NEAT1-vermittelte Dysfunktion der intestinalen Barriere durch Bindung an miR-29b-3p in lipopolysaccharidbeschädigten Caco-2-Zellen

Zusammenfassung

Diese Studie bewertete NEAT1 als diagnostischen Marker und Regulator der Darmbarrierefunktion bei reizdarmbedingter Diarrhö. NEAT1 war im Serum von Patienten erhöht, band miR-29b-3p, und durch dessen Herunterregulation verbesserten sich die Parameter für die Barrierefunktion, Apoptose und Entzündungsreaktionen in lipopolysaccharidgeschädigten Caco-2-Zellen.

Zusammenfassung

Die Pathogenese des Reizdarmsyndroms mit Durchfall (IBS-D) ist unklar, und die verfügbaren Therapien bleiben begrenzt. Diese Studie bewertete den diagnostischen Wert von NEAT1 bei IBS-D und untersuchte dessen potenziellen regulatorischen Mechanismus. Insgesamt wurden 116 Patienten mit IBS-D und 116 gesunde Kontrollpersonen eingeschlossen. Die Spiegel von NEAT1 und miR-29b-3p im Serum wurden mittels umgekehrter Transkription und quantitativer Echtzeit-PCR (RT-qPCR) bestimmt, und die diagnostische Aussagekraft wurde anhand von Receiver-Operating-Characteristic-(ROC)-Kurven bewertet. Für die mechanistischen Untersuchungen wurde ein Modell mit lipopolysaccharid-(LPS-)behandelten Caco-2-Darmepithelzellen etabliert. Die Zellviabilität wurde mittels Cell-Counting-Kit-8-(CCK-8)-Assay, die Apoptose mittels Durchflusszytometrie, die Barrierefunktion mittels transepithelialem elektrischem Widerstand (TEER) und die mRNA-Spiegel von ZO-1, Occludin und Claudin-2 mittels RT-qPCR analysiert. Mit dem Dual-Luciferase-Reporter-(DLR)-Assay und dem RNA-Immunpräzipitations-(RIP)-Assay wurde die Bindungsbeziehung zwischen NEAT1 und miR-29b-3p überprüft. NEAT1 war bei Patienten mit IBS-D stark exprimiert, während miR-29b-3p niedrig exprimiert war, und ihre Spiegel zeigten eine starke negative Korrelation. Die Absenkung von NEAT1 erhöhte die miR-29b-3p-Spiegel, verbesserte die Zellviabilität und den TEER, verringerte die Apoptose, erhöhte die mRNA-Spiegel von ZO-1 und Occludin, senkte die mRNA-Spiegel von Claudin-2 und milderte barrierekonjunktiv bedingte Parameter in LPS-behandelten Caco-2-Zellen ab. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass NEAT1 im Serum ein potenzieller Biomarker für IBS-D ist und dass die NEAT1/miR-29b-3p-Achse an der Dysfunktion der Darmbarriere beteiligt sein könnte.

Einleitung

Das Reizdarmsyndrom mit Durchfall (IBS-D) ist eine häufige funktionelle gastrointestinale Störung, die durch Bauchschmerzen, abdominale Blähungen und veränderte Stuhlgewohnheiten gekennzeichnet ist¹. Derzeit ist der pathophysiologische Mechanismus von IBS-D noch nicht vollständig aufgeklärt². Die Behandlungsmethoden bestehen hauptsächlich in symptomatischer Linderung, weisen jedoch eine begrenzte Wirksamkeit und eine hohe Rückfallrate auf³. Allgemein wird angenommen, dass IBS-D auf dem Zusammenspiel mehrerer Faktoren beruht, wie einer Dysregulation der Darm-Hirn-Achse, viszeraler Hypersensitivität, einer niedriggradigen intestinalen Entzündung und einer Barrierestörung^4,5. Obwohl diese Kriterien die Diagnosestellung bis zu einem gewissen Grad standardisiert haben, sind sie subjektiv und können zu verzögerten Diagnosen oder Fehlklassifizierungen führen, insbesondere wenn die Symptome der Patienten mit denen einer entzündlichen Darmerkrankung oder anderen organischen Erkrankungen überlappen. In der routinemäßigen klinischen Praxis existieren derzeit keine validierten objektiven Biomarker für IBS-D. Daher ist die Erforschung eines neuartigen molekularen Zielmoleküls, das sowohl diagnostischen Nutzen als auch therapeutisches Potenzial bietet, eine dringende Notwendigkeit im aktuellen Forschungsfeld des IBS-D.

In den letzten Jahren haben lange nicht-kodierende RNAs als Schlüsselmoleküle der epigenetischen Regulation ein großes Potenzial als diagnostische Marker und therapeutische Zielstrukturen bei einer Vielzahl von Erkrankungen gezeigt^6,7. Die Hauptursache für IBS-D ist eine Beeinträchtigung der Darmbarrierefunktion⁸. Die Zerstörung von Tight-Junction-Proteinen führt zu "intestinalem Leck", was wiederum die Schleimhaut-Immunantwort aktiviert^9,10. Die Aktivierung des Immunsystems setzt zahlreiche proinflammatorische Faktoren frei, die durch Aktivierung des intestinalen Immun-Nerven-Systems eine Darmfunktionsstörung verursachen können. Studien haben gezeigt, dass einige lncRNAs die intestinale epitheliale Barriere regulieren können^11,12. Es wurde berichtet, dass NEAT1 im kolorektalen Schleimhautgewebe von Patienten mit Kolitis hochreguliert ist¹³. Die Hemmung der lncRNA NEAT1 kann die Dysfunktion intestinaler epithelialer Zellen (IECs) bei Colitis ulcerosa lindern¹⁴. Die Expressionsprofile von NEAT1 bei IBS-D sowie deren diagnostischer Wert wurden jedoch bisher nicht untersucht. Außerdem könnte NEAT1 ein potenzieller diagnostischer Biomarker sein¹⁵. Falls NEAT1 im Serum von IBS-D-Patienten abnorm exprimiert ist, könnte dies die derzeitigen Rom-IV-Kriterien ergänzen und ein molekulares diagnostisches Hilfsmittel bereitstellen. Gleichzeitig hat sich das miRNA-Expressionsprofil bei IBS-Patienten ebenfalls signifikant verändert. Beispielsweise wurde die Herunterregulierung der miR-29b-3p-Expression mit der Pathogenese von IBS assoziiert¹⁶. Die upstream regulierenden Mechanismen, die die Expression von miR-29b-3p bei IBS-D steuern, sind jedoch bisher vollständig unerforscht. Insbesondere die Rolle von NEAT1 als kompetitive endogene RNA (ceRNA) für miR-29b-3p im Kontext von IBS-D wurde bisher nicht untersucht, obwohl dieser Mechanismus bei anderen Erkrankungen bereits gut belegt ist^17,18. Außerdem bleibt das Potenzial von zirkulierendem NEAT1 als nicht-invasivem Serum-Biomarker zur Diagnose von IBS-D, obwohl frühere Studien sich hauptsächlich auf die Expression auf Gewebeebene konzentrierten, bislang vollständig unbekannt.

Wir vermuten, dass das lncRNA-NEAT1 an der Regulierung der Darmbarrierefunktion bei IBS-D dadurch beteiligt sein könnte, dass es als ceRNA wirkt und miR-29b-3p „absaugt“. Auf Grundlage des oben genannten Forschungshintergrunds verfolgt die vorliegende Studie folgende Ziele: (1) die Konzentrationen von NEAT1 und miR-29b-3p im Serum von IBS-D-Patienten sowie deren diagnostische Bedeutung zu bewerten; (2) die direkte Bindungsinteraktion zwischen NEAT1 und miR-29b-3p experimentell zu bestätigen; und (3) die funktionelle Rolle der NEAT1/miR-29b-3p-Achse bei der Regulierung der Integrität der Darmbarriere und der Entzündungsreaktion an einem mit LPS behandelten Caco-2-Zellmodell aufzuklären.

