Die Neuanalyse öffentlicher Transkriptome zeigt gemeinsame Immunsignaturen zwischen Major Depression und Dermatomyositis im Einzelzellkontext

Summary

Diese Studie zielte darauf ab, eine integrative bioinformatische Reanalyse öffentlicher GEO-Datensätze in Kombination mit Einzelzellkontextualisierung zu nutzen, um gemeinsame Kandidatengene zwischen majorer depressiver Störung und Dermatomyositis zu identifizieren und deren Verteilung über Immunzell-Subsets in einem dermatomyositisbezogenen Einzelzell-Datensatz zu charakterisieren.

Abstract

Diese Studie zielte darauf ab, gemeinsame transkriptomische Signale zwischen majorer depressiver Störung und Dermatomyositis durch eine integrative bioinformatische Neuanalyse öffentlicher GEO-Datensätze mit Einzelzellkontextualisierung zu identifizieren. Der analytische Workflow umfasste die Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) zur Identifikation von Schlüsselmodulen, Gene Ontology (GO) und die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen zur funktionellen Charakterisierung, GeneMANIA- und eine Netzwerkvisualisierungsplattform-basierte Netzwerkanalyse zur Priorisierung von Kandidatengenen sowie die Bewertung von 113 maschinellen Lernmodellen kombiniert mit SHapley Additive Explanations (SHAP) zur Auswahl diagnostischer Merkmale. Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), Immuninfiltrationsanalyse und Einzelzell-RNA-Seq-basierte Kontextualisierung wurden anschließend durchgeführt, um den immunbezogenen zellulären Kontext der identifizierten Signale weiter zu charakterisieren. Die Integration dermatomyositis-bezogener GEO-Datensätze identifizierte 570 differenziell exprimierte Gene, von denen 33 Kandidaten-Gene über WGCNA gewonnen wurden. Funktionelle Anreicherungs- und Netzwerkanalysen hoben Immunabwehr, Zytotoxizität und Wege wie PPAR, IL-17 und Antigenverarbeitung hervor, wobei ELANE, PPBP und CTSG als hoch verbundene Knoten hervorgingen. Die maschinell-learningbasierte Feature-Priorisierung behielt 8 modellselektierte Kandidatengene bei, nämlich KIF4A, OLR1, KIR2DL4, KRT23, KIR3DS1, AZU1, SCG5 und LRRC37E. Die Immuninfiltrationsanalyse verband diese gemeinsamen Gene mit regulatorischen T-Zellen (Tregs), ruhenden Mastzellen, ruhenden dendritischen Zellen sowie sowohl klassisch aktivierten (M1) als auch alternativ aktivierten (M2) Makrophagen. Die Einzelzell-RNA-Seq-Kontextualisierung deutete zudem darauf hin, dass CD8⁺-T-Zell-Subsets mit unterschiedlichen Kandidatengen-Score-Zuständen unterschiedliche interzelluläre Kommunikationsmuster zeigten. Darunter waren die MIF–(CD74+CD44)-Achse und Signale von naiven/zentralen Speicher-T-Zellen bemerkenswerte Merkmale, die eine weitere Validierung erforderten. Insgesamt identifizierte diese Studie gemeinsame transkriptomische Signale zwischen großer depressiver Störung und Dermatomyositis und hob immunbezogene zelluläre Kontexte hervor, die eine weitere Validierung in echten komorbiden Kohorten rechtfertigen.

Introduction

Dermatomyositis ist eine chronische systemische Autoimmunerkrankung, die durch eine entzündliche Beteiligung der Haut und der Skelettmuskulatur gekennzeichnet ist, klinisch manifestiert durch symmetrische proximale Muskelschwäche und charakteristische kutane Läsionen sowie in schweren Fällen durch Multiorgandysfunktion¹. Zunehmende klinische Evidenz zeigt, dass Patienten mit Dermatomyositis häufig psychiatrische Begleiterkrankungen erleben, insbesondere die Major Depression ^2,3,4. Die Pathogenese der mit Dermatomyositis assoziierten majoren depressiven Störung ist multifaktoriell und entsteht aus einem komplexen Zusammenspiel zwischen psychosozialem Stress, neuroendokriner Dysregulation und systemischer Immunentzündung. Anhaltende Schmerzen, Müdigkeit und fortschreitende Muskelschwäche können die körperliche Funktion und Lebensqualität erheblich beeinträchtigen. Diese Belastungen können zu sozialen Störungen, chronischem psychischem Stress und verminderter Autonomie^führen. Darüber hinaus kann eine langfristige Glukokortikoidexposition die Achse hypothalamus-hypophysisch-nebennieren-(HPA) beeinträchtigen und die hippocampale Plastizität beeinträchtigen, wodurch die Anfälligkeit für depressionsbedingte Manifestationen erhöht^wird. Darüber hinaus werden anhaltende Immunaktivierung und systemische Entzündungen bei Dermatomyositis zunehmend als potenzielle Ursachen für depressionsbedingte Symptome anerkannt⁷. Diese peripheren Mediatoren können das zentrale Nervensystem beeinflussen, indem sie den Neurotransmitter-Stoffwechsel und die Neuroplastizität modulieren und so systemische Autoimmunität mit neuropsychiatrischen Manifestationen verknüpfen 7,8,9,10.

