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Methodenartikel

Intravitale Bildgebung der abgeschwächten auxotrophen Mycobacterium tuberculosis in der Mauslunge während früher intravaskulärer Infektion

96 Ansichten

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DOI:

10.3791/71019

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30. Juni 2026

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1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine, 2Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine, 6Cancer Dormancy Institute, Albert Einstein College of Medicine, 7Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die intravitale Bildgebung einer abgeschwächten, BSL-2-zugelassenen Mycobacterium tuberculosis. Spannung in der Mauslunge unter Verwendung eines permanenten Lungenfensters. Dieser Ansatz ermöglicht eine longitudinale, einzelzellige Auflösungsanalyse früher Wirts-Pathogen-Interaktionen, einschließlich bacillärer Lokalisation, vaskulärer Dynamik und Makrophagenaufnahme innerhalb derselben Lungenmikroumgebung.

Zusammenfassung

Die intravitale Mikroskopie ermöglicht eine direkte Visualisierung dynamischer zellulärer Prozesse in intakten Geweben. Seine Anwendung auf Mycobacterium tuberculosis (Mtb) wurde jedoch durch die Anforderungen an die Eindämmung der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) und die technischen Herausforderungen bei der Stabilisierung der Lunge für hochauflösende Bildgebung eingeschränkt. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das das thorakale Fenster für hochauflösende Bildgebung der Mauslunge (WHRIL) mit mc27902 kombiniert, einem genetisch definierten dreifach-auxotrophen Mtb-Stamm, der für BSL-2-Bedingungen zugelassen ist. Wir beschreiben außerdem die Entstehung von mc28471, einem tdTomato-exprimierenden Derivat von mc27902, dessen Vorbereitung auf eine intravenöse Infektion und die Anwendung für intravitale Bildgebung bei Reportermäusen. Dieses System ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung der frühen Infektionsdynamik, einschließlich eines schnellen bacillären Eintritts in die pulmonale Gefäße, der Aggregation, der Verbreitung in das Lungenparenchym und der Aufnahme von Makrophagen in derselben Lungenmikroumgebung über die ersten drei Tage nach der Infektion. Durch die Ermöglichung einer longitudinalen Bildgebung von Bazillen- und Wirt-Pathogen-Interaktionen mit Einzelzellauflösung überwindet dieser Ansatz wesentliche Einschränkungen, die mit konventionellen Bildgebungs- und Hoch-Containment-Modellen verbunden sind. Dieses Protokoll bietet eine praktische BSL-2-kompatible Plattform für die Echtzeit-intravitale Bildgebung abgeschwächter Mykobakterien in der Lunge und legt die Grundlage für mechanistische Studien zur bakteriellen Physiologie, zur Wirtserkennung und immunvermittelter Clearance.

Einleitung

Die hochauflösende intravitale Mikroskopie hat die Untersuchung dynamischen zellulären Verhaltens in intakten Geweben grundlegend verändert, indem sie eine direkte Visualisierung von Zellmigration, vaskulären Interaktionen und Immunüberwachung bei Einzelzellauflösung 1,2,3,4 ermöglicht. Obwohl diese Ansätze weit verbreitet in der Krebsforschung 3,5 eingesetzt werden, wurde ihre Anwendung auf Lungeninfektionen durch Atembewegungen, Gewebefragilität und Biosicherheit begrenzt. Jüngste Fortschritte bei thorakalen Bildgeräten, darunter vakuumstabilisierte und dauerhaft implantierte optische Fenster, haben viele dieser technischen Herausforderungen gelöst, indem sie stabile, bewegungsfreie Bildgebung der pulmonalen Mikroumgebung über längere Zeiträume bereitgestellt haben 6,7,8,9,10. Dauerhaft implantierbare Fenster sind insbesondere leistungsstarke Werkzeuge, da sie eine wiederholte Visualisierung des Gefäßflusses, der Dynamik der Immunzellen und des Einzelzellverhaltens über Stunden bis Wochen ermöglichen und maßgeblich an der Definition von Mechanismen der Krebsmetastase, der vaskulären Permeabilität und der Immunüberwachung beteiligt waren11,12.