Protokoll

Einbeziehung der Patienten

Alle Teilnehmer gaben ihre schriftliche informierte Einwilligung ab, nachdem sie den Forschungsinhalt vollständig verstanden hatten. Das Ethikkomitee des Pudong New Area People's Hospital in Shanghai hat dieses Forschungsprotokoll geprüft und genehmigt (Nr. 2024k007). Die Stichprobengröße wurde mit G*Power berechnet: Der ausgewählte Test war ein t-Test, und der statistische Test wurde so konzipiert, dass er Unterschiede zwischen zwei unabhängigen Stichproben erfasst. Bei einer Effektgröße von d = 0,5, α = 0,05 und einer Teststärke von 0,9 ergab die Berechnung, dass mindestens 86 Probanden pro Gruppe eingeschlossen werden sollten. Um mögliche unvorhergesehene Umstände während der Studie auszugleichen, wurden jeweils 116 Patienten pro Gruppe rekrutiert. Insgesamt wurden 116 Patienten mit IBS-D, die zwischen Juli 2024 und Juli 2025 das Pudong New Area People's Hospital in Shanghai aufsuchten, als experimentelle Gruppe in diese Studie eingeschlossen. Die Einschlusskriterien waren: (1) IBS-D gemäß den diagnostischen Kriterien von Rom IV; (2) Koloskopie ohne Hinweise auf organische Läsionen der Mukosa. Ausschlusskriterien: (1) Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), Darmkrebs usw.; (2) diabetische Patienten; (3) Patienten mit kürzlichem Bauchchirurgiehintergrund; sowie (4) Patienten mit schwerer Herz-, Leber- oder Niereninsuffizienz. Parallel dazu wurden 116 gesunde Probanden, die hinsichtlich demografischer Merkmale wie Alter und Geschlecht den Patienten entsprachen, als Kontrollgruppe rekrutiert. Bei den gesunden Kontrollpersonen wurde bestätigt, dass sie weder eine Vorgeschichte chronischer gastrointestinale Erkrankungen noch entsprechende klinische Symptome aufwiesen. Bei allen Probanden wurden 5 mL periphere Venenblut entnommen. Der Überstand wurde anschließend zur Kryokonservierung vor der späteren RNA-Extraktion in einen Ultratiefkühlschrank bei -80 °C überführt.

Jeder Teilnehmer füllte einen 10-tägigen Fragebogen aus, um die folgenden klinischen Manifestationen zu dokumentieren: (a) Beurteilung der Schwere der Bauchschmerzen anhand einer 10-Punkt-Visuellen Analogskala; (b) Häufigkeit von Bauchschmerzen während des Erhebungszeitraums (Anzahl der schmerzhaften Tage); (c) Häufigkeit der Darmentleerung (maximale Anzahl der Darmentleerungen pro Tag); (d) Bristol-Stuhlkonsistenzskala zur Beurteilung der Stuhleigenschaften. Der emotionale Zustand der Probanden wurde anhand der Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS) erfasst.

Zellkultur und Modellierung

Caco-2-Zellen wurden routinemäßig in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO₂ in einem Brutschrank kultiviert. Die Caco-2-Zelllinie differenziert spontan zu einer polarisierten Zellschicht mit engen Junctions und Mikrovilli und weist morphologische und funktionelle Eigenschaften auf, die denen reifer intestinaler Epithelzellen ähneln. LPS löst eine entzündliche Reaktion aus und stört die engen Junctions im intestinalen Epithel, wodurch die intestinale Permeabilität erhöht wird – ein Prozess, der den pathologischen Merkmalen des IBS-D stark ähnelt. Außerdem wurde aufgrund der Tatsache, dass LPS-behandelte Caco-2-Zellen in früheren Studien weit verbreitet zur Modellierung von IBS-assoziierten Barrierestörungen und Entzündungen verwendet wurden^19,20,21, in der vorliegenden Studie die Behandlung von Caco-2-Zellen mit Lipopolysaccharid (LPS) gewählt, um ein in vitro-Modell des IBS-D zu etablieren. Sobald die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht hatten, wurde das Kulturmedium durch komplettes Medium mit 5 µg/ml LPS²² ersetzt, und die Zellen wurden 24 h lang stimuliert. Als Kontrollgruppe dienten konventionell kultivierte Zellen ohne LPS.

Transfektion von Zellen

Um die Rollen von NEAT1 und miR-29b-3p in Caco-2-Zellen zu untersuchen, wurden Caco-2-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden in sechs Gruppen eingeteilt: 1. Kontrollgruppe (keine Behandlung); 2. LPS-Gruppe; 3. LPS + si-NC-Gruppe; 4. LPS + si-NEAT1-Gruppe; 5. LPS + si-NEAT1 + Inhibitor-NC-Gruppe; und 6. LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p-Inhibitor-Gruppe. Zwei kleine interferierende RNAs (si-NEAT1) gegen NEAT1 wurden entworfen und synthetisiert: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) und si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). Als negativer Kontrollansatz wurde eine nicht-zielgerichtete, zufällige Sequenz-siRNA (si-NC) verwendet. Gleichzeitig wurden auch der miR-29b-3p-Inhibitor und dessen negativer Kontrollansatz synthetisiert. miR-29b-3p-Inhibitor: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Negativer Kontrollansatz: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Caco-2-Zellen wurden in 24-Well-Platten ausgesät und transfiziert, sobald die Kulturen eine Konfluenz von 60–70 % erreichten, gemäß der Herstelleranleitung. Kurz gesagt, wurden 1,25 µL siRNA in 25 µL Medium mit reduziertem Serum verdünnt, um eine endgültige siRNA-Konzentration von 50 nM zu erreichen. Zur Hemmung von miRNA wurden 2 µL des miR-29b-3p-Inhibitors oder dessen negativen Kontrolle in 25 µL Medium mit reduziertem Serum auf eine Endkonzentration von 100 nM verdünnt. Separat wurden 1,5 µL des Transfektionsreagenzes mit 25 µL Medium mit reduziertem Serum gemischt. Die verdünnte siRNA (bzw. der Inhibitor/negative Kontrolle) wurde anschließend mit dem verdünnten Transfektionsreagenz vermischt, um den Transfektionskomplex zu bilden, der tropfenweise zu den Zellen gegeben wurde. Sechs Stunden nach der Transfektion wurde das Transfektionsgemisch durch frisches komplettes Medium ersetzt, und die Zellen wurden weitere 48 h kultiviert, bevor nachfolgende funktionelle Assays durchgeführt wurden. Die Effizienz der Genunterdrückung oder Hemmung wurde vor weiteren Experimenten mittels RT-qPCR überprüft.

Quantitative Echtzeit-Reverse Transkriptase-PCR (RT-qPCR)

Gesamt-RNA wurde aus Serumproben und Caco-2-Zellen, die den angegebenen Behandlungen unterzogen wurden, isoliert. Kurz gefasst wurde jede Probe mit 1 mL RNA-Extraktionsreagenz lysiert und mit 200 µL Chloroform versetzt. Nach Zentrifugation bei 12.000 × g 15 min bei 4 °C wurde die obere wässrige Phase in ein frisches Gefäß überführt, mit 500 µL Isopropanol versetzt und 30 min bei −20 °C gehalten. Anschließend wurden die Proben bei 12.000 × g für 10 min bei 4 °C. Der erhaltene RNA-Pellet wurde zweimal mit 75 %igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 20 µL RNase-freiem Wasser resuspendiert. Die RNA-Menge und -Reinheit wurden mit einem Mikrospektrophotometer bestimmt, und nur Proben mit einem A₂₆₀/A₂₈₀ Werte von 1,8–2,0 wurden verwendet. Die RNA wurde gemäß dem Herstellerprotokoll in cDNA revers transkribiert. Zur Detektion von NEAT1, ZO-1, Occludin, Claudin-2, und GAPDHFür jede 20 µL große Reverse-Transkriptionsreaktion wurden 1 µg Gesamt-RNA verwendet, die 1× RT-Puffer, 0,5 mM dNTPs, 0,5 µM Oligo(dT)-Primer, 200 U Reverse Transkriptase und RNase-freies Wasser enthielt. Die Reaktion wurde bei 37 °C für 15 min durchgeführt, gefolgt von einer Enzyminaktivierung bei 85 °C für 5 s.