Wichtig ist, dass diese Begründung nicht impliziert, dass eine der beiden Krankheiten biologisch homogen ist. Dermatomyositis umfasst klinisch und serologisch unterschiedliche Untergruppen, darunter anti-MDA5- und anti-TIF1-γ-assoziierte Phänotypen mit unterschiedlichen entzündlichen und klinischen Profilen 11,12,13. Die Major Depression wird ebenfalls zunehmend als heterogene Erkrankung anerkannt, und aktuelle Erkenntnisse stützen das Vorhandensein eines immun-inflammatorischen Subtyps statt einer einzigen universellen Entzündungssignatur ^14,15. Dementsprechend wurde die vorliegende Studie nicht darauf ausgelegt, ein einheitliches gemeinsames molekulares Programm anzunehmen, sondern vielmehr darauf abzielt, auf Kandidaten überlappende, immunassoziierte transkriptomische Signale zu erkennen, die auf Kohortenebene über unabhängige öffentliche Datensätze hinweg nachweisbar sind.

Über psychosozialen Stress und Behandlungsexposition hinaus ist ein biologisch testbarer Zusammenhang zwischen schwerer depressiver Störung und Dermatomyositis eine gemeinsame immun-inflammatorische Dysregulation. Die Major Depressive Störung ist eine heterogene Erkrankung und sollte nicht als ein einheitliches universelles transkriptomisches Profil angenommen werden. Konvergierende Belege stützen jedoch einen entzündungsbedingten Subtyp der Major Depression, und periphere transkriptomische Studien haben eine Dysregulation der angeborenen Immun-, neutrophil-bezogenen, Interferon- und Komplement-Signalwege in Teilgruppen der betroffenen Personen identifiziert 14,16,17. Parallel dazu wurde MAPK-bezogene Stresssignalisierung auch mit depressiven Phänotypen¹⁸ in Verbindung gebracht. Dermatomyotis hingegen ist eine gut bekannte, durch Interferon verursachte Autoimmunerkrankung, und transkriptomische Studien im Blut und betroffenen Geweben haben durchweg die Aktivierung von Typ-I-Interferon und breiteren immun-inflammatorischen Programmen nachgewiesen; jüngste Multi-OMIC-Analysen haben die ERK- und p38-bezogene MAPK-bezogene Signalwegaktivität bei Dermatomyositis 19,20,21 zudem hervorgehoben. Zusammen liefern diese Ergebnisse eine biologisch plausible Begründung, um zu untersuchen, ob eine Teilmenge immunassoziierter transkriptomischer Signale zwischen schwerer depressiver Störung und Dermatomyositis über unabhängige öffentliche Datensätze hinweg überschneiden könnte.

Trotz dieser Beobachtungen ist die molekulare Grundlage für die Überschneidung zwischen major depressiver Störung und Dermatomyositis weiterhin unzureichend verstanden. Wichtig ist, dass die derzeit verfügbaren öffentlichen Datensätze keine echte Kohorte von Patienten liefern, die gleichzeitig mit einer schweren depressiven Störung und Dermatomyotitis diagnostiziert wurden. Daher wurde die vorliegende Studie anstatt die Depression bei Patienten mit Dermatomyotitis direkt zu analysieren, darauf ausgelegt, gemeinsame transkriptomische Signale von Kandidaten über separate öffentliche Datensätze zu majorer depressiver Störung und Dermatomyositis durch einen integrativen bioinformatischen Reanalyserahmen²² zu identifizieren. Konkret wurden öffentlich zugängliche transkriptomische Datensätze mittels differentieller Expressionsanalyse, gewichteter Gen-Koexpressionsnetzwerkanalyse (WGCNA), funktioneller Anreicherungsanalyse, netzwerkbasierter Analyse und maschineller Lern-basierter Merkmalpriorisierung analysiert, um Kreuzkrankheitskandidatengene und -signalwege^{zu identifizieren 23}. Zusätzlich wurde ein dermatomyositisbezogener Einzelzell-Datensatz analysiert, um diese Kandidatengene auf Immunzellebene zu kontextualisieren. Wie in Abbildung 1 dargestellt, wird der gesamte analytische Workflow in einem schrittweisen Flussdiagramm zusammengefasst. Anstatt einen endgültigen Komorbiditätsmechanismus zu etablieren, zielte diese Studie darauf ab, einen hypothesengeleiteten Rahmen zur Identifizierung gemeinsamer molekularer Signale zwischen majorer depressiver Störung und Dermatomyotitis zu entwickeln.

