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Forschungsartikel

NEAT1-vermittelte Dysfunktion der intestinalen Barriere durch Bindung an miR-29b-3p in lipopolysaccharidbeschädigten Caco-2-Zellen

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DOI:

10.3791/71021

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14. August 2026

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1Department of Internal Medicine, Heyuan Street Community Healthcare Center of Heilongjiang Province Daqing City Datong District, 2Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, 3Department of Gastroenterology, Shanghai Pudong New Area People's Hospital, 4Department of organ Transplantation, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Third Hospital of Shanxi Medical University, Tongji Shanxi Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie bewertete NEAT1 als diagnostischen Marker und Regulator der Darmbarrierefunktion bei reizdarmbedingter Diarrhö. NEAT1 war im Serum von Patienten erhöht, band miR-29b-3p, und durch dessen Herunterregulation verbesserten sich die Parameter für die Barrierefunktion, Apoptose und Entzündungsreaktionen in lipopolysaccharidgeschädigten Caco-2-Zellen.

Zusammenfassung

Die Pathogenese des Reizdarmsyndroms mit Durchfall (IBS-D) ist unklar, und die verfügbaren Therapien bleiben begrenzt. Diese Studie bewertete den diagnostischen Wert von NEAT1 bei IBS-D und untersuchte dessen potenziellen regulatorischen Mechanismus. Insgesamt wurden 116 Patienten mit IBS-D und 116 gesunde Kontrollpersonen eingeschlossen. Die Spiegel von NEAT1 und miR-29b-3p im Serum wurden mittels umgekehrter Transkription und quantitativer Echtzeit-PCR (RT-qPCR) bestimmt, und die diagnostische Aussagekraft wurde anhand von Receiver-Operating-Characteristic-(ROC)-Kurven bewertet. Für die mechanistischen Untersuchungen wurde ein Modell mit lipopolysaccharid-(LPS-)behandelten Caco-2-Darmepithelzellen etabliert. Die Zellviabilität wurde mittels Cell-Counting-Kit-8-(CCK-8)-Assay, die Apoptose mittels Durchflusszytometrie, die Barrierefunktion mittels transepithelialem elektrischem Widerstand (TEER) und die mRNA-Spiegel von ZO-1, Occludin und Claudin-2 mittels RT-qPCR analysiert. Mit dem Dual-Luciferase-Reporter-(DLR)-Assay und dem RNA-Immunpräzipitations-(RIP)-Assay wurde die Bindungsbeziehung zwischen NEAT1 und miR-29b-3p überprüft. NEAT1 war bei Patienten mit IBS-D stark exprimiert, während miR-29b-3p niedrig exprimiert war, und ihre Spiegel zeigten eine starke negative Korrelation. Die Absenkung von NEAT1 erhöhte die miR-29b-3p-Spiegel, verbesserte die Zellviabilität und den TEER, verringerte die Apoptose, erhöhte die mRNA-Spiegel von ZO-1 und Occludin, senkte die mRNA-Spiegel von Claudin-2 und milderte barrierekonjunktiv bedingte Parameter in LPS-behandelten Caco-2-Zellen ab. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass NEAT1 im Serum ein potenzieller Biomarker für IBS-D ist und dass die NEAT1/miR-29b-3p-Achse an der Dysfunktion der Darmbarriere beteiligt sein könnte.

Einleitung

Das Reizdarmsyndrom mit Durchfall (IBS-D) ist eine häufige funktionelle gastrointestinale Störung, die durch Bauchschmerzen, abdominale Blähungen und veränderte Stuhlgewohnheiten gekennzeichnet ist1. Derzeit ist der pathophysiologische Mechanismus von IBS-D noch nicht vollständig aufgeklärt2. Die Behandlungsmethoden bestehen hauptsächlich in symptomatischer Linderung, weisen jedoch eine begrenzte Wirksamkeit und eine hohe Rückfallrate auf3. Allgemein wird angenommen, dass IBS-D auf dem Zusammenspiel mehrerer Faktoren beruht, wie einer Dysregulation der Darm-Hirn-Achse, viszeraler Hypersensitivität, einer niedriggradigen intestinalen Entzündung und einer Barrierestörung4,5. Obwohl diese Kriterien die Diagnosestellung bis zu einem gewissen Grad standardisiert haben, sind sie subjektiv und können zu verzögerten Diagnosen oder Fehlklassifizierungen führen, insbesondere wenn die Symptome der Patienten mit denen einer entzündlichen Darmerkrankung oder anderen organischen Erkrankungen überlappen. In der routinemäßigen klinischen Praxis existieren derzeit keine validierten objektiven Biomarker für IBS-D. Daher ist die Erforschung eines neuartigen molekularen Zielmoleküls, das sowohl diagnostischen Nutzen als auch therapeutisches Potenzial bietet, eine dringende Notwendigkeit im aktuellen Forschungsfeld des IBS-D.

