Methodenartikel

Eine mikrofluidische Plattform zur Untersuchung der mikrobiellen Niederschlagung von Metalloxiden in porösen Medien

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DOI:

10.3791/71047

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12. Juni 2026

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1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein mikrofluidisches System zur Untersuchung der mikrobiellen Niederschlagung von Manganoxidmineralien vor. Die Biomineralbildung wird in situ mittels optischer Mikroskopie und Bildanalyse gemessen. Dieser Ansatz kann angepasst werden, um die Niederschlagung anderer deutlich gefärbter biogener Minerale in porösen Umgebungen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Mikroorganismen fällen häufig Metalloxid-Nanopartikel in Böden, Sedimenten und anderen umweltrelevanten porösen Medien aus. Die Bildung und Reaktivität von Mangan- (Mn) und Eisenoxiden (Fe) bleiben jedoch in physikalisch komplexen Umgebungen schlecht charakterisiert. Obwohl Laborsysteme poröse Medien als Substrat integrieren können, erfordern sie destruktive Probenahmen und sind nicht leicht für Porenanalysen geeignet. Die dynamische, aber unzugängliche Natur poröser Medien erfordert daher die Fähigkeit, mikrobiell vermittelte mineralische Niederschlagung in situ und in Echtzeit zu lösen. Um diese Lücke zu schließen, wird eine mikrofluidische Plattform entwickelt, um die mikrobielle Niederschlagung von Metalloxiden in einem Modellporenraum zu bewerten. Diese Plattform ist mit dem Mn-oxidierenden Bakterium Pseudomonas putida GB-1 validiert. Die Entwicklung von Biofilmen und die dazugehörige Mn-Oxid-Niederschlagung werden unter kontinuierlichem Fluss mit Zeitraffer-Farbhellfeldmikroskopie visualisiert. Ein Bildsubtraktionsalgorithmus wird dann mit Endpunktmassemessungen kombiniert, um die Rate der Mn-Oxid-Niederschlagsrate zu schätzen. Dieser Ansatz bietet ein Werkzeug, um systematisch zu testen, wie die mikrobielle Fällung von Metalloxiden als Reaktion auf sich verändernde physikalische und chemische Bedingungen variiert.

Einleitung

Metalloxidminerale spielen eine entscheidende Rolle im biogeochemischen Kreislauf1. Mangan-(Mn)- und Eisen-(Fe)-Oxide sind bei circumneutralem pH-Wert negativ geladen und absorbieren leicht kationische Metalle 2,3,4,5,6,7,8, was die Verfügbarkeit von Mikronährstoffen und die Beweglichkeit der Schadstoffe in der Rhizosphäre und der hyporheischen Zone reguliert. Diese Mineralien beeinflussen die Stabilität und den Abbau organischer Substanz 9,10,11,12 und bestimmen die Kohlenstoffaufnahme durch Pflanzen und Bodenmikroben. In technischen Systemen (z. B. Wasseraufbereitungsfilter, angelegte Feuchtgebiete) wird Metalloxid-Niederschlag direkt zur Entfernung von Mn oder Fe und zur Sanierung von mitvorkommenden Schadstoffengenutzt. Diese Metalloxide sind an ihren charakteristischen Farben erkennbar, die von ocker über dunkelbraun bis schwarz18,19 reichen.

Die Ausfällung von Metalloxiden wird häufig durch Mikroorganismen in einem Prozess namens Biomineralisation 20,21,22 ermöglicht. Zahlreiche Mn-oxidierende Bakterien und Pilze synthetisieren Multikupfer-Oxidasen und Peroxidasen, die den Elektronentransfer von Mn(II) zu Mn(III) und Mn(IV) unter aeroben Bedingungen katalysieren, was zur Niederschlagung von birnessitähnlichen Mn(III, IV)-Oxidmineralien 2,23,24 führt. Zusätzlich oxidieren verschiedene Fe-oxidierende Bakterien enzymatisch Fe(II) bis Fe(III) in circumneutralen oder sauren, sauerstoffbegrenzten Umgebungen und produzieren Fe(II, III) (Oxyhydr)oxide, darunter Ferrihydrit und Magnetit 25,26,27,28. Diese biogenen Minerale fällen neben Zelloberflächen aus und reichen sich auf extrazellulären Polymeren, Hüllen und anderen zellulären Strukturen an, wodurch Mikrobe-Mineral-Assemblagen 2,23,25,27,29,30 entstehen.

Trotz der allgegenwärtigen Verbreitung von Mn- und Fe-Biomineralisation in komplexen Umgebungen fehlen Porenebenen-Einblicke. Porenräume sind strukturell heterogen, weisen bevorzugten Flüssigkeitsfluss und nicht-gleichmäßigen Reaktantentransport auf, die die Verteilung biogeochemischer Reaktionen bestimmen31,32,33,34,35. Darüber hinaus kann mikrobielle Aktivität lokale geochemische Gradienten erzeugen, die die Biomineralisierung fördern oder begrenzen, während Schwankungen in der Porenflüssigkeitschemie (z. B. pH-Wert, gelöster Sauerstoff, Redoxpotenzial) die Mineralausfällung verbessern oder die Auflösungerleichtern können 34,35. Studien zur Biomineralisierung von Mn und Fe basieren typischerweise entweder auf gut gemischten Chargenbedingungen30, 36, 37, 38, 39, 40 oder Kolonnen41, 42, 43, 44, um die Oxidationskinetik zu quantifizieren oder Biomineralpräzipitate zu charakterisieren. Batch-Experimente fehlen jedoch die räumliche Heterogenität, die porösen Systemen innewohnt. Spalten, die gepackte granulare Medien enthalten, bieten eine relevante physikalische Architektur, sind jedoch in ihrem Nutzen begrenzt, da sie destruktive Abtastung zu statischen Zeitpunkten erfordern, was den Experimentfortschritt stoppt und ungestörte Porenskalenbeobachtungen verhindert. Daher sind neue experimentelle Ansätze erforderlich, um die mikrobielle Niederschlagung von Metalloxiden in porösen Medien zu untersuchen.

Mikrofluidische Systeme sind ein Werkzeug zur Untersuchung biogeochemischer Reaktionen in situ und in Echtzeit. Mikrofluidische Reaktoren können schnell und kostengünstig gefertigt werden, mit reproduzierbaren und anpassbaren Geometrien, die natürliche oder idealisierte poröse Mediensimulieren. Die resultierenden Geräte sind optisch transparent und ermöglichen eine zerstörungsfreie Visualisierung und Quantifizierung von Porenprozessen, einschließlich Biofilmbildung 46,47,48,49, Hotspot-Entwicklung50,51, abiotischer Metallausfällung52,53 und Kalkit-Biomineralisation 34,54,55,56 . Darüber hinaus ermöglichen mikrofluidische Systeme den Nutzern, Randbedingungen zu steuern und systematisch zu variieren, einschließlich Metallkonzentration, Vorhandensein oder Fehlen gelösten Sauerstoffs sowie Flüssigkeitsflussrate. Schließlich können je nach Reaktorsubstrat direkte Messungen der Mikrobe-Mineral-Fluid-Interaktionen mittels Röntgen-, Raman- oder Infrarotspektroskopie57 durchgeführt werden. Die Entwicklung einer solchen mikrofluidikbasierten Plattform zur Untersuchung der mikrobiellen Niederschlagung von Metalloxiden eröffnet somit eine neue Forschungsmöglichkeit zur Bildung und Reaktivität von Mn- oder Fe-Mineralphasen, die den Kreislauf von Kohlenstoff, Nährstoffen und Schadstoffen in porösen Umgebungen vorantreiben.

Diese Arbeit nutzt die Biomineralisierung von Mn als Fallstudie, um die mikrobielle Niederschlagung von Metalloxiden in einer dynamischen porösen Umgebung zu quantifizieren. Das folgende Protokoll zeigt, wie man einen mikrofluidischen Reaktor mit Pseudomonas putida GB-1 fertigen und inokulieren kann, einem Modellbakterium, das dafür bekannt ist, Mn(II) zu Mn(III, IV) in seiner stationären Wachstumsphase 58,59 zu oxidieren. Mit einem druckbasierten Durchflusskontrollsystem werden nacheinander nährstoffreiches Wachstumsmedium und eine Minimalsalzlösung injiziert, um die Biofilmbildung zu fördern und die Ausfällung von Mn-Oxid zu induzieren. Hochauflösende Farbbrightfield-Bilder des mikrofluidischen Porenraums werden in regelmäßigen Zeitintervallen aufgenommen, um den Farbkontrast zwischen P. putida GB-1-Biofilmen und ansammelnden Mn-Oxiden zu erfassen. Am Ende jedes Experiments werden alle im Reaktor enthaltenen Mn-Oxide verdaut, und die Gesamtmasse wird mit induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) gemessen. Die Niederschlagsrate von Mn-Oxid wird als Funktion der Zeit geschätzt, indem diese Endmassemessungen mit einem Bildsubtraktionsalgorithmus integriert werden. Dieser Arbeitsablauf kann leicht angepasst werden, um andere Organismen oder Metalloxid-Ausfällungsprozesse unter verschiedenen Umweltbedingungen zu untersuchen.

