Methodenartikel

Eine integrierte Methode zur photothrombotischen Schlaganfallmodellierung und zur in-vivo-Optrodenerfassung neuronaler und astrozytischer Aktivität bei sich wirkenden Mäusen

DOI:

10.3791/71017

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29. Mai 2026

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1South China Research Center for Acupuncture and Moxibustion, Medical College of Acu-Moxi and Rehabilitation, Guangzhou University of Chinese Medicine, 2Rehabilitation Department, The Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, Guangzhou Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll bietet eine integrierte Methode, die virale Abgabe, Optrodenimplantation, photothrombotische Induktion, gleichzeitige Aufzeichnung der Astrozyten- und neuronalen Aktivität sowie optogenetische Stimulation von Astrozyten umfasst. Diese integrierte Methode zielt darauf ab, eine parallele Untersuchung der Astrozyten-Neuron-Beziehung über die akuten bis chronischen Stadien des ischämischen Schlaganfalls zu ermöglichen.

Zusammenfassung

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Die Untersuchung der Dynamik von Astrozyten und Neuronen nach ischämischem Schlaganfall ist unerlässlich, um die Genesungsmechanismen nach dem Schlaganfall zu verstehen. Allerdings gelingt es den aktuellen Methoden oft nicht, Echtzeit-Interaktionen zwischen Neuronen und Astrozyten bei Tieren bei bestimmten Verhaltensaufgaben zu erfassen, was unsere Fähigkeit einschränkt, die akute Phase der Schlaganfallpathologie zu untersuchen. Dieses Protokoll präsentiert eine integrierte Methode, die photothrombotische Schlaganfallmodellierung mit gleichzeitiger Mehrkanal-Elektrophysiologie-Aufzeichnung und Faserphotometrie in wachen, verhaltenden Mäusen mit einer maßgefertigten Optrode kombiniert. Das Protokoll beinhaltet eine fokale Ischämie-Induktion mittels Photothrombose, gefolgt von gleichzeitiger Erfassung neuronaler Spitzen und astrozytischer Kalziumtransienten. Die Optrode ermöglicht die gleichzeitige Abgabe von Photothrombose, die Aufzeichnung von Kalziumsignalen und die optogenetische Manipulation, ohne separate chirurgische Eingriffe erforderlich zu machen. Repräsentative Ergebnisse bestätigen den Erfolg bei der gleichzeitigen Aufzeichnung von astrozytischen Kalziumsignalen und neuronalem Spiking. Die optogenetische Manipulation von Astrozyten führt zu messbaren Veränderungen der neuronalen Feuermuster (Verringerung der Feuerfrequenz der pyramidalen Neuronen um 1,55 ± 0,45 Hz und der Interneuron um 3,64 ± 1,37 Hz im Vergleich zur präoptogenetischen Stimulation, n = 2), was bestätigt, dass das System in der Lage ist, Interaktionen zwischen Astrozyten und Neuronen zu untersuchen. Dieser integrierte Ansatz adressiert kritische Lücken in der Schlaganfallforschungsmethodik, indem er Echtzeit-multimodale Aufzeichnungen vom akuten bis zum chronischen Stadium des Schlaganfalls bei verhaltenden Tieren bereitstellt.

Einleitung

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Ischämischer Schlaganfall bleibt eine primäre globale Gesundheitsherausforderung und stellt weltweit eine führende Ursache sowohl für Sterblichkeit als auch für langfristige erworbene Behinderungen 1,2,3. Die hohe Behinderungsrate im Zusammenhang mit ischämischem Schlaganfall ist mit einer Vielzahl klinischer Symptome verbunden, die von motorischer Lähmung und sensorischem Verlust bis hin zu kognitiven Beeinträchtigungen 4,5,6 reichen. Es besteht ein dringender Bedarf, ein tieferes Verständnis der pathologischen und Genesungsmechanismen des ischämischen Schlaganfalls während der Reparaturphase zu erlangen. Über das neuronale Versagen hinaus wurde das katastrophale Versagen von Astrozytenkürzlich hervorgehoben 7,8. Astrozyten, die häufigsten Gliazellen, sind ein wesentlicher Bestandteil des zentralen Nervensystems sowie der tripartiten Synapse. In jeder Phase der ischämischen Kaskade spielen Astrozyten eine unverzichtbare Rolle und beeinflussen die neuronale und funktionelle Genesungtiefgreifend 9,10,11. Im gesunden Gehirn sind Astrozyten und Neuronen funktionell über die tripartite Synapse gekoppelt, wo astrozytische Prozesse die prä- und postsynaptischen Endpunkte abdecken und aktiv an der synaptischen Übertragungteilnehmen 7,8. Astrozyten regulieren die extrazellulären Glutamatkonzentrationen über exzitatorische Aminosäuretransporter, erhalten die Kaliumhomöostase über Kir4.1-Kanäle aufrecht und modulieren die synaptische Stärke durch die Freisetzung von Gliotransmittern über calciumabhängige Exozytose 7,8. In diesem Zusammenhang repräsentieren astrozytische intrazelluläre Kalziumtransienten die astrozytische Aktivität und sind eng mit neuronalem Feuer7 verknüpft. Während eines ischämischen Schlaganfalls wird diese fein abgestimmte Beziehung schnell unterbrochen. Der Zusammenbruch der ionischen Gradienten nach Energieversagen löst eine massive Glutamatfreisetzung und eine sich ausbreitende Depolarisation aus, was zu einer Verletzung exzitotoxischer neuronaler Neuronen und zur Proliferation reaktiver Astrozyten12 führt. Astrozyten in und um den Infarktkern durchlaufen eine Kaskade pathologischer Veränderungen, darunter Kalziumüberlastung, Beeinträchtigung der Glutamatwiederaufnahme, Verlust der Synapsenkopplung und Versagen der Gliotransmitterfreisetzung13. Gleichzeitig wird die neuronale Spiking-Aktivität stark unterdrückt, da Neuronen an Lebensfähigkeit und Membranpotenzialintegrität14,15 verlieren. In der Peri-Infarkt-Zone führen überlebende Neuronen und reaktive Astrozyten dynamische Interaktionen, die als entscheidend für das Ergebnis der Genesung nach einem Schlaganfall gelten; Die Echtzeit-elektrophysiologischen und Kalziumkorrelate dieser Interaktion bei wachen, sich verhaltenden Tieren bleiben jedoch schlecht charakterisiert13,16. Daher gilt das Verständnis der astrozytischen Aktivität parallel zu neuronalen Signalen als Grundpfeiler für die neuronale funktionelle Erholung nach ischämischer Verletzung.