In den letzten Jahren haben lange nicht-kodierende RNAs als Schlüsselmoleküle der epigenetischen Regulation ein großes Potenzial als diagnostische Marker und therapeutische Zielstrukturen bei einer Vielzahl von Erkrankungen gezeigt6,7. Die Hauptursache für IBS-D ist eine Beeinträchtigung der Darmbarrierefunktion8. Die Zerstörung von Tight-Junction-Proteinen führt zu "intestinalem Leck", was wiederum die Schleimhaut-Immunantwort aktiviert9,10. Die Aktivierung des Immunsystems setzt zahlreiche proinflammatorische Faktoren frei, die durch Aktivierung des intestinalen Immun-Nerven-Systems eine Darmfunktionsstörung verursachen können. Studien haben gezeigt, dass einige lncRNAs die intestinale epitheliale Barriere regulieren können11,12. Es wurde berichtet, dass NEAT1 im kolorektalen Schleimhautgewebe von Patienten mit Kolitis hochreguliert ist13. Die Hemmung der lncRNA NEAT1 kann die Dysfunktion intestinaler epithelialer Zellen (IECs) bei Colitis ulcerosa lindern14. Die Expressionsprofile von NEAT1 bei IBS-D sowie deren diagnostischer Wert wurden jedoch bisher nicht untersucht. Außerdem könnte NEAT1 ein potenzieller diagnostischer Biomarker sein15. Falls NEAT1 im Serum von IBS-D-Patienten abnorm exprimiert ist, könnte dies die derzeitigen Rom-IV-Kriterien ergänzen und ein molekulares diagnostisches Hilfsmittel bereitstellen. Gleichzeitig hat sich das miRNA-Expressionsprofil bei IBS-Patienten ebenfalls signifikant verändert. Beispielsweise wurde die Herunterregulierung der miR-29b-3p-Expression mit der Pathogenese von IBS assoziiert16. Die upstream regulierenden Mechanismen, die die Expression von miR-29b-3p bei IBS-D steuern, sind jedoch bisher vollständig unerforscht. Insbesondere die Rolle von NEAT1 als kompetitive endogene RNA (ceRNA) für miR-29b-3p im Kontext von IBS-D wurde bisher nicht untersucht, obwohl dieser Mechanismus bei anderen Erkrankungen bereits gut belegt ist17,18. Außerdem bleibt das Potenzial von zirkulierendem NEAT1 als nicht-invasivem Serum-Biomarker zur Diagnose von IBS-D, obwohl frühere Studien sich hauptsächlich auf die Expression auf Gewebeebene konzentrierten, bislang vollständig unbekannt.

Wir vermuten, dass das lncRNA-NEAT1 an der Regulierung der Darmbarrierefunktion bei IBS-D dadurch beteiligt sein könnte, dass es als ceRNA wirkt und miR-29b-3p „absaugt“. Auf Grundlage des oben genannten Forschungshintergrunds verfolgt die vorliegende Studie folgende Ziele: (1) die Konzentrationen von NEAT1 und miR-29b-3p im Serum von IBS-D-Patienten sowie deren diagnostische Bedeutung zu bewerten; (2) die direkte Bindungsinteraktion zwischen NEAT1 und miR-29b-3p experimentell zu bestätigen; und (3) die funktionelle Rolle der NEAT1/miR-29b-3p-Achse bei der Regulierung der Integrität der Darmbarriere und der Entzündungsreaktion an einem mit LPS behandelten Caco-2-Zellmodell aufzuklären.