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll macht mehrere Annahmen über das Hintergrundwissen der Nutzer und die verfügbare Instrumentierung. Erstens sollten Nutzer entweder Zugang zu einem Reinraum haben und mit den Verfahren der Fotolithographie zur Herstellung einer mikrofluidischen Form vertraut sein oder eine gewerbliche Form erwerben. Als Nächstes sollten die Nutzer mit grundlegenden mikrobiologischen Methoden vertraut sein, wie der Einsatz aseptischer Techniken, der Herstellung von Lagerlösungen und dem Streifen von Platten. Nutzer benötigen außerdem Zugang zu einem Autoklaven, einer Mikrozentrifuge, einem Shaker-Inkubator und einem Massenspektrometer. Schließlich sollten die Nutzer in optischer Mikroskopie und Bildanalyse versiert sein.

1. Herstellung und Montage von mikrofluidischen Reaktoren

HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten mikrofluidischen Reaktoren sind in AutoCAD mit einer Sandkorngeometrie entworfen, die von Wang et al.55 übernommen wurde. Jede Form erzeugt sechs Replikationskanäle mit einem Porenraum von 15 mm × 10 mm, einer Porosität von 0,41 und einem Porenvolumen von 2,3 μL. Mit Ausnahme der Plasmabehandlung werden Reaktoren in einem laminaren Strömungsschrank gefertigt, um eine staubarme Umgebung zu gewährleisten.

  1. Gießen Sie die mikrofluidischen Kanäle in Polydimethylsiloxan (PDMS) mittels Weichlithographie.
    1. In einem Plastikbecher wiegt man Elastomerbasis und Härtemittel im Verhältnis 10:1 (hier 25 g bzw. 2,5 g).
    2. Mit einem Kunststoffmesser vermischen Sie die Elastomerbasis und das Aushärtungsmittel 10 Minuten lang gründlich.
    3. Entgasen Sie das PDMS im Becher mit einem Vakuum-Desikator für eine Stunde, um Luftblasen zu entfernen.
    4. Gieße das PDMS in die Form und entfette es 30 Minuten lang, um eventuelle Restluft zu entfernen.
    5. Stellen Sie die Form auf eine Heizplatte und härten Sie sie 3 Stunden bei 95 °C aus.
    6. Sobald es ausgehärtet und abgekühlt ist, benutze ein Skalpell, um das PDMS herauszuschneiden und es aus dem Schimmel zu ziehen.
    7. Auf einer Schneidematte schneiden Sie die sechs mikrofluidischen Kanäle mit einer Rasierklinge auseinander und lassen 2–3 mm um den Rand jedes Kanals zurück. Stanzen Sie Ein- und Auslasslöcher in jedem Kanal mit einer Biopsiestanz.
    8. Decken Sie beide Seiten jedes mikrofluidischen Kanals mit einem Streifen klarem Klebeband ab, um Staubansammlung zu verhindern, und lagern Sie sie in einer 100-mm-Petrischale.
  2. Einen Tag vor dem Experiment wird der endgültige mikrofluidische Reaktor mit Luftplasma zusammengebaut.
    1. Entferne das klare Klebeband aus einem mikrofluidischen Kanal, spüle dann das PDMS und einen Glasdeckel mit 70 % Ethanol ab und trockne mit komprimiertem Stickstoff.
      VORSICHT: Ethanol ist entflammbar. Führen und lagern Sie sie gemäß dem Sicherheitsdatenblatt.
    2. Legen Sie den Mikrofluidikkanal und den Deckel mit der Deckel nach oben in einen Plasmareiniger. Evakuieren Sie die Kammer für 1 Minute, dann Plasma für 1 Minute (18 W und ~0,5 Torr).
    3. Entfernen Sie den Mikrofluidkanal und den Deckelträger vom Plasmareiniger und legen Sie den Deckel auf das PDMS, wobei Sie sanft klopfen, um die Bindung sicherzustellen. Lagern Sie den zusammengebauten Reaktor über Nacht in einer 100-mm-Petrischale.

2. Mikrofluidisches Durchflusskontrollsystem

HINWEIS: Ein modulares System von Elveflow wird verwendet, um sequentielle Flüssigkeitsinjektion mit minimalen Druck- und Durchflussstörungen zu ermöglichen. Zu den Systemkomponenten gehören ein Luftkompressor, ein Durchflussregler, ein Verteilventil, ein Durchflusssensor, ein Flüssigkeitsreservoir-Rack (für 15-mL konische Röhren) und die Elveflow Smart Interface (ESI)-Software (Abbildung 1). Andere Durchflusskontrollsysteme, wie Spritzenpumpen, können entweder im Infusions- oder Entzugsmodus verwendet werden, mit speziellen Spritzen oder Reservoirs für jede Einflusslösung und einem Splitterventil mit niedrigem Totvolumen, um sequentielle Flüssigkeitsinjektionen durch eine einzelne Rohrleitung zu ermöglichen. Mit Spritzenpumpen sollte jedoch Vorsicht geboten werden, um Druckschwankungen zu minimieren, die Biofilme lösen können.

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Abbildung 1: Durchflusskontrollsystem und Geometrie des mikrofluidischen Reaktors. Das experimentelle System besteht aus einem Durchflussregler, (1), der über pneumatische Rohre verbunden ist, (2) mit einem Flüssigkeitsreservoir-Rack, (3), einem Verteilventil zur sequentiellen Einspritzung von Wachstumsmedium (GMMn) und Salzlösung (SSMn), (4), einem Durchflusssensor (5), der mit dem Durchflussregler verbunden ist, um Echtzeit-Rückkopplung und Durchflussanpassung zu ermöglichen, (6), PEEK-Rohren mit geringem Innendurchmesser zur Erzeugung von fluidischem Widerstand, (7), einer Blasenfalle (8) stromaufwärts des Mikrofluidreaktors (9). Systemschaltplan nicht skalierbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