Trotz dieser Fortschritte wurde die intravitale Bildgebung bisher nicht bei einer Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-Infektion in der in vivo Säugetierlunge mit Einzelzellauflösung angewendet. Die engsten Vorbilder stammen aus der intravitalen Bildgebung mykobakterieller Infektionen in anderen Umgebungen. Echtzeit-Bildgebung der Mycobacterium marinum-Infektion in Zebrafischembryonen13 zeigte frühe Makrophageninteraktionen und Granulominitiation, während eine Zweiphotonenbildgebung von BCG-induzierten Granulomen in der Mausleber14,15 Makrophagen- und T-Zelldynamik während der Granulomentwicklung zeigte und eine begrenzte Antigenpräsentation sowie die Funktion von T-Zell-Effektoren in granulomatösen Läsionen zeigte. Diese Studien lieferten grundlegende Einblicke in die Interaktionen zwischen Mykobakteriellen Wirt und Erregern, konnten jedoch nicht auf die intakte Lunge der Säugetierezugreifen 8,16.

Intravitale Bildgebungsmethoden wurden auch auf die Lunge in anderen infektiösen und biologischen Kontexten angewandt, darunter die allgemeine Pulmonalbildgebung8, Studien, die zeigen, dass das Patrouillieren von alveolaren Makrophagen Bakterien vor dem Immunsystem verbergen kann17 und charakterisieren die unmittelbare myeloide Reaktion auf SARS-CoV-2-Infektion in der menschlichen Lunge16. Intravitale Bildgebung wurde ähnlich auf grippeinfizierte Lungen angewendet und ermöglicht eine direkte Visualisierung dynamischen Immunzellverhaltens im infizierten Lungengewebe18,19.

Ganzkörper-optische Bildgebungsmethoden mit faseroptischer mikroendoskopischer Anregung20 und Reporterenzym-Fluoreszenztechnologie 21,22 haben eine empfindliche Detektion von Mtb in Mauslungen ermöglicht, können jedoch keine einzelnen oder kleinen Bazillencluster nachweisen, die bakterielle Aggregationsdynamik verfolgen oder direkte Interaktionen zwischen Mykobakterien und Wirtszellen im intakten Lungengewebe visualisieren. Hoch-Containment-intravitale Bildgebungsmethoden wurden für infizierte Lungen in BSL-3-Umgebungen eingesetzt, darunter SARS-CoV-2-Infektion23 und Mtb-fokussierte 24-Multiphotonen-Bildgebungsplattformen. Diese Studien zeigen die Machbarkeit der Bildgebung infizierter Lungen unter Eindämmung, aber solche Einrichtungen bleiben technisch anspruchsvoll und sind nicht weit verbreitet. Die Arbeit mit virulenten Mtb erfordert eine BSL-3-Eindämmung, was erhebliche technische und biosicherheitstechnische Herausforderungen für die intravitale Bildgebung23,24 darstellt. Daher basieren die meisten Studien früher Mtb-Infektionen auf statischen Endpunkt-Analysen, die die räumliche und zeitliche Dynamik des bakteriellen Verhaltens in der Lunge nicht erfassen können.

Die Entwicklung genetisch definierter, BSL-2-zugelassener dreifach-auxotropher Mtb-Stämme bietet eine einzigartige Gelegenheit, diese Einschränkungen zu überwinden. Der mc27902-Stamm, ein Pantothenat-Leucinin-Arginin-Mtb-Auxotroph-Derivat von H37Rv, ist vollständig abgeschwächt, repliziert sich nicht bei immungeschwächten Mäusen, behält die klassische säurefeste Färbung, zeigt eine normale Phagenanfälligkeit und kann sicher außerhalb der BSL-3-Einrichtungen25 behandelt werden. Diese Eigenschaften machen MC27902 zu einem idealen Ersatzmann, um intravitale Bildgebungsmethoden zu etablieren und frühe Wirts-Pathogen-Interaktionen unter reduzierter Biosicherheit zu untersuchen.

Hier wenden wir das Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL) mit mc28471 an, einem fluoreszierenden tdTomato-exprimierenden Derivat des dreifach-auxotrophen Mtb-Stamms mc27902, um eine frühe Mtb-Infektion in der intakten Mauslunge zu visualisieren. Experimente wurden an immungeschwächten Rag2-/- Mäusen 26 durchgeführt, die mit MacBlue-Mäusen27 gekreuzt wurden, wobei der Csf1r-Promotor die Expression des verbesserten cyan-fluoreszenten Proteins (ECFP) in Monozyten, Mikroglia und Teilgruppen dendritischer Zellen und Makrophagen vorantreibt. Das MacBlue-Transgen ermöglicht eine klare Visualisierung mononukleärer Phagozytenpopulationen während einer frühen Mtb-Infektion. Wir entschieden uns, Rag2-defiziente Mäuse einzusetzen, um das System auf die frühesten angeborenen Wirts-Pathogen-Interaktionen zu fokussieren und die zusätzliche Komplexität adaptiver Immunantworten während des hier untersuchten kurzen Bildzeitraums zu vermeiden. Wichtig ist, dass diese Technik nicht auf Rag2-defizienten Mäuse beschränkt ist und auch bei immunkompetenten Tieren angewendet werden kann.