Die quantitative PCR wurde mit cDNA als Vorlage unter Verwendung eines auf SYBR Green basierenden Echtzeit-PCR-Systems durchgeführt. Die Expressionslevel von NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, Occludin, und Claudin-2 wurden mit genspezifischen Primern gemessen. U6 diente als Referenzgen für miR-29b-3p, während GAPDH zur Normalisierung von NEAT1 und genenbezogenen engen Verbindungen verwendet wurde. Die relative Expression wurde mit der 2−ΔΔCt-Methode berechnet. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Test zur Zellviabilität

Caco-2-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in 96-Well-Platten mit je 1 × 10⁴ Zellen pro Well ausgesät. Es wurden eine Leerkontrollgruppe (enthält nur das Kulturmedium), eine Kontrollgruppe (nicht behandelte Zellen) und eine Versuchsgruppe (Caco-2-Zellen unter verschiedenen Behandlungsbedingungen) eingerichtet, jeweils mit 5–6 parallelen Wells. Die Zellen wurden vier verschiedenen Zeitpunkten zugeordnet: 0, 24, 48 und 72 h. Für jeden Zeitpunkt wurde eine separate Kulturplatte angelegt, um wiederholtes Öffnen des Inkubators während der Messungen zu vermeiden. Nach der Kultivierungszeit wurden 10 µL CCK-8-Lösung unter Vermeidung von Blasenbildung zu jedem Well hinzugefügt. Anschließend wurde die Kulturplatte für 2 h in einen 37 °C, 5 % CO₂ enthaltenden Inkubator zurückgebracht und dort dunkel inkubiert. Die Absorption jedes Wells wurde unmittelbar bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. Schließlich wurde die Zellviabilität in Prozent angegeben.

Apoptose-Assay für Zellen

Die Apoptose wurde mittels Durchflusszytometrie nach Färbung mit Annexin V-FITC/PI quantifiziert. Caco-2-Zellen aus jeder Behandlungsgruppe wurden gesammelt und zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Zentrifugation erfolgte bei 300 × g für 5 min bei 4 °C. Der Zellpellet wurde dann in 100 µL 1× Bindungspuffer resuspendiert, gefolgt von der sukzessiven Zugabe von 5 µL Annexin V-FITC und 5 µL PI. Nach vorsichtigem Mischen wurden die Proben 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden 300 µL 1× Bindungspuffer zugegeben, und die Suspension wurde vorsichtig gemischt, bevor sie in ein 5-mL-Durchflusszytometrie-Röhrchen überführt wurde. Die Proben wurden innerhalb von 1 h mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Trans-epithelialer elektrischer Widerstand (TEER)

Die Permeabilität wurde durch die Messung der TEER-Werte von Caco-2-Zellen²³ bestimmt. Caco-2-Zellen wurden in Transwell-Kammern ausgesät und 21 Tage lang kultiviert, um eine dichte Monoschicht zu bilden. Für jede experimentelle Bedingung wurden sechs unabhängige biologische Wiederholungen sowie jeweils fünf technische Wiederholungen durchgeführt. Vor und nach der experimentellen Behandlung wurden die TEER-Werte jeder Gruppe mit einem Transmembranwiderstandsmessgerät unter Verwendung mit Ethanol sterilisierter und mit PBS gepufferter Elektroden gemessen. Kurz gesagt, wurde der lange Elektrodenstab in das basolaterale Kulturmedium und der kurze Stab in das apikale Kulturmedium eingetaucht, um einen Kontakt mit der Filtermembran zu vermeiden. Nach Erreichen der Stabilität wurde der Widerstandswert (Ω) abgelesen, und die Messung wurde wiederholt, bis drei übereinstimmende Werte vorlagen. Der Widerstand leerer Transwell-Filter (ohne Zellen) wurde unter denselben Bedingungen gemessen und von allen experimentellen Werten subtrahiert. TEER (Ω·cm²) = (Probenwiderstand – Blankowiderstand) × effektive Membranfläche. Die Daten werden als (Versuchsgruppe/Kontrollgruppe) × 100 % dargestellt.

Enzymgebundener Immunosorbens-Assay (ELISA)

Die Überstände von Caco-2-Zellen aus verschiedenen Behandlungsgruppen wurden nach 24-stündiger Kultur gesammelt. Die Konzentrationen proinflammatorischer Zytokine, einschließlich Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8) und Interleukin-1β (IL-1β), wurden mithilfe kommerzieller ELISA-Reagenzien gemäß den Herstelleranweisungen bestimmt. Der Test wurde streng nach den Anweisungen durchgeführt. Die Proben und Standards wurden in die mit Antikörpern vorbeschichteten Wells gegeben, anschließend inkubiert und gewaschen. Danach wurde der biotinylierte Detektionsantikörper hinzugefügt. Nach einer weiteren Inkubation und Wäsche wurde Streptavidin, markiert mit Meerrettichperoxidase, zugegeben. Schließlich wurde das Substrat TMB zur Farbentwicklung hinzugefügt, und die Reaktion wurde mit der Stopplösung beendet. Die Absorption jedes Wells wurde unmittelbar bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen.

Western Blot

Proteine wurden aus Caco-2-Zellen nach den angegebenen Behandlungen mithilfe von RIPA-Puffer, der Proteaseinhibitoren enthielt, isoliert. Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem Bicinchoninsäure-(BCA)-Assay bestimmt. Pro Probe wurden 30 µg Protein pro Lane auf 10 %igen SDS-PAGE-Gelen aufgetragen, aufgetrennt und auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden eine Stunde bei Raumtemperatur mit 5 % fettfreier Milch blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit Antikörpern gegen ZO-1 (1:1.000), Occludin (1:500), Claudin-2 (1:1.000) und GAPDH (1:5.000) inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Membranen eine Stunde bei Raumtemperatur mit HRP-gekoppelten sekundären Antikörpern behandelt. Die Banden wurden mittels verstärkter Chemilumineszenz (ECL) detektiert, und die Bandenintensität wurde mit ImageJ analysiert. GAPDH diente als Ladekontrolle.

Dual-Luciferase-Reporter-(DLR)-Assay

Die potenziellen Bindungsstellen von miR-29b-3p an die NEAT1-Sequenz wurden mittels der ENCORI-Datenbank (https://rnasysu.com/encori/) vorhergesagt. Anschließend wurden NEAT1-Fragmente, die entweder Wildtyp- (WT) oder mutierte (MUT) Bindungsstellen enthielten, in den pmirGLO-Reporter-Vektor kloniert. Das konstruierte rekombinante Plasmid wurde gemeinsam mit miR-29b-3p-Mimetika (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) oder Inhibitoren sowie deren jeweiligen negativen Kontrollen (Mimetikum-NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’) in die Zellen co-transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen gesammelt und die Aktivitäten von Feuerfliegen-Luciferase und Renilla-Luciferase mittels eines Dual-Luciferase-Nachweismittels bestimmt. Die Renilla-Luciferase-Aktivität diente als interne Referenz zur Standardisierung.

