In-vitro-Reifung, Befruchtung und Kultur von Präimplantationsembryonen der Maus

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren für die In-vitro-Reifung von Maus-Oocyten, die In-vitro-Fertilisation und die anschließende Embryokultur bis zum Blastozystenstadium.

Zusammenfassung

Die in-vitro-Reifung der Maus-Oocyten, kombiniert mit In-vitro-Fertilisation und anschließender Embryonalkultur, ermöglicht die Erzeugung von präimplantierten Embryonen unter definierten Bedingungen. Diese Verfahren erleichtern die Untersuchung der biologischen Funktionen und molekularen Mechanismen, die der Eierreifung, Befruchtung und frühen Embryonalentwicklung zugrunde liegen. Die erfolgreiche Anwendung dieses Ansatzes hängt jedoch von sorgfältigem Umgang mit Eizellen und Spermien, geeigneten Kulturbedingungen und einer genauen Einschätzung des Entwicklungsfortschritts in jeder Phase ab. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung unreifer Kumulus-Oocyten-Komplexe (COCs) aus Maus-Eierstöcken, zur In-vitro-Reifung von Oocyten, zur In-vitro-Fertilisation und zur In-vitro-Kultur von Embryonen bis zum Blastozystenstadium. Zu diesen Verfahren gehören die Vorbereitung und Gleichgewichtsanpassung von Medien- und Kulturschalen, die Isolierung und Auswahl von COCs nach der Eierstockdissektion, das Sammeln und Kapazitäten von Spermien, die Durchführung der Insemination unter standardisierten Bedingungen sowie anschließend die Kultivierung von Embryonen zur Entwicklungsbewertung. Der Entwicklungsverlauf wird anhand morphologischer Kriterien bewertet, darunter die Bildung männlicher und weiblicher Pronuklei, die Spaltung in das Zweizellstadium und die Blastozystenbildung. Dieses Protokoll kann in Studien zur Eizellreifung und der Funktion der mütterlichen Faktoren integriert werden und bietet ein wertvolles Werkzeug für die Grundlagenforschung in der reproduktiven Biologie von Säugetieren.

Einleitung

Das Verständnis der Eizellqualität und der Entwicklungskompetenz ist für eine erfolgreiche Befruchtung und die anschließende embryonale Entwicklung^{unerlässlich 1,2}. Die Oocytenreifung erfordert nicht nur eine genaue Chromosomensegregation während der Kernreifung, sondern auch die zytoplasmatische Reifung, einschließlich der Organellenumverteilung und der Ansammlung von mütterlichen mRNAs und Proteinen³. Die frühe embryonale Entwicklung basiert auf mütterlich bereitgestellten mRNAs und Proteinen, und die maternelen Vorräte in der Eierzelle unterstützen die präimplantationelle Entwicklung. Allerdings sind die Identitäten und Funktionen vieler mütterlicher Regulatoren der Säugetierembryogenese noch unvollständig verstanden⁴. Daher sind weitere systematische Studien erforderlich, um die Mechanismen der Eizellreifung, Befruchtung und Embryonalentwicklung zu klären.

Die Maus ist ein weit verbreitetes Modellsystem zur Untersuchung der Entwicklung von präimplantatorischen Embryonen. In-vitro-Reifung (IVM) bezeichnet das Sammeln unreifer Oozyten aus dem Eierstock und deren Reifung unter kontrollierten Laborbedingungen⁵. Anschließend ermöglicht die In-vitro-Fertilisation (IVF), dass reife Ozyten gemeinsam mit kapaziatierten Spermien inkubiert werden, um Zygoten für frühe embryonale Entwicklungsstudien zu bilden. Im Vergleich zur herkömmlichen IVF mit in vivo gereiften Oozyten zeigen IVM-abgeleitete Ozyten jedoch oft niedrigere Reifungs- und Befruchtungsraten sowie eine verminderte Entwicklungskompetenz⁶. Diese Einschränkungen werden größtenteils auf die Asynchronität zwischen Kern- und zytoplasmatischer Reifung unter In-vitro-Kulturbedingungen zurückgeführt. Darüber hinaus ist die Stabilität der meiotischen Spindel in Maus-Oozyten empfindlich gegenüber Veränderungen des pH-Werts und der Temperatur während der IVM, und eine Spindelstörung kann zum Reifungsstopp⁷ beitragen. Folglich bleibt die verringerte Kompetenz der IVM-abgeleiteten Oozyten ein großes Hindernis, das die effiziente Embryonalproduktion für Entwicklungs- und mechanistische Studien einschränkt.