  1. Richte alle Hardware gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und kalibriere sie.
    HINWEIS: Das Flüssigkeitsreservoir-Rack, das Verteilventil und der Durchflusssensor sind in einem maßgefertigten Mikroskopinkubator installiert, um das Experiment bei 30 °C zu halten.
  2. Stellen Sie den Druckregler des Luftkompressors auf 3 bar ein und verbinden Sie den Auslass des Luftkompressors mit dem Einlass des Durchflussreglers mit einem pneumatischen Polyurethanrohr.
  3. Befestigen Sie einen hydrophoben Filter am Auslass des Durchflussreglers, um den Rückfluss von Flüssigkeiten zu verhindern, und schließen Sie den Durchflussregler dann mit zwei Einlassöffnungen des Flüssigkeitsreservoirs mit pneumatischem Polyether-Polyurethan-Rohr mit einem Ansaugkrümmer und Widerhakenadaptern an.
  4. Schließen Sie das Flüssigkeitsreservoir-Rack, das Verteilventil und den Durchflusssensor wie folgt mit Rohren an, wobei flanschlose Anschlüsse für 1/16-Zoll-Außendurchmesser-Rohre verwendet werden, sofern nicht anders angegeben.
    1. Verbinden Sie zwei Auslasskanäle des Flüssigkeitsreservoirs mit den ersten beiden Einlassöffnungen des Verteilerventils mit 80 cm Polytetrafluorethylen-(PTFE)-Rohr mit einem 1/32-Zoll-Innendurchmesser (ID).
    2. Verbinden Sie den Auslassanschluss des Verteilerventils mit dem Einlassanschluss des Durchflusssensors mit 15 cm PTFE-Rohr mit 500-μm-Durchmesser und einem Adapteranschluss.
    3. Befestigen Sie 60 cm 63,5 μm Ein-ID Polyetherether-Keton (PEEK)-Rohr mit einer Adapterverbindung an den Ausgangsanschluss des Durchflusssensors.
      HINWEIS: Für Experimente mit unterschiedlichen Durchflussraten wird die PEEK-Rohrlänge entsprechend angepasst, um ausreichenden fluidischen Widerstand für die Flussstabilität zu gewährleisten.
    4. Verbinden Sie den PEEK-Schlauch mit 10 cm 500-μm-ID-PTFE-Schlauch über eine Bindenverbindung.
    5. Befestigen Sie den PTFE-Schlauch am Einlassanschluss eines mikrofluidischen Blasenfalls, der mit einem PTFE-Membranfilter (Porengröße ~10 μm) ausgestattet ist.
    6. Befestigen Sie 75 cm PTFE-Rohr mit 200-μm-Einsetz am Ausgang des Blasenfalls, um Gegendruck für eine effektive Blasenentfernung zu erzeugen. Dieses Rohr wird am Einlassloch des mikrofluidischen Reaktors befestigt.
  5. Vor jedem Experiment sterilisieren Sie das Durchflusskontrollsystem mit allen Schläuchen und Hardware verbunden, indem eine 1%ige Bleichlösung für das Dreifache des Systemvolumens (~4 Stunden pro Rohrleitung bei 7,0 μL·min-1) gespült wird, gefolgt von sterilem ultrareinem Wasser für die gleiche Dauer.
  6. Reinigen Sie das Durchflusskontrollsystem zwischen den Experimenten wie folgt.
    1. Spülen Sie das Verteilventil und den Durchflusssensor durch Spülen von 100 % Isopropanol und sterilem ultrareinem Wasser, um Rückstände oder Niederschläge zu verhindern.
      VORSICHT: Isopropanol ist brennbar. Führen und lagern Sie sie gemäß dem Sicherheitsdatenblatt.
    2. Autoklav der Blasenfalle.
    3. Ersetzen Sie nach jedem Experiment den Blasenfall-Membranfilter und die 200-μm-ID-PTFE-Schläuche, um Verstopfungen (Membranfilter) oder bakterielle Besiedlung (Tubing) zu verhindern.

3. Experimentelle Medien und Lösungen

  1. Bereiten Sie flüssiges Luria-Brühe (LB, Miller's Formulierung) Medium vor, indem Sie 2,5 % LB-Pulver in ultrareinem Wasser bei 121 °C für 20 Minuten autoklavieren. Für LB-Agarplatten 2,5 % LB-Pulver und 1,5 % Agar in ultrareinem Wasser bei 121 °C für 20 Minuten, dann in 100-mm-Petrischalen (~20 ml pro Schale) gießen und abkühlen lassen, bis sie fest sind.
  2. Aus filtersterilisierten Lagerlösungen, die mit der American Chemical Society (ACS) hergestellt wurden, oder bakteriologischen Reagenzien in ultrareinem Wasser werden 30 ml von jedem der folgenden hergestellt. Salzlösung und Zusammensetzung des Wachstumsmediums stammen aus Gehin et al.59.
    1. Salzlösung ohne Mn(II) (SS0) vorbereiten: 0,4 mM CaCl2,2H 2O, 0,25 mM MgSO4,7H 2O, 0,25 mM Na2HPO4,2H 2O, 0,15 mM KH2PO4, 1:2 Fe(III)-EDTA (20 μM FeCl3,6H 2O und 40 μM EDTA angepasst auf pH 6,5 mit 1M NaOH), 10 mM HEPES-Puffer (angepasst auf pH 7,0 mit 1M NaOH), 5 mM (NH4)2SO4 und Spurenmetalle (40 nM CuSO4·5H2O, 273 nM ZnSO4,7H 2O, 84 nM CoCl2,6H 2O, 53,7 nM Na2MoO4,2H 2O) in sterilem ultrareinem Wasser.
    2. Salzlösung mit Mn(II) (SSMn) vorbereiten: Genauso wie SS0 mit 50 μM MnCl2·4H2O.
    3. Wachstumsmedium ohne Mn(II) vorbereiten (GM0): Dasselbe wie SS0 mit 1,5 g· L-1 Hefeextrakt und 1,5 g· L-1-Casaminosäure hinzugefügt.
    4. Bereite Wachstumsmedium mit Mn(II) vor (GMMn): Dasselbe wie GM0 mit 50 μM MnCl2·4H2O.
      VORSICHT: Salzlösungen und Wachstumsmedien enthalten Metalle mit Gesundheits- und Umweltgefahren. Führen und lagern Sie sie gemäß den Sicherheitsdatenblättern.
  3. Bereiten Sie eine Säurelösung mit 40 mM Oxalsäuredihydrat und 2 % Salpetersäure in ultrareinem Wasser für die Verdauung der Mn-Oxide im Mikrofluidreaktor vor.
    VORSICHT: Oxalsäuredihydrat und Salpetersäure sind korrosiv, und Salpetersäure ist ein starker Oxidator. Führen und lagern Sie sie gemäß den Sicherheitsdatenblättern.
  4. Bereiten Sie eine 1%ige Salpetersäurelösung in ultrareinem Wasser für die Verdünnung der ICP-MS-Probe vor.

4. Bakterienkultivierung

HINWEIS: Die bakterielle Kultivierung erfolgt mit aseptischer Technik auf der Arbeitsplatte mit einem Bunsenbrenner. Die Materialien sind steril, sofern nicht anders angegeben. Die Inkubationsdauern sind spezifisch für P. putida GB-1 und müssen möglicherweise für andere Mikroorganismen angepasst werden.

  1. Aus einem -80 °C Stock wird P. putida GB-1 auf einer LB-Agarplatte gestreift. Inkubieren Sie die Platte etwa 20 Stunden bei 30 °C, um das Wachstum von Bakterienkolonien zu ermöglichen.
  2. Am Abend vor dem Experiment geben Sie 10 ml LB-Medium in ein 50-mL konisches Rohr und inokulieren Sie mit einer Plattenkolonie. Inkubieren Sie die LB-Vorkultur in einem Shaker-Inkubator bei 30 °C und 180 U/min für 16 Stunden, um die stationäre Phase zu erreichen.
  3. Nach 16 Stunden Inkubation wird 1 ml LB in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr vorkultiviert und für 1 Minute bei 8.000 x g zentrifugiert, um die Bakterien zu pelletieren.
  4. Waschen Sie den Aliquot dreimal, um das verbrauchte LB-Medium zu entfernen, indem Sie das Übersetzungsmittel entsorgen, das Zellpellet in 1 mL SS0 neu suspendieren und das Korn 1 Minute bei 8.000 x g zentrifugieren . Das endgültige Pellet in 1 mL SS0 wieder suspendieren.
  5. Messen Sie die optische Dichte (OD600) der gewaschenen Zellsuspension in einer nichtsterilen Cuvette mit einem Zelldichtemessgerät. Der erwartete OD600 für P. putida GB-1 beträgt in diesem Schritt 3,6–3,8, sodass eine mindestens fünffache Verdünnung in SS0 erforderlich ist.
  6. Inokulieren Sie 20 ml GM0 mit gewaschener Zellsuspension auf einen anfänglichen OD600 von 0,01 in einer 50-mL Erlenmeyer-Flasche. Inkubieren Sie bei 30 °C und 180 U/min für 6 Stunden, um die mittlere exponentielle Phase zu erreichen.

