Ein Mausmodell einer einzelnen und wiederholten rotierenden geschlossenen Kopf-Gehirnverletzung

Zusammenfassung

Ein reproduzierbares Mausmodell der rotationsbedingten Gehirnschädigung wird beschrieben und bietet eine vielseitige Methode, um die subtilen funktionellen und biologischen Grundlagen – einschließlich neurovaskulärer, entzündlicher und Verhaltensänderungen – nach einzelnen oder wiederholten Wirkungen ohne offensichtliche strukturelle Hirnschäden zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Gehirnerschütterung (CBI), das pathophysiologische Substrat, das der klinischen Gehirnerschütterung zugrunde liegt, ist eine häufige, aber unzureichend verstandene Erkrankung mit potenzieller langfristiger neurologischer Beeinträchtigung bei einer Teilgruppe der Patienten. Insbesondere repetitive CBI, also bei Kontaktsportarten, wurde mit anhaltenden kognitiven Defiziten und progressiver Neurodegeneration (z. B. chronisch traumatische Enzephalopathie, CTE) in Verbindung gebracht. Um diese Wissenslücke zu schließen, wurde ein reproduzierbares Mausmodell einer geschlossenen Kopfrotations-Hirnverletzung entwickelt, das zentrale biomechanische und pathologische Merkmale der CBI wiederholt. Ein stereotaktisch gelenkter elektromagnetischer Impaktor wurde verwendet, um einen standardisierten Schlag auf den intakten Schädel zu führen. Um die fokale Belastung des Schädels und des angrenzenden Hirngewebes zu verringern, wurde die Imporspitze mit einer maßgefertigten Silikonkappe ausgestattet. Diese Konfiguration induzierte zuverlässig eine Kopfrotation mit geringer Variabilität zwischen Tieren und verhinderte gleichzeitig Schädelbrüche oder mikroskopische Gewebeverletzungen. Um die physiologische neuronale und vaskuläre Aktivität zu erhalten und potenziell neuromodulatorische Auswirkungen der Tiefenanästhesie zu vermeiden, wurde bei bewussten Mäusen unter leichter Sedierung mit dem α2-Agonisten Medetomidin eine Hirnverletzung hervorgerufen. Die induzierten Aufprall verursachten reproduzierbare rotierende Kopfbewegungen mit nur geringer Variabilität, die auf die Kopfposition zurückzuführen ist. Die strukturelle Hirnintegrität wurde mittels in vivo T2-gewichteter Magnetresonanztomographie bewertet und durch ex vivo histologische Analysen bestätigt, die keine Hinweise auf Gewebestörungen, Prellungen oder Mikroblutungen zeigten, jedoch eine milde, weitreichende Störung der mikrovaskulären Grenzfläche. Dieses neuartige Modell der rotativen geschlossenen Kopfverletzung bietet eine robuste experimentelle Grundlage für longitudinale Untersuchungen subtiler neurovaskulärer, entzündlicher und Blut-Hirn-Barriere-Veränderungen, die ohne offensichtliche strukturelle Pathologie auftreten. Seine Anwendung ermöglicht mechanistische Einblicke in die Pathophysiologie klinischer Gehirnerschütterungen und mögliche neurodegenerative Folgen wiederholter Verletzungen und erleichtert so die Entwicklung dringend benötigter klinischer Biomarker.

Einleitung

Traumatische Hirnverletzung (TBI) bleibt eine bedeutende Ursache für langfristige Behinderung in allen Altersgruppen, wobei Jugendliche und junge Erwachsene überproportional^{betroffen sind 1,2,3}. Die überwiegende Mehrheit der TBI wird als mild (mTBI) klassifiziert und wird auf klinischer Ebene häufig als Gehirnerschütterung bezeichnet. Obwohl eine Gehirnerschütterung per Definition nicht mit offensichtlicher struktureller Hirnschädigung assoziiert ist, die durch konventionelle Neurobildgebung nachweisbar ist, deuten zunehmend Hinweise darauf hin, dass der zugrunde liegende Verletzungsmechanismus – hier als Gehirnerschütterung (CBI) bezeichnet – eine eigenständige und klinisch relevante pathophysiologische Entität darstellt.