Durch die Kombination eines permanenten Lungenfensters mit einem BSL-2-kompatiblen, fluoreszierenden abgeschwächten Mtb-Stamm ermöglicht diese Plattform eine serielle intravitale Bildgebung von Bazillen-Wirtszell-Interaktionen im selben Lungenmikromilieu mit Einzelzellauflösung über mehrere Tage. Obwohl hier für eine frühe Infektion demonstriert wurde, ist die Plattform selbst nicht zwangsläufig auf frühe Zeitpunkte beschränkt und könnte je nach experimentellem Modell und Studiendesign prinzipiell auf spätere Stadien angewendet werden. Da die erfolgreiche Anwendung dieser Bildgebungsplattform von der Verwendung der hier beschriebenen spezifischen fluoreszierenden Bazillärpräparate abhängt, haben wir die wesentlichen Schritte zur Erzeugung und Herstellung dieses Reagens als Teil des vollständigen Protokolls aufgenommen. Diese Plattform bietet direkte, Echtzeitbildgebung des Mtb-Verhaltens in vivo und legt die Grundlage für zukünftige mechanistische Studien zur bakteriellen Physiologie, zur Wirtserkennung und immunvermittelter Clearance.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden gemäß institutionellen Richtlinien zur Biosicherheit und Tierpflege durchgeführt und vom Albert Einstein College of Medicine Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Der Stamm mc28471 ist ein pYUB1169-Transformant von mc27902, einem dreifach-auxotrophen Mtb-Stamm, der für den BSL-2-Einsatz zugelassen ist. Alle Arbeiten mit lebenden Bakterien wurden unter Standardvorsichtsmaßnahmen für den Umgang mit Mykobakterien durchgeführt.