5. Biomineralisierungsexperiment

  1. Am Morgen des Experiments bereiten Sie das Durchflusskontrollsystem vor.
    1. Heizen Sie den Mikroskop-Inkubator auf 30 °C vor.
    2. Gießen Sie 10 ml GMMn und SSMn in zwei 15-mL konische Röhren und verbinden Sie die Röhren mit dem Flüssigkeitsreservoir-Rack. Spülen Sie SSMn für etwa das Dreifache des Systemvolumens (~4 Stunden bei 7,0 μL·min-1), gefolgt von GMMn für die gleiche Dauer.
  2. Sättigen Sie den vorbereiteten mikrofluidischen Reaktor 5 Stunden nach der Inokulierung der mittelexponentiellen Kultur.
    HINWEIS: Die Reaktorsättigung und Inokulation erfolgen mit aseptischer Technik auf der Arbeitsplatte mit einem Bunsenbrenner. Die Materialien sind steril, sofern nicht anders angegeben.
    1. Entgasen Sie den Reaktor 20 Minuten lang in einem Vakuum-Desikator.
    2. Während der Reaktor entgast, ziehen Sie 1–2 ml SS0 in eine 3-mL Kunststoffspritze, dann eine stumpfe Nadel und 20 cm Tygon-Rohr mit 0,02-Zoll-ID befestigen. Drücken Sie den Spritzenkolben, bis der Schlauch vollständig gesättigt ist.
    3. Entfernen Sie den Reaktor aus dem Desikator, befestigen Sie das Rohr mit einer schrägen Pinzette am Reaktorauslass und sättigen Sie den Reaktor manuell mit der Spritze, bis sich ein Tropfen am Einlassloch bildet.
    4. Befestigen Sie 20 cm 0,02-Zoll-Tygon-Rohr am Einlassloch des Reaktors. Geben Sie weiterhin SSMn in den Reaktor, bis alle Luftblasen entfernt sind (200–300 μL).
  3. Bereiten Sie das Reaktorinokulum vor und inokulieren Sie den mikrofluidischen Reaktor.
    1. Entferne die mittelexponentielle Kultur 6 Stunden nach der Impfung aus dem Shaker-Inkubator und messe den OD600. Der erwartete OD600 beträgt in diesem Schritt 1,6–1,8, daher wird eine Verdünnung um 4-fach in SS0 empfohlen.
    2. Verdünnen Sie die mittlere exponentielle Kultur in 2 mL SSMn auf einen anfänglichen OD600 von 0,005 in einem 2-mL Mikrozentrifugenrohr. Wenden Sie das Rohr mehrmals um, um zu mischen.
    3. Setzen Sie das Reaktoreinlassrohr in das Mikrozentrifugenrohr und stellen Sie sicher, dass ein Tropfen Flüssigkeit das Inokulum berührt, um die Luftzufuhr in den Schlauch zu verhindern. Schließen Sie das Mikrozentrifugenrohr teilweise und sichern Sie den Deckel mit Klebeband, um eine Verunreinigung zu verhindern.
    4. Entnehmen Sie 4–5 ml SSMn in eine 5-mL glas-gasdichte Spritze, um den Lauf zu befeuchten, und geben Sie dann ab, bis 0,5 ml in der Spritze verbleiben. Lade die Spritze in eine Spritzenpumpe.
    5. Nehmen Sie die Nadel aus der Kunststoffspritze und befestigen Sie sie an der Glasspritze, wobei Sie darauf achten, keine Luft in der Nadelnabe einzuschließen.
    6. Inokulieren Sie den Reaktor mit der Spritzenpumpe, indem Sie das Inokulum für 20 Minuten mit einer Durchflussrate von 8,33 μL·min-1 (~70 Porenvolumen) in den Reaktor entnehmen.
    7. Nach der Impfung schalten Sie die Spritzenpumpe aus und lassen Sie die Bakterien sich eine Stunde lang absetzen und anheften.
    8. Nach 1 Stunde entferne die Spritze aus der Spritzenpumpe, lasse sie aber am Auslassrohr angeschlossen.
  4. Verbinden Sie den inokulierten mikrofluidischen Reaktor mit dem Durchflusskontrollsystem.
    1. Bewegen Sie den Reaktor und die Spritze von der Arbeitsplatte in den Mikroskop-Inkubator.
    2. Im Mikroskopstadium werden die Einlassrohre vom Reaktor entfernt.
    3. Drücke sanft auf den Spritzenkolben, um am Reaktoreinlassloch einen Tropfen zu erzeugen.
    4. Biegen Sie das PTFE-Rohr vom Durchflusskontrollsystem manuell in einem rechten Winkel (~1 cm vom Ende des Rohrs) ab, sodass es senkrecht zur PDMS-Oberfläche angrenzt und so seitliche Kräfte und Lufteindringung in das Reaktoreinlassloch minimiert.
    5. Tauchen Sie das Ende des PTFE-Schlauchs in eine Lösung aus 1% Polyethylenglykol-Diacrylat (PEG-DA), um die hydrophobe Außenseite des Schlauchs zu benetzen. Stellen Sie sicher, dass ein Tropfen GMMn am Ende des PTFE-Rohrs vorhanden ist, und befestigen Sie das Rohr am Einlassloch des Reaktors.
    6. Trennen Sie die Spritze und legen Sie das Auslassrohr in ein nicht-steriles 5-mL-Mikrozentrifugenrohr, um das Abwasser des Reaktors aufzufangen.
    7. Stellen Sie die Durchflussmenge in der Software des Durchflusssystems auf 1,33 μL·min-1 ein. Richtete ein Programm ein, um gentechnisch veränderteMn für 15 Stunden (~500 Porenvolumen) zu liefern, um die Biofilmbildung zu fördern, gefolgt von SSMn für 28,5 Stunden (~1.000 Porenvolumen), um eine Mn-Biomineralisierung zu induzieren.
  5. Montieren Sie den mikrofluidischen Reaktor im Einsatz der Mikroskopstufe.
    HINWEIS: Ein eigens angefertigtes Ultraviolett-C (UVC)-Bestrahlungssystem, das am Mikroskop-Stufeneinsatz befestigt ist, wird verwendet, um unerwünschtes Bakterienwachstum und Mineralausfällungen außerhalb des mikrofluidischen Porenraums zu verhindern (Abbildung 2). Dieses Design basiert auf Ramos et al.60 und kann mit einem automatisierten Programm gesteuert werden. Siehe Fadely et al.61 für Details.
    1. Platzieren Sie einen Probenrahmen unter den Reaktor zur Stabilität und montieren Sie dann den Rahmen und den Reaktor starr im Stufeneinsatz, um sicherzustellen, dass sie vollständig immobilisiert sind.
    2. Befestigen Sie den PTFE-Schlauch mit einem Stück Klebeband am Stage-Einsatz, um zu verhindern, dass sich das Rohr vom Reaktoreinlassloch löst.
    3. Richten Sie die UVC-Arme auf einem Abstand von 3 mm vom Porenraumrand auf der Einlassseite und 2 mm auf der Auslassseite aus, um die Streuung von ultraviolettem Licht und Biofilmschäden im Porenraum zu minimieren.
      HINWEIS: Eine korrekte UVC-Ausrichtung führt zu wenig bis gar keiner Biomassakkumulation im Reaktoreinlassbereich (Abbildung 3A). Eine zu große Ausrichtung der UVC-Arme vom Einlassrand des Porenraums entfernt (Abbildung 3B) oder das Fehlen von Bestrahlung (Abbildung 3C) führt zu einer mineralischen Niederschlagung stromaufwärts des Porenraums.
    4. Richte ein Programm für Reaktorbestrahlung ein. Behandle die Ein- und Auslassbereiche des Reaktors für 5 Minuten bei t = 0 Stunden, um die während der Impfung abgelagerten Bakterien zu inaktivieren, und behandeln Sie dann den Auslassbereich nur für 5 Minuten bei t = 17,5 Stunden, um eventuelle verbleibende Biofilme zu inaktivieren.

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Abbildung 2: Sonderangefertigtes UVC-Bestrahlungssystem für Mikrofluidikreaktoren. (A). Draufsicht des auf dem Mikroskop-Stufeneinsatz montierten Systems mit beweglichen Armen (blau) mit angeschlossenen UVC-Leuchtdioden-(LED)-Arrays (gelbe Rechtecke) und einem mikrofluidischen Reaktor, der auf einem Probenrahmen (kleines graues Rechteck) montiert ist. (B). Tiefe Ansicht des Systems zeigt UVC-LEDs (beige Quadrate), die in die beweglichen Arme eingebettet sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Wirkung der UVC-Bestrahlung auf die mikrofluidische Reaktoreinlassregion. (A). Reaktoreinlassbereich mit einer 5-minütigen UVC-Behandlung bei t = 0 H, was eine korrekte Ausrichtung für die vollständige Entfernung unerwünschter Biofilme zeigt. (B). Reaktoreinlassbereich mit einem falsch ausgerichteten UVC-Array, das Restbiofilme im Einlassloch und außerhalb des Porenraums hinterließ, wodurch Mn-Oxide stromaufwärts ausfällen konnten. (C). Reaktoreinlassbereich ohne UVC-Behandlung, was zu umfangreichem Biofilmwachstum und mineralischer Niederschlagung führt. Graue Schattierung markiert den Porenraum. Die Maßstabsleiste beträgt 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

6. Optische Zeitraffermikroskopie

HINWEIS: Ein Nikon Ti2 Eclipse invertiertes Epifluoreszenzmikroskop mit einer Digitalkamera (2304 x 2304 Pixel pro Sichtfeld), einer Weißlicht-Engine, 4x-Objektiv (1,62 μm·pixel-1) und der NIS Elements-Software wird für die Farbhellfeldabbildung verwendet. Andere optische Mikroskope, die Farbabbildung ermöglichen, sind ebenfalls geeignet. Die Verwendung der Farbbildgebung verbessert die Empfindlichkeit gegenüber niedriger Mnoxidmasse. Wenn Zeitraffer-Automatisierung keine Option ist, können Nutzer Bilder manuell sammeln und sie als Zeitreihe nachbearbeiten.