Insbesondere wird wiederholte CBI, insbesondere wenn sie in kurzer Zeitfolge auftritt, wie sie häufig in Kontaktsportarten und militärischen Einrichtungen vorkommt, mit anhaltendem kognitiven Abbau, neuropsychiatrischen Symptomen und der Entwicklung einer chronischen traumatischen Enzephalopathie (CTE^{) in} Verbindung gebracht1,2,3. Diese scheinbare Diskrepanz zwischen der milden Natur der ursprünglichen Verletzung und dem Potenzial langfristiger neurologischer Folgen stellt sowohl für die klinische Diagnose als auch für die mechanistische Forschung eine große Herausforderung dar.

Neue Belege deuten darauf hin, dass subtile, aber anhaltende Veränderungen an der neurovaskulären und neuroglialen Schnittstelle einen relevanten Krankheitsmechanismus darstellen⁴. Diese Veränderungen umfassen die Integrität der Blut-Hirn-Schranke (BBB), mikrovaskuläre Struktur, gliale Aktivierung, neuronale Erregbarkeit und endogene Reparaturprozesse, was die zelluläre Pathophysiologie potenziell mit den langfristigen funktionellen und verhaltensbedingten Defiziten verknüpft, die nach insbesondere wiederholtem CBI 5,6,7,8 beobachtet wurden . Insgesamt werden solche Veränderungen zunehmend als potenzielle Ursachen für die verzögerten funktionellen und verhaltensbezogenen Defizite nach CBI erkannt. Die diffuse und facettenreiche Natur erschwert jedoch ein mechanistisches Verständnis und hat bisher die Entwicklung gezielter therapeutischer Interventionen behindert.

Präklinische Modelle, die zentrale Aspekte der pathophysiologischen Kaskade wiederholen, sind entscheidende Werkzeuge, um diese Mechanismen zu analysieren und neue therapeutische Wege zu identifizieren. Obwohl es eine breite Palette experimenteller TBI-Modelle gibt, wurden die meisten entwickelt, um mittelschwere bis schwere Verletzungen nachzuahmen oder auf fokale strukturelle Schäden^{zu basieren 9,10,11}. Im Gegensatz dazu gibt es einen erstaunlichen Mangel an Tiermodellen für den charakteristischen Verletzungsmechanismus von CBI⁵. Meistens wird ein als "mild" bezeichnetes zerebrales Trauma durch einen fokalen Aufprall auf den starr fixierten Kopf oder sogar durch einen direkten kortikalen Aufprall nach einer Kraniotomie ausgelöst, was dem diffusen, durch Beschleunigung und Verzögerung getriebenen Verletzungsmechanismus, der eine Gehirnerschütterung^{beim Menschen definiert}, grundsätzlich widerspricht^. Obwohl solche Ansätze eine präzise Kontrolle über Verletzungsparameter ermöglichen, verringert ihre begrenzte Fähigkeit, die Dynamik realer Gehirnerschütterungen zu replizieren, ihre translationale Relevanz.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, existieren mehrere Methoden, um eine replizierbare und diffuse geschlossene Hirnverletzung 12,13,14 zu induzieren. Aufbauend auf diesen Konzepten und mit dem Ziel, die technische Komplexität zu minimieren, wurde ein kontrolliertes Rotationsverletzungsmodell bei Mäusen entwickelt, das einen kommerziell erhältlichen elektromagnetischen Impaktor verwendet, der oft in anderen experimentellen Traumamodellen verwendet wird (z. B. kontrollierter kortikaler Aufprall, CCI). Durch die reproduzierbare Wirkung auf den frei beweglichen Kopf erhält dieser Ansatz die strukturelle Integrität und ermöglicht gleichzeitig die longitudinale Untersuchung neurovaskulärer, neuroglialer und funktioneller Veränderungen nach einzelner und wiederholter CBI unter Bedingungen, die den biomechanischen Merkmalen einer menschlichen Gehirnerschütterung nahekommen.