1. Bau des BSL-2-zugelassenen tdTomato-Express-Mtb-Zugs MC28471

  1. Erzeugung des tdTomato-exprimierenden BSL-2-sicheren mc28471 durch Plasmidtransformation
    1. Transformieren Sie den BSL-2-zugelassenen dreifach-auxotrophen Stamm mc27902 mit dem episomalen mykobakteriellen Plasmid pYUB1169, das das vom G13-Promotor exprimierte tdTomato-Gen enthält, um das fluoreszierende Derivat mc28471 zu erzeugen.
    2. Inokulieren Sie 100 μL mc27902 (optische Dichte bei 600 nm (OD600 nm) von 0,7-1,0) in 10 mL steriles Middlebrook 7H9, ergänzt mit OADC-Anreicherung (10 % (v/v)), Glycerol (0,2 % (v/v)), D-Pantothenat (24 mg/L), L-Leucin (50 mg/L), L-Arginin (200 mg/L), Natriumpropionat (0,1 mM) und Tyloxapol (0,05 % (v/v)) in einer 30-mL-Tintenfassflasche.
    3. Inkubieren Sie die Kultur, während Sie langsam (100 U/min) bei 37 °C schütteln, bis sie eine OD600 nm von 0,7–1,0 erreicht hat.
    4. Die Zellen werden in ein 15-mL konisches Zentrifugenrohr übertragen und 10 Minuten bei 3.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entsorge das Supernatant und lasse die Zellen in 10 mL sterilem 10%igen Glycerol mit 0,05% (v/v) Tyloxapol (Wash #1) wieder suspendieren (Wash #1). Wiederhole die Zentrifugation und Waschen zweimal. Resuspendiere das Zellpellet in 0,175 mL 10 % Glycerol mit 0,05 % (v/v) Tyloxapol und füge 2 μL pYUB1169 DNA (100–200 ng DNA) hinzu.
    5. MC27902 und pYUB1169 in eine 0,2 cm Elektroporations-Cuvette übertragen. Warte 10 Minuten. Man tappt die Cuvette 2 bis 3 Mal, um Luftblasen zu entfernen, und elektropoliert bei 2.500 mV, 1.000 Ω, 25 μF, Zeitkonstante 20 ms, bei Raumtemperatur.
    6. Fügen Sie der Cuvette 1 ml steriles Middlebrook 7H9 mit OADC-Anreicherung (10 % (v/v)), Glycerol (0,2 % (v/v)), D-Pantothenat (24 mg/L), L-Leucin (50 mg/L), L-Arginin (200 mg/L), Natriumpropionat (0,1 mM) und Tyloxapol (0,05 % (v/v)) hinzu und übertragen den Inhalt der Cuvette in ein 15 ml konisches Zentrifugenrohr. Inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht bei 37 °C.
    7. Platte 0,1 mL der Transformationsmischung auf eine Middlebrook 7H10 Agarplatte, ergänzt mit OADC-Anreicherung (10 % (v/v)), Glycerol (0,2 % (v/v)), D-Pantothenat (24 mg/L), L-Leucin (50 mg/L), L-Arginin (200 mg/L), Natriumpropionat (0,1 mM) und Kanamycin (20 mg/L). Zentrifugieren Sie das verbleibende Transformationsgemisch, entsorgen Sie 0,9 ml des Supernatanten und lassen Sie das Zellpellet im Restsupernatant wieder suspendieren. Plattieren Sie die resuspendierten Zellen auf eine zweite Middlebrook 7H10 Agarplatte, die dieselben Nahrungsergänzungsmittel und Antibiotika enthält. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 3–4 Wochen. Rosa Kolonien deuten auf erfolgreiche Transformanten hin.
    8. Wählen Sie eine isolierte rosa Kolonie aus und ziehen Sie sie bei 37 °C, langsam schüttelnd, in 5 mL steriler Middlebrook 7H9, ergänzt mit OADC-Anreicherung (10 % (v/v)), Glycerol (0,2 % (v/v)), D-Pantothenat (24 mg/L), L-Leucin (50 mg/L), L-Arginin (200 mg/L), Natriumpropionat (0,1 mM), Tyloxapol (0,05 % (v/v)) und 20 mg/L Kanamycin in einer 30-mL-Tintenfassflasche.
  2. Zubereitung von MC28471 für intravenöse Infektion
    1. Wachsen Sie 10 mlMC28471 bei 37 °C, langsam schüttelnd, in sterilem Middlebrook 7H9, ergänzt mit OADC-Anreicherung (10 % (v/v)), Glycerol (0,2 % (v/v)), D-Pantothenat (24 mg/L), L-Leucin (50 mg/L), L-Arginin (200 mg/L), Natriumpropionat (0,1 mM), Tyloxapol (0,05 % (v/v)) und 20 mg/L Kanamycin in einer 30-ml-Tintenfassflasche bis zur mittleren Log-Phase (OD600 nm sollte zwischen 0,7 und 1,0 liegen).
    2. Die Zellen werden in ein 15 mL konisches Zentrifugenrohr übertragen und 10 Minuten bei 3.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie die Zellen in 10 mL steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,05 % (v/v) Tyloxapol (PBS-T, Waschmittel #1). Wiederhole die Zentrifugation und Waschen zweimal. Suspendieren Sie das Zellpellet in 4 mL PBS-T und sonisieren Sie die Zellen mit einer Leistung von 100 W, 2x 1.000 J.
    3. Messen Sie die optische Dichte der Kultur und verdünnen Sie sie in PBS-T für eine Endkonzentration von 5 x 106 CFUs pro Injektion, wobei die ungefähre Umrechnung verwendet wird, dass ein OD600 nm von 1 1 x 108 CFU/ml entspricht. Da diese Beziehung mit Dehnungs- und Wachstumsbedingungen variieren kann, sollte OD600 nm empirisch gegen verplattente CFU-Werte kalibriert werden, um Genauigkeit und Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