  1. Für hochwertige Bilder führen Sie die folgenden Ausrichtungs- und Korrekturschritte durch:
    1. Um eine gleichmäßige Beleuchtung zu gewährleisten, stellen Sie die Köhler-Ausrichtung manuell gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
    2. Optimieren Sie die Hellfeldbeleuchtung, um Bildunter- oder Übersättigung zu vermeiden (Fusion Pad > Color > Auto Brightness und Fusion Pad > Color > Auto White).
      HINWEIS: Es ist am besten, die Hellfeldbeleuchtung nur einmal bei einem Reaktor zu optimieren, der bereits Biofilme und Mn-Oxide enthält, und dann dieselbe Belichtungszeit und Farbbalance auf alle folgenden Experimente anzuwenden, um eine gleichbleibende Beleuchtung zu gewährleisten. Hier wird eine 5-ms-Beleuchtung mit Rot bei 97,58 %, Grün bei 44,76 % und Blau bei 100 % verwendet.
    3. Um Quilt-Artefakte beim Aufnehmen von zusammengestickten Bildern des mikrofluidischen Porenraums zu vermeiden, wenden Sie eine Schattierungskorrektur an (Acquire > Shading Correction Panel).
  2. Stellen Sie die Mittelkoordinate des zusammengestickten Bildes ein (ND Acquisition > XY).
  3. Richte den Scan-Bereich des zusammengestickten Bildes ein (hier 5 x 4 Sichtfelder) und wende eine Überlappung von 1 % an (ND-Aufnahme > großes Bild).
  4. Richten Sie die Aufnahme von Farbhellfeldbildern mit dem 4x-Objektiv ein (ND Acquisition > λ).
  5. Stellen Sie die Bildfrequenz mit Intervallen von 1 Stunde für 15 Stunden (Wachstumsphase) und 0,5 Stunden für 28,5 Stunden (Mineralisierungsphase) (ND-Aufnahme > Zeit) ein und führen Sie dann das Zeitrafferprogramm aus.
    HINWEIS: Die Dauer der Wachstums- und Mineralisierungsphasen ist spezifisch für P. putida GB-1 und kann bei Bedarf für andere Mikroorganismen angepasst werden.
  6. Nach Abschluss des Experiments exportieren Sie die Bilder als Tagged Image File Format (TIFF) (Macro Panel > Export Images in TIFF).

7. Säureverdauung und Mn-Massenmessung

HINWEIS: Ein ICP-MS wird verwendet, um die im mikrofluidischen Reaktor erhaltene Mn-Masse zu messen, aber auch andere Instrumente wie optische Emissionsspektrometer (ICP-OES) sind akzeptabel. Wenn analytische Instrumente nicht verfügbar sind, können säureverdaute Proben an ein kommerzielles Labor geschickt werden.

  1. Am Ende des Experiments wird der Reaktor aus dem Mikroskopstufeneinsatz entfernt und Ein- und Auslassrohr getrennt.
  2. Entnehmen Sie 1,5 ml Säurelösung in eine 5-mL Glas-gasdichte Spritze (getrennt von der Impfspritze). Befestigen Sie eine stumpfe Nadel und 20 cm 1/32-Zoll-PTFE-Schlauch mit 1/32-Zoll-ID an der Spritze und dosieren Sie Säure manuell, bis sich am Ende des Schlauchs ein Tropfen bildet.
  3. Auf der Arbeitsplatte laden Sie die Spritze in eine Spritzpumpe und verbinden Sie den Schlauch mit dem Reaktoreinlassloch, wobei Sie darauf achten, keine Luftblasen einzuschließen, da sie verhindern können, dass die Säurelösung alle Poren durchdringt. Schließen Sie 30 cm 1/32-Zoll-ID-PTFE-Rohr an das Reaktorauslassloch an und setzen Sie das Ende des Auslassrohrs in ein 2-mL Mikrozentrifugenrohr.
  4. Säurelösung wird für 10 Minuten mit einer Durchflussrate von 100 μL·min-1 in den Reaktor eingespritzt.
  5. Nach der Injektion der Säurelösung trennen Sie die stumpfe Nadel von der Glasspritze. Füllen Sie eine 10-ml-Kunststoffspritze mit Luft und schließen Sie sie an die stumpfe Nadel an, geben Sie dann manuell die gesamte Luft in der Spritze ab, um die verbleibende Säure aus dem Reaktor und dem Schlauch in das 2-mL-Mikrozentrifugenrohr abzuleiten.
    HINWEIS: Obwohl nach der Luftinjektion ein kleines Volumen der Säurelösung im Porenraum eingeschlossen bleiben kann, ist es im Verhältnis zum insgesamt injizierten Volumen vernachlässigbar. Nutzer, die mit Geometrien mit niedrigerer Porosität arbeiten, könnten erwägen, zusätzliche Luftmengen zu spülen, um Flüssigkeitsschichten und Restsäure aus schlecht verbundenen Poren zu entfernen.
  6. Verdünnen Sie die verdaute Probe mit 1 % Salpetersäure gemäß dem ICP-MS-Kalibrierungsbereich. Hier bereiten Sie eine 100-fache Verdünnung (5 ml Gesamtvolumen) in einem 15-mL konischen Rohr vor.
  7. Messen Sie die Mn-Konzentration in der verdünnten Probe mit ICP-MS. Korrigieren Sie die gemessene Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor und dem Gesamtprobenvolumen, um die im Reaktor erhaltene Mn-Masse zu bestimmen.

8. Bildanalyse

HINWEIS: MATLAB wird wegen seiner eingebauten Funktionen zur Bildanalyse empfohlen, die im Text enthalten sind. Andere Werkzeuge wie ImageJ oder Pythons Bildanalysebibliotheken können jedoch ebenfalls verwendet werden, um vergleichbare Analysen durchzuführen. Wichtige Schritte zur Bildanalyse sind in Abbildung 4 dargestellt. Alle Bildanalyseskripte werden als Supplemental File bereitgestellt (Supplementary File 1, Supplementary File 2 und Supplementary File 3).

figure-protocol-4
Abbildung 4: Bild-Subtraktions-Workflow zur Isolierung von Mn-Oxid-Ausfällungen. Aus Zeitraffer-Farbbrightfield-Bildern wurde ein Referenzbild (tref) (1) identifiziert, um die Intensität der darunterliegenden stationären Phasenbiofilme aus allen nachfolgenden Zeitpunktbildern (tn) zu entfernen. (2) Binärmasken aller tn wurden erzeugt (3) und mit sowohl tref (4) als auch mit dem entsprechenden tn (5) multipliziert, um die Biofilm-Biomineral-Ausdehnung zu erfassen. Schließlich wurden die maskierten TN vom maskierten Tref subtrahiert (6). Die resultierenden intensitätskorrigierten Matrizen quantifizieren die Abnahme der Intensität (a.u.) durch die Ansammlung von Mn-Oxid an jedem Pixel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