Dementsprechend übernahm diese Studie einen schrittweisen Priorisierungsrahmen. Krankheitsassoziierte Koexpressionsmodule wurden erstmals separat in Datensätzen für eine schwere depressive Störung und Dermatomyositis identifiziert, und ihre Überschneidungen wurden verwendet, um Kandidaten für Kreuzkrankheitssignale zu definieren. Diese Kandidaten wurden dann funktional durch Anreicherung und GeneMANIA-basierte Netzwerkanalyse kontextualisiert, innerhalb eines dermatomyositiszentrierten Klassifikationsrahmens mittels maschineller Lernmethoden priorisiert und schließlich in einem dermatomyositisbezogenen Einzelzelldatensatz untersucht, um zelluläre Kontextualisierung zu ermöglichen.

Abbildung 1: Flussdiagramm des Datenerfassungs- und Analyseprozesses. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Mehrere alternative Ansätze wurden verwendet, um die molekulare Überlappung zwischen Krankheiten zu untersuchen. Der einfache Durchschnitt differenziell exprimierter Gen-(DEG)-Listen ist rechnerisch unkompliziert, fehlt jedoch die modulbezogenen kontextuellen Informationen durch die Koexpressionsanalyse und ist empfindlich gegenüber beliebigen Faltungsänderungen und P-Wert-Schwellenwerten. Traditionelle Meta-Analyse-Pools bewirken Größen über Studien derselben Krankheit hinweg, sind jedoch nicht darauf ausgelegt, gemeinsame Signale über zwei verschiedene Erkrankungen hinweg zu identifizieren. Der derzeitige Workflow integriert mehrere komplementäre analytische Schichten – Überlappung mit Koexpressionsmodulen, funktionale Anreicherung, Netzwerkanalyse, maschinell-learningbasierte Merkmalpriorisierung, Immundekonvolution und Einzelzellkontextualisierung – die jeweils einen eigenen Zweck innerhalb eines sequentiellen Priorisierungsrahmens erfüllen. Dieses mehrschichtige Design hilft, die Anzahl der Kandidatengene schrittweise zu reduzieren und bietet eine kreuzvalidierte biologische Kontextualisierung auf mehreren Ebenen. Das Protokoll ist auf jedes Krankheitspaar anwendbar, für das öffentlich verfügbare Bulk-Transkriptom- und optional Einzelzelldatensätze existieren, insbesondere wenn echte komorbide Kohorten nicht verfügbar sind. Der Workflow ist jedoch beobachtend und beinhaltet keine formalen Kausal-Inferenz-Rahmenbedingungen; Alle Ergebnisse sollten als hypothesenbildend interpretiert werden und eine unabhängige experimentelle Validierung erfordern.

Insgesamt wurde der analytische Workflow als sequentielle Priorisierungsstrategie und nicht als direktes Kausalinferenz-Framework konzipiert. Jeder Schritt erfüllte einen eigenen Zweck: WGCNA-basierte Modulüberschneidungen für die Identifikation gemeinsamer Signale durch Kandidaten, Anreicherung/Netzwerkanalyse für biologische Kontextualisierung, maschinelles Lernen zur Merkmalspriorisierung in dermatomyositisbezogener Klassifikation und Einzelzellanalyse für Zelltyp-Kontextualisierung.

Protocol

Diese Studie nutzte ausschließlich öffentlich zugängliche, deidentifizierte Datensätze aus der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank. Da die Arbeit eine Sekundäranalyse bestehender öffentlicher Daten beinhaltete und keinen direkten Kontakt mit Teilnehmern, keine Intervention oder Zugriff auf identifizierbare personenbezogene Daten beinhaltete, waren keine zusätzliche Zustimmung des Ethikkomitees und eine informierte Zustimmung erforderlich.

