Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur biologischen Feinjustierung des plättchenreichen Fibrins durch Anreicherung mit Cobalamin und Alpha-Tocopherol vor der Zentrifugation, was eine kontrollierte Modulation von Wachstumsfaktoren und Zytokinfreisetzung unter in vitro-Bedingungen ermöglicht.
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Forschungsartikel
Anreicherung von plättchenreichem Fibrin mit Cobalamin und Alpha-Tocopherol zur Modulation der Wachstumsfaktorfreisetzung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Thrombozytenreiches Fibrin (PRF) ist ein autologes Biomaterial, das aufgrund seiner Biokompatibilität und der anhaltenden Freisetzung von Wachstumsfaktoren in der regenerativen Zahnmedizin weit verbreitet verwendet wird. Die jüngste Forschung hat sich darauf konzentriert, PRF biologisch zu modulieren, um seine regenerative Leistung zu verbessern, ohne die grundlegenden Vorbereitungsprinzipien zu verändern. Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur biologischen Feinabstimmung von PRF durch Anreicherung mit Cobalamin und Alpha-Tocopherol vor der Zentrifugation und bewertet deren Auswirkungen auf den Wachstumsfaktor und die freisetzung proinflammatorischer Zytokine unter in-vitro-Bedingungen . Periphere Blutproben, die von gesunden Freiwilligen entnommen wurden, wurden mit einem festen Zentrifugationsprotokoll verarbeitet. Cobalamin oder Alpha-Tocopherol wurde vor der Zentrifugation dem Vollblut zugesetzt, um bioaktiv modifizierte PRF-Matrizen zu erhalten. Die Freisetzungsprofile von plättchenabgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF), transformierendem Wachstumsfaktor-β1 (TGF-β1), vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), insulinähnlichem Wachstumsfaktor-1 (IGF-1), Fibroblast-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2), Interleukin-1β (IL-1β) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) wurden bei 24 Stunden und 72 Stunden mittels eines enzymgekoppelten Immunsorbent-Tests quantifiziert. Mit Cobalamin angereichertes PRF war mit signifikanten Intergruppenunterschieden in den TGF-β1-Spiegeln und einer reduzierten Freisetzung proinflammatorischer Zytokine assoziiert, was auf eine Verschiebung hin zu einer günstigeren regenerativen Mikroumgebung hinweist. Im Gegensatz dazu waren die beobachteten Zunahmen bei FGF-2 und IGF-1 zeitabhängig und wurden in allen Gruppen nachgewiesen, ohne einen cobalaminspezifischen Effekt nachzuweisen. Alpha-tocopherolangereicherte PRF zeigte eine selektive Zunahme der VEGF-Freisetzung, was auf einen möglichen proangiogenen Einfluss hindeutet. Diese Ergebnisse zeigen, dass gezielte Vitaminanreicherung eine kontrollierte Modulation der PRF-Bioaktivität ermöglicht und gleichzeitig deren autologe und antikoagulanzfreie Natur bewahrt. Dieses Protokoll bietet einen praktischen Rahmen für die biologisch feinjustierte PRF und unterstützt dessen Nutzung als abstimmbare regenerative Plattform für zukünftige translationale und klinische Anwendungen.
Einleitung
Thrombozytenreiches Fibrin (PRF) ist ein autologes Thrombozytenkonzentrat der zweiten Generation, das aufgrund seiner Biokompatibilität, einfachen Vorbereitung und seiner Fähigkeit zur nachhaltigen Freisetzung von Wachstumsfaktoren 1,2 weit verbreitet in der Parodontologie, Implantatzahnmedizin und Mundchirurgie verbreitet ist. PRF wird durch Zentrifugation von Vollblut ohne den Einsatz von Antikoagulanzien oder exogenen Aktivatoren gewonnen, was zu einer dreidimensionalen Fibrinmatrix führt, die Blutplättchen und Leukozyten einschließt. Diese zellulären Komponenten dienen als endogene Reservoirs von Wachstumsfaktoren, darunter plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), transformierender Wachstumsfaktor-β1 (TGF-β1), vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), insulinähnlicher Wachstumsfaktor-1 (IGF-1) und Fibroblastenwachstumsfaktor 2 (FGF-2), die zusammen Angiogenese, Zellwanderung, Proliferation und extrazelluläre Matrix-Remodellierung während der Geweberegeneration 3,4 regulieren.