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Protokoll

Einbeziehung der Patienten

Alle Teilnehmer gaben ihre schriftliche informierte Einwilligung ab, nachdem sie den Forschungsinhalt vollständig verstanden hatten. Das Ethikkomitee des Pudong New Area People's Hospital in Shanghai hat dieses Forschungsprotokoll geprüft und genehmigt (Nr. 2024k007). Die Stichprobengröße wurde mit G*Power berechnet: Der ausgewählte Test war ein t-Test, und der statistische Test wurde so konzipiert, dass er Unterschiede zwischen zwei unabhängigen Stichproben erfasst. Bei einer Effektgröße von d = 0,5, α = 0,05 und einer Teststärke von 0,9 ergab die Berechnung, dass mindestens 86 Probanden pro Gruppe eingeschlossen werden sollten. Um mögliche unvorhergesehene Umstände während der Studie auszugleichen, wurden jeweils 116 Patienten pro Gruppe rekrutiert. Insgesamt wurden 116 Patienten mit IBS-D, die zwischen Juli 2024 und Juli 2025 das Pudong New Area People's Hospital in Shanghai aufsuchten, als experimentelle Gruppe in diese Studie eingeschlossen. Die Einschlusskriterien waren: (1) IBS-D gemäß den diagnostischen Kriterien von Rom IV; (2) Koloskopie ohne Hinweise auf organische Läsionen der Mukosa. Ausschlusskriterien: (1) Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), Darmkrebs usw.; (2) diabetische Patienten; (3) Patienten mit kürzlichem Bauchchirurgiehintergrund; sowie (4) Patienten mit schwerer Herz-, Leber- oder Niereninsuffizienz. Parallel dazu wurden 116 gesunde Probanden, die hinsichtlich demografischer Merkmale wie Alter und Geschlecht den Patienten entsprachen, als Kontrollgruppe rekrutiert. Bei den gesunden Kontrollpersonen wurde bestätigt, dass sie weder eine Vorgeschichte chronischer gastrointestinale Erkrankungen noch entsprechende klinische Symptome aufwiesen. Bei allen Probanden wurden 5 mL periphere Venenblut entnommen. Der Überstand wurde anschließend zur Kryokonservierung vor der späteren RNA-Extraktion in einen Ultratiefkühlschrank bei -80 °C überführt.

Jeder Teilnehmer füllte einen 10-tägigen Fragebogen aus, um die folgenden klinischen Manifestationen zu dokumentieren: (a) Beurteilung der Schwere der Bauchschmerzen anhand einer 10-Punkt-Visuellen Analogskala; (b) Häufigkeit von Bauchschmerzen während des Erhebungszeitraums (Anzahl der schmerzhaften Tage); (c) Häufigkeit der Darmentleerung (maximale Anzahl der Darmentleerungen pro Tag); (d) Bristol-Stuhlkonsistenzskala zur Beurteilung der Stuhleigenschaften. Der emotionale Zustand der Probanden wurde anhand der Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS) erfasst.

Zellkultur und Modellierung

Caco-2-Zellen wurden routinemäßig in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C und 5 % CO₂ in einem Brutschrank kultiviert. Die Caco-2-Zelllinie differenziert spontan zu einer polarisierten Zellschicht mit engen Junctions und Mikrovilli und weist morphologische und funktionelle Eigenschaften auf, die denen reifer intestinaler Epithelzellen ähneln. LPS löst eine entzündliche Reaktion aus und stört die engen Junctions im intestinalen Epithel, wodurch die intestinale Permeabilität erhöht wird – ein Prozess, der den pathologischen Merkmalen des IBS-D stark ähnelt. Außerdem wurde aufgrund der Tatsache, dass LPS-behandelte Caco-2-Zellen in früheren Studien weit verbreitet zur Modellierung von IBS-assoziierten Barrierestörungen und Entzündungen verwendet wurden19,20,21, in der vorliegenden Studie die Behandlung von Caco-2-Zellen mit Lipopolysaccharid (LPS) gewählt, um ein in vitro-Modell des IBS-D zu etablieren. Sobald die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht hatten, wurde das Kulturmedium durch komplettes Medium mit 5 µg/ml LPS22 ersetzt, und die Zellen wurden 24 h lang stimuliert. Als Kontrollgruppe dienten konventionell kultivierte Zellen ohne LPS.