Photothrombose ist ein weit verbreitetes ischämisches Modell; Es verwendet lichtempfindlichen Farbstoff und lokalisiertes Licht, um ischämische Läsionen in bestimmten Zielbereichen zu induzieren17. Aktuelle Schlaganfallmodellierungs- und Aufzeichnungsprotokolle behindern die Untersuchung der Interaktion von Astrozyten und Neuronen nach einem Schlaganfall durch drei technische Hauptengpässe 17,18,19. Die Trennung von Modellierung und Aufzeichnung ist ein häufiger Nachteil der meisten aktuellen Protokolle, da es zu einer Zeitlücke zwischen der Etablierung des Modells und der Echtzeit-Signalaufzeichnung20,21 führt. Allerdings sind Minuten bis Stunden nach einem ischämischen Schlaganfall eine essentielle Phase, in der sowohl Neuronen als auch Astrozyten eine drastische Schwankungdurchlaufen. Ohne gleichzeitige Überwachung der Astrozyten-Neuron-Interaktion unmittelbar nach dem ischämischen Vorfall wird die Untersuchung einer wirksamen frühen Intervention des ischämischen Schlaganfalls stark behindert. Eine weitere Einschränkung der aktuellen Protokolle liegt in der Isolation der Aufzeichnungsmodalitäten; Die meisten aktuellen Methoden sind für einen einzigen Signaltyp optimiert. Zum Beispiel bietet die Mehrkanal-Elektrophysiologie den Nachweis neuronaler Feuerungen und lokaler Feldpotenziale (LFPs), ist jedoch blind gegenüber Signalzuständen der Gliazellen15,16. Umgekehrt wird die Überwachung der astrozytischen Dynamik durch in vivo durchgeführt. Kalziumbildgebung erfasst astrozytische Schwankungen, aber es fehlen neuronale Feuerdaten. Der letzte Engpass der aktuellen Protokolle scheint der Aufzeichnungsstatus des Tieres zu sein; In den meisten Protokollen ist das Tier betäubt oder frei beweglich. Motorische Dysfunktion gilt jedoch als eine der problematischsten Nachfolge eines Schlaganfalls; Das Verständnis des Zusammenhangs zwischen bestimmten Verhaltensweisen und den Ereignissen zwischen Astrozyten und Neuronen ist unerlässlich. Daher besteht ein dringender Bedarf an einer integrierten Methode, die in der Lage ist, ein photothrombotisches Schlaganfallmodell durchzuführen und gleichzeitig sowohl Astrozyten- als auch neuronale Signale bei wachen Mäusen zu erfassen, die bestimmte Verhaltenstests durchführen. Bestehende Methoden behandeln jeweils nur eine Teilmenge dieser Anforderungen. Die Zweiphotonen-Kalziumbildgebung liefert eine außergewöhnliche räumliche Auflösung der astrozytischen Mikrodomänendynamik im intakten Gehirn, erfordert jedoch, dass Tiere kopffixiert oder betäubt werden, was eine naturalistische Verhaltensbewertung verhindert, und kann nicht gleichzeitig mehrkanalige neuronale Spike-Daten13 erfassen. Die eigenständige Faserphotometrie ermöglicht astrozytische Kalziumüberwachung bei frei handelnden Tieren, bleibt jedoch blind gegenüber neuronalen Feuermustern und bietet keine elektrophysiologische Anzeige der Schaltungsfunktion16. Die multikanalige extrazelluläre Elektrophysiologie löst die Spitzenaktivität von Neuroneneinheiten und lokalen Feldpotentialen mit hoher zeitlicher Auflösung auf, liefert jedoch keine Informationen über den Signalzustand derAstrozyten 15. Keiner dieser Ansätze kann jedoch gleichzeitig einen präzise lokalisierten photothrombotischen Schlaganfall induzieren und gleichzeitig multimodale Aufzeichnungen vom selben anatomischen Ort ohne Unterbrechung durchführen.