Mauspräimplantationsembryonen können auch durch das Sammeln von in vivo-abgeleiteten Zygoten und deren Kultivierung in vitro (IVC) gewonnen werden. In vivo-abgeleitete Zygoten, die von den Eileitern gesammelt werden, bieten einen relativ synchronisierten Ausgangspunkt für Experimente, die sich auf Post-Fertilization-Ereignisse^{konzentrieren 8}. Allerdings findet die Eierstockreifung und die Anhäufung mütterlicher Faktoren vor der Befruchtung in vivo statt; Daher sind in vivo-abgeleitete Zygoten weniger anfällig für experimentelle Manipulationen von Reifungsbedingungen oder mütterlichen Vorräten, um ihre Auswirkungen auf die nachfolgende Embryonalentwicklung zu bewerten⁴. Daher sind die Optimierung von IVM- und IVF-Protokollen sowie die Einführung standardisierter Arbeitsverfahren mit strenger Qualitätskontrolle (z. B. strenge Temperatur-, pH- und Handhabungspraktiken) unerlässlich, um verfahrensbedingte Variabilität zu minimieren und die Entwicklungskompetenz von Eizellen und Embryonen zu schützen.

Hier beschreiben wir ein IVM–IVF–IVC-Protokoll, das die Medienvorbereitung, die Isolierung und Auswahl der COCs, IVM- und IVF-Verfahren sowie die In-vitro-Embryokultur detailliert beschreibt (Abbildung 1). Das Protokoll beinhaltet praktische, stufenspezifische Kontrollpunkte für die routinemäßige Qualitätskontrolle, einschließlich der Extrudierung des ersten Polarkörpers (PB1), Bildung männlicher und weiblicher Pronuklei (2PN), Zweizellspaltung und Blastozystenbildung. Dieses Protokoll ermöglicht eine reproduzierbare und effiziente Erzeugung von Präimplantationsembryonen unter definierten Bedingungen und unterstützt mechanistische Studien, Kulturoptimierung und nachgelagerte Anwendungen in der Entwicklungs- und Fortpflanzungsbiologie.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Northwest A&F University in China genehmigt (Genehmigungsnummer: 20230503).

1. Tierhaltung

1. Wildtyp-Weibchen C57BL/6 und männliche DBA/2-Mäuse anschaffen und sie unter spezifischen, pathogenfreien Bedingungen (SPF) halten, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei einer Temperatur von 20–22 °C und 55 % ± 10 % Luftfeuchtigkeit. Gib eine Brutnahrung und Wasser ad libitum. Männliche Hausmäuse einzeln (ein Männchen pro Käfig).

2. Vorbereitung der Medien

1. Um eine 50 IU/mL PMSG-Arbeitslösung herzustellen, lösen Sie 5.000 IE Schwangermer-Serumgonadotropin (PMSG) in 100 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf.
   HINWEIS: Aliquot die Lösung in 1 mL Einwegportionen und lagern Sie diese bei –20 °C. Jeden Aliquot unmittelbar vor der Anwendung bei Zimmertemperatur auftauen.
2. Zur Herstellung eines IVM-Kulturmediums fügen Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Zutaten auf 100 mL Medium 199 (M199) Basismedium hinzu. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3–7,4 ein und filtern Sie das Medium dann steril durch einen 0,22-μm-Filter in sterile Medium-Flaschen. Etikettieren Sie die Flasche mit "IVM" mit Initialen, Herstellungsdatum und Verfallsdatum und lagern Sie sie bis zu einem Monat bei 4 °C.
3. Um eine 0,1%ige (w/v) Hyaluronidase-Lösung herzustellen, lösen Sie 10 mg Hyaluronidase in 10 ml M2-Medium auf.
   HINWEIS: Lagern Sie in Einweg-Aliquots von 1 ml bei –20 °C und erwärmen Sie sie auf 37 °C vor der Verwendung.

3. Zubereitung der Speisen (Abbildung 2)

HINWEIS: Passen Sie die Anzahl der IVM-, IVF- und IVC-Tropfen entsprechend der erwarteten Anzahl von COCs und Embryonen an, wobei 20–30 COCs pro 100 μL-Tropfen für IVM und IVF und 20–30 Embryonen pro 100 μL-Tropfen für die Embryokultur verwendet werden.