In Kombination mit longitudinaler Verhaltensbewertung, in-vivo-Bildgebung und ex-vivo-Histologie bietet dieses Modell eine vielseitige und zugängliche Plattform, um neurovaskuläre, gliale und Verhaltensänderungen nach einzelnen oder wiederholten Auswirkungen zu untersuchen. Daher eignet es sich hervorragend zur Untersuchung der subtilen sekundären Krankheitsmechanismen der CBI, zur Identifikation translationaler Surrogatparameter und zur Bewertung potenzieller therapeutischer Interventionen in einem klinisch relevanten experimentellen Kontext.

Protokoll

Alle Tierverfahren entsprachen dem deutschen Tierschutzgesetz und wurden von institutionellen und staatlichen Behörden genehmigt (LANUV Nordrhein-Westfalen; AZ 81-02.04.2020.A058). Die Experimente wurden nach den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Ein schematischer Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll induziert zuverlässig eine Gehirnerschütterung, wie ein definiertes Panel struktureller, verhaltensbezogener und neurovaskulärer Validierungsergebnisse belegt (Abbildung 2). Alle in dieser Studie verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle detailliert dargestellt.

1. Allgemeine Überlegungen

HINWEIS: Mäuse wurden sozial unter standardisierten Bedingungen (12-Stunden-Hell/Dunkelzyklus) mit Ad-Libitum-Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Die Mäuse wurden mindestens sieben Tage vor der Operation an die Versuchseinrichtung gewöhnt. Insgesamt wurden in dieser Pilotstudie 40 Mäuse eingesetzt, wobei 10 Tiere jeder Versuchsgruppe zugeordnet wurden (Sham als Kontrollgruppe, Einzel-CBI-Gruppe, repetitive CBI bei Hochfrequenzen und repetitive CBI in Niederfrequenzgruppen). Stellen Sie ein Hochgeschwindigkeitskamerasystem auf Augenhöhe auf, wobei der Mauskopf fest vor der Maus steht (z. B. 10 cm). Um Konsistenz über die Prüfungen hinweg zu gewährleisten, halten Sie die Kameraposition und -ausrichtung konstant. In dieser Studie wurde eine GoPro Hero6 mit 240 Bildern pro Sekunde (fps) und einer Auflösung von 1080px verwendet. Die Open-Source-Bewegungsanalyse-Software Kinovea (Version 2025.2.0) wird für die beschriebenen kinematischen Analysen verwendet.

2. Analgesie und Anästheseinleitung

1. Bereiten Sie das Setup vor, einschließlich des stereotaktischen Rahmens und der Befestigung für den elektromagnetischen Impaktor.
2. Verabreichen Sie Tramadol (1 mg/mL) zwei Tage vor der Einleitung von Trauma mit Wasser und setzen Sie das für drei Tage nach der (letzten) Operation fort.
3. Anästhesie wird mit Isofluran in einem Lachgas/Sauerstoff-Gemisch (O₂ 30 %, N₂O 70 %) induziert, mit 4–4,5 % Isofluran in einer Induktionskammer.
4. Beurteilen Sie die chirurgische Toleranz mit dem Zehenknurfreflex. Fahren Sie fort, sobald eine Rückzugsreaktion fehlt.
5. Nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und legen Sie sie auf ein Heizkissen innerhalb des stereotaktischen Rahmens. Halten Sie die Kerntemperatur bei 37 ± 1,0 °C mit einer faseroptischen rektalen Sonde. Schützen Sie die Augen vor Austrocknung, indem Sie eine Augensalbe auftragen.
6. Halten Sie die Anästhesie aufrecht, indem Sie Isofluran mit 2,0–2,5 % über einen Nasenkegel abgeben, der mit dem stereotaktischen Aufbau verbunden ist.