Um die bestehenden technischen Einschränkungen zu beheben, schlagen wir dieses integrierte System vor. Dieses System adressiert alle drei Einschränkungen innerhalb eines einzigen chronisch implantierten Geräts und ermöglicht die gleichzeitige Photothrombose-Einleitung, die astrozytische Kalziumaufnahme mittels Faserphotometrie und die multikanalige neuronale Elektrophysiologie bei wachen, frei handelnden Mäusen – vom Beginn des Schlaganfalls bis zu den chronischen Phasen des Schlaganfalls. Die Machbarkeit dieser Methode wird durch die chronische Einnistung eines maßgefertigten Optrodes in die Gehirne von Mäusen bestätigt, der einen astrozytenspezifischen Kalziumindikator und einen optogenetischen viralen Vektor exprimiert. Mit der Methode werden astrozytische Kalziumtransienten und neuronale Feueraktivitäten während Verhaltensaufgaben und unter optogenetischer Modulation gleichzeitig aufgezeichnet und analysiert.

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Protokoll

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Dieses Protokoll erhielt die Genehmigung vom Animal Care and Use Committee der Guangzhou University of Chinese Medicine (00379474) und wurde gemäß den Richtlinien und Vorschriften des National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Alle möglichen Maßnahmen wurden umgesetzt, um die Anzahl der in dieser Studie eingesetzten Tiere zu minimieren.

1. Virusvektorabgabe

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt die stereotaktische Injektion astrozytenspezifischer AAV-Vektoren in den motorischen Kortex (M1FL). Ziel ist es, eine stabile, astrozytenspezifische Expression sowohl des GCaMP6s-Kalziumindikators als auch des opto-vTRAP-optogenetischen Konstrukts vor der Optrodenimplantation zu erreichen. Hauptausstattung: stereotaxischer Rahmen, digitales Verniersystem, Glas-Mikropipette und Mikroinfusionspumpe.

  1. Setzen Sie die Maus in die Induktionskammer; Beginnen Sie mit der Anästheseinleitung mit 3 %–4 % Isofluran, und die Konzentration kann in der ersten Minute auf maximal 5 % erhöht werden, bis die Maus nicht mehr reaktiv ist.
    VORSICHT: Isofluran ist ein flüchtiges Anästhetikum. Führen Sie alle Verfahren unter aktiver Beatmung durch. Vermeiden Sie längere persönliche Kontakte.
  2. Übertragen Sie die Maus in den stereotaxischen Rahmen mit einer Anästhesiemaske und verwenden Sie 1–2 % Isofluran, um eine tiefe anästhetische Ebene aufrechtzuerhalten.
  3. Kontrollieren Sie alle 10 Minuten die Tiefe der Anästhesie mittels Atmungsrhythmus, Palpebralisreflex und Zehenklemmen. Halten Sie die Körpertemperatur der Maus bei 36–37,5 °C mit einer rückkopplungsgesteuerten Heizmatte.
  4. Tragen Sie während der Operation eine Augensalbe auf, um Hornhautschäden zu vermeiden.
  5. Befestigen Sie die Maus an einem stereotaxischen Rahmen mit Ohrbügeln und Mundbalken. Stellen Sie die Ohrbügel ein, um sicherzustellen, dass der Mauskopf symmetrisch fixiert ist. Stellen Sie sicher, dass der Kopf mit sanfter Sonde immobilisiert ist.
  6. Entfernen Sie das Haar gründlich mit Enthaarungscreme und führen Sie einen Mittellinienschnitt mit einer chirurgischen Schere vor, um den Schädel freizulegen. Reinigen Sie das Periost mit Kochsalzlösung und Wattestäbchen, um Bregma und Lambda freizulegen.
  7. Senken Sie die Glasmikropipette ab, um Bregma und Lambda nacheinander zu berühren; beachten Sie die Z-Koordinate auf dem digitalen Vernier. Stellen Sie den Mundstab so ein, dass der Unterschied <0,04 mm beträgt.
  8. Senken Sie die Glas-Mikropipette bis zur Berührung von Bregma und setzen Sie den digitalen Vernier auf null. Die Mikropipette wird nacheinander 2,3 mm links und rechts von Bregma bewegt; beachten Sie die Z-Koordinate auf dem digitalen Vernier. Stellen Sie die Ohrbügel ein, um sicherzustellen, dass die beidseitigen Unterschiede <0,04 mm betragen.
  9. Setze den digitalen Vernier bei Bregma auf null zurück und markiere den motorischen Cortex (M1FL; AP: +1,5 mm, ML: +0,74 mm). Verwenden Sie einen Mikrobohrer mit 0,5 mm Bohrern (runde Spitze), um an der markierten Stelle ein kleines Loch mit etwa 0,5 mm Durchmesser zu bohren. Bohren Sie sorgfältig, um Blutungen und Schäden am Gehirngewebe zu vermeiden; Geben Sie eiskalte Kochsalzlösung ab, um die während des Bohrvorgangs entstehende Wärme auszugleichen.
  10. Senken Sie die Glas-Mikropipette, die an eine Mikroinfusionspumpe angeschlossen ist, an die Zielstelle (DV: -0,94 mm von der Gehirnoberfläche). Vor dem Laden mischen Sie AAV9-GfaABC1D-GCaMP6s und AAV9-GfaABC1D-opto-vTRAP in gleichen Mengen, um eine virale Mischung herzustellen. Infundieren Sie 400 nL des Gemisch (200 nL jedes Vektors) mit einer Geschwindigkeit von 50 nL/min.
    HINWEIS: Der virale Cocktail enthält: 200 nL des astrozytenspezifischen Kalziumindikators (AAV-GfaABC1D-GCaMP6s, 1,0 × 1013 vg/mL) und 200 nL des astrozytenspezifischen optogenetischen viralen Vektors (AAV-GfaABC1D-opto-vTrap, 1 × 1013vg/mL). Eine erfolgreiche astrozytenspezifische Transduktion wurde in einer Teilmenge von Tieren durch Immunfluoreszenzfärbung für GFAP bestätigt, was die Kolokalisierung des fluoreszierenden Reporters mit GFAP-positiven Zellen und das Fehlen einer Expression in GFAP-negativen Zellen bestätigte.
    VORSICHT: AAV-Vektoren sind rekombinante biologische Agenten; Behandle alle viralen Vektoren und Abfälle gemäß den Biosicherheitsrichtlinien der Institution.
  11. Lassen Sie die Pipette nach Abschluss der Infusion noch 10 Minuten an Ort und Stelle, um eine bessere Virusdiffusion zu gewährleisten und Rückfluss zu verhindern. Ziehen Sie die Pipette langsam heraus, nähen Sie die Kopfhaut (4-0, 20 mm, 3/8 Kreis) und legen Sie die Maus auf ein Heizkissen, bis sie sich vollständig erholt hat.
    HINWEIS: Für eine optimale virale Expression ist eine Dauer von 3–4 Wochen erforderlich. Der detaillierte Zeitplan des Protokolls ist in Abbildung 1A dargestellt.

