Identifikation von AChE-gezielten antizerebralen Parese aus Coptis chinensis mittels Affinitätsultrafiltration und experimenteller Validierung

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie war es, die wichtigsten aktiven Komponenten von Coptis chinensis zu identifizieren und deren Wirkung bei der Intervention der Zerebralparese (CP) mittels Affinitätsultrafiltration und experimenteller Verifikation zu klären.

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie war es, die wichtigsten aktiven Komponenten von Coptis chinensis zu identifizieren und deren Wirkmechanismen bei der Intervention bei Zerebralparese (CP) mittels Affinitätsultrafiltration zu erläutern. Mit Acetylcholinesterase (AChE) als Ziel wurde Koptisin aus dem Extrakt von C. chinensis als Komponente mit der stärksten Bindungskapazität herausgefiltert, die eine Bindungsrate von 21,9 % und eine signifikante in-vitro-hemmende Aktivität (IC₅₀ = 3,24 μg/mL) aufwies. Molekulare Andockungen und Molekulardynamik-Simulationen zeigten, dass Koptisin stabil an die aktive Tasche von AChE binden kann. Anschließend wurden Verifikationsexperimente an einem neonatalen Rattenmodell von hypoxisch-ischämischer Hirnschädigung (HIBD) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Intervention mit Coptisin (10 mg/kg) die räumlichen Lern- und Gedächtnisdefizite bei den Modelltieren signifikant verbesserte, den zerebralen Blutfluss in der verletzten Hemisphäre erhöhte, pathologische Schäden am Gehirngewebe linderte und die abnormale Aktivierung von AChE im Gehirn hemmte. Zusammenfassend kombinierte diese Studie die Affinitätsultrafiltrationstechnologie und bestätigte, dass Koptisin, identifiziert aus C. chinensis-Extrakt, AChE hemmen und neuroprotektive Effekte sowie eine Verbesserung des Gehirnblutflusses ausüben kann. Es dient als entscheidende materielle Grundlage für C. chinensis , um CP-ähnliche neurologische Defizite zu mildern und so Kandidatenmoleküle und wissenschaftliche Belege für die Entwicklung verwandter Medikamente zu liefern.

Einleitung

Zerebralparese (CP) ist ein dauerhaftes Syndrom, das durch nicht-fortschreitende Schäden am sich entwickelnden Gehirn von Föten oder Säuglingen verursacht wird und hauptsächlich durch motorische Funktionsstörungen und Haltungsanomalien gekennzeichnet ist. Obwohl derzeit mehrere klinische Behandlungsansätze für CP verfügbar sind, fehlt es weiterhin an idealen Medikamenten, die neurologische Defizite mit minimalen Nebenwirkungen grundlegend beheben können. Im Gegensatz zu chemisch synthetisierten Medikamenten, die meist auf einzelne Ziele wirken und relativ hohe potenzielle Toxizität aufweisen, liefern traditionelle chinesische Medikamente (TCMs) mit ihren Vorteilen der Multikomponenten-, Multi-Ziel- und ganzheitlichen Regulation sowie den günstigen Sicherheitsprofilen, die in der langfristigen klinischen Praxis nachgewiesen wurden, neue Erkenntnisse und ein Reservoir an Wirkstoffkandidaten zur Behandlung komplexer Hirnerkrankungen^1, 2,3,4,5,6. Daher hat die Untersuchung hochwirksamer und toxizarmer chemischer Komponenten aus TCMs eine bedeutende wissenschaftliche Bedeutung und klinischen Wert⁷.

Unter den komplexen pathologischen Mechanismen der Zerebralparese spielt die Dysfunktion des cholinergen Nervensystems eine zentrale Rolle ^8,9. Acetylcholinesterase (AChE) ist ein Schlüsselenzym, das den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) hydrolysiert. Eine übermäßig hohe Aktivität dieses Enzyms führt zu ACh-Depletion, beeinträchtigt die cholinerge Signalübertragung und verschlimmert folglich die motorische Kontrolle und kognitiven Dysfunktionen. Daher hat sich AChE als wichtiges und gut etabliertes Medikamentenziel für die Entwicklung neuroprotektikulenter Substanzen etabliert. Die Hemmung der AChE-Aktivität zur Erhöhung des ACh-Spiegels in der synaptischen Spalte wird als eine der wirksamen Strategien zur Linderung von CP-bedingten neurologischen Defiziten anerkannt. Im Zusammenhang mit hypoxisch-ischämischer Hirnverletzung kann die Störung der cholinergen Neurotransmission die neuronale Dysfunktion weiter verschlimmern und somit zu motorischen und kognitiven Beeinträchtigungen beitragen, die für CP relevant sind. Daher wurde AChE in dieser Studie nicht nur als klassisches neurofunktionales Ziel, sondern auch als mechanistisch relevanter Einstiegspunkt für die Screening bioaktiver Verbindungen mit potenziellen Anti-CP-Effekten ausgewählt.