  1. Laden Sie ein hochauflösendes TIFF der Geometrie des mikrofluidischen Porenraums (exportiert aus AutoCAD) in den Arbeitsbereich, um es als Kornmaske (Imread) zu verwenden.
  2. Richten Sie die Farbbrightfield-Bilder auf und registrieren Sie sie, um die Korn-Maske effektiv aufzutragen.
    1. Erzeugen Sie eine Registrierungsbinärform des ersten Zeitpunktbildes (t = 0 h).
      1. Lade das Farb-Brightfield-TIFF in den Arbeitsbereich (Imread).
      2. Schneiden Sie das Bild etwas größer als die Größe des Porenraums (Imcrop).
      3. Schärfe das Bild, um die Auflösung der Korngrenzen zu verbessern (unschärfen).
      4. Binarisieren Sie das Bild mit einer adaptiven Schwelle, die dunkle Merkmale priorisiert (rgb2gray, adaptthresh mit Vordergrundpolarität = "dunkel" und bei Bedarf angepasste Empfindlichkeit, imbinarisieren, Komplement).
      5. Fülle die Körner der resultierenden Registrierungsbinär, um feste Merkmale zu erzeugen (Auffüllen mit angegebenen "Löchern"). Beachten Sie, dass nicht alle Körner gefüllt werden dürfen.
      6. Erodieren Sie das Registrierungsbinär bei Bedarf, um Hintergrundrauschen zu entfernen, und erweitern Sie sich dann, um verlorene Pixel an den Kornkanten zu ersetzen (imerodieren, imdilatieren).
    2. Verwenden Sie einen skaleninvarianten Feature-Transform (SIFT)-Registrierungsalgorithmus, um die Transformationsmatrix zu berechnen, die benötigt wird, um das Registrierungsbinär an die Kornmaske auszurichten (detectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d mit Transformationstyp = "affin").
    3. Wende diese Transformationsmatrix auf das Registrierungsbinär und das erste Zeitpunktbild an und überlagere sie dann mit der Kornmaske, um die Passung (Imwarp, Imshowpair) zu bewerten.
    4. Wenn nach der SIFT-Registrierung eine schlechte Ausrichtung besteht, wenden Sie bei Bedarf die lokale Registrierung an (cpselect, fitgeotform2d mit Transformationstyp = "lwm", imwarp).
    5. Schneide das registrierte Bild und die Kornmaske nach Bedarf zu, um Registrierungsartefakte an den Matrixkanten zu entfernen, und dann auf die Porenraummaße (15 mm x 10 mm) zu reduzieren (Umschneiden, Imresize).
    6. Durchlaufe alle Farbbrightfield-Bilder, um dieselbe Registrierung (Imwarp) anzuwenden.
  3. Identifizieren Sie visuell ein Referenzbild (tref, Panel 1 in Abbildung 4), wenn Biofilme erstmals in die stationäre Phase eintreten, was als fehlende fortgesetzte Bewegung oder Wachstum festgestellt wird (hier t = 18,5 H).
  4. Binarisieren Sie jedes Zeitpunktbild (tn, Panel 2 in Abbildung 4) (rgb2gray, adaptthresh mit Vordergrundpolarität = "dunkel" und Empfindlichkeit nach Bedarf angepasst, imbinarisieren, Imkomplement), sodass Biofilm-Biomineral-Assemblagen = 1 und Körner und leere Poren = 0 sind. Multiplizieren Sie jede Zeitpunkt-Maske mit der invertierten Kornmaske (Imkomplement), um verbleibende Korngrenzen zu entfernen.
  5. Multiplizieren Sie tn mit der entsprechenden Zeitpunktmaske (Panel 3 in Abbildung 4), um die Biofilm-Biomineral-Region von Interesse zu isolieren (Panel 5 in Abbildung 4), und multiplizieren Sie dann tref mit jeder Zeitpunktmaske, um denselben Bereich zu isolieren (Panel 4 in Abbildung 4).
  6. Ziehe alle maskierten tn von der maskiertent-Ref ab, um die mit der Ansammlung von Mn-Oxid zu jedem Zeitpunkt verbundene Abnahme der Pixelintensität zu quantifizieren (imsubtrahieren), und konvertiere dann in zusammengesetzte, intensitätskorrigierte Matrizen (rgb2gray, Panel 6 in Abbildung 4).
  7. Um die räumliche Verteilung der Minerale über den Porenraum (a.u.) zu bewerten, summieren Sie entlang der Säulen (Summe mit Dimension = 1) jeder intensitätskorrigierten Matrix.
  8. Zur Abschätzung der Geschwindigkeit der Mn-Oxid-Niederschlagsrate über die Zeit (μg·h-1):
    1. Summiert man jede intensitätskorrigierte Matrix (Summe mit Dimension = "alle") zusammen, um die gesamte korrigierte Intensität an jedem Zeitpunkt zu quantifizieren.
    2. Teile die gesamte korrigierte Intensität zu jedem Zeitpunkt durch die gesamte korrigierte Intensität am letzten Zeitpunkt, sodass der Endzeitpunkt = 1 ist und alle vorherigen Werte bruchteilig sind. Skaliere auf μg um, indem man mit der mit ICP-MS gemessenen Mn-Masse multipliziert.
    3. Nehmen Sie die Ableitung bezüglich der Zeit, indem Sie die Massenzunahme (μg) zwischen aufeinanderfolgenden Zeitpunkten (Diff) durch das Zeitintervall zwischen den Bildern (0,5 H) teilen.

Ergebnisse

Dieses Protokoll bietet eine experimentelle Plattform für raumzeitlich aufgelöste Bildgebung von Biofilmbildung und Mn-Biomineralisierung. Farbhellfeldbilder zeigten, dass die Biofilme von P. putida GB-1 gleichmäßig im mikrofluidischen Porenraum bei t = 18,5 Stunden vor Beginn der Mn-Oxid-Niederschlagung verteilt waren (Abbildung 5A). Anschließend sammelten sich Mn-Oxide bevorzugt auf der Einlassseite des Porenraums an, die der einflussreichen Mn(II)-Quelle am nächsten liegt (Abbildung 5B). Der Unterschied zwischen dem Referenzbild und den nachfolgenden Bildzeitpunkten zeigte den isolierten Beitrag von Mn-Oxid-Niederschlägen zur Gesamtbildintensität (Abbildung 5C) und ermöglichte die Quantifizierung des beobachteten Reaktorskalengradienten bei der Mineralakkumulation (Abbildung 5D). Im Biofilmmaßstab erfasste dieser Bildsubtraktionsansatz die allmähliche Niederschlagung von Mn-Oxiden auf Biofilmoberflächen und die Ansammlung von Mineralien an den Rändern der Biofilme, die mit Porenflüssigkeit in Kontakt sind (Abbildung 6).

Das Protokoll bietet zudem einen Workflow zur Abschätzung der Kinetik der Mn-Oxid-Niederschlagung aus Bildsubtraktion und ICP-MS-Messungen. Dreifache mikrofluidische Reaktoren enthielten zum letzten experimentellen Zeitpunkt 4,29 ± 0,22 μg Mn. Die Säureverdauung des Reaktorinhalts wurde zuvor mittels Synchrotron-basierter Messungen der Mn-Oxidmasse validiert und führte zu weniger als 18 % Fehler61. Daher wurden die intensitätskorrigierten Matrizen auf diese Endmasse neu skaliert. Die daraus resultierende geschätzte Niederschlagsrate von Mn-Oxid war nichtmonoton, nahm steil zwischen t = 19,5 h und t = 21 h an, bevor sie bei 0,29 ± 0,04 μg·h-1 ihren Höhepunkt erreichte und allmählich bis t = 43,5 h abbremste (Abbildung 7). Es sollte beachtet werden, dass diese Ratenberechnung keine Nanopartikel-Mn-Oxide unterhalb der Auflösung des optischen Mikroskops oder jegliche Oxidmasse berücksichtigt, die durch den Transport über die Experimentdauer verloren geht, die minimal erwartet wird. Dieser Ansatz nutzt daher zugängliche Mikroskopietechniken, um zeitliche Trends in der Biomineralisationskinetik halbquantitativ zu bewerten.