Transfektion von Zellen

Um die Rollen von NEAT1 und miR-29b-3p in Caco-2-Zellen zu untersuchen, wurden Caco-2-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden in sechs Gruppen eingeteilt: 1. Kontrollgruppe (keine Behandlung); 2. LPS-Gruppe; 3. LPS + si-NC-Gruppe; 4. LPS + si-NEAT1-Gruppe; 5. LPS + si-NEAT1 + Inhibitor-NC-Gruppe; und 6. LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p-Inhibitor-Gruppe. Zwei kleine interferierende RNAs (si-NEAT1) gegen NEAT1 wurden entworfen und synthetisiert: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) und si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). Als negativer Kontrollansatz wurde eine nicht-zielgerichtete, zufällige Sequenz-siRNA (si-NC) verwendet. Gleichzeitig wurden auch der miR-29b-3p-Inhibitor und dessen negativer Kontrollansatz synthetisiert. miR-29b-3p-Inhibitor: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Negativer Kontrollansatz: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Caco-2-Zellen wurden in 24-Well-Platten ausgesät und transfiziert, sobald die Kulturen eine Konfluenz von 60–70 % erreichten, gemäß der Herstelleranleitung. Kurz gesagt, wurden 1,25 µL siRNA in 25 µL Medium mit reduziertem Serum verdünnt, um eine endgültige siRNA-Konzentration von 50 nM zu erreichen. Zur Hemmung von miRNA wurden 2 µL des miR-29b-3p-Inhibitors oder dessen negativen Kontrolle in 25 µL Medium mit reduziertem Serum auf eine Endkonzentration von 100 nM verdünnt. Separat wurden 1,5 µL des Transfektionsreagenzes mit 25 µL Medium mit reduziertem Serum gemischt. Die verdünnte siRNA (bzw. der Inhibitor/negative Kontrolle) wurde anschließend mit dem verdünnten Transfektionsreagenz vermischt, um den Transfektionskomplex zu bilden, der tropfenweise zu den Zellen gegeben wurde. Sechs Stunden nach der Transfektion wurde das Transfektionsgemisch durch frisches komplettes Medium ersetzt, und die Zellen wurden weitere 48 h kultiviert, bevor nachfolgende funktionelle Assays durchgeführt wurden. Die Effizienz der Genunterdrückung oder Hemmung wurde vor weiteren Experimenten mittels RT-qPCR überprüft.

Quantitative Echtzeit-Reverse Transkriptase-PCR (RT-qPCR)

Gesamt-RNA wurde aus Serumproben und Caco-2-Zellen, die den angegebenen Behandlungen unterzogen wurden, isoliert. Kurz gefasst wurde jede Probe mit 1 mL RNA-Extraktionsreagenz lysiert und mit 200 µL Chloroform versetzt. Nach Zentrifugation bei 12.000 × g 15 min bei 4 °C wurde die obere wässrige Phase in ein frisches Gefäß überführt, mit 500 µL Isopropanol versetzt und 30 min bei −20 °C gehalten. Anschließend wurden die Proben bei 12.000 × g für 10 min bei 4 °C. Der erhaltene RNA-Pellet wurde zweimal mit 75 %igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 20 µL RNase-freiem Wasser resuspendiert. Die RNA-Menge und -Reinheit wurden mit einem Mikrospektrophotometer bestimmt, und nur Proben mit einem A260/A280 Werte von 1,8–2,0 wurden verwendet. Die RNA wurde gemäß dem Herstellerprotokoll in cDNA revers transkribiert. Zur Detektion von NEAT1, ZO-1, Occludin, Claudin-2, und GAPDHFür jede 20 µL große Reverse-Transkriptionsreaktion wurden 1 µg Gesamt-RNA verwendet, die 1× RT-Puffer, 0,5 mM dNTPs, 0,5 µM Oligo(dT)-Primer, 200 U Reverse Transkriptase und RNase-freies Wasser enthielt. Die Reaktion wurde bei 37 °C für 15 min durchgeführt, gefolgt von einer Enzyminaktivierung bei 85 °C für 5 s.