RNA-Immunpräzipitations-(RIP-)Assay

Für den RIP-Assay wurden Caco-2-Zellen geerntet, mit PBS gespült und für 15 min bei 200 µL RIP-Lysepuffer, ergänzt mit Protease- und RNase-Inhibitoren, auf Eis inkubiert. Die Zelllysate wurden bei 16.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, und 10 µL jedes Überstandes wurden als Input-Kontrolle aufbewahrt. Für die Immunpräzipitation wurden 40 µL Protein A/G-Magnetkugeln mit 5 µg Anti-Ago2-Antikörper oder normalem IgG in 200 µL RIP-Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur rotiert. Nach dreimaligem Waschen mit jeweils 500 µL RIP-Waschpuffer wurden 100 µL der Kugelsuspension mit 100 µL Lysat gemischt, mit RIP-Waschpuffer auf ein Endvolumen von 1 mL aufgefüllt und über Nacht bei 4 °C unter Rotation inkubiert. Die Kugeln wurden anschließend fünfmal mit jeweils 500 µL RIP-Waschpuffer gewaschen und in 150 µL desselben Puffers resuspendiert. Der Proteindigest wurde durch Zugabe von 15 µL Proteinase K (20 mg/mL) und 15 µL 10 % SDS durchgeführt, gefolgt von einer Inkubation bei 55 °C für 30 min unter Schütteln. Der Überstand wurde gesammelt, und die RNA wurde mit dem Extraktionsreagenz isoliert und über Nacht präzipitiert. Die Anreicherung von NEAT1 und miR-29b-3p wurde anschließend mittels RT-qPCR bestimmt.

Analysen zur subzellulären Lokalisation

Caco-2-Zellen wurden mithilfe des referenzierten, im Handel erhältlichen Reagenzes zur Trennung von Kern- und Zellplasmafraktion gemäß Herstelleranleitung in nukleäre und zytoplasmatische Fraktionen aufgetrennt. Gesamt-RNA wurde aus diesen beiden Fraktionen isoliert, und die Verteilung von NEAT1 im Zellkern und im Zytoplasma wurde mittels RT-qPCR nachgewiesen. Die Kalibrierung erfolgte unter Verwendung von U6 (überwiegend nukleär) und GAPDH-mRNA (überwiegend zytoplasmatisch) als Indikatoren für die Trenneffizienz.

Statistische Analyse

Für klinische Serumproben zeigte eine Power-Analyse (t-Test, d = 0,5, α = 0,05, Power = 0,9), dass mindestens 86 Probanden pro Gruppe erforderlich waren. Um mögliche unvorhergesehene Umstände während der Studie zu berücksichtigen, wurden jeweils 116 Patienten pro Gruppe eingeschlossen, um klinisch signifikante Unterschiede nachweisen zu können. Die Normalverteilung der stetigen Variablen wurde mittels des Shapiro-Wilk-Tests überprüft. Da alle stetigen Daten normalverteilt waren (P > 0,05), wurden parametrische Analysen verwendet. Kategoriale Variablen wurden mit dem Chi-Quadrat-Test analysiert. Zellbasierte Experimente umfassten sechs unabhängige biologische Wiederholungen mit jeweils fünf technischen Wiederholungen pro biologischer Wiederholung. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angegeben. Der Vergleich zwischen zwei Gruppen mit stetigen Variablen erfolgte mittels Students t-Test, während Vergleiche zwischen mehreren Gruppen mittels einfaktorieller ANOVA mit Tukeys post-hoc-Test analysiert wurden. Statistische Signifikanz wurde definiert als P < 0,05.

Ergebnisse

Expression von NEAT1 und diagnostischer Wert

Im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe (HC) waren die Expressionsniveaus von NEAT1 bei Patienten mit IBS-D deutlich höher (P < 0,0001; Abbildung 1A). Die Fläche unter der Kurve (AUC) von NEAT1, wie sie durch die Receiver-Operating-Characteristic-(ROC)-Kurve dargestellt wird, betrug 0,867 (95 % CI: 0,821–0,913). Die Spezifität lag bei 75,9 %, während die Sensitivität bei 84,5 % lag (Abbildung 1B). Dies legt nahe, dass eine abnormale Expression von NEAT1 im Serum von Patienten mit IBS-D als neuartiger diagnostischer Biomarker für diese Erkrankung dienen könnte.

Zusätzlich wurden die klinischen Daten der Patienten in den gesunden und der IBS-D-Gruppe verglichen. Die Ergebnisse zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen hinsichtlich Alter, Geschlecht oder anderer Merkmale (P > 0,05). Es gab jedoch signifikante Unterschiede in den Werten der HADS, der Stuhlfrequenz und der Stuhlkonsistenz (P < 0,0001, Tabelle 2). Bezüglich der Häufigkeit von Bauchschmerzen litten 69 Patienten an Symptomen für ≥ 5 Tage, was 59,48 % der Fälle entspricht. Hinsichtlich der Schwere der Bauchschmerzen hatten 72 Patienten einen Wert ≥ 5, was 62,07 % entspricht (Tabelle 2). Dies bedeutet, dass Patienten mit IBS-D anhand ihrer Symptome eindeutig von der Kontrollgruppe unterschieden werden können. Angesichts der klinischen Assoziation zwischen erhöhtem NEAT1 und IBS-D-Symptomen untersuchten wir anschließend den funktionellen Einfluss von NEAT1 auf die Integrität der Darmbarriere unter Verwendung eines mit LPS behandelten Caco-2-Zellmodells.

Wirkungen geringer Konzentrationen von NEAT1 auf die Schädigung der Darmbarriere und entzündliche Reaktionen in mit LPS behandelten Caco-2-Zellen

Um die bei Reizdarmsyndrom mit Durchfall (IBS-D) beobachtete Dysfunktion der Darmbarriere und die chronische Entzündung niedriger Schwelle zu modellieren, behandelten wir Caco-2-Zellen mit LPS. Nach Zugabe von LPS stiegen die NEAT1-Spiegel im Vergleich zur Kontrollgruppe an. Nach der Transfektion mit si-NEAT1 war der NEAT1-Spiegel im Vergleich zur LPS + si-NC-Gruppe deutlich vermindert (P < 0,0001, Abbildung 2A). Die Behandlung mit LPS verringerte die Zellviabilität und erhöhte die Apoptose im Vergleich zur Kontrollgruppe. Nach der Herunterregulation von NEAT1 stieg die Zellviabilität an und die Apoptoserate sank im Vergleich zur LPS + si-NC-Gruppe (P < 0,001; Abbildung 2B,C). Nach der Herunterregulation von NEAT1 wurde der durch LPS verursachte Rückgang des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) signifikant wiederhergestellt (P < 0,0001, Abbildung 2D). LPS verringerte die mRNA-Expression von ZO-1 und Occludin und erhöhte die Expression von Claudin-2 im Vergleich zu den Kontrollen, wohingegen die Herunterregulation von NEAT1 diese Veränderungen umkehrte (P < 0,001, Abbildung 2E-G). Die Behandlung mit LPS kann eine entzündliche Reaktion in den Zellen auslösen. Die Konzentrationen der proinflammatorischen Faktoren TNF-α, IL-6, IL-8 und IL-1β in den Zellen waren höher als in der Kontrollgruppe. Nach der Herunterregulation von NEAT1 waren die Gehalte an proinflammatorischen Faktoren in den Zellen im Vergleich zur si-NC-Gruppe signifikant vermindert (P < 0,0001, Abbildung 3A-D). Dies legt nahe, dass niedrige NEAT1-Spiegel die LPS-induzierte Dysfunktion der Darmbarriere und entzündliche Reaktionen reduzieren und dass NEAT1 möglicherweise zum Fortschreiten des IBS-D beiträgt.

Direkte Bindung von NEAT1 und Auswirkungen auf miR-29b-3p in Caco-2-Zellen

In Caco-2-Zellen befindet sich NEAT1 hauptsächlich im Zytoplasma (Abbildung 4A). Die Bindungsstellen von NEAT1 und miR-29b-3p wurden mithilfe der ENCORI-Datenbank vorhergesagt. Darauf basierend entwarfen wir die Sequenzen WT-NEAT1 und MUT-NEAT1 (Abbildung 4B). Die Ergebnisse des DLR-Experiments zeigten, dass miR-29b-3p-Mimics die enzymatische Aktivität von WT-NEAT1 im Vergleich zum Mimetikum-NC verringerten, während die Inhibitoren sie im Vergleich zum Inhibitor-NC erhöhten. Umgekehrt hatte keiner der beiden Behandlungen einen Einfluss auf MUT-NEAT1 (P < 0,0001, Abbildung 4C). Der RIP-Assay ergab, dass NEAT1 und miR-29b-3p in der anti-Ago2-Fraktion im Vergleich zur anti-IgG-Gruppe deutlich angereichert waren, was auf eine spezifische Interaktion zwischen beiden hinweist (P < 0,0001, Abbildung 4D). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass NEAT1 spezifisch an miR-29b-3p bindet. Gleichzeitig war der Spiegel von miR-29b-3p bei IBS-D-Patienten im Vergleich zur HC-Gruppe signifikant vermindert (P < 0,0001, Abbildung 4E). Die AUC der ROC-Kurve betrug 0,856 (95 % KI: 0,808–0,905) bei einer Sensitivität von 89,7 % und einer Spezifität von 71,6 % (Abbildung 4F). Die Pearson-Korrelationsanalyse zeigte eine inverse Korrelation zwischen den NEAT1-Spiegeln und der Expression von miR-29b-3p (r = -0,744, P < 0,0001, Abbildung 4G).