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Abbildung 5: Reaktorskalierte Verteilung von Biofilmen und Mn-Oxiden. (A). Farbhellfeldbild von P. putida GB-1-Biofilmen im mikrofluidischen Porenraum zu Beginn der stationären Phase (t = 18,5 h, tref). (B). Farbhellfeldbild von Mn-Oxid fällt auf und um P. putida GB-1-Biofilme zum finalen experimentellen Zeitpunkt (t = 43,5 Stunden). (C). Intensitätskorrigierte Matrix der Mineralakkumulation zum finalen experimentellen Zeitpunkt (t = 43,5 h), mit grauen Körnern und weißen Poren. Der Maßstab beträgt 1 mm (D). Eindimensionale räumliche Verteilung mit insgesamt korrigierter Intensität vom Einlass (links) zur Auslassseite (rechts) des Porenraums (t = 43,5 h). Die durchgezogene Linie stellt einen 1-mm-gleitenden Durchschnitt entlang des Porenraums vom Einlass zum Auslass dar, der über dreifache Experimente gemittelt wird, und die Schattierung stellt die Standardabweichung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 6: Mnoxid-Akkumulation im Biofilmmaßstab. (A). Wählen Sie Farbhellfeldbilder von repräsentativen P. putida GB-1 Biofilmen aus. Manganoxide waren zunächst als Farbwechsel von Grau zu Braun auf Biofilmoberflächen nachweisbar (gezeigt bei t = 20 h und t = 21 h) und später als Ansammlung von dunkelbraunen Ausfällungen an Biofilmrändern (gezeigt bei t = 33 h und t = 43 h). (B). Intensitätskorrigierte Matrizen der Mineralakkumulation mit Körnern in dunklem Grau, Poren in Weiß und darunterliegenden Biofilmen in hellgrau. Der Maßstab beträgt 150 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 7: Schätzung der Niederschlagsrate von Mn-Oxid über die Zeit. Die Rate (μg·h-1) wurde quantifiziert, indem die gesamte korrigierte Intensität zu jedem Zeitpunkt auf die mit ICP-MS gemessene Endpunkt Mn-Masse neu skaliert und dann die Ableitung bezüglich der Zeit genommen wurde. Marker stellen den Durchschnitt dreifacher Experimente dar, und die Schattierung stellt die Standardabweichung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Akte 1: Step1_ImageRegistration.m.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 2: Step2_ImageSubtraction.00.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsakte 3: Step3_Figures.00.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Diese experimentelle Plattform bietet einzigartige Möglichkeiten, die räumlich-zeitlichen Dynamiken biogeochemischer Prozesse in porösen Umgebungen zu untersuchen, die frei von Artefakten sind, die die Erfassung hochaufgelöster Daten verhindern. Dieser Ansatz eignet sich besonders gut für die Biomineralisierung von Mn und Fe, die mineralische Niederschläge mit charakteristischen Ocker-, Braun- und Schwarztönen erzeugen, die mit optischer Mikroskopie und Bildanalyse leicht segmentiert werden können. Anhand der Mn-Biomineralisierung als Fallstudie ist es möglich, Muster und Raten der Mineralpräzipitation in situ mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu bewerten.

Mehrere Aspekte dieses Protokolls ermöglichten die Sammlung reproduzierbarer Messungen biogeochemischer Transformationen. Erstens ermöglichte die Verwendung eines sequentiellen Einspritzventils mit geringem Totvolumen Experimente mit mehreren Flüssigkeiten, ohne die Biofilme im mikrofluidischen Porenraum zu stören. Dieses Setup bewahrte die anfängliche räumliche Verteilung des Biofilms, indem Druckstöße verhindert wurden, die beim Austausch von eingespritzten Flüssigkeiten zu Abwurf oder Verdrängung von Biofilmen führen können, was bei anderen Instrumenten wie Spritzenpumpen auftreten kann. Diese Komponente bietet dem Nutzer zudem die Flexibilität, die geochemischen Bedingungen der ansässigen Mikroorganismen individuell anzupassen. Schließlich ermöglicht dieses Setup, da es die anfängliche Biofilmverteilung bewahrt, systematisch zu testen, wie unterschiedliche Biofilmmorphologien oder Biomassemengen die Verteilung und Rate der Mnoxid-Niederschlagsrate beeinflussen.

Zweitens ermöglichte die Minderung der Bildung und das Eindringen von Blasen im mikrofluidischen Porenraum mehrtägige Experimente, die die umweltrelevanten Zeiträume der Mn-Biomineralisierung erfassten. Blasen, ein häufiges und oft unvermeidliches Problem in langen Experimenten überRaumtemperatur 62,63, können einzelne Poren fragmentieren und blockieren, den Flüssigkeitsfluss umleiten und den Reaktionsverlauf stören. Um ein Blaseneinfangen im Porenraum zu verhindern, wurde der Reaktor vor der Impfung vollständig gesättigt. Um das Einschleudern von Blasen durch das Durchflusskontrollsystem zu minimieren, wurde der Mikroskopinkubator weit vor dem Experiment auf 30 °C eingestellt, und mehrere Volumina Einflusslösung wurden vor dem Anbringen des inokulierten Reaktors gespült. Dieser Schritt entfernte die eingeschlossene Luft aus den Schläuchen und den Verschraubungen und minimierte das Risiko eines Flüssigkeitsausgases während des Experiments. Eine Blasenfalle wurde ebenfalls in das Durchflusskontrollsystem integriert, um eventuelle Restblasen aufzufangen, wobei ein 200-μm-Durchmesser von PTFE-Schläuchen am Ausgang des Fanges befestigt war, um den Widerstand zu erhöhen und die Effizienz der Blasenentfernung zu verbessern. Um zu verhindern, dass Luft an der Grenzfläche zwischen dem Einflussrohr und dem Reaktoreinlassloch eingeschlossen wird, wurden schließlich alle Verbindungen mit Flüssigkeitströpfchen an beiden Enden des Rohrs und dem gestanzten Loch hergestellt, das hydrophobe PTFE-Rohr wurde mit 1 % PEG-DA beschichtet, und das Ende des eingesetzten Rohrs wurde während des gesamten Experiments senkrecht zur PDMS-Oberfläche gehalten.

Drittens sorgte die Integration eines speziell entwickelten UVC-Bestrahlungssystems in die experimentelle Plattform für eine definierte geochemische Randbedingung und reproduzierbare Einschränkung der Mn-Biomineralisierung im mikrofluidischen Porenraum. Pilotexperimente zeigten, dass überflüssige Biofilme im Reaktoreinlassbereich Mn-Oxide stromaufwärts des Porenraums ausfällten, was die Verfügbarkeit von Mn(II) stromabwärts einschränkte. Durch eine kurze Bestrahlung der Ein- und Auslassbereiche des Reaktors mit korrekter Ausrichtung nach der Phase ohne Durchfluss wurde die Entwicklung von Biofilmen durch ursprünglich abgelagerte Bakterien verhindert. Kontinuierlicher unidirektionaler Flüssigkeitsfluss verhinderte eine Rekolonisierung des Reaktoreinlassbereichs nach dieser anfänglichen UVC-Behandlung. Die Bestrahlung des Reaktorauslassbereichs bei t = 17,5 h vor Beginn der stationären Phase und sichtbarer Mn-Oxid-Niederschlagung minimierte die Menge der Mineralansammlung stromabwärts des Porenraums. Dies ermöglichte den direkten Vergleich von Farbhellfeld-Bilddaten mit Mn-Masse, die mit ICP-MS verwertet und gemessen wurde.

Die Kombination aus Bildsubtraktion und Endpunktmassemessungen bot eine halbquantitative Methode zur Bewertung der Kinetik der Mn-Oxid-Niederschlagung in situ. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Pixelintensität bei sehr hoher Mineraldichte aufgrund der begrenzten Kameraempfindlichkeit gegenüber dunklen Farben61 nicht mehr direkt proportional zur Mn-Oxidmasse ist. Die Bewertung dieses nichtlinearen Verhaltens könnte verbessert werden, indem Säureverdautungsproben zu definierten Zeitpunkten durchgeführt und die verdaute Masse mit der ursprünglichen Masse nach dem finalen experimentellen Zeitpunkt skaliert wird. Wenn eine exakte Quantifizierung der Mineralmasse erforderlich ist, können Nutzer eine Kalibrierungskurve mit Mineralproben bekannter Intensität und Masse entwickeln, wie sie zuvor in Fadely et al.61 gezeigt wurde, oder direkte Messungen mit synchrotronbasierter Röntgenfluoreszenz durchführen.