3. Vorbereitung des Schädels

1. Fixiere die Maus im stereotaktischen Rahmen mit speziellen Ohrbügeln.
2. Rasieren Sie die Kopfhaut und desinfizieren Sie den Operationsbereich gründlich mit einem alkoholbasierten Antiseptikum.
3. Lokale Betäubung wird durch subkutane Injektion von Bupivacain (0,1 mg/kg) angewendet.
4. Überprüfen Sie den Zehen-Kneifreflex vor dem Hautschnitt erneut. Nur ohne Entzugsreaktion werden durchgeführt, um eine gleichmäßige Tiefe der Anästhesie sicherzustellen.
5. Führen Sie einen Hautschnitt in der Mittellinie von etwa 7 mm durch, um den Schädel freizulegen.
6. Den Schädel vorsichtig über dem rechten Scheitelbein zwischen Bregma und Lambda freilegen.
7. Stellen Sie sicher, dass der stereotaktische Rahmen senkrecht zum Schädel ausgerichtet ist, wobei die vertikale Achse in einem 90°-Winkel zur Kopfoberfläche positioniert ist.
8. Befestige einen Markierungsstift in den stereotaktischen Halter und zentriere ihn direkt auf Bregma.
9. Null alle stereotaktischen Koordinaten und verschiebe den Marker-Pin auf die vordefinierte anteroposteriore (AP) und mittellaterale (ML) Koordinate (in unserem Modell bei AP 0,5, ML -2,5). Markiere den Zielpunkt mit einem wasserresistenten Filzstift.

4. Anpassung der Analgesie

1. Lass die Maus von den Ohrbügeln los.
2. Injizieren Sie Medetomidin subkutan (0,5 mg/kg) und reduzieren Sie den Isofluran schrittweise auf <0,5 %.
3. Halten Sie die Anästhesie bei < 0,5 % Isofluran aufrecht, während Sie kontinuierlich Atmung und Körpertemperatur überwachen.
4. Erlauben Sie unter diesen Bedingungen für 10 Minuten ein Gleichgewicht, um einen gleichmäßigen Anästhesiezustand zu erreichen und gleichzeitig die neuronale Netzwerkaktivität zu erhalten. Atemfrequenz, fehlende Reflexreaktionen und stabile Körpertemperatur (37 ± 1,0 °C) wurden als standardisierte Indikatoren verwendet, um eine vergleichbare Anästhesietiefe bei Tieren sicherzustellen.

5. Aufprallinduktion

HINWEIS: Vor dem Experiment sollte ein Kopfhalter für das Tiermodell aus kommerziell erhältlicher Polyethylen-(PE)-Schaumrohrisolierung hergestellt werden, einem geschlossenen, nicht vernetzten Polymerschaum, der die Abwärtsbeschleunigung einschränkt und gleichzeitig Rotationsbewegungen erlaubt. Zusätzlich sollte eine maßgefertigte 5-mm-Kugelschlagspitze aus Silpuran gefertigt werden (Verhältnis 1:1; Steifigkeit 830 kPa).

1. Entfernen Sie die rektale Temperaturprobe und beenden Sie die Isofluranabgabe, dann legen Sie die Maus in Bauchlage auf den Kopfhalter.
2. Befestigen Sie die maßgefertigte Silikonkappe an der kommerziell erhältlichen Schlagvorspitze.
3. Installieren Sie den elektromagnetischen Impaktor in den stereotaktischen Halter und stellen Sie sicher, dass das Gerät in einem 10°-Winkel zur Schädeloberfläche ausgerichtet ist.
4. Richten Sie die Impaktorspitze über dem vordefinierten Zielbereich auf dem Schädel aus.
5. Senken Sie die Schlagvorrichtung in der ausgestreckten Position, bis sie leicht die Schädeloberfläche berührt.
6. Ziehe die Impaktorspitze zurück und führe sie auf die gewünschte Einkerbungstiefe (d. h. 3 mm in diesen Experimenten) in Richtung Schädeloberfläche. Bei Kontrolltieren lassen Sie das Absenken weg und erhöhen Sie stattdessen die Spitze um denselben Betrag.
7. Fang mit der Videoaufnahme an. Einen einzelnen rotativen Stoßstoß erzeugen, indem der elektromagnetische Blitz über den Steuerschalter mit einer Geschwindigkeit von 5 mm/s und einer Pulsdauer von 0,1 ms ausgelöst wird.
8. Ziehen Sie den Impakt sofort nach Abschluss des Aufpralls ein.
9. Antagonisieren Sie die Medetomidin-Anästhesie mit dem Antagonisten Atipamazol (0,5 mg/kg, s.c.).