2. Dauerhafte Lungenfensterimplantation bei Mäusen zur intravitalen Bildgebung

  1. Bereiten Sie eine Rag2KO MacBlue-Maus für die intravitale Bildgebung vor. In dieser Studie wurde eine 10 Wochen alte männliche Maus mit einem Gewicht von 30 g verwendet. Mäuse beider Geschlechter, 8–12 Wochen alt und innerhalb des erwarteten Gewichtsbereichs für dieses Alter, sind jedoch für diesen Eingriff geeignet. Dieser Stamm exprimiert verstärktes cyanfarbenes fluoreszierendes Protein (ECFP) in Makrophagen auf einem Rag2-Knockout-Hintergrund und wurde durch Kreuzung von B6.129S6-Rag2tm1FwaN12-Mäusen (Rag2, Modell RAGN12) mit Tg (Csf1r-GAL4/VP16, UAS-ECFP)1Hume/J-Mäuse (Stock Nr. 026051) erzeugt.
  2. Implantieren Sie das Fenster für hochauflösende Bildgebung der Lunge (WHRIL) 24 Stunden vor bakterieller Infektion, um einen stabilen optischen Zugang zur Lunge zu gewährleisten und die Genesung vor der Bildgebung zu ermöglichen.
  3. Anästhesie mit 5 % Isofluran in einer Induktionskammer induzieren. Überprüfen Sie vor Beginn eines Eingriffs eine ausreichende Narkosetiefe und überwachen Sie das Tier während der gesamten Operation und Bildgeben, um Schmerzen, Beschwerden oder Atembeeinträchtigungen vorzubeugen.
  4. Präoperative Analgesie verabreichen: 10 μL (0,1 mg/kg) Buprenorphin subkutan in 90 μL sterilem PBS injizieren.
  5. Tragen Sie auf beide Augen eine Augensalbe auf, um das Austrocknen der Hornhaut während der Anästhesie zu verhindern.
  6. Binde eine 2-0 Seidennaht um die Basis eines 22G-Katheters, wobei ~2 Zoll breite Enden zur Sicherung des Katheters bleiben.
  7. Intubieren Sie die Maus mit dem nahtgebundenen Katheter. Visualisieren Sie die Luftröhrenöffnung durch Transillumination und bestätigen Sie die Platzierung mit einer Aufblasglühbirne (beidseitiger Brustaufbau).
    HINWEIS: Eine unsachgemäße Intubation kann zu Atemwegsverletzungen oder unzureichender Belüftung führen. Erst fortfahren, wenn die korrekte Platzierung durch eine beidseitige Brusterweiterung bestätigt wurde.
  8. Sichern Sie den Intubationskatheter, indem Sie nach erfolgreicher Intubation die 2-0-Seidennaht um die Schnauze binden. Verbinde den Katheter mit dem Beatmungsgerät.
  9. Legen Sie die Maus in den rechten lateralen Dekubitus auf eine beheizte chirurgische Plattform, um den linken Thorax freizulegen, und sichern Sie dann die Vorder- und Hintergliedmaßen sowie den Rücken mit Klebeband, um während des gesamten Eingriffs eine stabile Position zu erhalten.
  10. Reduzieren Sie den Isofluranspiegel für den Rest der Operation auf 3 %. Entfernen Sie Haare am linken oberen Thorax mit Enthaarungscreme.
  11. Bereiten Sie das Operationsfeld mit einer antiseptischen Lösung vor. Heben Sie die Haut an und machen Sie einen 5–10 mm langen kreisförmigen Schnitt mit einem Biopsie-Punch (33-35-SH) etwa 7 mm links vom Brustbein und 7 mm oberhalb des Subrippenrandes, zentriert über dem 6. bis 7. Zwischenrippenraum.
  12. Untersuchen Sie das freiliegende Feld auf oberflächliche Gefäße. Wenn eine Teilung eines sichtbaren Gefäßes notwendig ist, kauterisieren Sie beide Enden, um die Hämostase aufrechtzuerhalten. Entfernen Sie das darüber liegende Weichteil, um die Rippen vor dem Eintritt in die Brusthöhle klar freizulegen.
  13. Greifen und heben Sie die 6. oder 7. Rippe mit einer Pinzette an und durchbohren Sie vorsichtig den Zwischenrippenmuskel zwischen ihnen mit einer stumpfen Mikro-Dissektionsschere (abgerundete Seite zur Lunge zeigend), um in die Brusthöhle einzudringen.
    HINWEIS: Betreten Sie die Brusthöhle vorsichtig und unter direkter Sicht, um Verletzungen der Lunge, der Zwischenrippengefäße oder des umliegenden Gewebes zu vermeiden.
  14. Bringen Sie kurze, sanfte Druckluftstöße an die Interkostalöffnung ein, um die angrenzende Lungenoberfläche vorübergehend zu entleeren und sie von der Brustwand zu trennen, bevor Sie die Fensteröffnung schaffen.
  15. Positioniere den Biopsie-Punch auf das Schneidwerkzeug und führe das Schneidwerkzeug durch die Interkostalöffnung, wobei es parallel zur Brustwand bleibt. Stanzen Sie einen 5-mm-runden Defekt in den Brustkorb.