Auswirkungen einer niedrigen NEAT1-Expression auf die Schädigung der intestinalen Barriere in LPS-behandelten Caco-2-Zellen und die Spiegel von miR-29b-3p

In LPS-behandelten Caco-2-Zellen war die Expression von miR-29b-3p im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich herunterreguliert. Die Transfektion mit si-NEAT1 erhöhte die miR-29b-3p-Spiegel, während die Transfektion mit dem miR-29b-3p-Inhibitor die miR-29b-3p-Spiegel erneut verringerte (P < 0,0001, Abbildung 5A). Die Herunterregulation von NEAT1 erhöhte die Zellviabilität und verringerte die Apoptose, und diese Effekte wurden durch den miR-29b-3p-Inhibitor aufgehoben (P < 0,01, Abbildung 5B,C). Die durch LPS induzierte Abnahme des TEER-Werts wurde durch die Herunterregulation von NEAT1 wiederhergestellt, und diese Wiederherstellung wurde erneut durch den miR-29b-3p-Inhibitor verhindert (P < 0,0001, Abbildung 5D). Die Behandlung mit LPS führte im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einer verminderten Expression der ZO-1- und Occludin-mRNA sowie zu einer erhöhten Expression der Claudin-2-mRNA. Nach der Herunterregulation von NEAT1 stiegen die miR-29b-3p-Spiegel sowie die mRNA-Spiegel von ZO-1 und Occludin an, während die Claudin-2-mRNA-Spiegel im Vergleich zur LPS + si-NC-Gruppe abnahmen. Nach der Hemmung von miR-29b-3p verringerten sich die mRNA-Spiegel von ZO-1 und Occludin und die Claudin-2-mRNA-Spiegel stiegen im Vergleich zur LPS + si-NEAT1 + Inhibitor-NC-Gruppe an (P < 0,001, Abbildung 5E-G). NEAT1 (hauptsächlich das zytoplasmatische Subtyp NEAT1_1) wirkt als Sponge für miR-29b-3p. Die Herunterregulation von NEAT1 setzt miR-29b-3p frei, wodurch indirekt ZO-1 und Occludin hochreguliert und Claudin-2 herunterreguliert werden, was die durch LPS induzierte Barrierestörung abschwächt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass miR-29b-3p in diesem Modell die Expression von ZO-1 und Occludin positiv und die von Claudin-2 negativ reguliert und dass die Effekte der NEAT1-Herunterregulation zumindest teilweise durch miR-29b-3p vermittelt werden.

Wir untersuchten weiterhin die Expressionslevel von Tight-Junction-Proteinen mittels Western-Blot-Analyse. Wie in Abbildung 5H dargestellt, erhöhte die Knockdown-Induktion von NEAT1 die durch LPS verminderte Expression von ZO-1 und Occludin und unterdrückte im Vergleich zur LPS + si-NC-Gruppe die Expression von Claudin-2. Bei gleichzeitiger Transfektion mit einem miR-29b-3p-Inhibitor war jedoch der protektive Effekt des NEAT1-Knockdowns im Vergleich zur LPS + si-NEAT1 + Inhibitor-NC-Gruppe abgeschwächt. Diese Ergebnisse stützen die Schlussfolgerung, dass die NEAT1-Knockdown-Bedingung die Expression von Tight-Junction-Proteinen zumindest teilweise durch Hochregulierung von miR-29b-3p wiederherstellt und dadurch die intestinale Barrierefunktion verbessert.

Auswirkungen niedriger NEAT1-Spiegel auf die Darmentzündung in LPS-behandelten Caco-2-Zellen und die Expression von miR-29b-3p

In mit LPS behandelten Caco-2-Zellen löste LPS eine entzündliche Reaktion aus. Die Spiegel der proinflammatorischen Faktoren TNF-α, IL-6, IL-8 und IL-1β waren signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Nach der Abschaltung von NEAT1 stiegen die Spiegel von miR-29b-3p, während die Konzentrationen der proinflammatorischen Faktoren im Vergleich zu si-NC signifikant abnahmen. Nach Hemmung von miR-29b-3p stiegen die Spiegel der entzündlichen Faktoren erneut an (P < 0,0001, Abbildung 6A-D). Daher unterdrückt die Abschaltung von NEAT1 die Freisetzung entzündlicher Zytokine zumindest teilweise durch Hochregulierung von miR-29b-3p.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die NEAT1-Spiegel im Serum von Patienten mit IBS-D abnormal erhöht sind und dass NEAT1 eine hohe AUC aufweist, um Patienten mit IBS-D von gesunden Kontrollpersonen zu unterscheiden. Mechanistisch bindet NEAT1 direkt an miR-29b-3p und sequestriert es im Cytoplasma. In zellulären Modellen und funktionellen Wiederherstellungsversuchen führte die Verringerung von NEAT1 zu einer erhöhten Expression von miR-29b-3p, verbesserte die Zellüberlebensrate und die TEER, verringerte die Apoptose und dämpfte die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine. Diese Befunde stützen die Hypothese, dass NEAT1 die Integrität der Darmbarriere durch Hemmung von miR-29b-3p negativ reguliert, und legen nahe, dass eine gezielte Beeinflussung von NEAT1 eine mögliche diagnostische und therapeutische Strategie für IBS-D darstellen könnte.

Datenverfügbarkeit:

Die den Abbildungen und Tabellen zugrunde liegenden Rohdaten sind als Zusatzdatei 1 (Tabellendatei mit Rohdaten) und Zusatzdatei 2 (unedierte Western-Blot-Bilder) verfügbar.

