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Forschungsartikel
* These authors contributed equally
Bei Patienten mit Rückenmarksverletzungen (SCI) ist die Hochregulation von CASC11 mit dem Schweregrad der Verletzung verbunden. In vitro linderte die Downregulation von CASC11 Apoptose und Entzündung, was auf eine Verbindung mit der miR-130b-5p/SPP1-Achse hindeutet. Diese Ergebnisse deuten auf die potenzielle Rolle von CASC11 als Biomarker-Kandidat bei der SCI-Pathogenese hin.
Die Rückenmarksverletzung (SCI) ist ein schweres Trauma des zentralen Nervensystems. Diese Einzelzentren-, Beobachtungs- und In-vitro-Studie untersuchte das diagnostische Potenzial von CASC11 und seinen möglichen regulatorischen Mechanismus bei SCI anhand klinischer Serumproben und lipopolysaccharidstimulierter Zellmodelle. Die Werte von CASC11, miR-130b-5p und SPP1 wurden mittels einer Echtzeit-quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) gemessen. Zelluläre Funktionen und Zielbeziehungen wurden mittels Zellzählungs-Kit-8 (CCK-8), Durchflusszytometrie, Western Blot, enzymgebundenem Immunsorbent-Assay (ELISA), Dual-Luciferase-Reporter und RNA-Immunpräzipitationstests (RIP) bewertet. CASC11 war hochgradig in SCI exprimiert und mit einer Entzündung als potenzieller diagnostischer Biomarker assoziiert. In mit Lipopolysaccharid (LPS) behandelten PC-12-Zellen linderte das Abschalten von CASC11 die unterdrückte Zellaktivität, Apoptose und Entzündung, was durch den miR-130b-5p-Inhibitor rückgängig gemacht wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CASC11 mit der SCI-Schwere assoziiert ist, während in-vitro-Daten auf seine Beteiligung an entzündlichen und apoptotischen Reaktionen über die CASC11/miR-130b-5p/SPP1-Achse hinweisen. Diese Studie ist durch ihr Ein-Zentrum-Design und das Fehlen einer In-vivo-Validierung eingeschränkt.
Rückenmarksverletzung (SCI) bezeichnet eine vorübergehende oder dauerhafte systemische Störung, die durch äußere Einflüsse oder Krankheiten verursacht wird und zu einer Beeinträchtigung der motorischen, sensorischen, reflexartigen und autonomen Nervensystemfunktionenführt. Patienten erleben häufig lebenslange körperliche Funktionsdefizite und Komplikationen, was erhebliches Leid und Belastungen für Einzelpersonen und Familien verursacht. Die Ätiologie von SCI wird grob in traumatische und nicht-traumatische Ursprünge eingeteilt3. Traumatische Verletzungen, die überwiegend durch Wirbelsäulenbrüche durch äußere Einflüsse wie Verkehrsunfälle, Stürze aus der Höhe und sportbedingte Vorfälle verursacht werden, stellen eine wachsende Herausforderung im klinischen Management von SCI4 dar. Unterdessen gelten die nach der primären Verletzung ausgelöste sekundäre Verletzungskaskade, insbesondere die Dysregulation der Entzündungsreaktion und neuronale Apoptose, als entscheidende Faktoren, die zur kontinuierlichen Verschlechterung der neurologischen Funktion beitragen. Jüngste Studien haben die entscheidende Rolle von Neuroinflammation, Regeneration und funktioneller Erholung in der Pathophysiologie und Reparatur von SCI5 hervorgehoben. Als zentrale sekundäre Reaktion spielt die Neuroentzündung eine doppelte Rolle beim Prozess der Gewebeverletzung und -reparatur. Angesichts der begrenzten Regenerationskapazität des verletzten Rückenmarks ist ein synergetischer therapeutischer Ansatz erforderlich, der entzündungshemmende Behandlung, Zelltransplantation, Rehabilitation und molekulare Interventionen kombiniert6. Während eine Reihe diagnostischer und therapeutischer Strategien für SCI etabliert wurden, basiert die aktuelle klinische Praxis überwiegend auf bildgebenden Untersuchungen7. Diese Techniken sind jedoch durch hohe Anforderungen an fortschrittliche Ausrüstung, strenge Patientenanforderungen und erheblichefinanzielle Ausgaben begrenzt. Daher besteht ein dringender und unerfüllter Bedarf an einem bequemen, genauen und nicht-invasiven Laborbiomarker. Die Identifizierung eines solchen Markers würde eine frühzeitige Diagnose von SCI ermöglichen, ohne konventionelle Behandlungsprotokolle zu stören, und so die Entwicklung zeitnaher und wirksamerer therapeutischer Interventionen erleichtern.