Moderne Forschungen haben gezeigt, dass Heilpflanzen ein breites Spektrum pharmakologischer Aktivitätswerte aufweisen. Als klassische traditionelle chinesische Medizin zur Entfernung von Hitze und zur Trocknung von Feuchtigkeit bildet Coptis chinensis ein komplexes System, das reichlich an verschiedenen Isoquinolinalkaloiden enthalten ist. Neben dem bekannten Berberin enthält es auch eine Reihe von Bestandteilen mit ähnlichen Strukturen und vielfältigen pharmakologischen Aktivitäten, wie Koptisin, Epiberberin, Palmatin und Jatrorrhizin¹⁰. Diese Alkaloide bilden zusammen die materielle Grundlage für die pharmakologischen Effekte von C. chinensis. Frühere Studien haben gezeigt, dass C. chinensis und seine Alkaloide entzündungshemmende, antioxidative und potenziell neuroprotektive Eigenschaften besitzen. Angesichts eines so komplexen Komponentensystems sind traditionelle Forschungsmethoden jedoch schwierig, die wichtigsten aktiven Komponenten schnell und genau zu identifizieren, die direkt auf AChE abzielen, was die tiefgehende Aufklärung der Mechanismen der Auswirkungen von C. chinensis auf Hirnverletzung¹¹ stark einschränkt.

Im Vergleich zur konventionellen aktivitätsgesteuerten Isolierung, die üblicherweise wiederholte Fraktionierung, Bioaktivitätstests und Reinigung erfordert und zum Verlust oder Vernachlässigung von Verbindungen mit geringer Häufigkeit, aber hoher Affinität führen kann, ermöglicht die Affinitätsultrafiltration eine schnelle Screening von zielbindenden Liganden direkt aus komplexen Mischungen. Diese Technik ermöglicht ein effizientes und schnelles "Angeln" von aktiven Liganden, die an bestimmte Ziele binden (z. B. AChE), direkt aus den mehrkomponentigen Rohölextrakten von TCMs. Es eignet sich besonders für Systeme mit mehreren Alkaloidkomponenten, wie C. chinensis, da es die genaue Identifikation wirksamer Komponenten ermöglicht, die direkt mit dem Ziel aus der komplexen^{Mischung 12} interagieren. In Kombination mit computergestützten Ansätzen wie molekularem Andocken und molekularer Dynamik-Simulationen kann es intuitiv den Bindungsmodus, die Interaktionsarten und die komplexe Stabilität zwischen Komponenten und Zielproteinen auf atomarer Ebene vorhersagen und so robuste theoretische Belege und mechanistische Erklärungen für die Ergebnisse des experimentellen Screenings¹³ liefern.

Basierend auf dem obigen Hintergrund schlägt diese Studie folgende wissenschaftliche Hypothese auf: Unter den verschiedenen Alkaloiden in C. chinensis gibt es aktive Komponenten, die AChE speziell hemmen können, und diese Komponenten bilden die materielle Grundlage für ihre potenziellen anti-zerebralen Parese-Effekte. Um diese Hypothese zu verifizieren, integrierten wir moderne Screening-Techniken mit pharmakologischen Validierungsmethoden: Zunächst wurde unter Verwendung von AChE als Ziel die Affinitätsultrafiltrationstechnologie eingesetzt, um potenzielle Inhibitoren aus dem Multialkaloid-Extrakt von C. chinensis schnell zu screenen; Darüber hinaus wurden molekulare Andock- und Molekulardynamiksimulationen eingesetzt, um den Bindungsmechanismus auf atomarer Ebene zu klären; schließlich wurden in vivo Tierversuche durchgeführt, um die verbesserten Auswirkungen der untersuchten Komponenten auf das Verhalten, die Hirngewebepathologie und die AChE-Aktivität von Ratten mit CP zu überprüfen.

Protokoll

Alle Tierschutz- und experimentellen Verfahren wurden vom Ethikkomitee für Labortierschutz des First People's Hospital of Zunyi genehmigt (Ethics Nr. 2025-2-362). Während der Modellierungs- und Behandlungsphase wurden täglich der Zustand und das Überleben des Tierkörpers erfasst.

