-Befunde schwierig, da die meisten identifizierten Varianten in nicht-kodierenden oder intergenen Regionen liegen, was auf regulatorische Effekte auf die Genexpression und nicht auf direkte Veränderungen der Proteinstruktur¹¹ hindeutet. Darüber hinaus fehlt es primären GWAS-Daten an direkter Gewebespezifität, was komplementäre Downstream-Analysen erforderlich macht, um die zellulären Kontexte zu bestimmen, in denen diese Varianten ihre Wirkung zeigen. Transkriptomweite Assoziationsstudien (TWAS) adressieren diese Einschränkungen, indem sie genetisch vorhergesagte Genexpression aus Referenzpanels in bestehende GWAS-Datensätze integrieren, was eine systematische Identifikation funktionell relevanter krankheitsassoziierter Gene über mehrere Gewebe hinweg ermöglicht¹².

Um die kausale Inferenz zu stärken, verwendet die Mendelsche Randomisierung (MR) genetische Varianten als instrumentelle Variablen, wobei die zufällige Zuweisung von Allelen bei der Empfängnis genutzt wird, um Störungen zu reduzieren und die Kausalität umzukehren^13,14. Analysen von Expression Quantitative Trait Loci (eQTL) verknüpfen GWAS-Varianten weiter mit Gentranskription¹⁵, während die zusammenfassende Mendelsche Randomisierung (SMR) GWAS- und QTL-Datensätze integriert, um kausale Gene zu priorisieren und sie von Assoziationen zu unterscheiden, die durch Verknüpfungsungleichgewicht durch Heterogenitätstests verursacht werden¹⁶.

Diese Studie stellt die erste Anwendung eines integrativen TWAS- und MR-Rahmens dar, das sich speziell auf Osteomyelitis konzentriert und die Lücke zwischen GWAS-Befunden und klinisch umsetzbaren Erkenntnissen adressiert. Durch die Kombination experimenteller transkriptomischer Daten mit groß angelegten populationsgenetischen Daten wurden Krankheitsanfälligkeitsgene systematisch kartiert und kausale Beziehungen abgeleitet. Diese integrative Strategie zielt darauf ab, bisher unbekannte molekulare Wege aufzudecken, die an der Resistenz des Wirts gegen Osteomyelitis beteiligt sind, und Kandidatenziele für die präzise Therapieentwicklung zu identifizieren.

Protocol

Alle zusammenfassenden Statistiken, die in den Mendelian Randomization (MR) und Transcriptome-Wide Association Study (TWAS) Analysen verwendet wurden, basierten ausschließlich auf zuvor veröffentlichten, deidentifizierten Datensätzen. Ethische Genehmigung und individuelle Zustimmung für die Originalstudien sind in den jeweiligen Publikationen dokumentiert. Folglich wurde die zusätzliche ethische Genehmigung für diese Data-Mining-Studie vom Institutional Review Board des Tongde-Krankenhauses der Provinz Zhejiang (Zhe Tongde Lunshen 2024 [Yan] Nr. 028-JY) aufgehoben. Die für diese Forschung verwendeten Werkzeuge sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. RNA-seq-Datenerfassung und -verarbeitung

Transkriptomdaten wurden aus der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank (GSE272198) gewonnen, um die Konservierung angeborener Immunwege bei Säugetierarten für die erste Validierung zu bewerten¹⁷. Knochenmark-abgeleitete Makrophagen (BMDMs) wurden 1 Stunde lang mit S. aureus infiziert (Infektionsvielfachheit, MOI = 10), gefolgt von einer Behandlung mit Lysostaphin (20 μg/mL) und Gentamicin (50 μg/mL) zur Entfernung von extrazellulären Bakterien. Nach drei Waschverfahren mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden BMDMs 24 Stunden lang kultiviert, in einem vollständigen RNA-Extraktionsreagenz lysiert und sequenziert.

Die RNA-Qualität wurde mit einem automatisierten Elektrophoresesystem bewertet, um die Integrität sicherzustellen. Die Bibliotheken wurden aus drei unabhängigen Experimenten vorbereitet und auf einer Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform sequenziert. Rohwerte wurden mit STAR (v2.7.10a) auf das Mausgenom (GRCm38, mm10) ausgerichtet. Differenziell exprimierte Gene (DEGs) wurden mit DESeq2 (v1.38.0) identifiziert. Um Fehlalarme zu mindern, wurde die statistische Signifikanz als angepasster p-Wert (FDR) definiert, < 0,05 und |log₂-fache Änderung| > 1. Die Analyse der Gen-Ontologie (GO) wurde mit clusterProfiler (v4.6.0) durchgeführt, und die Gen-Satz-Anreicherungsanalyse (GSEA) wurde mit GseaVis (v0.0.5) durchgeführt. Heatmaps wurden mit dem pheatmap-Paket (v1.0.12) in R (v4.2.0) generiert.