Abbildung 1. Expression und diagnostischer Wert von NEAT1 bei Patienten mit IBS-D. (A) NEAT1-Expressionsniveaus im Serum von gesunden Kontrollpersonen (HC, n = 116) und IBS-D-Patienten (n = 116), gemessen mittels RT-qPCR; (B) ROC-Kurvenanalyse von NEAT1 zur Unterscheidung von IBS-D-Patienten und gesunden Kontrollen. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt (n = 116 pro Gruppe). **** P < 0,0001. Abkürzungen: IBS-D = Reizdarmsyndrom mit Durchfall; ROC = receiver operating characteristic. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2. Wirkung von NEAT1 auf die durch LPS verursachte Schädigung der intestinalen Barriere in Caco-2-Zellen. (A) Die Transfektion mit si-NEAT1 verringert die durch LPS induzierten NEAT1-Spiegel; (B) Zellviabilität, gemessen mittels CCK-8-Assay nach 0, 24, 48 und 72 h. Die Herunterregulation von NEAT1 verbessert die Zellviabilität; (C) Apoptoserate, bestimmt durch Durchflusszytometrie mit Annexin V-FITC/PI-Färbung. Die Stilllegung von NEAT1 reduziert die Apoptoseraten; (D) Transepitheliale elektrische Widerstandskraft (TEER), gemessen in Caco-2-Monolagen. Die Hemmung von NEAT1 erhöht den zellulären TEER; (E–G) mRNA-Expressionsmengen von (E) ZO-1, (F) Occludin und (G) Claudin-2, gemessen mittels RT-qPCR. Die Stilllegung von NEAT1 steigert die mRNA-Expression von ZO-1 und Occludin, senkt hingegen die mRNA-Spiegel von Claudin-2. Die Daten sind als Mittelwert ± SD aus sechs unabhängigen Experimenten dargestellt (n = 6 pro Gruppe). *** P < 0,001; **** P < 0,0001, LPS im Vergleich zur Kontrolle, LPS + si-NEAT1 im Vergleich zu LPS + si-NC. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3. Wirkung der NEAT1-Knockdown auf die LPS-induzierte Freisetzung proinflammatorischer Zytokine in Caco-2-Zellen. (A–D) Konzentrationen von (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 und (D) IL-1β in Zellkulturüberständen, gemessen mittels ELISA. Die NEAT1-Knockdown verringert die LPS-induzierten Spiegel von TNF-α, IL-6, IL-8 und IL-1β. Die Daten sind als Mittelwert ± SD aus sechs unabhängigen Experimenten dargestellt (n = 6 pro Gruppe). **** P < 0,0001, LPS im Vergleich zu Kontrolle, LPS + si-NEAT1 im Vergleich zu LPS + si-NC. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4. Direkte Bindung von NEAT1 und Assoziation mit miR-29b-3p. (A) Subzelluläre Lokalisation von NEAT1 in Caco-2-Zellen, bestimmt durch nukleär-zytoplasmatische Fraktionierung (U6: nukleärer Kontrollmarker, GAPDH: zytoplasmatischer Kontrollmarker). NEAT1 befindet sich hauptsächlich im Zytoplasma; (B) Vorhergesagte WT- und MUT-Bindungssequenzen von NEAT1 für miR-29b-3p aus der ENCORI-Datenbank; (C) Der DLR-Assay bestätigte die Bindungsbeziehung zwischen NEAT1 und miR-29b-3p; (D) RIP bestätigte die Bindungsbeziehung zwischen NEAT1 und miR-29b-3p. Die Daten in A, C und D zeigen den Mittelwert ± SD aus sechs unabhängigen Experimenten (n = 6 pro Gruppe). (E) Expressionsspiegel von miR-29b-3p im Serum von gesunden Kontrollpersonen (HC, n = 116) und IBS-D-Patienten (n = 116); (F) ROC-Kurve von miR-29b-3p zur Unterscheidung von IBS-D-Patienten und gesunden Kontrollpersonen; (G) Pearson-Korrelationsanalyse zwischen den NEAT1- und miR-29b-3p-Spiegeln bei IBS-D-Patienten. NEAT1 war negativ mit der Expression von miR-29b-3p korreliert (r = -0,744, P < 0,0001). Die Daten in E zeigen den Mittelwert ± SD (n = 116 pro Gruppe). **** P < 0,0001. Abkürzungen: WT = Wildtyp; MUT = Mutant; DLR = Dual-Luciferase-Reporter; RIP = RNA-Immunpräzipitation. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5. Auswirkungen der Herunterregulation von NEAT1 auf die Darmbarrierefunktion in LPS-behandelten Caco-2-Zellen und miR-29b-3p. (A) Die Herunterregulation von NEAT1 erhöht die miR-29b-3p-Spiegel, während die Transfektion mit miR-29b-3p-Inhibitoren die miR-29b-3p-Expression verringert. (B) Zellviabilität, gemessen mittels CCK-8-Assay. Niedrige NEAT1-Spiegel steigern die Zellviabilität durch Erhöhung von miR-29b-3p; (C) Apoptoserate, bestimmt durch Durchflusszytometrie. Niedrige NEAT1-Spiegel verringern die Apoptoserate durch Erhöhung von miR-29b-3p; (D) Niedrige NEAT1-Spiegel erhöhen den TEER der Zellen durch Erhöhung des miR-29b-3p-Spiegels; (E–G) mRNA-Expression von (E) ZO-1, (F) Occludin und (G) Claudin-2. Niedrige NEAT1-Spiegel erhöhen die Expression von ZO-1 und Occludin und verringern die Expression von Claudin-2-mRNA durch Steigerung von miR-29b-3p. (H) Repräsentative Western-Blot-Bilder, die die Proteinexpression von ZO-1, Occludin, Claudin-2 und GAPDH unter den angegebenen Behandlungsbedingungen zeigen. Die Daten sind als Mittelwert ± SD aus sechs unabhängigen Experimenten dargestellt (n = 6 pro Gruppe). ** P < 0,01; *** P < 0,001; **** P < 0,0001, LPS vs. Kontrolle, LPS + si-NEAT1 vs. LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-Inhibitor vs. LPS + si-NEAT1 + Inhibitor-NC. Abkürzung: miR-Inhibitor = miR-29b-3p-Inhibitor; TEER = transepitheliale elektrische Widerstand. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6. Auswirkungen der NEAT1-Knockdown auf die Entzündungsreaktion in LPS-behandelten Caco-2-Zellen und miR-29b-3p. (A–D) Konzentrationen von (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 und (D) IL-1β in Zellkulturüberständen, gemessen mittels ELISA. Geringe Mengen an NEAT1 verringern den Gehalt an TNF-α, IL-6, IL-8 und IL-1β im Zellüberstand, indem miR-29b-3p erhöht wird. Die Daten sind als Mittelwert ± SD aus sechs unabhängigen Experimenten dargestellt (n = 6 pro Gruppe). **** P < 0,0001, LPS vs. Kontrolle, LPS + si-NEAT1 vs. LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-Inhibitor vs. LPS + si-NEAT1 + Inhibitor-NC. Abkürzung: miR-Inhibitor = miR-29b-3p-Inhibitor. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Gen	Primer-Sequenz
NEAT1 vorwärts	5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’
NEAT1 rückwärts	5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’
ZO-1 vorwärts	5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3′
ZO-1 rückwärts	5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’
Occludin vorwärts	5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’
Occludin rückwärts	5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’
Claudin-2 vorwärts	5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’
Claudin-2 rückwärts	5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’
miR-29b-3p vorwärts	5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’
miR-29b-3p rückwärts	5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’
GAPDH vorwärts	5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’
GAPDH rückwärts	5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’
U6 vorwärts	5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
U6 rückwärts	5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

Tabelle 1: Primersequenzen.

Indikator	Kontrollgruppe (N=116)	IBS-D-Gruppe (N=116)	P
Alter, Jahre
< 40	63	54	0.293
≥ 40	53	62
Geschlecht
Männlich	64	66	0.895
Weiblich	52	50
Rauchen
NEIN	58	53	0.599
JA	58	63
Alkoholkonsum
NEIN	63	58	0.599
JA	53	58
HADS, Punktzahl
< 8	96	26	< 0.0001
≥ 8	20	90
Anzahl der Stuhlgänge, Anzahl/Tag
< 4	103	51	< 0.0001
≥ 4	13	65
Stuhlkonsistenz, Bristol-Skala
< 5	87	25	< 0.0001
≥ 5	29	91
Häufigkeit von Bauchschmerzen, Anzahl der Tage
< 5	/	47	/
≥ 5	/	69
Schweregrad von Bauchschmerzen, Punktzahl
< 5	/	44	/
≥ 5	/	72

Tabelle 2: Vergleich der demografischen und klinischen Merkmale zwischen gesunden Kontrollpersonen und Patienten mit reizdarmbedingtem Durchfall (IBS-D). Die Werte sind als Teilnehmeranzahlen für jede Gruppe angegeben (n = 116/Gruppe). Gruppenübergreifende Unterschiede wurden mittels des Chi-Quadrat-Tests bewertet. Abkürzung: HADS = Hospital Anxiety and Depression Scale; IBS-D = irritable bowel syndrome with diarrhea.