Lange nicht-kodierende RNA (lncRNA) stellt eine Hauptkategorie funktionaler RNA-Moleküle dar, die trotz fehlendem proteinkodierendem Potenzial integraler Bestandteile einer Vielzahl biologischer Funktionen sind, darunter die Regulation von Entzündung und Apoptose9. LncRNAs wirken als molekulare Schwämme für MikroRNAs (miRNAs) und verhindern so effektiv, dass diese miRNAs an ihre Ziel-mRNAsbinden und sie zum Schweigen bringen. Zum Beispiel vermittelt lncRNA MAGI2-AS3 miR-223-3p, um die Bruchheilung11 zu beschleunigen. Die Zielsetzung des lncRNA OIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2-Netzwerks bietet einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz zur Verbesserung der Genesung bei SCI12. CASC11, charakterisiert durch ein 872-bp-Transkript auf Chromosom 8q24.21, wird als Molekül mit dysregulierter Expression in verschiedenen menschlichen Krebsarten erkannt13. CASC11 zeigt eine positive Expression bei Patienten mit postmenopausaler Osteoporose und besitzt die Fähigkeit, Betroffene von gesunden Kontrollpersonenzu unterscheiden. Darüber hinaus zeigt CASC11 ein ähnliches Hochregulationsmuster und therapeutisches Potenzial bei Patienten mit Frakturen15. Basierend auf diesen Berichten könnte CASC11 entzündliche Reaktionen und Zellaktivität regulieren. Trotz dieser Erkenntnisse sind das Expressionsmuster und die biologische Rolle von CASC11 bei SCI völlig unbekannt. Da Hyperentzündung und Apoptose Haupttreiber sekundärer SCI sind, vermuteten wir, dass CASC11 ein Kandidat-Biomarker und regulatorischer Faktor bei SCI sein könnte. Diese Studie untersuchte die klinische Assoziation und das Biomarkerpotenzial von CASC11 bei SCI durch Analyse von Patientenkohorten und In-vitro-Zellmodellen (Abbildung 1). Darüber hinaus untersuchten wir einen möglichen molekularen Mechanismus von CASC11, einschließlich seiner möglichen Rolle bei der Modulation der Entzündungsreaktion nach einer SCI.
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Einschreibung der Fächer
Patienten mit akutem Rückenmarkstrauma (n = 300), die von Januar 2023 bis Mai 2025 im Krankenhaus behandelt wurden, wurden ausgewählt und gemäß der American Spinal Injury Group (Grade A, n = 98), der Gruppe für unvollständige Rückenmarksverletzungen (ISCI) (Grade B, C und D; n = 95) und der Gruppe für normale neurologische Funktion (NNF) (Grade E, n = 107) gemäß der American Spinal Injury Association Impairment Scale (AIS-Klassifikation) eingeteilt. Bei Patienten der NNF-Gruppe wurden radiologische Hinweise auf SCI, wie Ödem, Prellungen oder Kompression, durch Magnetresonanztomographie (MRT) bestätigt, aber keine sensorischen oder motorischen Defizite wurden nachgewiesen. Weitere 90 gesunde Teilnehmer, die im gleichen Zeitraum rekrutiert wurden, wurden als Kontrollgruppe ausgewählt. Die Einschlusskriterien waren: (1) Diagnose eines SCI, bestätigt durch bildgebende (MRT oder CT) gemäß den festgelegten klinischen Managementrichtlinien16; (2) Trauma, das innerhalb von 24 Stunden vor der Krankenhausaufnahme erlitten wurde; und (3) erwachsene Teilnehmer mit vollständigen klinischen Daten. Ausschlusskriterien waren: (1) Vorgeschichte vorheriger Operationen im Zusammenhang mit Fraktur oder SCI; (2) schwere koronare Herzkrankheit oder bedeutende kardiopulmonale Erkrankung; (3) akute schwere kraniocerebrale Verletzung; und (4) bösartige Tumore, kardiovaskuläre/zerebrovaskuläre Erkrankungen oder Immunerkrankungen. Die Genehmigung für diese Studie wurde vom Ethikausschuss des Vierten Volkskrankenhauses von Shenzhen eingeholt, und die Probanden erhielten eine informierte Einwilligung. Die in dieser Studie verwendeten Verfahren entsprachen den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki.