  16. Setzen Sie eine 5-0 Seidennaht mit Beutelschnur ~1 mm vom Rand des runden Defekts entfernt und verlaufen zwischen benachbarten Rippen, um die Öffnung zu umschließen.
  17. Setzen Sie den Fensterrahmen so ein, dass die Ränder des Brustwanddefekts in die Nut des Rahmens passen, dann ziehen Sie die Taschennähte fest und sichern, um den Rahmen zu fixieren.
  18. Geben Sie Cyanoacrylat-Gel-Kleber in eine 1-mL-Spritze. Heben Sie den Rahmen vorsichtig an, um ihn von der Lunge zu trennen, und tragen Sie dann eine dünne Schicht Cyanoacrylatkleber auf die Unterseite des Rahmens auf.
  19. Trocknen Sie die Lungenoberfläche mit einem kontinuierlichen, sanften Luftstrom, bis die Oberfläche matt erscheint.
    HINWEIS: Verwenden Sie nur einen sanften Luftstrom und vermeiden Sie langanhaltendes Trocknen, da übermäßiger Druck oder Übertrocknung die Lungenoberfläche schädigen und die Fensterhaftung beeinträchtigen kann.
  20. Mit positivem Exspiratoriedruck (PEEP) bläut man die Lunge auf und befestigt das Fenster dann am Rahmen. Lasse den PEEP los und halte Druck auf den Fensterrahmen für 20–30 Sekunden.
    HINWEIS: Überdruck beim Aufblasen oder Platzieren des Rahmens kann die Lunge schädigen oder die Dichtung beeinträchtigen. Üben Sie nur den minimalen Druck aus, der nötig ist, um eine sanfte Apposition zu erreichen.
  21. Setzen Sie eine zweite 5-0 Seiden-Taschennaht <1 mm vom Rand des Hautschnitts an. Stecken Sie die Haut unter den Rahmen, stellen Sie sicher, dass überschüssige Haut unter dem Fensterrahmen aufgefangen oder abgeschnitten wird, ziehen Sie dann die Taschenschnur fest an und binden Sie sie fest.
  22. Mit einem Vakuum-Tonabnehmer tragen Sie eine sehr dünne Klebeschicht auf die Unterseite des 5-mm-Deckdeckels auf und kratzen Sie den Überschuss am Rand eines rechteckigen Deckglases ab. Trocknen Sie erneut die Lungenoberfläche mit einem kontinuierlichen, sanften Luftstrom.
  23. Positionieren Sie den kreisförmigen Überdecker in der Vertiefung des Fensterrahmens in einem flachen Winkel (~15°) über der Lungenoberfläche. Erhöhen Sie kurz den Atemwegsdruck, um die Lunge aufzupumpen, und drehen Sie dann den Deckmantel in eine parallele Position, sodass die Lungenoberfläche der Unterseite des Glases entgegensteht. Halte etwa 25 Sekunden sanften Druck, während der Kleber aushärtet, und löse dann den Vakuumaufnehmer vom Deckmantel.
    HINWEIS: Vermeiden Sie das Einfangen von Blasen oder das Auftragen von überschüssigem Klebstoff beim Platzieren des Deckslips, da dies die Bildqualität mindern, die Abdichtung stören oder die Lungenoberfläche verletzen kann.
  24. Tragen Sie eine kleine Menge flüssiges Cyanoacrylat an der Grenzfläche zwischen dem Deckmantel und dem Metallrahmen auf, um die luftdichte Dichtung zu verstärken.
  25. Befestigen Sie eine sterile Nadel an eine 1-mL Insulinspritze. Führen Sie die Nadel direkt unterhalb des Xiphoideusprozesses ein und führen Sie durch das Zwerchfell in Richtung der linken Schulter in die Brusthöhle. Aspirieren Sie vorsichtig, um die verbleibende intrathorakale Luft zu entfernen.
    HINWEIS: Führen Sie die Nadel vorsichtig vor, um Lunge, Herz oder größere Gefäße nicht zu durchstochen. Aspirieren Sie vorsichtig und nur bis die Restluft entfernt ist.
  26. Isofluran ausschalten und die Beatmung mit 100 % Sauerstoff fortsetzen, bis eine nahezu normale Wach-Atemfrequenz fast wieder erreicht ist. Lassen Sie das Tier während der Genesung nicht unbeaufsichtigt. Wenn die normale spontane Atmung nicht rechtzeitig wieder aufgenommen wird, bieten Sie angemessene unterstützende Versorgung an oder lassen Sie sie gemäß den institutionellen Richtlinien einschläfern.
  27. Entfernen Sie die Sicherungsnähte, extubieren Sie die Maus und setzen Sie sie in einen sauberen, erwärmten Käfig zur Ergung. Überwachen Sie das Tier, bis es vollständig gehfähig ist; Mäuse, die ihre normale Atmung nicht wiedererlangen, sollten gemäß institutionellen Richtlinien eingeschläfert werden.
  28. Postoperative Analgesie verabreichen: 10 μL (0,1 mg/kg) Buprenorphin subkutan in 90 μL sterilem PBS injizieren.