Zusatzdatei 1: Rohdaten, die den Abbildungen und Tabellen zugrunde liegen. Diese Datei enthält die rohen numerischen Daten, die zur Erstellung der gezeigten quantitativen Ergebnisse verwendet wurden, in Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5und Abbildung 6, und die demografischen/klinischen Daten, die zusammengefasst sind in Tabelle 2.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 2: Unbearbeitete Western-Blot-Bilder. Diese Datei enthält die unbearbeiteten Western-Blot-Bilder für ZO-1, Occludin, Claudin-2 und GAPDH, die dem repräsentativen Western-Blot-Panel in Abbildung 5H entsprechen.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

IBS-D ist eine häufige funktionelle gastrointestinale Störung. Der pathologische Mechanismus ist bisher nicht vollständig aufgeklärt. In den letzten Jahren haben lncRNAs als Schlüsselmoleküle der epigenetischen Regulation ein großes Potenzial im Bereich der Krankheitsdiagnose und -therapie gezeigt. Die lncRNA NEAT1 wurde bereits bei verschiedenen Erkrankungen untersucht, wie beispielsweise kolorektalem Karzinom²⁴, Gliom²⁵ und Myokardinfarkt²⁶. Mehrere Studien haben gezeigt, dass NEAT1 an der Regulation entzündlicher Reaktionen¹³, der Zellproliferation²⁷ und der Integrität der Darmbarriere²⁸ beteiligt ist. Die spezifische Expression von NEAT1 bei IBS-D, ihr klinischer Wert sowie die zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen bei IBS-D sind jedoch bisher noch nicht ausführlich erforscht worden.

NEAT1 wird bei verschiedenen entzündlichen Erkrankungen, wie beispielsweise Pneumonie, hochreguliert²⁹, Arthrose³⁰, Rhinitis³¹und Sepsis³². Unsere Ergebnisse stimmen mit den in diesen Studien berichteten überein: NEAT1 die Expression bei Patienten mit IBS-D signifikant hochreguliert ist. Dies legt nahe, dass sie mit dem Auftreten von IBS-D assoziiert sein könnte. Derzeit basiert die Diagnose von IBS-D hauptsächlich auf den Römischen IV-Symptomkriterien, und es stehen keine objektiven laborbasierten Biomarker zur Verfügung. Obwohl diese Kriterien sich in der Forschung und vielen klinischen Anwendungen als wirksam erwiesen haben, weisen sie dennoch Einschränkungen auf, darunter Subjektivität, symptomatische Überschneidungen mit anderen Erkrankungen und diagnostische Verzögerungen. Weitere ROC-Kurvenanalysen deuten darauf hin, dass NEAT1 hat einen relativ guten diagnostischen Wert bei Patienten mit IBS-D. Serum NEAT1 Expressionsniveaus unterscheiden effektiv IBS-D-Patienten von gesunden Kontrollen mit einer AUC von 0,867 sowie hoher Sensitivität und Spezifität. Dies deutet darauf hin, dass NEAT1 bietet vielversprechend als Instrument zur Ergänzung der Rom-IV-Kriterien für die Diagnose oder als neuartiger diagnostischer Marker für IBS-D. Beispielsweise könnten Patienten mit chronischen Bauchschmerzen und Stuhlveränderungen, die erhöhte NEAT1 Die Beurteilung der Krankheitsaktivität kann mit größerer Sicherheit erfolgen, wenn die Ergebnisse der Biomarker zusammen mit den Rome-IV-Kriterien berücksichtigt werden. Dies ermöglicht einen frühzeitigen Beginn einer symptomorientierten Therapie und vermeidet unnötige invasive Untersuchungen. Umgekehrt ist bei Patienten mit normalen Biomarker-Ergebnissen, die jedoch die Rome-IV-Kriterien erfüllen, eine engmaschigere Überwachung erforderlich, um andere organische Erkrankungen auszuschließen. Daher wird erwartet, dass die Einbindung dieser Biomarker in die klinische Praxis die diagnostische Genauigkeit und Effizienz verbessert, obwohl eine prospektive Validierung in klinischen Settings noch aussteht.

Die klinischen Symptome von Patienten mit IBS-D könnten mit einer beeinträchtigten Darmbarrierefunktion zusammenhängen³³. Diese Funktion wird hauptsächlich durch die Tight-Junction-(TJ-)Struktur zwischen den Darmepithelzellen vermittelt, wobei die Proteine ZO-1 und Occludin wichtige Rollen spielen^34,35. ZO-1 ist an der Aufrechterhaltung der mechanischen Barriere und Permeabilität des Mukosepithels beteiligt³⁶. Occludin ist vor allem für die Bildung von Tight Junctions zwischen den Zellen verantwortlich, die für die Aufrechterhaltung ihrer Barrierefunktion entscheidend sind³⁷. Das Tight-Junction-Protein Claudin-2 spielt unter anderem eine wichtige Rolle bei der Bildung von Zellbypass-Porenkanälen³⁸. Bei Patienten mit IBS-D sind ZO-1 und Occludin typischerweise vermindert, Claudin-2 ist erhöht, die Darmbarriere ist geschädigt und die Permeabilität ist gesteigert. Diese Studie zeigte, dass die Abschaltung von NEAT1 den TEER des in vitro-Zellmodells erhöhte, was auf eine schädigende Wirkung von NEAT1 auf die Darmbarriere in diesem Modell hindeutet. Auf molekularer Ebene führte die Hemmung der NEAT1-Expression zu einem signifikanten Anstieg der mRNA-Expressionslevel der wichtigsten Tight-Junction-Proteine ZO-1 und Occludin, während die Expression von Claudin-2 abnahm. Dies legt nahe, dass NEAT1 die Expression von Tight-Junction-Proteinen negativ regulieren könnte, wodurch die physikalische Barriere des Darmepithels gestört und dessen Permeabilität erhöht wird. Letztlich kann dies zum Phänomen des „leaky gut“ führen. Zudem ist die bei IBS-D weit verbreitete niedriggradige Entzündung ein wichtiger Faktor, der die Schädigung der Barriere verschärft³⁹. Zahlreiche Studien haben bestätigt, dass lncRNAs als zentrale regulatorische Knotenpunkte in entzündlichen Signalwegen wirken können⁴⁰. Unsere Forschung stimmt damit überein. Die Abschaltung von NEAT1 reduziert signifikant die Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine TNF-α, IL-6, IL-8 und IL-1β, die durch LPS induziert wird. Dies ähnelt stark der Rolle von NEAT1 als proinflammatorische lncRNA in anderen entzündlichen Modellen und deutet darauf hin, dass bei IBS-D ein Teufelskreis aus Entzündung–Barrierekolle–Entzündung bestehen könnte, an dem NEAT1 eine wichtige Rolle spielt.

Mikro-RNAs (miRNAs) sind eine weitere wichtige Klasse von Faktoren, die an der Regulation von Krankheiten beteiligt sind. miR-29b-3p ist bei verschiedenen durch LPS induzierten zellulären Entzündungsreaktionen niedrig exprimiert.^41,42. In Übereinstimmung mit den meisten Studien fanden wir, dass die Spiegel von miR-29b-3p im Serum von IBS-D-Patienten deutlich herunterreguliert waren und eine starke negative Korrelation mit NEAT1 Hochregulierung. Wir zeigten weiterhin, dass NEAT1 bindet direkt an und „spongt“ miR-29b-3p im Zytoplasma in diesem Modell. Das funktionelle Rescue-Experiment zeigte weiterhin, dass NEAT1 beeinflusst die Vitalität und Apoptose von Caco-2-Zellen sowie die Spiegel von ZO-1, Occludin, und claudin-2-mRNA, zumindest teilweise über miR-29b-3p, und beeinflusst letztendlich die Integrität der intestinalen Barriere. Bemerkenswerterweise zeigen unsere Daten, dass im Kontext der mit Reizdarmsyndrom assoziierten Dysfunktion der intestinalen Barriere die Spiegel von miR-29b-3p positiv korrelieren mit ZO-1 und Occludin-Spiegel. Diese positive Regulation könnte indirekt erfolgen; beispielsweise könnte miR-29b-3p die Transkription von Tight-Junction-Proteinen unterdrücken, indem es deren transkriptionelle Repressoren gezielt hemmt, wodurch die Repression aufgehoben und die Expression gefördert wird ZO-1 und Occludin. Diese Hypothese wird auch durch frühere Studien gestützt, die berichteten, dass miR-29b-3p eine schützende Rolle bei entzündlichen Zuständen spielt, indem es negative Regulatoren der Barrierefunktion gezielt beeinflusst.⁴².