6. Nachwirkungsbeurteilung und Wundverschluss

1. Drehen Sie die Maus in eine Rückenposition.
2. Bewerten Sie den Aufrichtreflex, indem Sie die Zeit aufzeichnen, die das Tier benötigt, um in eine Bauchlage zurückzukehren.
3. Anästhesie wird mit Isofluran in einer Distickstoff-/Sauerstoffmischung (O₂ 30 %, N₂O 70 %) bei 4 % Isofluran erneut induziert.
4. Nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und legen Sie sie auf das Heizkissen neben dem stereotaktischen Rahmen. Halten Sie die Kerntemperatur bei 37 ± 1,0 °C mit einer faseroptischen rektalen Sonde.
5. Fixiere die Maus im stereotaktischen Rahmen mit Ohrbügeln.
6. Schließen Sie den Hautschnitt mit unterbrochenen Nähten und selbstabsorbierenden Filamenten (z. B. Polyglactin 910, 6-0).
7. Übertragen Sie die Maus in eine Wärmebox und überwachen Sie, bis sie vollständig das Bewusstsein wiedererlangt hat.
8. Bringen Sie das Tier zurück in seinen Stammkäfig.

7. Wiederholtes Impact-Paradigma

1. Weisen Sie Mäuse Sham-, Einzel- oder wiederholten CBI-Gruppen entsprechend dem experimentellen Design zu.
2. Für Gruppen mit wiederholter Verletzung planen Sie aufeinanderfolgende CBI-Sitzungen in festgelegten Abständen (z. B. alle 48 Stunden).
3. Vor jeder weiteren CBI verabreichen Sie eine präoperative Analgesie mittels Tramadol im Trinkwasser, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben.
4. Wiederholte Anästhesie, stereotaktische Markierung und Aufprall nach demselben Verfahren wie in den Abschnitten 3–6 beschrieben, einschließlich Lokalanästhesie mit Bupivacain (0,1 mg/kg, s.c.), Medetomidin-Verabreichung (0,5 mg/kg, S.c.) bei Aufrechterhaltung von Isofluran bei < 0,5 %, stereotaktisches Zielverfahren bei AP 0,5 und ML −2,5 relativ zu Bregma sowie die Abgabe eines rotationsbedingten Aufpralls mit einem elektromagnetischen Impaktor (Einkerbungstiefe 3 mm, Geschwindigkeit 5 mm/s, Pulsdauer 0,1 ms, 10° Winkel relativ zur Schädeloberfläche).
5. Sicherstellen Sie eine einheitliche Positionierung (Bauchlage auf einem Polyethylen-Schaumkopfhalter, der Rotationsbewegung ermöglicht), identische Aufprallparameter (Winkel, Tiefe, Geschwindigkeit und Dauer) sowie standardisierte peri- und postprozedurale Bedingungen, einschließlich Medetomidinantagonisierung mit Atipamazol (0,5 mg/kg, S.c.), Re-Induktion der Anästhesie (4 % Isofluran in O₂ 30 %/N₂O 70 %) und Temperaturkontrolle bei 37 ± 1,0 °C über wiederholte Sitzungen hinweg, um die Reproduzierbarkeit über Tiere und Zeitpunkte zu gewährleisten.
6. Stellen Sie über wiederholte Sitzungen hinweg eine einheitliche Positionierung, Aufprallparameter und Erholungsbedingungen sicher, um die Reproduzierbarkeit über Tiere und Zeitpunkte hinweg zu gewährleisten.
7. Überwachen Sie Tiere kontinuierlich auf kumulative Verhaltensdefizite nach wiederholten Einflüssen.