Datenquellen und Vorverarbeitung

Die gesamte Genexpression und der Einzelzelldatensatz stammen aus der GEO-Datenbank²⁴. Für eine schwere depressive Störung wurde der Datensatz GSE98793 verwendet, der periphere Blutproben von 128 Patienten und 64 gesunden Kontrollpersonen umfasst. Für Dermatomyotitis wurden die Datensätze auf Grundlage vordefinierter Kriterien ausgewählt, darunter Homo sapiens-Expressionsprofilierung, klar identifizierbare Krankheits- und Kontrollgruppen, verfügbare Plattformannotation für Probe-zu-Gen-Mapping sowie Eignung für Entdeckungs- oder Validierungsanalyse. Wenn eine GEO-Serie mehrere subtypen entzündlicher Myopathie enthielt, wurden für die vorliegende Studie nur Dermatomyositis und normale Kontrollproben extrahiert. GSE1551, GSE46239 und GSE128470 wurden als Entdeckungs-/Trainingsdatensätze verwendet, während GSE5370, GSE39454 und GSE11971 als unabhängige Validierungsdatensätze verwendet wurden. Die in dieser Studie analysierten Datensätze zur Dermatomyositis stammen hauptsächlich aus betroffenen Muskeln oder Hautgeweben und nicht aus peripherem Blut. Einzelzelldaten für Dermatomyositis wurden aus dem Datensatz GSE190510 gewonnen.

Rohe Ausdrucksmatrizen wurden zusammen mit den entsprechenden Plattform-Annotationsdateien aus der GEO-Datenbank heruntergeladen. Probe-IDs wurden gemäß der vom Hersteller bereitgestellten GPL-Annotation offiziellen Gensymbolen zugeordnet. Sonden, die nicht eindeutig auf ein einziges offizielles Gensymbol abgebildet werden konnten, wurden entfernt. Wenn mehrere Sonden auf dasselbe Gen abgebildet wurden, wurden sie auf Genebene unter Verwendung des durchschnittlichen Expressionswerts der 'avereps'-Funktion im Limma-Paket kollabiert, wodurch eine gen-probe-probe-Expressionsmatrix erzeugt wurde.

Um intensitätsabhängige Verzerrung zu reduzieren und die Varianz zu stabilisieren, wurde die log2-Transformation angewendet, wenn es angemessen war, entsprechend der Verteilung der Ausdruckswerte. Die Zwischen-Array-Normalisierung wurde dann mit der Funktion 'normalizeBetweenArrays' im Limma-Paket durchgeführt. Fehlende Werte, sofern vorhanden, wurden mittels K-nächster Nachbar-Imputation imputiert. Für die integrierten Dermatomyotitis-Trainingsdatensätze wurde die Batch-Korrektur mit der 'ComBat'-Funktion im SVA-Paket durchgeführt, wobei Datensatz/Plattformursprung als Batch-Variable und Probengruppe (Dermatomyositis versus gesunde Kontrolle) in die Designmatrix aufgenommen wurden, um die während der Batch-Anpassung interessante biologische Variation zu erhalten.

Alle Analysen wurden in R unter Verwendung einer integrierten Entwicklungsumgebung für R auf einem Desktop-Betriebssystem durchgeführt. Das Limma-Paket wurde für die Zusammenfassung und Normalisierung von Probes verwendet. Das SVA-Paket wurde für ComBat-Batchkorrekturen verwendet. Fehlende Werte wurden mittels K-nächster Nachbar-Imputation mit k = 10 imputiert.

Analyse des gewichteten Gen-Koexpressionsnetzwerks

Die Analyse des gewichteten Gen-Koexpressionsnetzwerks (WGCNA) wurde separat für die Datensätze der Major Depressiven und Dermatomyositis unter Verwendung des WGCNA-R-Pakets^25,26 durchgeführt. Die Proben wurden hierarchisch gruppiert, wobei flashClust verwendet wurde, um Ausreißer zu identifizieren; Proben, die eine Dendrogramm-Höhe von 100 überstiegen, und Gene in den unteren 25 % der Varianz wurden ausgeschlossen. Für jedes Netzwerk wurde mit pickSoftThreshold eine Soft-Threshold-Leistung (β) ausgewählt, um eine ungefähre skalenfreie Topologie (R² > 0,8) zu erreichen. Die Adjazenzmatrix wurde in eine Topological Overlap Matrix (TOM) umgewandelt, und Module wurden durch dynamischen Baumschnitt mit einer Mindestmodulgröße von 60 und einer Merge-Cut-Höhe von 0,25²⁷ identifiziert. Das WGCNA R-Paket wurde zusammen mit flashClust für hierarchisches Clustering verwendet. Der zufällige Seed wurde auf 12345 gesetzt, um reproduzierbar zu sein. Die Moduleigengene wurden mit dem Krankheitszustand mittels Pearson-Korrelation korreliert, wobei die P-Werte nach der Benjamini–Hochberg-Methode angepasst wurden. Für jede Krankheit wurde das Modul mit der stärksten und bedeutendsten Verbindung zum Krankheitsstatus als zentrales krankheitsassoziiertes Modul beibehalten. Die Überschneidung zwischen den Schlüsselmodulgenen aus dem Datensatz für schwere depressive Störungen und denen aus dem Dermatomyotitis-Datensatz wurde als gemeinsamer Gensatz für Kandidaten für nachgelagerte Analysen definiert. Die differentielle Expressionsanalyse der integrierten Dermatomyositis-Kohorte wurde separat durchgeführt, um dermatomyotitis-bezogene transkriptionelle Veränderungen zu charakterisieren.