3. Intravitale Bildgebung

  1. Lassen Sie Mäuse sich nach der Fenstereinpflanzung erholen, bevor sie bildgebend werden. Führen Sie Bildgebung 1 bis 5 Tage nach der Operation durch.
  2. Führen Sie eine Anästhesie mit 3 % Isofluran ein und halten Sie dann während der Bildgebung bei 1,5 %.
  3. Stecken Sie den maßgefertigten Adapter für Bühnenplatte und Fensterrahmen zwischen die Haut und den äußeren Rand des Lungenfensterrahmens und sichern Sie eine Standard-Mikroskop-Bühnenplatte mit Klebeband.
  4. Platziere die Maus mit dem individuellen Bühnenplatten-Fensterrahmen-Adapter, der an der Mikroskop-Übersetzungsstufe befestigt ist. Körpertemperatur bei ~37 °C halten Sie eine mit Zwangsluft beheizte Kammer und Temperatursensor-Rückkopplungsschleife.
  5. Mit der Maus auf der Stufenplatte wird die Haut um das Auge auf der Injektionsseite vorsichtig zurückgezogen, um die mediale Canthus freizulegen, und FITC-dextran (150 kDa; 20 mg/mL, 100 μL) retro-orbital injiziert, um die Gefäße zu markieren.
  6. Erstellen Sie Schnappschuss-, Z-Stack- oder Zeitrafferaufnahmen der Lungengefäße vor der bakteriellen Injektion mit den folgenden Parametern.
    1. Für Konfokalmikroskopie-Einstellungen: Bittiefe: 12 Bit, Bildrate: 2 fps, Bildgröße: 512 × 512 Pixel, Pixelgröße: 0,497 μm/Pixel, 0,994 μm/Pixel, Z-Schrittgröße: 2 μm, Gesamtz-Tiefe: 50–70 μm, Bilddurchschnitt: 3, Scangeschwindigkeit: 2 μs/Pixel (977 Zeilen/s), Laseranregungswellenlängen: 405 nm, 488 nm, 559 nm, Laserleistung an der Probe: 230 μW (405 nm), 75 μW (488 nm), 40 μW (559 nm), Detektionsfilter: 430-470 nm (Blau), 505-540 nm (Grün), 575-675 nm (Rot), Detektorverstärkungen: 800 V für Blau, 650 V für Grün, 700 V für Rot, Lochdurchmesser: 60 μm oder 1 Airy-Einheit für 559 nm
    2. Für die Multiphotonenmikroskopie werden die gleichen Bildparameter verwendet wie bei der Konfokalmikroskopie, mit dem Unterschied, dass ein 920-nm-Anregungslaser mit 25 mW Laserleistung an der Probe eingesetzt wurde.
  7. Retro-orbital injizieren Sie 5 x 106 CFUs tdTomaten-exprimierend mc28471.
    HINWEIS: Führen Sie Retro-Orbitalinjektionen nur mit angemessenem Training und Zurückhaltung durch, da eine falsche Technik zu Augenverletzungen, Blutungen oder einer fehlgeschlagenen Abgabe des Inokulums führen kann.
  8. Erstellen Sie Schnappschüsse, Z-Stack- und Zeitrafferaufnahmen von Tuberkulose und fluoreszenzmarkierten Zellen und Gefäßen mit den Bildgebungsparametern in 3.6.1 und 3.6.2. Passen Sie die Verstärkung aller Detektoren an, um das Signal zu maximieren und gleichzeitig eine Sättigung des Detektors zu vermeiden.
  9. Nach der Bildgebung schalten Sie Isofluran aus und nehmen Sie die Maus aus dem Mikroskop. Halten Sie die Maus warm und überwachen Sie sie bis zur vollständigen Genesung.
  10. Wiederholen Sie die Bildgebung zu den folgenden Zeitpunkten nach MC28471 Injektion: 0–60 Min, 6 Stunden und 3 Tage. Für jede Bildgebende Sitzung wird FITC-dextran (100 μL, retro-orbital) erneut injiziert, um die Gefäße zu visualisieren, und anschließend Bilder wie in den Schritten 3.8-3.9 beschrieben aufgenommen.