1. Bereiten Sie eine passende Anzahl von 35 mm großen Ozytenabnahmeschalen vor, von denen jede 2 ml M2-Medium enthält, ergänzt mit 0,2 mM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX). Verwenden Sie eine Schale für Eierstockpunktionen und COC-Entnahme (eine Schale pro zwei Weibchen) und eine weitere zum Waschen der COCs. Erwärmen Sie die Gerichte vor der Verwendung auf 37 °C vor.
2. Bereite IVM-Gerichte vor.
   1. In einer 60-mm-Schale bereiten Sie fünf 100-μL-Tropfen IVM-Medium zum Waschen vor (beschriften Sie die Schüssel als "IVM-Wasch").
   2. In einer separaten 60-mm-Schale bereiten Sie mehrere 100 μL Tropfen IVM-Medium zur Reifung vor (Beschriftung der Schale als "IVM").
   3. Füge vorsichtig genügend Mineralöl hinzu, um die Tropfen zu bedecken, und bringe die Schüssel bei 37 °C in einem 5%igen CO2-Inkubator mindestens 2 Stunden in Gleichgewicht, bevor mit der Eizellentnahme begonnen wird.
3. Bereite IVF-Gerichte vor.
   1. In einer 60-mm-Schale bereiten Sie ein oder zwei 300-μL-Tropfen vorausgeglichen Embryokulturmedium für die Spermienfreisetzung und Kapazität vor (beschriften Sie die Schale als "Spermienkapazität").
      HINWEIS: Der zweite Kapazitationstropfen wird als Reserve für Fälle vorbereitet, in denen die Spermienbeweglichkeit im ersten Tropfen unzureichend ist, eine neue epididymale Spermienprobe entnommen und kapazitiert werden muss oder die Spermienkonzentration vor der Befruchtung angepasst werden muss.
   2. Bereiten Sie zwei separate 60-mm-Schalen vor, die jeweils fünf 100 μL Tropfen vorausgegleichtes Kulturmedium zum Waschen enthalten (beschriften Sie die Schüssel als "IVF-Waschen").
      HINWEIS: Verwenden Sie eine "IVF-Waschschüssel", um IVM-gereifte COCs vor der Befruchtung zu waschen, und verwenden Sie die andere "IVF-Waschschüssel", um nach der Koinkubation vermutete Zygoten zu waschen, um Kumuluszellen und Restspermien zu entfernen.
   3. In einer separaten 60-mm-Schale bereiten Sie mehrere 100-μl-Tropfen vorausgeglichen Embryokulturmedium für die Befruchtung vor (Beschriftung der Schale als "IVF").
      HINWEIS: Ein präausgeglibrtes Embryokulturmedium wird sowohl für die Spermienkapazität als auch für die Insemination verwendet, um während der Spermienvorbereitung und Befruchtung konstante Bedingungen aufrechtzuerhalten.
   4. Fügen Sie vorsichtig ausreichend Mineralöl hinzu, um die Tropfen zu bedecken, und bringen Sie die Schalen mindestens 12 Stunden lang bei 37 °C in einem 5%igen CO2-Inkubator in Gleichgewicht, bevor Sie mit der Spermienkapazität beginnen.
4. Bereite IVC-Gerichte vor.
   1. In einer 60-mm-Schale bereiten Sie fünf 100-μL-Tropfen vorausgegleichtes Embryokulturmedium zum Waschen der Embryonen vor (etikettieren Sie die Schale als "IVC-Wasch").
   2. In einer separaten 60-mm-Schale bereiten Sie mehrere 100-μL-Tropfen vorausgeglichen Embryokulturmedium für die Embryokultur vor (etikettieren Sie die Schale als "IVC").
   3. Füge vorsichtig ausreichend Mineralöl hinzu, um die Tropfen zu bedecken, und bringe die Schüssel mindestens 12 Stunden vor Beginn der Embryokultur bei 37 °C in einen 5%igen CO2-Inkubator aus.