Herstellung von C. chinensis-Extrakt
In dieser Studie wurde ein beschleunigter Lösungsmittelextraktor zur beschleunigten Gewinnung der n-Butanol-Fraktion aus medizinischen Materialien von C. chinensis verwendet. Insgesamt wurde 1 g getrocknetes Pulver von C. chinensis genau gewogen und in 40-ml-Extraktionszellen gegeben. Metalldichtungen und Glasfaserfiltermembranen wurden nacheinander über und unter der Extraktionszelle angebracht, um die Probe zu filtern, und die Probe wurde mit Quarzsand umwickelt. Während des Extraktionsprozesses wurden Temperatur und Druck auf 90 °C bzw. 100 bar eingestellt. Der beschleunigte Extrakt wurde gesammelt, und das Extraktionslösungsmittel wurde mit einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit verdampft, um getrocknete Extrakte verschiedener polarer Fraktionen zu erhalten. Methanol: Wasser (50:50, v/v) wurde als Rekonstituierungslösungsmittel ausgewählt. Der Extrakt wurde durch eine 0,45 μm mikroporöse Membran gefiltert und bei 4 °C gelagert. Vor der Probendetektion wurde die inhibitorische Aktivität des Blank-Rekonstituierungslösungsmittels auf AChE untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass seine hemmende Wirkung vernachlässigbar war, was darauf hindeutete, dass die Auswahl des Rekonstitutionslösungsmittels in diesem Experiment die experimentellen Ergebnisse nicht beeinflussen würde.

Acetylcholinesterase-Hemmungstest
Das Experiment wurde in einer 96-Well-Platte durchgeführt. Zuerst wurde PBS hinzugefügt, gefolgt von AChE (0,1 U/mL) und C. chinensis-Proben nacheinander. Nach der Inkubation bei 37 °C für 10 Minuten wurden 5,5′-Dithiobis (2-Nitrobenzoesäure) (DTNB) chromogene Lösung (2,5 mmol/mL) und ATChI-Substrat (10 mmol/mL) hinzugefügt. Die Mischung wurde weitere 10 Minuten bei 37 °C inkubiert, und die Reaktion wurde durch Zugabe von 60 μL 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) beendet. Die Absorption wurde mit 405 nm gemessen. Jede C. chinensis-Probe wurde in 4 Gruppen aufgeteilt: Kontrollgruppe a: PBS (120 μL), AChE-Lösung (20 μL), DTNB-Lösung (40 μL), ATChI-Lösung (40 μL) und SDS-Lösung (60 μL) wurden nacheinander hinzugefügt; Blanke Kontrollgruppe b: PBS (120 μL), DTNB-Lösung (40 μL), ATChI-Lösung (40 μL) und SDS-Lösung (80 μL); Probengruppe c: PBS (80 μL), C. chinensis-Extrakt (20 μL), AChE-Lösung (20 μL), DTNB-Lösung (40 μL), ATChI-Lösung (40 μL) und SDS-Lösung (60 μL); Beispiel-Leergruppe d: PBS (100 μL), C. chinensis-Extrakt (20 μL), DTNB-Lösung (40 μL), ATChI-Lösung (40 μL) und SDS-Lösung (60 μL). Huperzine A wurde als positive Kontrolle mit einer Anfangskonzentration von etwa 2,5 mg/mL verwendet. Die Anfangskonzentration des N-Butanol-Fraktionsextrakts lag bei etwa 1 mg/mL. Sowohl Huperzine A als auch die Proben wurden mit einem 60%igen Gradienten verdünnt. Die Hemmungsrate wurde mit folgender Formel berechnet: Hemmungsrate (%) = [1 - (c - d)/(a - b)] × 100 %, wobei a, b, c und d die Absorptionswerte der Kontrollgruppe a, der leeren Kontrollgruppe b, der Stichprobengruppe c und der leeren Gruppe d darstellen.

Die Hemmungsrate bei jeder getesteten Konzentration wurde mit der oben beschriebenen Formel berechnet. Konzentrations-Hemmungskurven wurden dann konstruiert, indem die Hemmungsrate gegen den Logarithmus der Verbindungskonzentration dargestellt wurde. IC20-, IC50- und IC80-Werte wurden mittels nichtlinearer Regressionsanpassung mit der GraphPad Prism-Software auf Basis der angepassten Konzentrations-Antwort-Kurven berechnet und definiert als die Konzentrationen, die erforderlich sind, um die AChE-Aktivität jeweils 20 %, 50 % und 80 % zu hemmen.