2. Optrode-Inspektion und funktionale Überprüfung

HINWEIS: Vor der Einpflanzung muss die maßgefertigte Optrode physisch inspiziert und optisch getestet werden, um sicherzustellen, dass sie in allen drei funktionellen Modi (Photothrombose, optogenetische Stimulation und Faserphotometrie) Licht abgeben kann. Hauptausrüstung erforderlich: Mikroskop, optischer Leistungsmesser und Laserquellen bei 532 nm, 488 nm, 470 nm und 405 nm.

  1. Physische Inspektion des Oprosten:
    1. Legen Sie das gefertigte Objekt unter ein Mikroskop, um die Anordnung der Aufzeichnungsstellen zu inspizieren.
    2. Stellen Sie sicher, dass die 16 Wolfram-Mikrodrähte gleichmäßig gebündelt sind und die zentrale Glasfaser umgeben. Prüfen Sie auf verbogene oder Kreuzungskabel, die elektrische Kurzschlüsse verursachen könnten.
    3. Bestätigen Sie, dass die Spitze der Glasfaser kürzer ist als die der Wolfram-Mikrodrähte (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Die Glasfaserspitze sollte 100–200 μm von den Elektrodenspitzen23 entfernt zurückgesetzt sein. Dieser Offset, übernommen aus Lee et al.22, stellt sicher, dass der Lichtkegel den Aufzeichnungsbereich ausreichend abdeckt und gleichzeitig übermäßiges photoelektrisches Rauschen verhindert. Forscher werden ermutigt, den entsprechenden Offset empirisch unter ihrer eigenen Optik zu überprüfen.
  2. Verbinden Sie die Glasfaser mit der Lasermodellierungsquelle und der Aufzeichnungsquelle. Verwenden Sie ein optisches Leistungsmessgerät, um den Ausgang an der Faserspitze für die folgenden drei Funktionsmodi zu messen (Abbildung 1B):
    1. Photothrombotischer Modellierungsmodus: Überprüfen, ob das System hochintensives kontinuierliches Wellenlicht (CW) liefern kann (532 nm).
      HINWEIS: In diesem Experiment wird Glasfaser mit NA 0,22 verwendet. Der geschätzte beleuchtete Fleckdurchmesser bei 100–200 μm unterhalb der Faserspitze beträgt etwa 200–400 μm. Stellen Sie sicher, dass die Leistung an der Spitze >20 mW erreicht, um eine erfolgreiche Rose Bengal-Aktivierung und Thrombusbildung zu gewährleisten.
    2. Optogenetische Manipulationsmodus: Teste den gepulsten Laserausgang (z. B. 488 nm für Opto-vTrap).
      HINWEIS: Kalibrieren Sie die Leistung an der Spitze auf 10 mW; dies ist für die Aktivierung von Opto-vTRAP bei einer Aufzeichnungstiefe von 0,94 mm im motorischen Kortex optimiert. Für andere Hirnregionen wird eine Verhaltens- oder elektrophysiologische Überprüfung empfohlen.
    3. Faserphotometrie-(Kalziumaufnahme-)Modus: Teste das Energieschwachlicht (z. B. 470 nm und 405 nm).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Ergebnis stabil ist und auf einem sehr niedrigen Niveau (<50 μW) gehalten wird, um die Phototoxizität und Photobleachung des Kalziumindikators (z. B. GCaMP6s) während der Langzeitaufzeichnung zu minimieren.