4. Eierstocksammlung

1. Verabreichen Sie 10 IU PMSG intraperitoneal an 8–10 Wochen alte weibliche C57BL/6 Mäuse.
2. Nach 48 Stunden nach der PMSG-Injektion wird die Maus durch eine zervikale Ausrenkung eingeschläfert und auf Rücke gelegt. Besprühen Sie den Bauch mit 70 % Ethanol, um das Fell zu benetzen und zu verhindern, dass es in die Bauchhöhle eindringt.
3. Machen Sie mit einer feinen Sezierschere einen kleinen Schnitt in der unteren Bauchhaut und öffnen Sie die Haut vorsichtig mit behandschuhten Händen, um die Peritonealmembran freizulegen.
4. Öffnen Sie die Peritonealmembran und schieben Sie den Darm vorsichtig zur Seite. Lokalisieren Sie das Gebärmutterhorn und folgen Sie ihm zum Eierstock. Identifizieren Sie den Eierstock in der Nähe der Niere, der typischerweise von einem Fettkissen umgeben ist.
5. Verwenden Sie feine Sezierscheren, um den Eierstock vom Gebärmutterhorn zu trennen und überschüssiges Bindegewebe sowie Fett zu entfernen.
6. Trage die Eierstöcke sofort in vorgewärmtes M2-Medium um, das mit IBMX ergänzt wird. Wiederholen Sie das Verfahren, um den kontralateralen Eierstock zu sammeln und in dieselbe Schale zu transferieren.
7. Stellen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop und beginnen Sie mit der Follikelpunktion und der Entnahme der COCs.

5. COCs Sammlung und Kultur

1. Unter einem Stereomikroskop werden sichtbare Gehweisfollikel vorsichtig mit einer sterilen Spritzennadel durchstechen, um COCs im M2-Medium freizusetzen.
   HINWEIS: Beim Sammeln von Maus-GV-Ozyten sollte bevorzugt sichtbar große antrale Follikel auf der Eierstockoberfläche durchstechen werden, die typischerweise wölbend und halbdurchsichtig mit einer klaren Geweihhöhle erscheinen.
2. Mit einer fein gezogenen Glas-Pasteur-Pipette sammeln Sie die freigesetzten COCs und geben sie in eine saubere 35-mm-Schale mit vorgewärmtem M2-Medium und IBMX um.
3. Waschen Sie die COCs bei Bedarf durch serielle Übertragung auf einen sauberen Bereich der 35-mm-Schüssel, um abgetrennte Granulosenzellen und Gewebereste zu entfernen, wobei bei jedem Transfer Rückstände zurückbleiben (Abbildung 3).
   HINWEIS: Verwenden Sie nur COCs mit drei oder mehr kompakten Kumuluszellschichten und gleichmäßig granuliertem Zytoplasma ohne freie Räume für die folgenden Schritte ^9,10. Entleerte GV-Ozyten und teilweise kumulus-umschlossene GV-Ozyten sind von diesem Protokoll ausgeschlossen. Unter unseren experimentellen Bedingungen wurden durchschnittlich 26 unreife COCs pro weiblicher Maus erhalten.
4. Nach der Räumungsentfernung werden die COCs in die IVM-Waschschüssel übertragen und durch sequentielle Übergabe durch fünf 100-μL-Tropfen IVM-Waschmedium gewaschen.
   HINWEIS: Während der Übertragungen sollten Sie das Übertragungsvolumen minimieren, um Kreuzkontaminationen zwischen den Tropfen zu vermeiden.
5. Die gewaschenen COCs werden in 100 μL Tropfen IVM-Medium (20–30 COCs pro Tropfen) übertragen und bei 37 °C in 5 %_CO2 für 14 Stunden kultiviert.
   HINWEIS: Sammeln, waschen und übertragen Sie COCs mit minimaler Verzögerung auf das IVM-Medium, um das Entwicklungspotenzial zu erhalten.
6. (Optional) Nach der IVM inkubieren Sie die COCs kurz in 1 mg/mL Hyaluronidase und pipieren Sie sie sanft wiederholt mit einer Mikropipette, bis die Kumuluszellen vollständig entfernt sind.
   HINWEIS: Begrenzen Sie die Hyaluronidase-Exposition auf maximal 3 Minuten, da längere Exposition die Eizellen schädigen kann.
7. (Optional) Waschen Sie die entblößten Eizellen in frischem M2-Medium auf einer erhitzten Stufe und prüfen Sie anschließend die Reifung der Eizellen unter einem Stereomikroskop.
8. (Optional) Ozyten mit extrudiertem ersten polaren Körper gelten als ausgereift und im Metaphase-II-(MII)-Stadium. Berechnen Sie die Reifungsrate als Anzahl der Eizellen mit einem extrudierten ersten polaren Körper geteilt durch die Gesamtzahl der kultivierten Ozyten.
   HINWEIS: Die Schritte 5.6–5.8 werden verwendet, um die Eizellreifung nach IVM zu beurteilen, indem eine bestimmte Bewertungskohorte vor der PB1-Bewertung entnommen wird. Diese Schritte sind für COCs, die direkt zur IVF übergehen, nicht erforderlich.