Funktionale Anreicherungsanalyse

Die Gen-Ontologie-(GO)-Anreicherungsanalyse wurde mit R durchgeführt. Gensymbole wurden mithilfe von org in Entrez-IDs umgewandelt. Hs.eg.db und signifikant angereicherte GO-Begriffe (S. < 0,05) wurden mit EnrichGO in clusterProfiler identifiziert. Für die multidimensionale Visualisierung der Ergebnisse wurden Balkendiagramme und Blasendiagramme mit dem Enrichplot-Paket erstellt, während mit dem Circlize-Paket ein Kreisdiagramm erstellt wurde, um GO-Kategorien, Genzählungen und Anreicherungsfaktoren darzustellen. Legenden wurden mit dem ComplexHeatmap-Paket hinzugefügt. Die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Signalweganreicherungsanalyse differenziell exprimierter Gene wurde ebenfalls in R durchgeführt. Gensymbole wurden basierend auf der Organisation in Entrez-IDs umgewandelt. Hs.eg.db Datenbank und signifikant angereicherte Signalwege (FDR < 0,05) wurden mit der enrichKEGG-Funktion aus dem clusterProfiler-Paket 28,29,30,31 identifiziert. Die Anreicherungsergebnisse wurden mithilfe von Balken- und Blasendiagrammen visualisiert.

GeneMANIA-basierte funktionale Assoziationsnetzwerkanalyse

Basierend auf den zuvor identifizierten gemeinsamen Genen wurde ein auf GeneMANIA basierendes funktionelles Assoziationsnetzwerk aufgebaut, um den Interaktionskontext zwischen diesen Genen und ihren verwandten Partnern zu erforschen. Die Genliste wurde bei GeneMANIA unter Verwendung von Homo sapiens als Referenzart eingereicht. GeneMANIA integriert mehrere Evidenztypen, darunter Koexpression, physikalische Interaktionen, Signalwege, Kolokalisierung, genetische Interaktionen und geteilte Proteindomänen. Das resultierende Netzwerk wurde exportiert und in eine Netzwerkvisualisierungsplattform für Visualisierung und Analyse importiert. Die topologische Analyse des Netzwerks wurde anschließend in einer Netzwerkvisualisierungsplattform durchgeführt, um die hochvernetzten Kandidatenknoten^{32, 33} und ³⁴ zu identifizieren.

Maschinell-Lern-basierte diagnostische Modellkonstruktion

Für die diagnostische Klassifikation wurden mehrere maschinelle Lernalgorithmen verwendet, darunter Random Forest (RF), Support Vector Machine (SVM), Linear Discriminant Analysis (LDA), Naive Bayes, Gradient Boosting Machine (GBM), XGBoost, glmBoost, Elastic Net (Enet), Ridge, Least Absolute Shrinkage and Selection Operator (LASSO), Stepwise Generalized Linear Model (Stepglm) und Partial Least Squares Regression Generalized Linear Model (plsRglm)³⁵. Ein zweistufiges Modellierungsrahmen wurde angewandt, um 113 Kandidatenmodellkombinationen zu erzeugen. In der ersten Phase wurde der Anfangsalgorithmus für das Variablenscreening in der Trainingskohorte verwendet; In der zweiten Phase wurden die erhaltenen Variablen verwendet, um ein diagnostisches Klassifikationsmodell anzupassen. Modelle mit ≤5 ausgewählten Variablen wurden vom weiteren Vergleich ausgeschlossen. Die kombinierten Dermatomyositis-Datensätze dienten als Trainingskohorte, wobei die Bezeichnungen als Dermatomyositis versus gesunde Kontrollgruppen definiert wurden, während die unabhängigen Validierungskohorten für die externe Leistungsbewertung verwendet wurden. Interne Resampling und Tuning waren algorithmusspezifisch: glmnet-basierte Modelle (LASSO, Ridge und Elastic Net) verwendeten eine 10-fache Kreuzvalidierung, um lambda.min auszuwählen; GBM verwendete eine 10-fache interne Kreuzvalidierung, um die optimale Anzahl von Bäumen zu bestimmen; XGBoost verwendete eine fünffache Neubeprobung, um die letzte Boosting-Runde entsprechend dem minimalen Test-Log-Verlust auszuwählen; glmBoost verwendete cvrisk-basierte interne Kreuzvalidierung, um die stoppende Iteration zu bestimmen; und LDA wurde dem Caret-Crossvalidierungsrahmen zugeordnet. Für Algorithmen ohne explizite Abstimmungsschritte in der vorliegenden Implementierung wurden feste oder paketbasierte Einstellungen verwendet. Um Informationsleckage zu verringern, wurden Merkmalsauswahl, Modellanpassung und interne Abstimmung ausschließlich mit der Trainingskohorte durchgeführt, während die Validierungskohorte ausschließlich für unabhängige Vorhersagen und AUC-basierte Leistungsbewertungen verwendet wurden. Das Caret-Paket wurde für das Workflow-Management des maschinellen Lernens verwendet, mit glmnet, randomForest, e1071, gbm, xgboost, mboost, plsRglm und MASS für einzelne Algorithmen. Die SHAP-Analyse wurde mit dem Shapviz-Paket durchgeführt. Der zufällige Seed wurde vor jeder Modellanpassung auf 12345 gesetzt. Modelle mit weniger als 5 ausgewählten Merkmalen wurden ausgeschlossen. Die Interpretierbarkeit des Modells und der Genbeitrag wurden weiter mit SHapley Additive Explanations (SHAP) bewertet, und die informativsten Gene wurden als modellausgewählte Kandidatenmerkmale für die nachgelagerte biologische Interpretation priorisiert.