TWAS-Analyse

Ganzblut-RNA-Sequenzierung und Ganzgenom-Sequenzierung (WGS)-Daten wurden aus dem Genotype-Tissue Expression (GTEx)-Projekt (V8)¹⁸ gewonnen. Vortrainierte Genexpressionsmodelle wurden aus einem öffentlichen Repository (https://doi.org/10.5281/zenodo.3842289) verwendet. Zusammenfassende Osteomyelitis-Statistiken für TWAS wurden vom FinnGen-Konsortium abgerufen, bestehend aus 2.336 Fällen und 473.264 Kontrollgruppen¹².

TWAS wurde mit drei Algorithmen durchgeführt: Gelenkgewebeimputation (JTI), PrediXcan¹⁹ und UTMOST ^12,20. JTI schätzt die Genexpressionsähnlichkeit und die Zugänglichkeit von epigenetischen Chromatinen, um die Vorhersagegenauigkeit zu optimieren. PrediXcan wendet elastische Netzregression mit fünffacher Kreuzvalidierung an, während UTMOST die Genauigkeit durch Nutzung von Multi-Gewebe-Expressionsdaten mit sparse-group LASSO erhöht. Das modifizierte UTMOST-Rahmenwerk, beschrieben von Zhou et ^al.12, standardisiert Hyperparameter für unverzerrte Schätzungen. Gene mit stabilen Kreuzvalidierungswerten – vordefiniert als Korrelationskoeffizient r > 0,1 und prädiktive Signifikans p < 0,05²¹ – wurden als imputierbar beibehalten. Vollblut-Transkriptommodelle wurden mit SNP-Kovarianzmatrizen aus dem 1000 Genomes-Referenzdatensatz etabliert.

Zusammenhänge zwischen vorhergesagter Genexpression und Osteomyelitis-Risiko wurden anschließend analysiert. Um Mehrfachtests zu berücksichtigen, wurde die statistische Signifikanz für TWAS hauptsächlich mit einer False Discovery Rate (FDR)-Schwelle von < 0,05 definiert. Angesichts des hypothesengenerierenden Charakters dieser mehrstufigen Studie wurden auch Loci, die eine suggestive (nominale) Schwelle von p < 0,05 erreichten, für downstream-Mendelsche Randomisierungs- (SMR)- und Kolokalisierungsanalysen priorisiert. Diese integrative Strategie zielt darauf ab, die Erfassung potenzieller regulatorischer Faktoren zu maximieren und dabei auf Multi-OMIC-Cross-Validation (TWAS + SMR) zu setzen, um die Robustheit der priorisierten Kandidaten sicherzustellen.

SMR-Analyse

Diese Studie hielt sich an die Richtlinien²² zur Stärkung der Berichterstattung über Beobachtungsstudien in der Epidemiologie (STROBE). Um rechnerisch einen Phänotyp zu definieren, der die genetische Veranlagung für mitochondriale Dysfunktion repräsentiert (im Folgenden für Analysezwecke als "Mitodys" bezeichnet), wurden Transkripte, die allen bekannten mitochondrial-bezogenen Genen entsprechen, aus der MitoCarta3.0-Datenbank²³ extrahiert. Dieser Gensatz diente als vordefinierte, biologisch fundierte Grundlage für die spätere polygene Risikovorhersage. Alle nachgelagerten funktionalen Interpretationen im Zusammenhang mit "Mitodien" stammen aus dieser rechnergestützten Schlussfolgerung und sollten als prädiktiv und hypothesengenerierend betrachtet werden.

Expression quantitative Trait Loci (eQTL)-Instrumente wurden mit Varianten innerhalb von 1000 kb von Codierungssequenzen (cis-eQTLs) generiert. Zusammenfassungsstatistiken stammen aus dem eQTLGen Consortium und GTEx V8²⁴. Insgesamt wurden 8.932.843 SNPs, die mit 1.013 mitodysbezogenen Transkripten verknüpft sind, basierend auf einer genomweiten Signifikanzschwelle P < 5E-8 ausgewählt. Ausgangswerte zu GWAS-Ergebnissen für Osteomyelitis-Ergebnisse wurden aus FinnGen²⁰ gewonnen.