8. Kinematische Analyse

1. Exportiere die Videos im Standardformat (z. B. MP4) zur Analyse und lade sie in die Kinovea-Software.
2. Navigiere zum entsprechenden Zeitfenster, das Vor- und Nachaufprall-Frames enthält (z. B. -0,025 bis 0,3 Sekunden vom Aufprall). Stelle sicher, dass du in den Softwareeinstellungen eine angemessene Bildrate (z. B. 240 fps) einstellst. Definiere eine Skalierungsreferenz (z. B. Entfernung zwischen den Augen).
3. Verwenden Sie das Tracking-Tool von Kinovea, um ein Dreipunkt-Tracking-System einzurichten (z. B. rechtes Auge, linkes Auge, Nase; Abbildung 3A). Beginnen Sie mit der Verfolgung für jeden Punkt und korrigieren Sie manuell Tracking-Fehler, besonders bei schneller Bewegung oder Okklusion.
4. Exportiere nachgefolgte Koordinaten als CSV- oder Excel-Dateien.
   HINWEIS: Weitere kinematische Analysen wurden mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Skript durchgeführt. Zeitaufgelöste Tracking-Daten, die von Kinovea exportiert wurden, wurden importiert und vorbearbeitet, um ungültige Einträge zu entfernen und eine konsistente Zeitskalierung sicherzustellen. Die Kopfübersetzung wurde als Schwerpunkt der drei erfassten Orientierungspunkte (rechtes Auge, linkes Auge und Nase) definiert, aus denen lineare Verschiebung, Geschwindigkeit und Beschleunigung mittels numerischer Differenzierung abgeleitet wurden. Die Kopfrotation wurde anhand der Ausrichtung der Auge-Nase-Achse geschätzt, wobei die Winkelverschiebung relativ zur Ausgangslinie vor dem Aufprall und der Winkelgeschwindigkeit als erste Ableitung berechnet wurde. Um die Rauschverstärkung zu reduzieren, wurden alle Positions- und Winkelsignale vor der Differenzierung mit einem Savitzky–Golay-Filter geglättet. Der primäre Ergebnisparameter war die maximale Winkelverschiebung, während Geschwindigkeits- und Beschleunigungsprofile als relative Maße der Kopfbewegungsdynamik über Versuche hinweg analysiert wurden.

Ergebnisse

Allgemeine Überlegungen:

Die Anwendung dieses Protokolls induziert reproduzierbar eine Gehirnerschütterung, wie ein definierter Satz struktureller, verhaltensbezogener und neurovaskulärer Validierungsdaten zeigt (siehe Abbildung 2). Die strukturelle Integrität wurde nach der Verletzung erhalten. Es wurde keine offensichtliche makroskopische Gewebestörung oder Blutung festgestellt, was darauf hindeutet, dass das P...

Diskussion

Ein neuartiges Mausmodell der geschlossenen Kopf-CBI, das auf einer Beschleunigungs-Verzögerungs-Verletzung basiert, ist charakterisiert und weist eine leichte, aber weit verbreitete Beeinträchtigung des BBB sowie einen charakteristischen neuropsychiatrischen Phänotyp auf, der an eine klinische Gehirnerschütterung erinnert. Indem zentrale Merkmale der CBI kontrolliert und konsistent reproduziert werden, während die strukturelle Integrität erhalten bleibt, bietet das Modell einen nützlich...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Medikament
Antipamezole	Vetoquinol	VM 06043/4004	Medetomidin-Antagonist (α2-Adrenozeptor-Antagonist), subkutan (0,5 mg/kg)
Bepanthen Augensalbe	Bayer	11809917	Augenschutz während der Anästhesie, topisch
Bupivacain	Sigma-Aldrich	B1160000	Lokalanästhesie, subkutan (0,1 mg/kg)
Isofluran	CP pharma	1214CN	Anästhesie, Inhalation (Induktion und Aufrechterhaltung)
Medetomidin	Vetoquinol	VM 06043/4003	Sedativ/Anästhetikum-Adjunkt (α2-Adrenozeptor-Agonist), subkutan (0,5 mg/kg)
Tramadol-Hydrochlorid (100 mg/ml)	Grünenthal	6867645	Analgetikum, verabreicht über das Trinkwasser, 1 mg/ml Endkonzentration für Mäuse, von 2 Tagen vor bis 3 Tagen nach der Operation
Ausrüstung
Polyethylen-Halskissen	Custom		Unterstützung für die Bauchlage während des Aufpralls
Sterotaxische Impaktor Silupran Abdeckung	Custom		Verteilt die mechanische Belastung, verhindert lokale Schädelschäden, angebracht am Impaktor-Spitze, 830 kPa
Sterotaxischer Impaktor	Leica Biosystems	39463923/IM10131	Elektromagnetisches Aufprallgerät für kontrollierte Aufprallübertragung
Werkzeuge
GoPro Hero6	GoPro Inc., San Mateo, CA, USA
Kinovea		(Version 2025.2.0)
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, USA	N/A