3. Chronische Optrodenimplantation

HINWEIS: Dieser Abschnitt behandelt das chirurgische Verfahren zur chronischen Implantation des Optroden an der viralen Injektionsstelle. Die präzise Lokalisierung der Injektionskoordinaten ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Aufnahme von Elektroden und optischer Faser den Bereich der GCaMP6s und die Opto-vTRAP-Expression ermöglicht. Hauptausrüstung erforderlich: stereotaktischer Rahmen, Mikrobohrer, Pinzette, Kranioplastikschrauben, Agarosegel und Zahnbeton.

  1. Für die Anästhesie, stereotaktische Fixierung, Schädelvorbereitung und Balancierung folgen Sie dem gleichen Verfahren wie in Abschnitt 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass während des Schnitts auf der Kopfhaut 1,5 cm × 1,5 cm der Kopfhaut entfernt werden, wobei sichergestellt wird, dass genügend Haut um die Augen erhalten bleibt.
  2. Reinigen Sie den Schädel mit Wasserstoffperoxid und 0,9 % Kochsalzlösung. Identifizieren Sie Bregma und setzen Sie den digitalen Vernier auf null zurück.
  3. Verwenden Sie den Bohrer (0,8 mm, runde Spitze), um die Oberfläche des Schädels leicht zu rauen und so eine bessere Haftung des Zahnzements zu ermöglichen.
  4. Markiere den motorischen Kortex mit einem Marker (M1FL; AP: 1,5 mm, ML: 0,74 mm), und nutze es dann als Mittelpunkt, um ein 5 mm × 5 mm großes Quadrat zu zeichnen (Abbildung 1C).
    1. Benutze einen Mikrobohrer mit entsprechender Geschwindigkeit (etwa 10.000 U/min) und ziehe das Quadrat nach. Lassen Sie während des Bohrens ständig eiskalte Kochsalzlösung auf den Bohrweg geben, um die beim Hochgeschwindigkeitsbohren entstehende Hitze auszugleichen und Hirngewebeschäden zu vermeiden. Hören Sie sofort auf, wenn sich der Knochenlappen lockert (Abbildung 1C).
  5. Bohren Sie drei kleine Löcher (0,5 mm Durchmesser) über die kontralaterale Hemisphäre und das Kleinhirn und implantieren Sie Kranioplastik-Schrauben in die Löcher. Stellen Sie sicher, dass jede Schraube die Dura Mater erreicht, aber weitere Penetrationen und zusätzlichen Schaden am Gehirngewebe vermeiden (Abbildung 1C).
  6. Verwenden Sie eine Pinzette, um die zuvor gelockerte Knochenlappe zu entfernen. Vermeiden Sie zusätzliche Abwärtsbewegungen während der Entfernung, um Schäden am Gehirngewebe zu vermeiden und die Dura Mater intakt zu halten.
    HINWEIS: Wenn Blutungen auftreten, kann ein hämostatischer Schwamm verwendet werden, um die Blutung schnell zu stoppen.
  7. Verwenden Sie eine Pinzette mit einer ultrafeinen Spitze (<0,03 mm × 0,01 mm), um die Dura Mater am Schädelfenster zu entfernen. Verhindern Sie, dass die Pinzettspitze während dieses Vorgangs direkt in Hirngewebe einklemmt.
    HINWEIS: Nachdem der Knochen entfernt wurde, ist es sehr wichtig, das Gehirngewebe feucht zu halten. Es wird empfohlen, sterile mit Kochsalzlösung getränkte Wattebällchen zu verwenden, um das Fenster zu bedecken, wenn kein Eingriff stattfindet, um Schwellungen und neuronale Schäden durch Trockenheit zu vermeiden.
  8. Befestigen Sie die Optrode am Mikromanipulatorarm des stereotaxischen Rahmens und bewegen Sie sie über das Schädelfenster. Verflechte die silberne Masse und die Referenzdrähte der Optrode sicher mit den drei Kranioplastikschrauben (Abbildung 1C).
  9. Reinigen Sie die Schädelfensteroberfläche mit steriler Kochsalzlösung, um sicherzustellen, dass keine Blutungen oder Blutgerinnsel vorhanden sind, die das Einführen der Elektrode behindern könnten. Senken Sie die Optrode langsam auf die gewünschte Tiefe (DV: -0,94 mm) mit einer Geschwindigkeit von 1 μm/s.
    HINWEIS: Das freiliegende kortikale Gewebe sollte während der Einnistung mit steriler Kochsalzlösung befeuchtet werden.
  10. Tragen Sie nach der Einnistung eine Schicht Agarose über das Schädelfenster auf, um das kortikale Gewebe vor Zahnzement zu schützen.
  11. Tragen Sie 3–4 Schichten Zahnklement auf, um den freiliegenden Schädel zu bedecken, sodass das gesamte Objekt verankert ist. Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaxischen Rahmen, sobald der Zahnklement starr geworden ist (Abbildung 1C).
  12. Sorgen Sie für 3–5 Tage für Analgesie und lassen Sie die Maus 1–2 Wochen erholen, bevor sie aufgenommen und modelliert wird.