Die auf Zusammenfassung basierende Mendelian Randomization (SMR)-Analyse wurde mit SMR (Version 1.0.3) mit Standardparametern durchgeführt, um pleiotrope Assoziationen zwischen Genexpressionsmerkmalen und Osteomyelitis-Ergebnissen zu schätzen. Der kausale Effekt beta_mitodys–Osteomyelitis repräsentiert die geschätzte log-Odds-Effektgröße der mitochondrialen Dysfunktion auf Osteomyelitis und wird berechnet als:

Odds Ratios (ORs) repräsentieren die Veränderung pro natürlicher logarithmischer Erhöhung der standardisierten Genexpressionsniveaus um eine Einheit. Die Kolokalisierung wurde weiter mit dem HEIDI-Test (Heterogenität in abhängigen Instrumenten) bewertet.

Results

Charakterisierung der Massen-RNA-Sequenzierung und funktioneller Anreicherungen

Nach der Methodik, die zur Isolierung uninfizierter (Kontroll) versus S. aureus-infizierte BMDMs verwendet wurde, wurden in der experimentellen Gruppe 3.775 DEG identifiziert, darunter 1.686 hochregulierte und 2.089 herunterregulierte Gene. Die GO-Analyse zeigte ein Netzwerk, das stark für die angeborene Immunaktivierung angereichert ist, einschließlich po...

Discussion

Durch die Integration von TWAS- und SMR-Analysen über translationale Datensätze hinweg identifizierte diese Studie ein zentrales Netzwerk genetischer Loci, die mit Osteomyelitis-Phänotypen assoziiert sind. Die Identifizierung von LYNX1 und MS4A14 als Kandidatengen-Ziele stellt einen wichtigen Beitrag dar, der mechanistische Einblicke über konventionelle GWAS-Ergebnisse hinaus bietet, indem er den transkriptomischen Kontext einbezieht. Dieser integrative Ansatz hebt das Potenzial von Präz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
clusterProfiler	Guangchuang Yu's Team (Sun Yat-sen University)	Nicht zutreffend	Wird für die Gene Ontology (GO) funktionelle Anreicherungsanalyse von unterschiedlich exprimierten Genen verwendet.
DESeq2	Bioconductor Project (Open Source)	Nicht zutreffend	Wird verwendet, um unterschiedlich exprimierte Gene (DEGs) zu identifizieren
GSEA / GseaVis	Broad Institute / Open Source Community	Nicht zutreffend	Wird für die Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) verwendet, um koordiniert exprimierte Gensets zu identifizieren. GseaVis wird wahrscheinlich für die Visualisierung verwendet.
HEIDI (Heterogeneity in Dependent Instruments) test	Integrierte Funktion innerhalb der SMR-Software	Nicht zutreffend	Wird verwendet, um zu testen, ob die in SMR beobachtete Assoziation durch Linkage Disequilibrium und nicht durch eine gemeinsame kausale Variante verursacht wird. P_HEIDI > 0,05 zeigt keine wesentliche Heterogenität an
JTI (Joint-Tissue Imputation)	Zhou et al. (Open Source Model)	Nicht zutreffend	Ein TWAS-Algorithmus, der die Genexpressionsähnlichkeit und epigenetische Chromatin-Zugänglichkeit schätzt, um die Vorhersagegenauigkeit zu optimieren.
pheatmap	Raivo Kolde (R-Paket)	Nicht zutreffend	Wird verwendet, um Heatmaps unterschiedlich exprimierter Gene für die Datenvisualisierung zu erzeugen.
PrediXcan	Gamazon et al. (Open Source Model)	Nicht zutreffend	Ein TWAS-Algorithmus, der eine elastische Netzregression mit fünffacher Kreuzvalidierung anwendet, um Genexpressionsdaten zu schätzen und die Assoziation mit dem Krankheitsrisiko zu testen.
SMR (Summary-data-based Mendelian Randomization)	Entwickelt von einem Team an der Fudan University (Open Source Software)	Nicht zutreffend	Wird verwendet, um eine zusammenfassungsbasierte Mendelsche Randomisierungsanalyse durchzuführen, um kausale Assoziationen zwischen Genexpression und Osteomyelitis-Risiko zu untersuchen. Version 1.0.3 wurde verwendet.
STAR	Alexander Dobin (Cold Spring Harbor Laboratory)	Nicht zutreffend	Wird verwendet, um RNA-Seq-Reads auf das Referenzgenom (Mausgenom GRCm38/mm10) auszurichten.
UTMOST	Hu et al. (Open Source Model)	Nicht zutreffend	Ein TWAS-Algorithmus, der die Vorhersagegenauigkeit durch die Nutzung von Multi-Tissue-Expressionsdaten in einem Sparse Group LASSO Framework verbessert.