Sammlung von Exemplaren
Venöse Blutproben (5 ml) wurden bei der Aufnahme bei der Aufnahme mit Serumseparatorröhrchen innerhalb von 24 Stunden nach der Verletzung entnommen. Das Blut wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten gerinnen und anschließend bei 3.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das Supernatant-Serum wurde sorgfältig getrennt, in RNase-freie Mikroröhren aliquotiert und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C gelagert.
Zellkultur und LPS-Induktion
Ratten-Phänochromozytomzellen (PC-12) und Maus-Mikroglialzellen (BV-2) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium kultiviert, das mit 10 % fetalem Rinderserum bei 37 °C ergänzt wurde. Um in vitro-Modelle für entzündliche Verletzungen zu etablieren, wurden PC-12- und BV-2-Zellen Lipopolysaccharid (LPS) in Konzentrationen von 0, 1, 5 und 10 μg/mL für 12 Stunden17 ausgesetzt. Jede Konzentration wurde in drei unabhängigen biologischen Replikaten getestet.
RT-qPCR
Die Gesamt-RNA wurde aus den Proben mittels eines Phenol-Chloroform-Extraktionsprotokolls isoliert, gefolgt von der Ausfällung mit Isopropanol. Die RNA-Reinheit wurde mittels Spektrophotometrie bewertet, und Proben mit einem A-Verhältnisvon 260/280 nm im Bereich von 1,8–2,1 wurden für nachgelagerte Analysen verwendet. RNA wurde gemäß dem Reverse-Transkriptionskit-Protokoll in cDNA transkribiert, und die resultierende cDNA wurde als Vorlage für RT-qPCR-Reaktionen mit einem SYBR-Green-Premix auf einem PCR-Instrument verwendet. Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) wurde als Referenzgen für CASC11 - und SPP1-mRNA verwendet, und kleine Kern-RNA (U6) wurde als Referenzgen für miR-130b-5p verwendet. Für Serumproben wurde synthetisches Cel-miR-39 vor der RNA-Extraktion in das Serum eingemischt, um Variationen in der RNA-Rückgewinnung zu kontrollieren. Die Zündbänder waren wie folgt: CASC11 vorwärts 5'-ACCCTATGGAGAACCGAGAAC-3' und Rückwärts 5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAAAT-3'; miR-130b-5p vorwärts 5'-ATCCATGGTTGAGCTTCCCG-3' und rückwärts 5'-TAGTGCAACCTCGTCAGAGC-3'; und SPP1 mRNA vorwärts 5'-GTTAAACAGGCTGATTCTGG-3' und umgekehrt 5'-CATGGTCATCATCATCTTCA-3'. Die Expression wurde mit der 2-ΔΔCt-Methode berechnet. Jede RT-qPCR-Reaktion wurde in dreifachen technischen Replikaten mit drei biologischen Replikaten durchgeführt.
Transfektion
Silencing CASC11 (si-CASC11), miR-130b-5p-Mimiker/Inhibitor, SPP1-Überexpressionsplasmid (ov-SPP1) und ihre jeweiligen negativen Kontrollen (NC) wurden synthetisiert und mit einem Transfektionsreagenz in PC-12- und BV-2-Zellen transfektiert. Die Transfektionseffizienz wurde 48 Stunden nach der Transfektion in dreifachen biologischen Replikaten bewertet.