Die quantitative PCR wurde mit cDNA als Vorlage unter Verwendung eines auf SYBR Green basierenden Echtzeit-PCR-Systems durchgeführt. Die Expressionslevel von NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, Occludin, und Claudin-2 wurden mit genspezifischen Primern gemessen. U6 diente als Referenzgen für miR-29b-3p, während GAPDH zur Normalisierung von NEAT1 und genenbezogenen engen Verbindungen verwendet wurde. Die relative Expression wurde mit der 2−ΔΔCt-Methode berechnet. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Test zur Zellviabilität

Caco-2-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in 96-Well-Platten mit je 1 × 104 Zellen pro Well ausgesät. Es wurden eine Leerkontrollgruppe (enthält nur das Kulturmedium), eine Kontrollgruppe (nicht behandelte Zellen) und eine Versuchsgruppe (Caco-2-Zellen unter verschiedenen Behandlungsbedingungen) eingerichtet, jeweils mit 5–6 parallelen Wells. Die Zellen wurden vier verschiedenen Zeitpunkten zugeordnet: 0, 24, 48 und 72 h. Für jeden Zeitpunkt wurde eine separate Kulturplatte angelegt, um wiederholtes Öffnen des Inkubators während der Messungen zu vermeiden. Nach der Kultivierungszeit wurden 10 µL CCK-8-Lösung unter Vermeidung von Blasenbildung zu jedem Well hinzugefügt. Anschließend wurde die Kulturplatte für 2 h in einen 37 °C, 5 % CO₂ enthaltenden Inkubator zurückgebracht und dort dunkel inkubiert. Die Absorption jedes Wells wurde unmittelbar bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. Schließlich wurde die Zellviabilität in Prozent angegeben.

Apoptose-Assay für Zellen

Die Apoptose wurde mittels Durchflusszytometrie nach Färbung mit Annexin V-FITC/PI quantifiziert. Caco-2-Zellen aus jeder Behandlungsgruppe wurden gesammelt und zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen. Die Zentrifugation erfolgte bei 300 × g für 5 min bei 4 °C. Der Zellpellet wurde dann in 100 µL 1× Bindungspuffer resuspendiert, gefolgt von der sukzessiven Zugabe von 5 µL Annexin V-FITC und 5 µL PI. Nach vorsichtigem Mischen wurden die Proben 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden 300 µL 1× Bindungspuffer zugegeben, und die Suspension wurde vorsichtig gemischt, bevor sie in ein 5-mL-Durchflusszytometrie-Röhrchen überführt wurde. Die Proben wurden innerhalb von 1 h mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Trans-epithelialer elektrischer Widerstand (TEER)

Die Permeabilität wurde durch die Messung der TEER-Werte von Caco-2-Zellen23 bestimmt. Caco-2-Zellen wurden in Transwell-Kammern ausgesät und 21 Tage lang kultiviert, um eine dichte Monoschicht zu bilden. Für jede experimentelle Bedingung wurden sechs unabhängige biologische Wiederholungen sowie jeweils fünf technische Wiederholungen durchgeführt. Vor und nach der experimentellen Behandlung wurden die TEER-Werte jeder Gruppe mit einem Transmembranwiderstandsmessgerät unter Verwendung mit Ethanol sterilisierter und mit PBS gepufferter Elektroden gemessen. Kurz gesagt, wurde der lange Elektrodenstab in das basolaterale Kulturmedium und der kurze Stab in das apikale Kulturmedium eingetaucht, um einen Kontakt mit der Filtermembran zu vermeiden. Nach Erreichen der Stabilität wurde der Widerstandswert (Ω) abgelesen, und die Messung wurde wiederholt, bis drei übereinstimmende Werte vorlagen. Der Widerstand leerer Transwell-Filter (ohne Zellen) wurde unter denselben Bedingungen gemessen und von allen experimentellen Werten subtrahiert. TEER (Ω·cm2) = (Probenwiderstand – Blankowiderstand) × effektive Membranfläche. Die Daten werden als (Versuchsgruppe/Kontrollgruppe) × 100 % dargestellt.