4. Photothrombotische Modellierung und gleichzeitige Aufzeichnung

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt Verhaltensgewöhnung, Baseline-Erfassung, Schlaganfallinduktion durch Photothrombose und Verfahren zur Longitudinalerfassung nach dem Schlaganfall. Die Photothrombose wird durch das implantierte Optrode abgegeben, während gleichzeitig Elektrophysiologie und Faserphotometrie-Aufzeichnung aufrechterhalten werden. Hauptausrüstung erforderlich: Rotarod-Apparat, Grifffestigkeitsmesser, Faserphotometriesystem, Mehrkanal-Neuralaufzeichnungssystem, Rose Bengal-Farbstoff und Laserquelle bei 530 nm.

  1. Lassen Sie die Maus vor dem Modellieren ein Verhaltenstraining durchlaufen.
    HINWEIS: Alle Tiere wurden unter standardisierten Laborbedingungen gehalten und getestet. Wohnverhältnisse: Raumtemperatur 20–25 °C, relative Luftfeuchtigkeit 50 %–60 %, bei einem 12-Stunden-Hell-/Dunkelzyklus (Licht an um 07:00 Uhr). Die Tiere hatten während der gesamten Studie freien Zugang zu Futter und Wasser. Alle Tests und chirurgischen Eingriffe wurden während der Lichtphase durchgeführt. Verhaltensaufzeichnungssitzungen wurden während der Lichtphase zu einer konstanten Tageszeit durchgeführt, um zirkadiane Variationen der neuronalen Aktivität und der astrozytischen Kalziumdynamik zu minimieren. Das Aufnahmegehäuse wurde zudem bei einer Umgebungstemperatur von 20–25 °C gehalten.
    1. Für den Rotarod-Test läuft die Maus 5 Minuten lang ununterbrochen auf der rotierenden Stange über 3 aufeinanderfolgende Versuche, wobei der Rotarod innerhalb von 5 Minuten von 4 auf 40 U/min beschleunigt.
    2. Für den Griffkrafttest lernt die Maus, die Teststange mit den Vorderpfoten zu ziehen, und führt drei aufeinanderfolgende Versuche durch, wobei die Ergebnisse unter 10 % schwanken.
  2. Stellen Sie die Datenerfassungsparameter für die Glasfaserphotometrie ein.
    1. Verwenden Sie ein Faserphotometriesystem mit zwei oder dreifachen Wellenlängen, um den Kalziumindikator anzuregen (z. B. GCaMP6s). Für GCaMP6s stellen Sie den Signalkanal auf 470 nm und den Steuerkanal auf 405 nm, um Bewegungsartefakte und Autofluoreszenz zu korrigieren.
      HINWEIS: Es ist sehr wichtig, die Aufzeichnungslaserleistung erneut zu testen, um sicherzustellen, dass der Ausgang an der Faserspitze zwischen 20–40 μW liegt, um Photobleaching und Fototoxizität zu vermeiden.
    2. Stellen Sie die Abtastrate der Datenerfassung auf 60–100 Hz ein, was ausreicht, um astrozytische Kalziumtransienten zu erfassen.
  3. Stellen Sie die Datenerfassungsparameter für die Mehrkanal-Elektrophysiologie ein.
    1. Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten des Aufnahmesystems (einschließlich des Grifffestigkeitstests und des Käfigs) richtig geerdet sind, um Lärm zu reduzieren. Verwenden Sie während der Aufnahme eine gemeinsame Medianreferenz (CMR), um globale Artefakte zu eliminieren.
      HINWEIS: Es ist sehr wichtig, die Signalspektrogrammansicht im Aufzeichnungssystem zu überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Stromleitungsstörungen vorliegen und das durch Bewegungsartefakte verursachte Rauschen minimiert wird. Große Bewegungsartefakte könnten auf ein Versagen der Schrauben und die Fixierung des Erdungsdrahts während der Einnistungsoperation hinweisen.
    2. Stellen Sie sicher, dass Breitband- und LFP-Signale in der Aufnahmesoftware ausgewählt werden, und überwachen Sie während der gesamten Aufnahmesitzung auftretende Rauschen.
  4. Machen Sie Basisaufnahmen.
    1. Kurzzeitige Betäubung mit Isofluran (innerhalb von 60 Sekunden); Verbinden Sie die Optrode über einen Adapter mit der Aufnahmeleitung.
    2. Platziere die Maus in eine Umgebung wie ein Heim-Käfig zur Aufnahme und lasse die Akklimatisierung nach dem Aufwachen 10 Minuten zu.
    3. Gleichzeitig mit dem Grifffestigkeitstest wird die Aufnahme durchgeführt, wobei die Maus die Testleiste einmal pro Minute für 5 Minuten ziehen muss.
    4. Stellen Sie sicher, dass Verhaltenstests sowohl in Mehrkanal- als auch in Glasfaserphotometriesystemen präzise zeitgestempelt sind, um eine Datenausrichtung zu ermöglichen (Abbildung 1D).
  5. Stellen Sie ein photothrombotisches Modell fest.
    1. Verabreichen Sie eine 1,5%ige Rose Bengal-Farbstofflösung intraperitoneal (i.p.) in einer Dosis von 10–20 mg/kg, warten Sie 5 Minuten, bis der Farbstoff durch die kortikale Gefäße zirkuliert.
      VORSICHT: Rose Bengal ist ein photosensibilisierender Farbstoff. Schützen Sie das Reagenz vor hellem Umgebungslicht. Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz beim Handeln.
    2. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran, wobei die zuvor beschriebenen Induktions- und Erhaltungsparameter verwendet werden.
    3. Wenn sich die Maus in einer tiefen anästhesie-Ebene befindet und mit einer Anästhesiemaske gehalten wird, verbinde die optische Sonde der Optrode mit der Laserquelle.
    4. Fokale Ischämie induzieren, indem ein 530 nm großer Laserstrahl mit 15 mW durch die implantierte Optrode für 5–8 Minuten abgegeben wird.
      VORSICHT: Der 530-nm-Laser mit 15 mW ist gefährlich. Alle Forscher müssen einen Laserschutz-Augenschutz tragen. Schauen Sie während der Photothrombose niemals direkt in die Faserspitze.
  6. Machen Sie die Aufzeichnung nach dem Schlaganfall.
    1. Legen Sie die Maus zur Wiederherstellung auf ein beheiztes Pad. Sobald die Maus vollständig wach ist (normalerweise innerhalb von 10 Minuten), wird die erste akute Aufnahme nach dem Schlaganfall gestartet.
    2. Wiederholen Sie täglich die Aufzeichnung, um den Krankheitsverlauf genau zu überwachen.
  7. Führen Sie eine optogenetische Manipulation durch.
    1. Neben der Aufzeichnung von Calciumsignalen und der Emission des Laserstrahls zur ischämischen Induktion ist die Optrode auch in der Lage, optogenetische Stimulation zu liefern, wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt (Abbildung 4).
    2. Verbinden Sie die Optrode mit einem optogenetischen Laserstimulator mit der richtigen Wellenlänge und Leistung (in diesem Fall sind es 488 nm, 10 mW, 5 Minuten für Opto-vTrap) und schalten Sie den Stimulator ein, um eine optogenetische Manipulation durchzuführen.