Die Zielgene, über die miR-29b-3p die Expression von ZO-1 und Occludin-mRNA reguliert, müssen jedoch noch weiter untersucht werden, um das ceRNA-Netzwerk vollständig zu erfassen, was eine Einschränkung unserer aktuellen Studie darstellt. Außerdem weist unsere Studie weitere Limitationen auf: Erstens handelte es sich um eine Einzelzentrenstudie mit einer relativ geringen Stichprobengröße (nur 116 IBS-D-Patienten wurden eingeschlossen). Der klinische diagnostische Wert von NEAT1 muss noch in großangelegten, multizentrischen prospektiven Kohortenstudien weiter validiert werden. Zweitens basiert diese Studie hauptsächlich auf klinischen Assoziationsanalysen und in-vitro-Zellmodellen. In Zukunft werden tierexperimentelle Modelle erforderlich sein, um die Rolle dieser Achse in vivo zu verifizieren. Drittens ist das spezifische downstream-Zielgen-Netzwerk von miR-29b-3p, das an der Pathogenese von IBS-D beteiligt ist, bisher noch nicht vollständig aufgeklärt. Zukünftige Studien sollten sich auf folgende Punkte konzentrieren: (1) Validierung des diagnostischen Werts von NEAT1 und miR-29b-3p bei IBS-C- und IBS-M-Patienten; (2) Prüfung der therapeutischen Wirksamkeit von auf NEAT1 abzielenden Interventionen in tierexperimentellen Modellen; und (3) Aufklärung des genauen molekularen Mechanismus, durch den miR-29b-3p Tight-Junction-Proteine reguliert. Solche Bemühungen werden die klinische Umsetzung unserer Ergebnisse unterstützen.

Zusammenfassend ist NEAT1 bei Patienten mit IBS-D stark exprimiert und weist in dieser Kohorte einen guten diagnostischen Wert auf. Niedrige NEAT1-Spiegel können die Zellviabilität fördern, die Apoptose verringern, Schäden an der Darmbarriere lindern und entzündliche Reaktionen unterdrücken, indem sie die Konzentration von miR-29b-3p in LPS-behandelten Caco-2-Zellen erhöhen. Die NEAT1/miR-29b-3p-Achse liefert eine neue Perspektive auf die komplexen pathophysiologischen Mechanismen von IBS-D. NEAT1 könnte als potenzieller diagnostischer Biomarker für IBS-D dienen, und die NEAT1/miR-29b-3p-Achse könnte ein potenzielles therapeutisches Ziel für diese Erkrankung darstellen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
24-Loch-Platten	Corning	CLS3524	Zum Aussäen von Zellen
96-Loch-Platten	Corning	CLS3599	Zum Aussäen von Zellen in CCK-8-Assays
Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Kit	Invitrogen	V13242	Zur Bestimmung der Apoptoserate
Anti-AGO2 monoklonaler Antikörper	Proteintech	67934-1-Ig	Zur Immunpräzipitation von Ago2-gebundenen RNA-Komplexen
Anti-Claudin-2-Antikörper	Invitrogen	32-5600	Primärantikörper, Verdünnung 1:1000
Anti-GAPDH-Antikörper	Cell Signaling Technology	5174	Primärantikörper, Verdünnung 1:5000; Beladungskontrolle
Anti-Human IgG-Antikörper	Proteintech	10284-1-AP	Wird als negativer Kontrollantikörper für den RIP-Assay verwendet
Anti-Occludin-Antikörper	Abcam	ab31721	Primärantikörper, Verdünnung 1:500
Anti-ZO-1-Antikörper	Proteintech	21773-1-AP	Primärantikörper, Verdünnung 1:1000
Caco-2-Zellen	SUNNCELL	SNL-068	Zur Erstellung von Modellen der intestinalen Epithelbarriere
CCK-8-Kit	Solarbio	CA1210	Kit zur Zellproliferationsbestimmung
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	Zur Phasentrennung bei der RNA-Extraktion
DMEM-Medium	Gibco	11965092	Zum Zellkultivieren
Dual-Luciferase-Reporter-Assay-Kit	ThermoFisher	16186	Zur Bestimmung der Luciferase-Aktivität
ELISA-Kit (für IL-1β)	R&D Systems	DY201	Zur Detektion von Zielproteinen in Zellkulturüberständen
ELISA-Kit (für IL-6)	R&D Systems	D6050B	Zur Detektion von Zielproteinen in Zellkulturüberständen
ELISA-Kit (für IL-8)	R&D Systems	NBP3-28022	Zur Detektion von Zielproteinen in Zellkulturüberständen
ELISA-Kit (für TNF-α)	R&D Systems	DTA00D	Zur Detektion von Zielproteinen in Zellkulturüberständen
Verbesserter chemilumineszenter (ECL) Substrat	Thermo Fisher	32106	Zur Sichtbarmachung von Proteinbanden
Ethanol (75 %)	Sigma-Aldrich	459844	Zum Waschen des RNA-Pellets
FBS (fötales Rinderserum)	Gibco	10099141	Zum Zellkultivieren
Durchflusszytometer	Beckman Coulter	B53002	Zur Bestimmung der Apoptoserate
HRP-konjugierte sekundäre Antikörper	Cell Signaling Technology	7074	Katalysieren die Erzeugung eines chemilumineszenten Signals aus ECL-Substraten
Isopropanol	Sigma-Aldrich	1133502500	Zur RNA-Präzipitation
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	Transfektionsreagenz
Lipopolysaccharid (LPS)	Sigma-Aldrich	L2880	Zur Induktion der Zellmodellerstellung
Mikroplattenreader	BioTek	Epoch 2	Zur Bestimmung der Absorption von Proben in 96-Loch-Platten
Nanodrop-Mikrospektrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000C	Zur Bestimmung der RNA-Konzentration und -Reinheit
Magermilchpulver	Coolaber	CN7861	Zum Blockieren von Membranen (5 %ige Lösung)
PARIS-Kit	Thermo Fisher	AM1921	Zur nukleär-zytoplasmatischen Fraktionierung
Penicillin–Streptomycin	Gibco	15140122	Zur Verhinderung von Kontaminationen während des Zellwachstums
Pierce BCA-Proteinassay-Kit	Thermo Fisher	23225	Zur Bestimmung der Protein-Konzentrationen
pmirGLO Dual-Luciferase-Vektor	Promega	E1330	Dual-Luciferase-Reportergenvektor
PrimeScript RT-Reagenzienkit	Takara	RR047A	Zur reversen Transkription von RNA in cDNA
PVDF-Membran	Millipore	IPVH00010	Zum Proteintransfer nach SDS-PAGE
Echtzeit-Fluoreszenz-quantitativer PCR-Instrument	Applied Biosystems	4365464	Zur Detektion von Zielgenen
RIPA-Lysispuffer (mit Proteaseinhibitoren)	Thermo Fisher	89901	Zur Gesamtproteingewinnung aus Zellen
RNA-Bindungsprotein-Immunpräzipitationskit	Sigma-Aldrich	17-701	RNA-Bindungsprotein-Immunpräzipitations-(RIP-)Assay unter Verwendung von Protein A/G-Magnetbeads
SDS-PAGE-Reagenzien (10 % Gel)	TargetMol	C0189	Zur Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht
SYBR Green Mastermix	Thermo Fisher	4309155	Zur Verwendung in PCR-Tests
TEER-Messgerät (Volt-Ohm-Meter)	Millipore	MERS00002	Transmembranwiderstandsmessgerät, zur Messung der Einzellagensintegrität
Transwell-Kammern	Corning Costar	CLS3413	Zum Kultivieren von Zellmonolagen und zur Messung des TEER
TRIzol-Reagenz	Invitrogen	15596026CN	Zur Gesamt-RNA-Extraktion