Enzymgebundener Immunosorbens-Assay (ELISA)

Die Überstände von Caco-2-Zellen aus verschiedenen Behandlungsgruppen wurden nach 24-stündiger Kultur gesammelt. Die Konzentrationen proinflammatorischer Zytokine, einschließlich Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8) und Interleukin-1β (IL-1β), wurden mithilfe kommerzieller ELISA-Reagenzien gemäß den Herstelleranweisungen bestimmt. Der Test wurde streng nach den Anweisungen durchgeführt. Die Proben und Standards wurden in die mit Antikörpern vorbeschichteten Wells gegeben, anschließend inkubiert und gewaschen. Danach wurde der biotinylierte Detektionsantikörper hinzugefügt. Nach einer weiteren Inkubation und Wäsche wurde Streptavidin, markiert mit Meerrettichperoxidase, zugegeben. Schließlich wurde das Substrat TMB zur Farbentwicklung hinzugefügt, und die Reaktion wurde mit der Stopplösung beendet. Die Absorption jedes Wells wurde unmittelbar bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen.

Western Blot

Proteine wurden aus Caco-2-Zellen nach den angegebenen Behandlungen mithilfe von RIPA-Puffer, der Proteaseinhibitoren enthielt, isoliert. Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem Bicinchoninsäure-(BCA)-Assay bestimmt. Pro Probe wurden 30 µg Protein pro Lane auf 10 %igen SDS-PAGE-Gelen aufgetragen, aufgetrennt und auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden eine Stunde bei Raumtemperatur mit 5 % fettfreier Milch blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit Antikörpern gegen ZO-1 (1:1.000), Occludin (1:500), Claudin-2 (1:1.000) und GAPDH (1:5.000) inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Membranen eine Stunde bei Raumtemperatur mit HRP-gekoppelten sekundären Antikörpern behandelt. Die Banden wurden mittels verstärkter Chemilumineszenz (ECL) detektiert, und die Bandenintensität wurde mit ImageJ analysiert. GAPDH diente als Ladekontrolle.

Dual-Luciferase-Reporter-(DLR)-Assay

Die potenziellen Bindungsstellen von miR-29b-3p an die NEAT1-Sequenz wurden mittels der ENCORI-Datenbank (https://rnasysu.com/encori/) vorhergesagt. Anschließend wurden NEAT1-Fragmente, die entweder Wildtyp- (WT) oder mutierte (MUT) Bindungsstellen enthielten, in den pmirGLO-Reporter-Vektor kloniert. Das konstruierte rekombinante Plasmid wurde gemeinsam mit miR-29b-3p-Mimetika (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) oder Inhibitoren sowie deren jeweiligen negativen Kontrollen (Mimetikum-NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’) in die Zellen co-transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen gesammelt und die Aktivitäten von Feuerfliegen-Luciferase und Renilla-Luciferase mittels eines Dual-Luciferase-Nachweismittels bestimmt. Die Renilla-Luciferase-Aktivität diente als interne Referenz zur Standardisierung.

RNA-Immunpräzipitations-(RIP-)Assay

Für den RIP-Assay wurden Caco-2-Zellen geerntet, mit PBS gespült und für 15 min bei 200 µL RIP-Lysepuffer, ergänzt mit Protease- und RNase-Inhibitoren, auf Eis inkubiert. Die Zelllysate wurden bei 16.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, und 10 µL jedes Überstandes wurden als Input-Kontrolle aufbewahrt. Für die Immunpräzipitation wurden 40 µL Protein A/G-Magnetkugeln mit 5 µg Anti-Ago2-Antikörper oder normalem IgG in 200 µL RIP-Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur rotiert. Nach dreimaligem Waschen mit jeweils 500 µL RIP-Waschpuffer wurden 100 µL der Kugelsuspension mit 100 µL Lysat gemischt, mit RIP-Waschpuffer auf ein Endvolumen von 1 mL aufgefüllt und über Nacht bei 4 °C unter Rotation inkubiert. Die Kugeln wurden anschließend fünfmal mit jeweils 500 µL RIP-Waschpuffer gewaschen und in 150 µL desselben Puffers resuspendiert. Der Proteindigest wurde durch Zugabe von 15 µL Proteinase K (20 mg/mL) und 15 µL 10 % SDS durchgeführt, gefolgt von einer Inkubation bei 55 °C für 30 min unter Schütteln. Der Überstand wurde gesammelt, und die RNA wurde mit dem Extraktionsreagenz isoliert und über Nacht präzipitiert. Die Anreicherung von NEAT1 und miR-29b-3p wurde anschließend mittels RT-qPCR bestimmt.