5. Multimodale Datenanalyse-Pipeline

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt den Analyse-Workflow zur Verarbeitung der multikanaligen elektrophysiologischen Daten (Spike-Sortierung), astrozytischer Kalziumsignale (ΔF/F-Berechnung) und die intermodale Ausrichtung der beiden Datenströme. Software erforderlich: Plexon Offline Sorter (Offline-Spike-Sortiersoftware), NeuroExplorer (Analyse-Software für neuronale Daten) und RWD OFRs (Faserphotometrie) Analysesoftware.

  1. Neuronale Spike-Sortierung (Plexon-System):
    1. Importiere die rohen .pl2-Dateien in die offline Spike-Sortiersoftware. Wenden Sie einen digitalen Hochbandpassfilter (<300 Hz) an, um hochfrequente Spike-Aktivitäten zu isolieren.
    2. Stellen Sie eine Spannungsschwelle ein (typischerweise -5 Standardabweichungen des Rauschens), um potenzielle Spitzen zu erkennen.
    3. Nach manuellem Screening und der Ungültigkeit von Rauschwellenformen wird die Scan-Funktion in der Offline-Spike-Sortiersoftware verwendet, um eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchzuführen, um Wellenformen zu gruppieren und nach verschiedenen Neuronenclusternzu scannen.
    4. Untersuchen Sie die Histogramme des Inter-Spike-Intervalls (ISI). Stellen Sie sicher, dass jede "Single Unit" eine ISI-Verletzungsquote von <1 % hat (entsprechend der Refraktärzeit). Die ISI-Verletzungsrate ist in der oberen linken Ecke jeder Einheit in der Offline-Spike-Sortiersoftware angezeigt.
    5. Exportiere die sortierten Zeitstempel in die Neuraldatenanalyse-Software. Verwenden Sie das Rate-Histogramm und die Peri-Event-Histogramme gegen die Zeit in der neuronalen Datenanalyse-Software, um Rate-Histogramme und Peri-Stimulus-Zeithistogramme (PSTH) zu erzeugen.
    6. Geben Sie die durchschnittliche Wellenformlänge und die mittlere Feuerrate jeder Einheit aus dem statistischen Abschnitt in der Neural-Datenanalyse-Software zur weiteren Analyse aus.
  2. Astrozytische Kalziumsignalverarbeitung (Faserphotometrie-Analysesoftware)
    1. Öffnen Sie die rohen Fluoreszenzdaten (470 nm Kanal für Signal und 410 nm Kanal für Bewegungssteuerung) in der Analysesoftware.
    2. Im Vorverarbeitungsbereich des Faserphotometriesystems führen Sie 410 nm als Steuerung zur Bewegungskorrektur aus, stellen Sie den Glättungskoeffizienten auf 8 und wählen Sie PLS Fit als Basiskorrektur.
    3. Berechnen Sie die Änderung der Fluoreszenz (ΔF/F) mit der Formel25:
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    4. Führen Sie eine Analyse von Astrozyten-Kalziumsignalen anhand von Ereigniszeitstempeln durch, extrahieren Sie Peri-Event-Daten zur Visualisierung (z. B. Heatmaps und Mittelwertspuren) und berechnen Sie die Fläche unter der Kurve (AUC).
  3. Synchronisierte Korrelation zwischen Astrozyten und Neuronen
    1. Richte neuronale Spitzen und Astrozyten-Kalziumsignale anhand des gemeinsamen Verhaltens-Ereignis-Zeitstempels als Zeit Null aus.
    2. Nach der Extraktion von Peri-Event-Daten richten Sie die beiden Datenströme auf diese gemeinsame Zeit-Null aus und visualisieren Sie die Astrozyten-Neuron-Korrelation (Abbildung 3).