Affinitätsultrafiltrationstest
Affinitätsultrafiltration wurde durchgeführt, um AChE-bindende Verbindungen aus dem C. chinensis-Extrakt zu screenen. Kurz gesagt wurde AChE-Lösung (0,1 U/mL in PBS, pH 7,4) als aktives Enzym verwendet. Die inaktivierte Enzymkontrolle wurde hergestellt, indem dieselbe AChE-Lösung 10 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad erhitzt wurde. Für jede Reaktion wurden 200 μL C. chinensis-Extraktlösung mit 200 μL aktiver oder inaktivierter AChE-Lösung gemischt und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Gemisch in ein 30 kDa starkes Ultrafiltrationszentrifugenrohr umgeleitet und bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Der zurückgehaltene Enzym-Liganden-Komplex wurde dreimal mit 200 μL PBS unter denselben Zentrifugationsbedingungen gewaschen, um ungebundene Komponenten zu entfernen. Anschließend wurden 200 μL 90 % Methanol hinzugefügt, um die an AChE gebundenen Liganden zu dissoziieren und zu elutieren, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation und einer Zentrifugation bei 12.000 × g für 10 Minuten. Das Eluat wurde gesammelt, gefiltert und mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Verbindungen, die in der aktiven Enzymgruppe relativ zur inaktivierten Enzymkontrolle angereichert wurden, wurden als potenzielle AChE-bindende Komponenten¹⁴ betrachtet.

HPLC-Analyse der wichtigsten Alkaloidmetaboliten
Die chromatographische Analyse wurde mit einem HPLC-System durchgeführt, das mit einer quartären Pumpe, einem Autosampler, einem Säulenofen und einem ultraviolett-sichtbaren (UV-Vis) Detektor ausgestattet war. Die Trennung erfolgte auf einer C18-chromatographischen Säule (250 × 4,6 mm, 5 μm), die bei 25 °C gehalten wurde. Die mobile Phase bestand aus Acetonitril (A) und 30 mmol/L Ammoniumbicarbonat-Lösung mit 0,7 % Ammoniak und 0,25 % Triethylamin (B), abgegeben, mit einer Durchflussrate von 1,0 mL/min. Das Gradient-Elutionsprogramm war wie folgt: 0–15 Min, 90%–75% B; 15–25 Min, 75%–70% B; 25–50 Min, 70%–55% B. Das Einspritzvolumen betrug 5 μL, und die UV-Detektion erfolgte bei 270 nm.

Zur quantitativen Analyse der wichtigsten Alkaloide in C. chinensis wurde jede Probe (0,02 g) genau gewogen und mit 10 ml Salzsäure-Methanol-Lösung (1:100, v/v) für 30 Minuten ultraschallweise extrahiert. Nach der Filtration wurde der Gewichtsverlust mit demselben Extraktionslösungsmittel auf das ursprüngliche Gewicht ausgeglichen, und die wurde vor der HPLC-Analyse durch eine 0,45-μm-Membran gefiltert. Acht authentische Referenzstandards, darunter Magnoflorin, Glauzin, Jatrorrhizin, Columbamin, Epiberberin, Koptisin, Palmatin und Berberin, wurden unter denselben chromatografischen Bedingungen analysiert. Für diese Analyten wurden Kalibrierungskurven mittels Referenzlösungen konstruiert. Da sich die Häufigkeitsniveaus und Detektorantworten der acht Alkaloide erheblich unterschieden, wurde der Kalibrierungsbereich für jeden Analyten individuell auf Basis von Literaturberichten und vorläufigen Experimenten optimiert, anstatt auf alle Verbindungen ein identisches Faltungsverdünnungsschema anzuwenden. Daher wurde nicht erwartet, dass die hohen zu niedrigen Konzentrationsverhältnisse der linearen Bereiche bei den acht Analyten identisch sind. Die Detektionsgrenzen (LOD) und Quantifizierungsgrenzen (LOQ) wurden bei Signal-Rausch-Verhältnissen von etwa 3 bzw. 10 geschätzt.