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Ergebnisse

Nach Elektroporation und Kanamycin-Auswahl zeigten isolierte Kolonien von mc28471 leuchtend rote Fluoreszenz, was die stabile tdTomato-Expression bestätigte. MC28471 Bazillen wurden erweitert, als Einzelzellsuspension vorbereitet und intravenös an Mäuse mit chirurgisch implantiertem WHRIL verabreicht. Eine intravitale Bildgebung wurde durchgeführt, um die frühe Mtb-Infektionsdynamik im Lungenmikroumfeld zu visualisieren. Für diese Studie wurden Basisaufnahmen der Lu...

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Diskussion

Diese Plattform schließt eine echte Lücke in der Tuberkuloseforschung, indem sie eine direkte Visualisierung von Bazillen- und Wirtszell-Interaktionen in der intakten Säugetierlunge unter BSL-2-Bedingungen ermöglicht. Frühere in vivo Bildgebungsstrategien, einschließlich der optischen Ganzkörperdetektion mittels faseroptischer mikroendoskopischer Anregung20, Reporterenzym-Fluoreszenzbildgebung21 und naheinfraroter fluoreszierender ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch folgende Förderungen unterstützt: AI26170; Die Evelyn-Lipper Family Foundation und das Gruss Lipper Biophotonics Center. Wir erkennen die Unterstützung durch die Analytical Imaging Facility an, unterstützt durch den NCI Cancer Center Grant P30 CA013330.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 ml KonusrohrCorning430790
2-0 Seidenligatur Ethicon, IncLA55G
5 mm DeckglasElectron Microscopy Sciences72296-05
5 mm Einweg-BiopsiestempelIntegra33-35-SH
5-0 Seidenpursenstring-Naht Ethicon, Inc640G
Gedrungene mikro-DissektionsschereRobozRS-5980
BuprenorphinHospira0409-2012-32Injektion von 10 μL Buprenorphin (0,3 mg/mL Stammlösung) verdünnt in 90 μL sterilem PBS (Enddosis = 0,1 mg/kg) 
DruckluftkanisterFalconDPSJB-12
CyanoacrylatkleberLoctite234790
D-Calcium-PantothenatAcros243305000
ECM 630 Elektroporationssystem komplett, mit SicherheitsständerBTX Harvard Apparatus45-0051
ElektroporationsküvetteFisher ScientificFB102
FITC-DextranSigma-AldrichFD150S-1G150 kDa
GlycerolFisher ChemicalsG33-1
Graefe-PinzetteRobozRS-5135Um den Rippen während des Lungenfenster-Implantationsvorgangs zu greifen und zu erheben
Isofluran Pivetal78949580
Isofluran-VerdampferSurgiVetVCT302
KanamycinGoldbio.comK-120-25
L-Arginin-MonohydrochloridSigma-AldrichA5131-100G
L-LeucinSigma-AldrichL8000
MacBlue-MäuseJackson LabsStamm #: 026051
Middlebrook 7H10 AgarDifco262710
Middlebrook 7H9 BrüheDifco271310
Middlebrook OADC-AnreicherungBecton Dickinson 212351
Muriner BeatmungsapparatKent ScientificPS-02PhysioSuite
NairChurch & Dwight Co., Inc.40002957
PBSCorning21-031-CV
PETG-Medien-TinteflascheThermo Scientific342020
PhysioSuiteKent ScientificPS-5623Um das Atemzugvolumen der Maus über die Intubation während der Operation zu überwachen
Plasmid pYUB1169Benutzerdefiniertes Plasmid
Rag2 KO MäuseJackson LabsStamm #: 008449
Kleintier-LungenaufblasballonHarvard Apparatus72-9083
NatriumpropionatThermo ScientificA17440.36
SonigatorFisher ScientificFB705
Sorval Zentrifuge X pro-SerieThermo Scientific75009020
Spektrophotometer Genesys 10 UVThermo Spectronic335903
SurgiSuiteKent ScientificSURGI-M02Multifunktionale chirurgische Plattform für Mäuse, mit Erwärmung
TrachealkatheterExelint International2674622G
TyloxapolSigma-AldrichT0307-50G
Vakuum-Aufnahmesystem Metallsonde Ted Pella, Inc.528-112

Referenzen

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