Bewertung der diagnostischen Leistung

Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC)-Kurven wurden mit dem "pROC"-R-Paket erzeugt, um die diagnostische Leistung von Kandidatenbiomarkern zu bewerten. Expressionsniveaus und die prädiktive Genauigkeit der Kandidatenmarker wurden in unabhängigen Datensätzen (GSE5370, GSE11971 und GSE39454) validiert. Die Modellleistung wurde weiter mittels Verwirrungsmatrizen bewertet. Die differentielle Expression von Schlüsselmodulgenen wurde mithilfe von Vulkan- und Boxdiagrammen visualisiert, und ROC-Kurven wurden erstellt, um den diagnostischen Wert einzelner Gene zu bewerten.

Genmengenanreicherungsanalyse

Um koordinierte funktionelle Veränderungen zu untersuchen, die mit den gemeinsamen transkriptomischen Signalen der Kandidaten verbunden sind, wurde die Gen-Satz-Anreicherungsanalyse (GSEA) mit clusterProfiler^36,37 durchgeführt. Genexpressionsdaten aus Dermatomyositis und Kontrollproben wurden nach differentieller Expression bewertet. Vordefinierte Gensätze, die den KEGG-Signalwegen entsprechen (c2.cp.kegg.Hs.symbols.gmt), wurden verwendet, um zu bewerten, ob Gene innerhalb jedes Weges einen koordinierten Trend der Auf- oder Abregulierung aufwiesen. Die statistische Signifikanz wurde als P < 0,05 definiert.

Analyse der Immunzellinfiltration

Die normalisierte, log2-transformierte und batch-korrigierte Dermatomyositis-Matrix wurde für die Immundekonvolution verwendet. Der CIBERSORT-Algorithmus wurde angewandt, um die relative Häufigkeit von Immunzell-Subtypen mithilfe der LM22-Referenzmatrix³⁸ zu schätzen. Proben mit Dekonvolution P < 0,05 wurden für die nachgelagerte Analyse zurückgehalten. Unterschiede in den abgeleiteten Immunzellanteilen zwischen den Gruppen wurden mit Boxdiagrammen visualisiert, und eine Spearman-Korrelationsanalyse wurde durchgeführt, um Assoziationen zwischen Immunzell-Subsets und Kandidatengenen zu bewerten.

Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse zur zellulären Kontextualisierung

Einzelzellige RNA-seq-Analysen wurden in R mit Seurat durchgeführt. Harmony wurde für die Batch-Korrektur verwendet, DoubletFinder für die Erkennung von Doublets, Celda/DeconX für die Schätzung der Umgebungs-RNA, Monocle für die Analyse von Pseudozeittrajektorien, CellChat für die Analyse der Zell-Zell-Kommunikation, AUCell für die Bewertung von Gen-Set-Aktivitäten und GSVA für die ssGSEA-Bewertung. Rohzählmatrizen wurden in Seurat-Objekte mit den Parametern min.cells = 5 und min.features = 300 importiert. Qualitätskontrollkennzahlen, einschließlich mitochondrialer, ribosomaler und hämoglobinbezogener Genanteile, wurden für jede Zelle berechnet. Zellen wurden nur dann behalten, wenn sie alle folgenden Kriterien erfüllten: nFeature_RNA > 500, nCount_RNA < 5.000, percent_mito < 25, percent_ribo > 3 und percent_hb < 1. Gene, die in weniger als 3 Zellen nachgewiesen wurden, wurden ausgeschlossen. Außerdem wurden MALAT1- und mitochondriale Gene vor der nachgelagerten Analyse entfernt. Nach der ersten Filterung wurden in jeder Probe mit DoubletFinder Doublets identifiziert, wobei PCs = 1:30 und pN = 0,25 sind; Die erwarteten Doublet-Raten wurden anhand der stichprobenspezifischen Zellnummern festgelegt (<4.000 Zellen: 2,5 %; 4.000–8.000 Zellen: 5 %; >8.000 Zellen: 6,5 %). Nur Singlets wurden beibehalten. Die Kontamination der Umgebungs-RNA wurde mit DecontX weiter geschätzt, und Zellen mit Kontaminationswerten < 0,2 wurden erhalten.