Über seine biologische Zusammensetzung hinaus wird die regenerative Leistung von PRF stark von der Architektur seines Fibrinnetzwerks und der biologischen Aktivität seiner zellulären Bestandteile beeinflusst. Aus diesem Grund sind neuere Untersuchungen über konventionelle Vorbereitungsprotokolle hinausgegangen und haben begonnen, PRF als biologisch verstellbares Trägersystem statt als passives Gerüst 5,6 zu konzeptualisieren. Strategien zur strukturellen Modifikation, wie die Einbindung von Biomaterialien wie Hyaluronsäure und Kollagen, haben gezeigt, dass die physikalischen und mechanischen Eigenschaften von PRF verändert werden können, was zu Veränderungen in der Fibrinorganisation, der mechanischen Stabilität und der Wachstumsfaktorfreisetzungskinetikführt. Diese Erkenntnisse haben zu einer wachsenden Zahl von Belegen beigetragen, die die Anpassungsfähigkeit von PRF an spezifische regenerative Anforderungen unterstützen.
Parallel zu biomaterialbasierten Ansätzen hat sich die vitaminbasierte Anreicherung als biologisch relevante Strategie zur Modulation der PRF-Bioaktivität etabliert. Vitamine sind dafür bekannt, grundlegende zelluläre Prozesse wie Stoffwechsel, Redox-Gleichgewicht, Kollagensynthese, Angiogenese und entzündliche Signalübertragung zu regulieren. Insbesondere Vitamine wie Ascorbinsäure, Cholecalciferol, Cobalamin und Alpha-Tocopherol haben gezeigt, dass sie das Zellverhalten und die Gewebeheilung über verschiedene molekulare Signalwegebeeinflussen 8. Frühere In-vitro-Studien haben gezeigt, dass vitaminangereicherte PRF-Formulierungen Wachstumsfaktorfreisetzungsprofile, die entzündliche Zytokinexpression und die biomechanischen Eigenschaften der Fibrinmatrix modulieren können, was darauf hindeutet, dass Vitaminsupplementierung ein wirksames Mittel zur biologischen Modifikation von PRF darstellt, ohne dessen autologe Naturzu verändern 9.
Kobalamin (Vitamin B12) und Alpha-Tocopherol (Vitamin E) sind essentielle Mikronährstoffe, die an wichtigen biologischen Prozessen beteiligt sind, die für die Gewebehomöostase und -reparatur relevant sind. Vitamin B12 spielt eine entscheidende Rolle bei der Nukleinsäuresynthese, dem Zellstoffwechsel und der Erythropoiese, und sein Mangel wurde mit oralen Schleimhautveränderungen und dem Abbau von parodontalem Gewebe in Verbindung gebracht10,11. Vitamin E wirkt als starkes Antioxidans, das die Lipidperoxidation begrenzt, oxidativen Stress reduziert und zur Kollagenstabilisierung sowie zur Modulation von Entzündungsreaktionen beiträgt12,13. Wichtig ist, dass die vorliegende Arbeit, obwohl sie auf früheren Untersuchungen zur Untersuchung verschiedener biologischer und physiologischer Modulatoren von PRF aufbaut, die aktuelle Studie ein eigenes Protokoll speziell zur Anreicherung mit Cobalamin und Alpha-Tocopherol vor der Zentrifugation einführt. Dementsprechend ist das Ziel dieser Studie, ein reproduzierbares Protokoll zur Herstellung von cobalamin- und alpha-tocopherool-angereichertem PRF zu beschreiben und die Auswirkungen dieses bioaktiven Feinabstimmungsansatzes auf die Freisetzung von Wachstumsfaktoren und proinflammatorischen Zytokinen unter in-vitro-Bedingungen zu bewerten.