Zur Analyse der Affinitäts-Ultrafiltrations-Eluate wurden die nach der Ultrafiltration von AChE dissoziierten Liganden aus wiederholten Experimenten gesammelt und vor der HPLC-Analyse konzentriert, um eine ausreichende Signalintensität für die Detektion sicherzustellen. Die konzentrierten Eluate wurden anschließend unter denselben HPLC-Bedingungen wie oben beschrieben analysiert. Die chromatographischen Spitzen in den Eluaten wurden durch gezielten Vergleich mit den acht authentischen Referenzstandards und mit dem chromatografischen Profil des unter identischen analytischen Bedingungen gewonnenen C. chinensis-Extrakts bestimmt. Daher war die vorliegende Analyse nicht für die de novo strukturelle Aufklärung unbekannter Verbindungen gedacht, sondern für gezielte Bestimmung der Frage, ob die bekannten Hauptalkaloide in C. chinensis im aktiven Enzym-Eluat im Vergleich zur inaktivierten Enzymkontrolle angereichert sind.

Molekular-Andockungstest
In der vorliegenden Studie konzentrierte sich die Docking-Analyse auf Coptisin, da es durch Affinitätsultrafiltration als bestbewerteter AChE-bindender Bestandteil identifiziert wurde und zudem die stärkste in-vitro-inhibitorische Aktivität unter den Hauptalkaloiden zeigte. Proteinkristalle wurden aus der Protein Data Bank (PDB) entnommen. Proteinkristalle mit kokristallisierten Liganden wurden als letzte Andockrezeptoren ausgewählt, und alle Zielproteinkristalle stammten vom Menschen. Die Rezeptordatei wurde mit der PyMOL-Software geöffnet, und die Rezeptor- sowie Ligandendateien wurden getrennt und gespeichert; der Rezeptor wurde mit MGLTools-Software eröffnet, gefolgt von der Entfernung von Wassermolekülen, dem Hinzufügen von Wasserstoffatomen und -ladungen, dem Zusammenführen unpolarer Wasserstoffatome, der Berechnung lokaler Atomladungen usw. und anschließend im PDBQT-Format gespeichert; Die Ligandendatei wurde mit MGLTools-Software geöffnet, Wasserstoffatome und -ladungen hinzugefügt und als PDBQT-Formatdatei gespeichert; Die Gitterbox wurde geöffnet, der Abstand wurde auf 1,000 gesetzt, die Anzahl der Gitterpunkte wurde festgelegt, die zentralen Punktkoordinaten der Box entsprechend dem kokristallisierten Liganden ausgewählt und als GPF-Datei^15,16 gespeichert.

Chemische Bauteilstrukturen wurden zunächst aus der SciFinder-Datenbank gesammelt und im cdx-Format gespeichert; jede dreidimensionale molekulare Struktur wurde mit dem ChemBio3D Ultra-Modul dargestellt, die Energieoptimierung erfolgte mit dem MM2-Kraftfeld, wurde im mol2-Format gespeichert und Ladungsparameter entfernt. Mit AutoDock wurde die mol2-Formatdatei mit MGLTools-Software geöffnet, Wasserstoffatome und -ladungen wurden dem Liganden hinzugefügt, rotierbare chemische Bindungen beobachtet und als pdbqt-Format-Datei gespeichert. Das AutoDock Vina-Modell (Version 1.2.5) wurde zur Durchführung der molekularen Andockungsbewertung eingesetzt.

Molekulardynamik-Simulationstest
Die Software Gaussian 16 und GaussView 6 wurden zur Optimierung der Ligandenstruktur verwendet. Nach dem Import der mol2-Datei der Ligandenstruktur in GaussView 6 wurde der Aufgabentyp auf Optimierung gesetzt, der Zustand des Zielmoleküls als Grundzustand ausgewählt, die Berechnungsmethode war Dichtefunktionaltheorie (DFT), die Spinmultiplizität wurde standardmäßig auf Standardspin gesetzt, das verwendete Funktional war B3LYP, das Lösungsmittelmodell war IEFPCM, und das Lösungsmittel war Wasser. Nach Abschluss der Molekularstrukturoptimierung wurde Gaussian 16 verwendet, um die erzeugte CHK-Datei in eine fch-Datei umzuwandeln, die dann in die Multiwfn-Software importiert wurde, um die RESP-Ladung des Liganden zu berechnen.