Proliferations- und Apoptose-Test
Für den Zellviabilitätstest wurden die Zellen in 96-Well-Platten mit 5 × 103 Zellen pro Bohrloch ausgesät und 24 Stunden lang kultiviert, um die Anhaftung zu ermöglichen. Nach dieser Inkubation wurden 10 μL CCK-8-Reagenz in jedes Bohrloch gegeben, gefolgt von einer 2-stündigen Inkubation bei 37 °C. Die optische Dichte wurde dann bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser aufgezeichnet. Zur Apoptose-Detektion wurden die Zellen mit Trypsin abgetrennt, zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) abgespült und in den Bindungspuffer suspendiert, bis eine Endkonzentration von 1 × 106 Zellen pro Well. Anschließend wurden 100 μL der Suspension in ein 5-mL-Durchflusszytometrierohr gegeben, gefolgt von der Zugabe von 5 μL Annexin V-FITC und 5 μL Propidiodid (PI) Färbelösung. Die Proben wurden vorsichtig gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt aufbewahrt. Anschließend wurde ein Bindungspuffer zu einem letzten zusätzlichen Volumen von 400 μL pro Röhre hinzugefügt, und apoptotische Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Alle Bedingungen wurden mit drei technischen Replikaten in drei unabhängigen biologischen Experimenten analysiert.
Dual-Luciferase-Aktivitätstest
Die nachgelagerten Ziele von CASC11 und miR-130b-5p wurden über bioinformatische Websites (lncRNASNP2 und TargetScan) vorhergesagt. Fragmente, die die Wildtyp- (wt) oder mutanten-(muten) komplementären Sequenzen enthalten, wurden synthetisiert und zu einem dual-luciferase-Reportervektor geklont, um wt- und mut-Reporter-Plasmide zu konstruieren. PC-12-Zellen wurden mit miR-130b-5p-Mimiker/Inhibitor und den konstruierten Wt/Mut-Plasmiden unter Verwendung eines lipidbasierten Transfektionsreagens gesät und ko-transfektiert. Nach 48 Stunden wurde die Luciferase-Aktivität quantifiziert, um die Wechselwirkung zu bewerten. Jede Gruppe bestand aus drei technischen Replikaten und drei biologischen Replikaten.
RNA-Immunpräzipitationstest (RIP)
RIP wurde mit einem RNA-bindenden Protein-Immunpräzipitationskit durchgeführt. Die Zellen wurden mit einem Lysepuffer lysiert und mit dem Anti-Ago2-Antikörper oder einem normalen IgG-Antikörper inkubiert. RNA-Protein-Komplexe wurden mit magnetischen Perlen angereichert. Nach dem Waschen wurden gebundene Proteine entfernt und immunpräzipitierte RNA isoliert. Die Anreicherungsniveaus von CASC11 und miR-130b-5p wurden durch RT-qPCR quantifiziert. Jede Gruppe bestand aus drei technischen Replikaten und drei biologischen Replikaten.
Westlicher Blot
Proteinlysate wurden aus PC-12- und BV-2-Zellen mittels Zelllysepuffer hergestellt, und der gesamte Proteingehalt wurde mit einem BCA-Test gemessen. Für jede Probe wurden 30 μg Protein auf 12%ige SDS-PAGE-Gele geladen und nach der elektrophoretischen Trennung auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden 2 Stunden lang bei Zimmertemperatur in 5 % Magermilch blockiert, die in TBST verdünnt wurde, und dann über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen Bcl-2, Bax, gespaltene Caspase-3 und GAPDH bei einer Verdünnung von 1:1.000 inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Membranen mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Proteinsignale wurden mit Bildanalysesoftware analysiert, und Banddichten wurden verwendet, um die Expression apoptosebezogener Proteine zu bewerten. Die Western-Blot-Experimente umfassten drei biologische Replikate, mit jeweils drei technischen Replikaten pro Gruppe.
ELISA
Die Konzentrationen der entzündlichen Zytokine TNF-α, IL-1β und IL-6 im Patientenserum sowie in PC-12- und BV-2-Zellsupernatanten wurden mit ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Die Proben wurden in vorbeschichteten Brunnen inkubiert, und Nachweisantikörper wurden für die weitere Inkubation hinzugefügt. Enzymkonjugate wurden hinzugefügt und inkubiert. Nach dem Waschen wurden Substrate zur Farbentwicklung hinzugefügt und die Reaktionen beendet. Die Absorption wurde bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser gemessen und basierend auf der bereitgestellten Standardkurve in Konzentrationen von Entzündungsfaktoren umgerechnet. Jeder ELISA-Test wurde in dreifachen technischen Replikaten über drei unabhängige biologische Replikate durchgeführt.