6. Spermienentnahme und -vorbereitung

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt die Sammlung und Kapazität von frischem Spermien. Vor der Befruchtung sollten frisch freigesetzte Spermien in einem vorausgeglichen Embryokulturmedium bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert werden, um die Kapazität zu ermöglichen.

1. Euthanasiere ein ausgewachsenes männliches DBA/2-Maus (10–16 Wochen alt) und entferne seine Cauda Epididymide, wobei möglichst viel Fett, Blut und Gewebeflüssigkeit vermiedes wird (Abbildung 4).
2. Für jedes Männchen werden beide Cauda-Epididymide in einen 300-μL-Tropfen vorausgegleichtes G-IVF-Medium übertragen, um die Spermienfreisetzung und Kapazität zu ermöglichen.
3. Immobilisieren Sie die Epididymis Cauda mit einer Pinzette, machen Sie fünf bis sieben Schnitte mit einer sterilen Spritznadel und drücken Sie das Gewebe vorsichtig zusammen, um konzentrierte Spermien freizusetzen.
   HINWEIS: Untersuchen Sie die Spermienbeweglichkeit und fahren Sie nur dann fort, wenn die Mehrheit der Spermien progressive Motilität (PR) zeigt, definiert als aktive Vorwärtsbewegung, und nicht als nicht-progressive Motilität (NP) oder Immotilität¹¹.
4. Inkubieren Sie die Schale bei 37 °C in 5 % CO₂ für 1 Stunde, um die Spermienkapazität zu ermöglichen.

7. In-vitro-Fertilisation

1. Nach 14 Stunden IVM werden die COCs durch sequentielle Übertragung durch fünf 100 μL Tropfen IVF-Waschmedium gewaschen und anschließend die gewaschenen COCs in die IVF-Inseminationstropfen übertragen (20–30 COCs pro 100 μL Tropfen).
2. Vorinkubieren Sie die Befruchtungsschale mit COCs bei 37 °C in 5 %_CO2 für 30 Minuten vor der Befruchtung.
3. Nach der Kapazität wird die Spermienkonzentration mit einem Hämozytometer bestimmt.
4. Basierend auf der Spermienkonzentration wird das erforderliche Inokulumvolumen berechnet und zu jedem IVF-Tropfen kapazitierte Spermien hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 4 × 10⁵ –1 × 10⁶ Spermien/ml zu erreichen.
   HINWEIS: Nach der Spermienzugabe wird bestätigt, dass in jedem Inseminationstropfen bewegliche Spermien vorhanden sind.
5. Inkubieren Sie die IVF-Schalen mit COCs und Spermien bei 37 °C in einem 5%igen CO₂-Inkubator für 4–6 Stunden.