Die gefilterten Daten wurden mit der LogNormalize-Methode mit einem Skalierungsfaktor von 10.000 normalisiert, gefolgt von der Identifikation variabler Gene, Datenskalierung und Analyse der Hauptkomponenten. Batch-Effekte über Samples hinweg wurden mit Harmony korrigiert, wobei orig.ident die Batch-Variable war. Die ersten 15 Harmony-Dimensionen wurden für die UMAP-Visualisierung und die Konstruktion von Nachbargraphen verwendet. Das Clustering wurde mit FindNeighbors und FindClusters durchgeführt, und das endgültige Clusterergebnis wurde mit einer Auflösung von 0,05 definiert. Zelltypen wurden manuell annotiert anhand kanonischer Markergene zusammen mit FindAllMarkers-Ergebnissen³⁹.

Für die nachgelagerte funktionale Kontextualisierung wurde die Aktivität des Kandidatengens auf Einzelzellebene bewertet, und die relevante Immunzell-Teilmenge wurde trajektorialen und interzellulären Kommunikationsanalysen unterzogen. Die Pseudozeitanalyse wurde mit Monokel durchgeführt, mit DDRTree-basierter Dimensionsreduktion, gefolgt von Zellordnung. Die Analyse der Zell-Zell-Kommunikation wurde mittels CellChat mit der humanen Liganden-Rezeptor-Datenbank durchgeführt, die auf die Kategorie Secreted Signaling beschränkt war, und Kommunikationen mit weniger als 10 Zellen wurden herausgefiltert.

Für jede Zelle wurde die Aktivität des Kandidatengens mit drei komplementären Ansätzen quantifiziert: AUCell, ssGSEA und AddModuleScore. AUCell-Scores wurden auf Basis von Gen-Ranking-Matrizen berechnet, und ssGSEA-Scores wurden mit dem GSVA-Framework erstellt. AddModuleScore wurde mit der integrierten Funktion von Seurat berechnet. Die resultierenden AUCell-, ssGSEA- und AddModuleScore-Werte wurden dann zu einer einzigen Score-Matrix kombiniert. Jeder Score-Typ wurde zunächst durch Z-Score-Transformation standardisiert und anschließend mittels Min–Max-Normalisierung auf einen 0–1-Bereich reskaliert. Der endgültige zusammengesetzte Wert ("Scoring") für jede Zelle wurde als Summe der drei normalisierten Werte definiert:

Scoring = normalisierte AUCell + normalisierte ssGSEA + normalisierte AddModuleScore.

Für nachgelagerte Untergruppenanalysen wurde die CD8⁺ T-Zell-Teilmenge extrahiert und die Zellen entsprechend dem medianen Scoring-Wert innerhalb dieser Teilmenge dichotomisiert. Zellen mit höheren Werten als dem Median wurden der High_Hub_genes Gruppe zugeordnet, während die übrigen Zellen der Low_Hub_genes Gruppe zugeordnet wurden.

Results

Identifikation von Kandidatengenen zwischen schwerer depressiver Störung und Dermatomyositis

Nach Datenzusammenführung, Normalisierung und Batch-Korrektur von dermatomyositis-bezogenen GEO-Datensätzen (Abbildung 2A, B) wurden insgesamt 570 differenziell exprimierte Gene identifiziert (Abbildung 2C, D), bestehend aus 517 hochregulierten und 53 herunter...