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Protokoll
Diese experimentelle Studie wurde gemäß den ethischen Grundsätzen der Erklärung von Helsinki durchgeführt und erhielt die Zustimmung des Ethikkomitees für klinische Forschung der Universität Çukurova (Genehmigungsnummer: 139/25; Datum: 8. Dezember 2023). Vor der Teilnahme wurden alle Personen über die Studienverfahren informiert und von jedem Teilnehmer eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt. Alle Verfahren mit menschlichen Blutproben wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Biosicherheitsvorschriften durchgeführt. Während des gesamten Versuchsprozesses wurden geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) verwendet, darunter Handschuhe, Masken und Labormäntel. Biologische Materialien wurden mit aseptischen Techniken behandelt, und alle Abfälle wurden gemäß festgelegten Biohazard-Managementprotokollen entsorgt. Alle in dieser Studie verwendeten Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt, einschließlich Herstellerdetails und relevanten Spezifikationen zur Sicherstellung der Reproduzierbarkeit.
1. Teilnehmerauswahl
Die Teilnehmer wurden aus systemisch gesunden Erwachsenen im Alter zwischen 20 und 30 Jahren rekrutiert, die eine angemessene Einhaltung der Studienverfahren nachweisen. Personen mit einer Vorgeschichte systemischer Erkrankungen, hämatologischen Erkrankungen oder Erkrankungen, die die Blutplättchenfunktion oder Wundheilung beeinträchtigen, galten nicht als berechtigt. Weitere Ausschlusskriterien waren Schwangerschaft oder Laktation, aktuelles Rauchen, kürzliche Infektion, bekannte Überempfindlichkeit gegenüber Cobalamin oder Alpha-Tocopherol sowie die Einnahme von Vitaminpräparaten oder Medikamenten, die die Thrombozytenaktivität in den vorangegangenen sechs Monaten beeinträchtigen könnten. Um die biologische Variabilität zu verringern, wurden nur Freiwillige mit normalen hämatologischen Ausgangsergebnissen aufgenommen, und alle Teilnehmer wurden vor der Aufnahme bewertet, um die Eignung für die PRF-Präparation sicherzustellen. Als vorläufige explorative klinische Studie verwendete diese Studie eine Stichprobengröße, die auf Machbarkeit und der Verfügbarkeit geeigneter Teilnehmer während des Untersuchungszeitraums basierte, und Stichproben von zwölf Teilnehmern wurden analysiert.
2. Blutentnahme und Gruppenzuweisung
Peripheres venöses Blut wurde von jedem Teilnehmer mit additivfreien 10-ml-Glasröhrchen unter aseptischen Bedingungen entnommen. Insgesamt wurden pro Teilnehmer fünf Röhrchen erhalten. Ein Röhrchen war für eine vollständige Blutbildanalyse vorgesehen, und ein Röhrchen wurde verwendet, um die Ausgangswerte von Serumcobalamin und Alpha-Tocopherol zu bestimmen. Die übrigen drei Röhren wurden für die Präparation von plättchenreichem Fibrin (PRF) vorgesehen. Unter diesen diente ein Röhrchen als Kontrollgruppe ohne Zusatzstoffe, ein Rohr erhielt vor der Zentrifugation Kobalamin (1 ml) zur Gewinnung von cobalaminangereichertem PRF, und ein Rohr erhielt vor der Zentrifugation Alpha-Tocopherol (0,5 ml), um eine mit Alpha-Tocopherol angereicherte PRF zu erhalten. Kobalamin wurde als sterile injizierbare Lösung (1000 μg/mL) verabreicht, und Alpha-Tocopherol wurde in Ampullenform (2 mL) verwendet. Alle Proben wurden unmittelbar nach der Blutentnahme entnommen, um eine vorzeitige Gerinnung zu vermeiden.