Analysen zur subzellulären Lokalisation

Caco-2-Zellen wurden mithilfe des referenzierten, im Handel erhältlichen Reagenzes zur Trennung von Kern- und Zellplasmafraktion gemäß Herstelleranleitung in nukleäre und zytoplasmatische Fraktionen aufgetrennt. Gesamt-RNA wurde aus diesen beiden Fraktionen isoliert, und die Verteilung von NEAT1 im Zellkern und im Zytoplasma wurde mittels RT-qPCR nachgewiesen. Die Kalibrierung erfolgte unter Verwendung von U6 (überwiegend nukleär) und GAPDH-mRNA (überwiegend zytoplasmatisch) als Indikatoren für die Trenneffizienz.

Statistische Analyse

Für klinische Serumproben zeigte eine Power-Analyse (t-Test, d = 0,5, α = 0,05, Power = 0,9), dass mindestens 86 Probanden pro Gruppe erforderlich waren. Um mögliche unvorhergesehene Umstände während der Studie zu berücksichtigen, wurden jeweils 116 Patienten pro Gruppe eingeschlossen, um klinisch signifikante Unterschiede nachweisen zu können. Die Normalverteilung der stetigen Variablen wurde mittels des Shapiro-Wilk-Tests überprüft. Da alle stetigen Daten normalverteilt waren (P > 0,05), wurden parametrische Analysen verwendet. Kategoriale Variablen wurden mit dem Chi-Quadrat-Test analysiert. Zellbasierte Experimente umfassten sechs unabhängige biologische Wiederholungen mit jeweils fünf technischen Wiederholungen pro biologischer Wiederholung. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angegeben. Der Vergleich zwischen zwei Gruppen mit stetigen Variablen erfolgte mittels Students t-Test, während Vergleiche zwischen mehreren Gruppen mittels einfaktorieller ANOVA mit Tukeys post-hoc-Test analysiert wurden. Statistische Signifikanz wurde definiert als P < 0,05.

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Ergebnisse

Expression von NEAT1 und diagnostischer Wert

Im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe (HC) waren die Expressionslevel von NEAT1 bei IBS-D-Patienten deutlich höher (P < 0,0001; Abbildung 1A). Die Fläche unter der Kurve (AUC) von NEAT1, wie sie durch die Receiver-Operating-Characteristic-(ROC)-Kurve dargestellt wird, betrug 0,867 (95 % KI: 0,821–0,913). Die Spezifität lag bei 75,9 %, während die Sensitivität be...

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Diskussion

IBS-D ist eine häufige funktionelle gastrointestinale Störung. Der pathologische Mechanismus ist bisher nicht vollständig aufgeklärt. In den letzten Jahren haben lncRNAs als Schlüsselmoleküle der epigenetischen Regulation ein großes Potenzial im Bereich der Krankheitsdiagnose und -therapie gezeigt. Die lncRNA NEAT1 wurde bereits bei verschiedenen Erkrankungen untersucht, wie beispielsweise kolorektalem Karzinom24, Gliom25 und Myokardinfarkt26