Discussion

Dermatomyositis ist eine chronische systemische Autoimmunerkrankung mit ausgeprägter Haut- und Muskelbeteiligung, und die häuflichen klinischen Beobachtungen deuten darauf hin, dass Patienten mit Dermatomyositis auch eine erhebliche psychiatrische Belastung erleben können, einschließlich Symptome, die mit einer schweren depressiven Störung übereinstimmen. In diesem Zusammenhang wandte die vorliegende Studie einen integrativen bioinformatischen Reanalyserahmen an, um gemeinsame transkript...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AddModuleScore	Seurat-Funktion	Version 4.4.0	Modulpunktzahlberechnung innerhalb von Seurat RRID: NA
AUCell	Bioconductor	Version 1.32.0	Single-Cell-Gene-Set-Aktivitätsbewertung RRID: SCR_021327
caret	CRAN	Version 7.0.1	Maschinelles-Lernen-Workflow-Unterstützung RRID: SCR_022524
celda / decontX	Bioconductor	Version 1.24.0	Schätzung der Umgebungs-RNA-Kontamination RRID: NA
CellChat	GitHub / CellChat	Version 2.2.0	Zell-Zell-Kommunikationsanalyse RRID: SCR_021946
CIBERSORT / LM22-Signaturmatrix	CIBERSORT	LM22	Schätzung der Immunzellinfiltration RRID: NA
clusterProfiler	Bioconductor	Version 4.12.6	Funktionelle Anreicherungsanalyse RRID: SCR_016884
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Version 3.10	eine Netzwerkvisualisierungsplattform für Visualisierung und Analyse RRID: SCR_003032
DoubletFinder	GitHub / McGinnis Lab	Version 2.0.4	Doppelterkennung in Single-Cell-Datensätzen RRID: NA
e1071	CRAN	Version 1.7.16	Support Vector Machine und Naive Bayes Modellierung RRID: NA
gbm	CRAN	Version 2.2.2	Gradient Boosting Machine Modellierung RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) Datenbank	National Center for Biotechnology Information (NCBI)	GSE98793	Major depressive disorder Bulk-Transkriptom-Datensatz RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) Datenbank	NCBI	GSE1551	Dermatomyositis Trainingsdatensatz; Skelettmuskelbiopsieproben RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) Datenbank	NCBI	GSE46239	Dermatomyositis Trainingsdatensatz; Hautbiopsieproben RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) Datenbank	NCBI	GSE128470	Dermatomyositis Trainingsdatensatz; Dermatomyositis-Proben aus der entzündlichen Myopathiekohorte extrahiert RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) Datenbank	NCBI	GSE5370	Unabhängiger Dermatomyositis-Validierungsdatensatz; unbehandelte Muskelproben von Erwachsenen RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) Datenbank	NCBI	GSE11971	Unabhängiger Dermatomyositis-Validierungsdatensatz RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) Datenbank	NCBI	GSE39454	Unabhängiger Dermatomyositis-Validierungsdatensatz; Dermatomyositis-Proben aus der entzündlichen Myopathiekohorte extrahiert RRID: NA
Gene Expression Omnibus (GEO) Datenbank	NCBI	GSE190510	Dermatomyositis-bezogener Single-Cell-RNA-seq-Datensatz RRID: NA
GeneMANIA	University of Toronto / GeneMANIA	Webserver-Version, auf die in dieser Studie zugegriffen wurde	Konstruktion eines funktionalen Assoziationsnetzwerks RRID: RRID:SCR_005709
glmnet	CRAN	Version 4.1.8	LASSO, Ridge und Elastic Net Modellierung RRID: NA
GSVA	Bioconductor	Version 2.0.7	ssGSEA-Bewertung RRID: NA
Harmony	CRAN	Version 1.2.4	Batchkorrektur für die Integration von Single-Cell-Daten RRID: NA
limma	Bioconductor	Version 3.60.6	Differentiale Expressionsanalyse, Probensummierung und Normalisierungs-Utilities RRID: SCR_010943
MASS	CRAN	Version 7.3.61	Lineare Diskriminanzanalyse RRID: NA
mboost	CRAN	Version 2.9.11	glmBoost Modellierung RRID: NA
Monocle	Bioconductor	Version 2.38.0	Pseudozeit-Trajektorienanalyse RRID: SCR_016339
org.Hs.eg.db	Bioconductor	Version 3.19.1	Humane Gen-Annotation-Datenbank RRID: NA
plsRglm	CRAN	Version 1.5.1	Teilweise Kleinste Quadrate generalisierte lineare Modellierung RRID: NA
pROC	CRAN	Version 1.18.5	ROC-Kurvenanalyse RRID: SCR_024286
R statistische Software	R Foundation for Statistical Computing	Version 4.4.2	Hauptumgebung für statistische Berechnungen RRID: SCR_001905
randomForest	CRAN	Version 4.7.1.2	Random Forest Modellierung RRID: SCR_015718
RStudio	Posit Software, PBC	Version 2024.4.1.748	Integrierte Entwicklungsumgebung für R RRID: SCR_000432
Seurat	CRAN / Satija Lab	Version 4.4.0	Vorverarbeitung, Clusterbildung und Visualisierung von Single-Cell-RNA-seq RRID: SCR_016341
shapviz	CRAN	Version 0.10.2	SHAP-basierte Analyse der Modellinterpretierbarkeit RRID: NA
sva	Bioconductor	Version 3.52.0	Batcheffektkorrektur mit ComBat RRID: NA
WGCNA