3. PRF Vorbereitung
Periphere venöse Blutproben wurden von jedem Teilnehmer mit sterilen, antikoagulantfreien Glasröhrchen entnommen. Unmittelbar nach der Entnahme wurden die Röhren in eine Zentrifuge gelegt und ohne Verzögerung verarbeitet, um eine vorzeitige Gerinnung zu verhindern. Die Zentrifugation erfolgte bei 2700 U/min (708 × g) für 12 Minuten (bei Raumtemperatur) mit einem Rotorsystem mit festem Winkel. Nach Abschluss der Zentrifugation wurden drei unterschiedliche Schichten beobachtet: eine niedrigere Fraktion roter Blutkörperchen, eine obere, plättchenarme Plasmaschicht und ein intermediäres Fibringerinnsel, das thrombozytenreiches Fibrin (PRF) darstellt. Das PRF-Gerinnsel wurde sorgfältig mit sterilen Instrumenten von der roten Blutkörperchenschicht getrennt und für weitere Verarbeitung isoliert. Zur Herstellung angereicherter PRF-Gruppen wurden die vorgesehenen Zusätze unmittelbar vor der Zentrifugation unter standardisierten Bedingungen in die Blutproben eingebracht. Dieser Ansatz ermöglichte die Einbindung bioaktiver Verbindungen in die sich entwickelnde Fibrinmatrix während der Gerinnselbildung (Abbildung 1).
Abbildung 1: Flussdiagramm, das das methodische Protokoll zur Entnahme der PRF-Proben demonstriert. 1 ml Cobalamin (A) und 0,5 ml Alpha-Tocopherol (B) wurden vor der Zentrifugation den Blutproben zugesetzt. Die resultierenden PRF-Proben befinden sich in den Röhrchen (C) und nachdem sie von der roten Blutkörperchenschicht (D) getrennt wurden. Finales cobalaminangereichertes PRF (E) und alpha-tocopherolangereichertes PRF (F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
4. In-vitro-Inkubation von PRF-Proben
Jedes PRF-Gerinnsel wurde in ein steriles Rohr übertragen, und das Zellkulturmedium wurde in einem standardisierten Verhältnis von 1 ml pro 1 g Gerinnsel (1:1, v/w) hinzugefügt, um eine gleichmäßige Diffusionsumgebung über alle Proben zu gewährleisten. Die Röhren wurden auf einen Orbitalshaker gesetzt und bei 37 °C für eine Gesamtdauer von 72 Stunden inkubiert, um die allmähliche Freisetzung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen aus der PRF-Matrix zu ermöglichen. Supernatanten wurden bei 24 Stunden und 72 Stunden gesammelt, in sterile Mikroröhren übertragen und bis zur weiteren Analyse bei −80 °C gelagert. Das Zellkulturmedium wurde ohne Serumsupplementierung verwendet, um Interferenzen durch exogene Wachstumsfaktoren zu vermeiden und sicherzustellen, dass alle gemessenen Biomoleküle ausschließlich aus der PRF-Matrix stammen.
5. ELISA-Analyse des Wachstumsfaktors
Die Konzentrationen von plättchenabgeleitetem Wachstumsfaktor (PDGF), transformierendem Wachstumsfaktor-β1 (TGF-β1), vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF), insulinähnlichem Wachstumsfaktor-1 (IGF-1), Fibroblast-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2), Interleukin-1β (IL-1β) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) in den gesammelten Supernatanten wurden mithilfe enzymgebundener Immunsorbent-Testkits gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Die Absorptionswerte wurden bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser gemessen, und die Analytkonzentrationen wurden anhand von Standardkalibrierungskurven berechnet.