8. Embryokultur

1. Nach 4–6 Stunden Inkubation verwenden Sie eine fein gezogene Glas-Pasteur-Pipette mit einem Innendurchmesser, der etwas größer als die Eizelle ist, um mutmaßliche Zygoten in minimalem Volumen zu aspirieren und in die IVF-Waschtropfen zu übertragen.
2. Waschen Sie die vermuteten Zygoten durch eine sequentielle Übertragung durch fünf IVF-Waschtropfen, wobei Sie in jedem Tropfen vorsichtig pipettieren, um überschüssige Spermien und Ablagerungen zu entfernen (Abbildung 5).
3. Übertragen Sie die gewaschenen presumptiven Zygoten in die IVC-Waschschüssel und spülen Sie sie nacheinander durch fünf vorgewärmte Embryokultur-Mittel-Waschtropfen, wodurch das Übertragen des IVF-Mediums minimiert wird.
4. Platzieren Sie die vermuteten Zygoten in Embryonal-Mittel-Kulturtropfen und kultivieren Sie bei 37 °C in 5 % CO₂ (20–30 Embryonen pro 100 μL Tropfen).
5. 6–8 Stunden nach der Befruchtung wird die Befruchtung unter einem Stereomikroskop beurteilt, indem man das Vorhandensein männlicher und weiblicher Pronuklei bewertet und Oocyten ausscheidet, die nur einen polaren Körper behalten und keine sichtbaren Pronuklei zeigen.
6. Bei 24 Stunden nach der Befruchtung wird die Anzahl der Zweizell-Embryonen gezählt und die Zwei-Zell-Rate berechnet als (Zweizell-Embryonen / befruchtete Eizellen).
7. Nach dem Zählen werden die ungespaltenen Embryonen entfernt und entsorgt und die übrigen gespaltenen Embryonen weiter kultiviert.
   HINWEIS: In diesem Stadium können Embryonen vitrifiziert, an Empfängerweibchen übertragen oder bis zum Blastozystenstadium in Kultur gehalten werden.
8. Die Embryonen werden weiterhin unter denselben Brutbedingungen bis 96 Stunden nach der Befruchtung (hpi) kultiviert. Beurteile die Blastozystenbildung bei 96 hpi anhand morphologischer Kriterien.
   HINWEIS: Während dieses Zeitraums ist kein weiterer Mediumwechsel erforderlich. Eine normale Blastozyst wird durch das Vorhandensein einer sichtbaren Blastocoel-Höhle, einer deutlichen inneren Zellmasse und einer intakten Trophektodermschicht erkannt.

Ergebnisse

Mit diesem Protokoll wurden die Maus-COCs sequentiell durch die In-vitro-Reifung , die In-vitro-Fertilisation und die anschließende In-vitro-Embryokultur verarbeitet, was zu einer reproduzierbaren Erzeugung von Präimplantationsembryonen und der Entwicklung bis zum Blastozystenstadium unter den beschriebenen Bedingungen führte. Nach 14 Stunden IVM zeigten die COCs typischerweise Cumulusexpansion und intakte Oocytenmorphologie. Die meiotische Reifung der Eizellen...

Diskussion

Dieses Protokoll bietet ein standardisiertes Verfahren für die in-vitro-Reifung der Maus-Oozyten, die In-vitro-Fertilisation und die In-vitro-Kultur unter Verwendung unreifer COCs, wodurch eine reproduzierbare Erzeugung und Bewertung von Präimplantationsembryonen im Blastozystenstadium unter definierten in vitro-Bedingungen möglich ist. In vielen Studien sind IVM-Ergebnisse empfindlich gegenüber laborspezifischen Unterschieden in Medien, Inkubationszei...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
35 mm Petrischale	Thermo Fisher Scientific	150255
60 mm Petrischale	Thermo Fisher Scientific	150270
Bovines Serumalbumin	Sigma-Aldrich	A8806
Zuchtdiät (Rodent Breeder Chow)	Keao Xieli (Beijing,China)	N/A
CO2-Inkubator	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Einweg-Pasteur-Pipette	Kimble	DWK63A53WT-1000EA
Epidermales Wachstumsfaktor	Gibco	PHG0313
Feinschneidezangen	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
Feinnadelzange	Rhino	SW14
Follikel-stimulierendes Hormon	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	(voräquilibriertes) Embryonenkulturmedium
Hämazytometer	Millicell	MDH-4N1
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthin)	Selleck	S5836
KnockOut Serumersatz	Gibco	A3181501
L-Cystein	Sigma-Aldrich	C7352
Luteinisierendes Hormon	Millipore	869003
M2-Medium	Sigma-Aldrich	M7167
Medium 199	Gibco	11150-059
Mikropipette	Gilson	F167350
Mineralöl	Sigma-Aldrich	M8410
Phosphatpufferlösung	Gibco	20012027
Pregnantes Mare Serum Gonadotropin	Ningbo Second hormone factory (Ningbo, China)	N/A
Natriumpyruvat	Sigma-Aldrich	P4562
Stereomikroskop	Olympus	SZX10
Sterile Mediumflaschen	Nalgene	46600-586
Steriler Spritzennadel	BD Biosciences	309623	1 mL, 27G1/2
Spritzenfiltereinheit	Millipore	SLGP033R
Thermoplatte	Tokai Hit	TPi-SZX2X