Die hier vorgestellte mikrofluidische Plattform kann zur Untersuchung von Biomineralisierungsprozessen unter einer Vielzahl von Umweltbedingungen eingesetzt werden. Während repräsentative Experimente für P. putida GB-1 optimiert wurden, kann dieses System systematisch eine Reihe von Einflusslösungschemikalien (z. B. Mn- oder Fe-Konzentration, Kohlenstoffquelle, Vorhandensein von mitvorkommenden Metallen), Durchflussraten, Temperaturen oder das Vorhandensein eines mikrobiellen Konsortiums testen. Spezifische saure oder suboxische Bedingungen, wie sie für Fe-oxidierende Bakterien günstig sind, können simuliert werden, indem der influensivere pH-Wert gesenkt oder das PDMS mit einem sauerstoffundurchlässigen Polymer beschichtet wird. Einblicke in die mikrobiellen Kontrollen der Biomineralisierung können durch die Implementierung von Reporter-Genfusionsstämmen und das Verfolgen der resultierenden optischen Fluoreszenz59,64 gewonnen werden. Mikrofluidische Reaktoren können umgestaltet werden, um eine Reihe poröser Umgebungen zu simulieren, indem die Partikelgrößenverteilung, Partikelform oder Porosität verändert oder das PDMS funktionalisiert wird, um die Oberflächenladung von Tonpartikeln oder natürlicher organischer Substanz nachzuahmen. Mit zusätzlichen Modifikationen (z. B. Ersatz des Glas-Reaktorsubstrats durch Kunststoff) können Reaktoren direkte spektroskopische Messungen des Metalloxidationszustands, der Mineralogie, organo-mineralischen Assoziationen oder der Sorption oder Ko-Fällung von Sekundärmetallen unterstützen. Schließlich kann diese experimentelle Plattform erweitert werden, um die Niederschlagung anderer Metall-Biominerale (z. B. Phosphate, Karbonate, Sulfide) zu untersuchen, sofern ihre optischen Eigenschaften ausreichend unterschiedlich sind, um eine Bildsegmentierung zu ermöglichen. Dieses Protokoll bietet daher einen Rahmen, um Biomineralisierung und Mikrobe-Mineral-Fluid-Interaktionen in relevanten porösen Umgebungen umfassend zu untersuchen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde vom U.S. National Science Foundation Center for Bio-mediated and Bio-inspired Geotechnics (ERC-1449501), der Swiss National Science Foundation (200021_188546) und der U.S. National Science Foundation (MCA-2322428, EAR-1847689, DMR-2003849) unterstützt. Ein Teil dieser Studie wurde am UC Davis Center for Nano and Micro Manufacturing (CNM2) durchgeführt. Wir danken Steven Lucero und der UC Davis Tech Foundry für das Design und die Herstellung des Mikroskop-Inkubators und des UVC-Bestrahlungssystems. Wir danken auch Dr. Yuze Wang und Dr. Jason DeJong für die Bereitstellung der porösen Mediumgeometrie, die für die Herstellung mikrofluidischer Reaktoren verwendet wird, sowie Dr. Arunima Bhattacharjee, Dr. Noah Goshi, Dr. Gregory Girardi und Dr. Hyehyun Kim für nützliche Diskussionen und/oder Schulungen in Photolithographie und Weichlithographie. Abschließend danken wir Dr. Gaitan Gehin, Dr. Tonya Kuhl, Dr. Filippo Miele und Dr. Charles Graddy für wertvolle Diskussionen über experimentelles Design und Bildanalyse.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Adapter-Verbindung (Elveflow, 6-40 zu 1/4-28)Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08Verwendet zur Schnittstelle zwischen Durchflusssensor und flanschlosen Verbindungen.
Agar (Fisher BioReagents)Fisher ScientificBP9744Verwendet zum Gießen von Platten für das Auftragen von eingefrorenen Beständen.
Luftkompressor (Jun-Air)ElveflowKCP-110Verwendet zur Befüllung des Durchflussreglers mit Druck.
Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4, CAS: 7783-20-2)Sigma-AldrichA4915Verwendet für experimentelle Medien und Lösungen.
WinkelzangeTDI International7-SAVerwendet zum Befestigen von Schläuchen an mikrofluidischen Reaktoren.
AutoCAD-SoftwareAutodesk --Verwendet zum Entwerfen der Geometrie des mikrofluidischen Reaktors.
AutoklavSteris--Verwendet zur Sterilisation von Materialien und Flüssigkeiten. 
WaageMettler ToledoME2002TVerwendet zum Wiegen von PDMS-Elastomerbasis und Härtungsmittel.
Barbierter Adapter (1/4-28 schwenkbar zu 3/32-Zoll barbiert)ElveflowKFI-06Verwendet zum Verbinden von Polyether-Polyurethan-Schläuchen mit Sammelschiene und Flüssigkeitsreservoir-Gestell.
Biopsie-Stanzer (Rapid-Core, 1,2 mm Durchmesser)Darwin MicrofluidicsPT-T983-12-25Verwendet zum Stanzen von Einlass-/Auslasslöchern in PDMS-Mikrofluidkanalen. 
Bleichen (Chlorox)ULINES-19719Verwendet zur Sterilisation des Durchflusskontrollsystems. Auf 1% in ultrareinem Wasser verdünnen.
Kanüle mit stumpfer Spitze (Jensen Global, 21-Gauge)QSourceJG21-10HPX-J004Verwendet zum Verbinden von Schläuchen mit Spritzen. Durch Autoklavieren für 30 min sterilisiert.
BunsenbrennerHumboldtH-5970Verwendet zur Aufrechterhaltung eines sterilen experimentellen Arbeitsbereichs.
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2·2H2O, Fisher Chemical, CAS: 10035-04-8)Fisher ScientificC79Verwendet für experimentelle Medien und Lösungen.
Casaminosäure (Fisher BioReagents, saure Caseinpepton)Fisher ScientificBP1424Verwendet für experimentelle Medien.
Zelldichtemesser (WPA Biowave CO8000)Avantor490005-906Verwendet zur Messung von OD600 von Bakterienkulturen. 
Klarer Klebeband (Scotch Magic)ULINES-10223Verwendet, um zu verhindern, dass Staub an PDMS-Mikrofluidkanälen haftet.
Cobalt(II)-chlorid-Hexahydrat (CoCl2·6H2O, CAS: 7791-13-1)Sigma-Aldrich255599Verwendet für experimentelle Medien und Lösungen.
Komprimierter StickstoffAirgasNIUHP300Verwendet zum Trocknen von mikrofluidischen Reaktorkomponenten.
Konischer Behälter (Falcon, 15-ml-Volumen, Polypropylen)Fisher Scientific14-959-49BVerwendet für Zulauflösungen und ICP-MS-Proben. Vorsterilisiert.
Konischer Behälter (Falcon, 50-ml-Volumen, Polypropylen)Fisher Scientific14-432-22Verwendet für LB-Vorkultur. Vorsterilisiert.
Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat (CuSO4·5H2O, CAS: 7758-99-8)Sigma-AldrichC8027Verwendet für experimentelle Medien und Lösungen.
SchneidematteULINES-18543Verwendet zum Zerlegen von PDMS-Mikrofluidkanälen und zum Stanzen von Einlass-/Auslasslöchern.
Cuvette (Fisherbrand, 1,5-ml-Volumen, Polystyrol)Fisher Scientific 14-955-127Verwendet zur Messung von OD600 von Bakterienkulturen. 
Digitalkamera (Hamamatsu ORCA-Fusion)Nikon77054115Verwendet für Zeitraffer-Farb-Hellfeld-Bildgebung von mikrofluidischen Experimenten.
Verteilerventil (MUX)ElveflowMUX-D-12Verwendet zum sequentiellen Einspritzen mehrerer Flüssigkeiten.
Elveflow Smart Interface (ESI) SoftwareElveflow --Verwendet zur Steuerung der Durchflussrate/Druckrückmeldung zwischen Durchflussregler und Durchflusssensor und zur Durchführung von Verteilerventil-Umschaltungen.
Erlenmeyerkolben (Fisherbrand, 50-ml-Volumen)Fisher ScientificFB50050Verwendet für mittel-exponentielle Kultur. Durch Autoklavieren für 30 min sterilisiert.
Ethanol (Fisher Chemical, Reagenzalkohol, 90% Reinheit, CAS: 64-17-5)Fisher ScientificA962P-4Verwendet zur Reinigung von PDMS und Deckgläsern für die Reaktorherstellung. Auf 70% in ultrareinem Wasser verdünnt.
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, CAS: 60-00-4)Sigma-AldrichEDSVerwendet für experimentelle Medien und Lösungen.
Flanschloses Verbindungsstück (1/4-28 für 1/16-Zoll-Außendurchmesser-Schlauch)ElveflowKFI-17Verwendet zum Verbinden von Schläuchen mit Elveflow-Hardware-Komponenten. Das Kit enthält Bundhülsen und Gewindemuttern.
Durchflussregler (OB1 MK3+)ElveflowOB1-2000Verwendet zur Bereitstellung von Durchflussrate/Druckrückmeldung für kontrollierte Flüssigkeitseinspritzung.
Durchflusssensor (MFS2)ElveflowMFS-D-2Verwendet zur Aufrechterhaltung eines stabilen Durchflusses für mikrofluidische Experimente unter Verwendung der Druckrückmeldung vom Durchflussregler.
Flüssigkeitsreservoir-Gestell ElveflowKPT-4SVerwendet zur Befüllung von Zulaufflüssigkeiten. Kompatibel mit 15-ml-Falcon-Konikbehältern.
Glaskoverslip (1,42 Zoll x

Referenzen

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