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
24-Loch-PlattenCorningCLS3524Zum Aussäen von Zellen
96-Loch-PlattenCorningCLS3599Zum Aussäen von Zellen in CCK-8-Assays
Annexin V-FITC/PI-Apoptose-KitInvitrogenV13242Zur Bestimmung der Apoptoserate
Anti-AGO2 monoklonaler AntikörperProteintech67934-1-IgZur Immunpräzipitation von Ago2-gebundenen RNA-Komplexen
Anti-Claudin-2-AntikörperInvitrogen32-5600Primärantikörper, Verdünnung 1:1000
Anti-GAPDH-AntikörperCell Signaling Technology5174Primärantikörper, Verdünnung 1:5000; Beladungskontrolle
Anti-Human IgG-AntikörperProteintech10284-1-APWird als negativer Kontrollantikörper für den RIP-Assay verwendet
Anti-Occludin-AntikörperAbcamab31721Primärantikörper, Verdünnung 1:500
Anti-ZO-1-AntikörperProteintech21773-1-APPrimärantikörper, Verdünnung 1:1000
Caco-2-ZellenSUNNCELLSNL-068Zur Erstellung von Modellen der intestinalen Epithelbarriere
CCK-8-KitSolarbioCA1210Kit zur Zellproliferationsbestimmung
ChloroformSigma-AldrichC2432Zur Phasentrennung bei der RNA-Extraktion
DMEM-MediumGibco11965092Zum Zellkultivieren
Dual-Luciferase-Reporter-Assay-KitThermoFisher16186Zur Bestimmung der Luciferase-Aktivität
ELISA-Kit (für IL-1β)R&D SystemsDY201Zur Detektion von Zielproteinen in Zellkulturüberständen
ELISA-Kit (für IL-6)R&D SystemsD6050BZur Detektion von Zielproteinen in Zellkulturüberständen
ELISA-Kit (für IL-8)R&D SystemsNBP3-28022Zur Detektion von Zielproteinen in Zellkulturüberständen
ELISA-Kit (für TNF-α)R&D SystemsDTA00DZur Detektion von Zielproteinen in Zellkulturüberständen
Verbesserter chemilumineszenter (ECL) SubstratThermo Fisher32106Zur Sichtbarmachung von Proteinbanden
Ethanol (75 %)Sigma-Aldrich459844Zum Waschen des RNA-Pellets
FBS (fötales Rinderserum)Gibco10099141Zum Zellkultivieren
DurchflusszytometerBeckman CoulterB53002Zur Bestimmung der Apoptoserate
HRP-konjugierte sekundäre AntikörperCell Signaling Technology7074Katalysieren die Erzeugung eines chemilumineszenten Signals aus ECL-Substraten
IsopropanolSigma-Aldrich1133502500Zur RNA-Präzipitation
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015Transfektionsreagenz
Lipopolysaccharid (LPS)Sigma-AldrichL2880Zur Induktion der Zellmodellerstellung
MikroplattenreaderBioTekEpoch 2Zur Bestimmung der Absorption von Proben in 96-Loch-Platten
Nanodrop-MikrospektrophotometerThermo ScientificND-2000CZur Bestimmung der RNA-Konzentration und -Reinheit
MagermilchpulverCoolaberCN7861Zum Blockieren von Membranen (5 %ige Lösung)
PARIS-KitThermo FisherAM1921Zur nukleär-zytoplasmatischen Fraktionierung
Penicillin–StreptomycinGibco15140122Zur Verhinderung von Kontaminationen während des Zellwachstums
Pierce BCA-Proteinassay-KitThermo Fisher23225Zur Bestimmung der Protein-Konzentrationen
pmirGLO Dual-Luciferase-VektorPromegaE1330Dual-Luciferase-Reportergenvektor
PrimeScript RT-ReagenzienkitTakaraRR047AZur reversen Transkription von RNA in cDNA
PVDF-MembranMilliporeIPVH00010Zum Proteintransfer nach SDS-PAGE
Echtzeit-Fluoreszenz-quantitativer PCR-InstrumentApplied Biosystems4365464Zur Detektion von Zielgenen
RIPA-Lysispuffer (mit Proteaseinhibitoren)Thermo Fisher89901Zur Gesamtproteingewinnung aus Zellen
RNA-Bindungsprotein-ImmunpräzipitationskitSigma-Aldrich17-701RNA-Bindungsprotein-Immunpräzipitations-(RIP-)Assay unter Verwendung von Protein A/G-Magnetbeads
SDS-PAGE-Reagenzien (10 % Gel)TargetMolC0189Zur Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht
SYBR Green MastermixThermo Fisher4309155Zur Verwendung in PCR-Tests
TEER-Messgerät (Volt-Ohm-Meter)MilliporeMERS00002Transmembranwiderstandsmessgerät, zur Messung der Einzellagensintegrität
Transwell-KammernCorning CostarCLS3413Zum Kultivieren von Zellmonolagen und zur Messung des TEER
TRIzol-ReagenzInvitrogen15596026CNZur Gesamt-RNA-Extraktion

Referenzen

  1. Ren M, Ma J, Qu M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of Shaoyao Gancao Tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine (Baltimore). 2024;103(50).
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