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Ergebnisse

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Experimentelle Zeitleiste

Abbildung 1 fasst den experimentellen Zeitplan und wichtige chirurgische Orientierungspunkte zusammen. Ein dreiwöchiges Intervall zwischen der viralen Injektion und der Optrodenimplantation ist entscheidend für eine ausreichende Expression von GCaMP6s, und robuste astrozytische Kalziumsignale sollten durch die Untersuchung der Faserphotometriespuren während der Baseline-Aufzeichnungsperio...

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Diskussion

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Das hier beschriebene integrierte Protokoll stellt einen bedeutenden Fortschritt in der Untersuchung der Astrozyten-Neuronen-Interaktionen während des ischämischen Schlaganfalls dar. Durch die Kombination der photothrombotischen Induktion mit Echtzeit-opto-elektrophysiologischer Überwachung und optogenetischer Manipulation überbrückt diese Methodik effektiv die Lücke zwischen Schlaganfallbeginn und der Beobachtung der Kreislauf-Reorganisation von Neuronen und Astrozyten. Jüngste Arbeiten...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Jugendprogramm der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas (Nr. 82405539), den Grundlagen- und Angewandten Grundlagenforschungsfonds der Provinz Guangdong (Nr. 2023A1515110322, 2025A1515011811), das Youth Talent Support Program der China Association of Chinese Medicine (2025-QNRC2-B16), das Wissenschafts- und Technologie-Kokonstruktionsprojekt der National Comprehensive Reform Demonstration Zone für traditionelle chinesische Medizin (GZY-KJS-GD-2025-048), GZY-KJS-GD-2025-033), das Sonderprojekt zur Festigung der Fundamente der Akupunktur- und Moxibustion-Disziplin der Guangzhou University of Chinese Medicine.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2% TTC FärbelösungSolarbioG3005
AgoroseBiosharpBS081
Körpertemperatur-Wartungssystem / Homeothermischer MonitorRWD life Science69002
Kraniale SchraubenZhongke Huida23092007
Datenerwerbs- und Analysesoftware (Faserphotometrie)RWD life ScienceORFs
Datenerwerbs- und Analysesoftware (Mehrkanal-Elektrophysiologie)PlexonPlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer 
Digitales Labor-Stereotaxie-GestellRWD life Science68804
PinzetteFST11252-00Pinzetten-Durchmesser 0,005 mm ´ 0,025 mm
Laser-LeistungsmesserSanwaLP10
Laser-Speckle-Blutfluss-BildgebungssystemPericam ABPericam PSI NR
MäuseRisemiceC57BL/6J
Miniatur-HandkranialbohrerRWD life Science78001
Mäuse-Virus-MikroinjektorRWD life Science68025
OptrodeBenutzerdefiniertKedouBenutzerdefiniert mit 16 Wolframelektroden um 1 Lichtleiter
PrismGraphPad5.01 Version
R studioPositVersion 4.4.1
rAAV-GfaABC1D-GCaMP6sBrainVTAPT-2560Astrozytenspezifischer Calcium-Indikator
rAAV-GfaABC1D-opto-vTrapBrainCaseBC-2446Astrozytenspezifischer optogenetischer viraler Vektor
Rose Bengal FärbemittelSigma-Aldrich198250Lichtempfindlicher Farbstoff zur Thrombusinduktion/Sigma-Aldrich
Wagenmontierte Anästhesie-ArbeitsstationRWD life ScienceR520Anästhesiegerät für steuerbare Inhalationsanästhesie für Mäuse

Referenzen

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Dynamik von Astrozyten und NeuronenIn vivo ElektrophysiologieFiber Photometriefokale Isch mieAufzeichnung von Calciumsignalenoptogenetische Manipulationneuronales Spiking

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