Statistische Analyse
Kontinuierliche Variablen wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben, und kategoriale Variablen als Zahlen und Prozentsätze (n, %). Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit dem Schüler-t-Test durchgeführt. Für Vergleiche mit mehr als zwei Gruppen wurde eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) angewandt, gefolgt vom Tukey-Post-hoc-Test. Die Fähigkeit von CASC11, zwischen klinischen Gruppen zu unterscheiden, wurde mittels einer Analyse der Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC) bewertet. Die Assoziationen zwischen zwei Variablen wurden mit der Pearson-Korrelationsanalyse untersucht. Bei zellbasierten Experimenten enthielt jede Gruppe drei unabhängige biologische Replikate, und jede Messung wurde in drei technischen Replikaten wiederholt. Die statistische Signifikanz wurde als P < 0,05 definiert.
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Grundlegende Daten der Probanden
Die Ausgangsmerkmale der Patienten in den Gruppen Kontroll, NNF, ISCI und CSCI sind in Tabelle 1 dargestellt. Die statistische Analyse zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen in Variablen wie Geschlecht, Alter, Body-Mass-Index (BMI), Verletzungsätiologie und Verletzungszeit (P > 0,05). Signifikante Unterschiede zwischen den vier Gruppen wurden hinsichtlich Aufentha...
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SCI ist eine verheerende Erkrankung des zentralen Nervensystems, die häufig zu erheblichen Defiziten bei Empfindung, motorischer Kontrolle und autonomer Funktion führt und somit die Lebensqualität und langfristigen Prognose eines Patienten erheblich verringert18. Patienten können nach Wirbelsäulentrauma mit funktionellen Beeinträchtigungen und sensorischem Verlust auftreten, und bildgebende Untersuchungen (wie MRT) können eingesetzt werden, um das Auftreten von SC...
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.
Nicht anwendbar.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BCA protein assay kit | Yeasen, China | P0010 | |
| CCK-8 Lösung | Sigma-Aldrich, USA | 96992 | |
| Dual-Luciferase Reporter Vektor | Promega, USA | E133A | pmirGLO Vektor |
| Dulbecco’s Modifiziertes Eagle-Medium | ATCC, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
| ELISA-Kit für IL-1β | R&D Systems, USA | DY401 | |
| ELISA-Kit für IL-6 | R&D Systems, USA | HS600B | |
| ELISA-Kit für TNF-α | R&D Systems, USA | DTA00C | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand Island, NY, USA | 10099141 | |
| Fluozytometer | BD FACSCalibur, USA | FACS101 | |
| Bildanalysesoftware | NIH, Bethesda, MD, USA | version 1.44p | ImageJ Software |
| Isopropanol | Beijing Chemical Factory, China | 32064 | |
| Lipidbasiertes Transfektionsreagenz | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3000008 | Lipofectamin 3000 |
| Lipopolysaccharid | Sigma-Aldrich, USA | L2880 | |
| Lysepuffer | Beyotime, China | P0013D | RIPA-Lysepuffer |
| Mikroplatten-Reader | Reagen, China | RNE90002 | |
| PC-12 und BV-2 Zellen | ATCC, Manassas, USA | ||
| Phenol-Chloroform-Reagenz | Thermo, USA | 15596026 | Trizol-Reagenz |
| Reverse-Transkriptase-Kit | Takara, Japan | RR047A | PrimeScript RT-Kit |
| RNA-Bindungsprotein-Immunpräzipitations-Kit | Millipore, USA | 17-700 | Magna RIP-Kit |
| RNase-freie Mikroröhrchen | Axygen, Corning, NY, USA | MCT-150-C-S | |
| Serumseparatorröhrchen | Terumo, Tokyo, Japan | VP-AS109K60 | |
| Statistische Analysesoftware | San Diego, USA | version 9.0 | GraphPad Prism |
| SYBR Green-Vormischung | Takara, Japan | RR420A | SYBR Premix Ex Taq |