6. Statistische Analyse
Statistische Analysen wurden mit IBM SPSS Statistics for Windows (Version 20.0) durchgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung und Median (Minimum–Maximum) angegeben, je nachdem. Die Normalität der Datenverteilung wurde mit dem Shapiro–Wilk-Test bewertet. Intragruppenvergleiche zwischen Zeitpunkten wurden mit dem gepaarten t-Test oder dem Wilcoxon-Signed-Rank-Test durchgeführt, während intergruppenbezogene Vergleiche mit wiederholten Varianzanalysen oder dem Friedman-Test, je nach Zweck, durchgeführt wurden. Ein p-Wert von <0,05 galt als statistisch signifikant.
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Ergebnisse
Bei allen Teilnehmern wurde eine erfolgreiche Präparation von Kontroll-, cobalaminangereichertem und alpha-tocopherolreichem plättchenreichem Fibrin (PRF) erreicht. Die makroskopische Untersuchung bestätigte die Bildung gut strukturierter PRF-Gerinnsel mit erhaltener Fibrinintegrität und ausreichender mechanischer Stabilität, was eine standardisierte Handhabung, Inkubation und anschließende biochemische Analysen ermöglichte (Tabelle 1).
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Diskussion
Die vorliegende Studie zeigt, dass plättchenreiches Fibrin (PRF) durch gezielte Anreicherung mit Kobalamin und Alpha-Tocopherol vor der Zentrifugation biologisch fein abgestimmt werden kann, was zu einer deutlichen und reproduzierbaren Modulation von Wachstumsfaktor- und Zytokinfreisetzungsprofilen führt. Diese Erkenntnisse bestärken das sich entwickelnde Konzept, dass PRF nicht nur ein passives autologes Gerüst ist, sondern eine biologisch responsive Matrix, deren regeneratives Verhalte...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Alpha-Tocopherol (Vitamin E) | AKSU FARMA, Istanbul, Türkei | A11HA03 | Ampulle EVIGEN 2 mL |
| Zentrifuge (40 °F; Rotor mit festem Winkel) | Verfahren für PRF, Nizza, Frankreich | 913023410238 | Duo-Zentrifuge |
| Kobalamin (Vitamin B12) | DEVA HOLDING, Istanbul, Türkei | B03BA01 | Ampule DODEX 1000 mcg/mL |
| Eppendorfer Röhren | Axygen | PCR-02-C | 200 Stück |
| Glasblut-Sammelröhrchen | Hema & U-Bahn (Istanbul, Türkei) | HNM8080 | (10 mL) Kein Antikoagulans |
| HRP-Lösung | Im ELISA-Kit enthalten | ||
| Menschliches ELISA-Set – FGF | Wuhan Fine Biotech | EH0541 | Fine Test |
| Menschliches ELISA-Set – IGF-1 | Wuhan Fine Biotech | ER0030 | Fine Test |
| Menschliches ELISA-Set – PDGF | Wuhan Fine Biotech | ER1240 | Fine Test |
| Menschliches ELISA-Set - TGFβ-1 | Wuhan Fine Biotech | EH0287 | Fine Test |
| Menschliches ELISA-Set – VEGF | Wuhan Fine Biotech | EH0327 | Fine Test |
| Menschlicher IL-1β ELISA-Trikot | Wuhan Fine Biotech | EH0185 | Fine Test |
| Menschliches TNF-Α ELISA-Trikot | Wuhan Fine Biotech | EH0302 | Fine Test |
| Mikropipetten & Tipps | Eppendorf | 3123000063 | 1 Set |
| Mikroplattenleser | Biochrom | EZ Read 400 | 450 nm |
| Orbitalshaker | Stuart | SSM3 | Mini Gyro-Rocke |
| Präzisionsmaßstab | Sartorius | H51-D | 1 Stück |
| RPMI-1640 Zellkulturmedium | HyClone, Cytiva, USA | SH30027.01 | 500 mL |
| Sterile Schere | ASA Dental (Istanbul, Türkei) | 0305-1 | 1 Stück |
| Stop-Lösung | Im ELISA-Kit enthalten | ||
| Substratlösung | Im ELISA-Kit enthalten | ||
| Waschpuffer | Im ELISA-Kit enthalten |
Referenzen
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