Nach der Berechnung der RESP-Ladung wurde die erzeugte CHG-Datei in die Software sobtop_1.0 (dev5) importiert, um die für die Molekulardynamik-Simulation benötigte Ligandentopologiedatei zu erzeugen. Die Molekulardynamik-Simulation wurde mit der Software GROMACS 2019.6 mit dem AMBER99 Kraftfeld durchgeführt. Die Strukturdateien des Proteinmoleküls und des kleinen Moleküls wurden in die Software importiert, eine triklinische Box mit periodischer Grenze von 1,0 nm wurde eingerichtet, und das TIP3P-Wassermodell wurde zum Auffüllen verwendet. Die Particle Mesh Ewald (PME)-Methode wurde verwendet, um langstreckige elektrostatische Wechselwirkungen zu berechnen, und der gmx-Geion-Befehl wurde verwendet, um eine angemessene Anzahl von Natriumionen und Chloridionen einzuführen, um die Ladung des gesamten Systems zu neutralisieren. Die Simulation wurde bei einer konstanten Temperatur von 298 K und einem Standardatmosphärendruck von 100 kPa durchgeführt. Zur Energieminimierung wurde die steilste Abstiegsmethode (steilste) eingesetzt. Die Befehle gmx grompp und gmx mdrun wurden verwendet, um 10.000 Schritte des NVT (isotherm-isochorischen Ensembles) Gleichgewichts und NPT (isomisch-isobares Ensemble) auszuführen, wobei die Temperaturkopplungskonstante bzw. Druckkopplungskonstante auf 0,1 ps bzw. 0,5 ps gesetzt wurden, und die Dauer der Gleichgewichtssimulation betrug 100 ps. Nachdem das System das Gleichgewicht erreicht hatte, wurde der Zeitabschnitt auf 2 fs gesetzt und eine 10-ns-molekulardynamische Simulation auf dem Komplex durchgeführt, wobei Trajektoriendaten alle 2 ps gespeichert wurden. Der 10-ns-Produktionslauf wurde als explorative Simulationslänge ausgewählt, um eine dynamische, kurzfristige Bewertung des angedockten Koptisin–AChE-Komplexes zu ermöglichen, anstatt eine umfassende konformationelle Stichprobennahme. Diese Einstellung wurde verwendet, um zu bewerten, ob der angedockte Komplex über die Zeit einen relativ stabilen Bindungsmodus aufrechterhalten kann. Die Befehle gmx rms, gmx rmsf, gmx Gyrate und gmx hBonds wurden weiter verwendet, um die Wurzelmittlere Quadratabweichung (RMSD), die Wurzelmittelquadratfluktuation (RMSF), den Rotationsradius des Proteins, Wasserstoffbrücken und die lösungsmittelzugängliche Oberfläche zu berechnen. QTgrace wurde zur Ergebnisvisualisierung verwendet.

Tierversuchsverifizierung
Achtzehn gesunde neonatale Sprague-Dawley (SD) Rattenwelpen (7 Tage postnatal) beidereines Geschlechts wurden ausgewählt. Alle Versuchstiere wurden in einer speziellen, pathogenfreien (SPF) Tierversuchseinrichtung untergebracht. Diese Anlage war mit einem strengen Barrieresystem ausgestattet, das die Invasion von Mikroorganismen und Parasiten effektiv verhindern konnte. Die Umweltparameter des Wohnraums wurden automatisch von einem zentralen Steuerungssystem überwacht und reguliert: Temperatur 22 ± 2 °C, relative Luftfeuchtigkeit 55 % ± 10 % und Lichtzyklus 12 Stunden Licht/12 Stunden Dunkelzyklus. Ein neonatales Rattenmodell von hypoxisch-ischämischer Hirnschädigung (HIBD), modifiziert durch die klassische Rice-Vannucci-Methode, wurde verwendet, um die pathologischen und verhaltensbezogenen Merkmale von CP zu simulieren.

Kurz gesagt: Nachgeburtstag-7-Rattenjungen wurden mit 2–3 % Isofluran zur Einleitung und 1–2 % zur Erhaltung betäubt. Nach einer angemessenen Betäubung wurde ein Mittellinienschnitt in der Halswirbelsäule gemacht, und die linke Arteria Halsschlagader wurde sorgfältig isoliert und dauerhaft ligiert. Der Schnitt wurde dann genäht, und die Jungtiere durften sich eine Stunde auf einer Wärmelage erholen. Anschließend wurden die Jungtiere in den Modell- und Coptisin-Gruppen in einer Kammer mit 8 % O₂ und 92 % N₂ für 2 Stunden bei 37 °C einer Hypoxie ausgesetzt, um eine hypoxisch-ischämische Hirnverletzung zu induzieren. Sham-operierte Tiere unterzogen sich derselben Anästhesie und operativen Exposition ohne Karotisligatur oder hypoxische Behandlung. Nach der Hypoxie wurden die Jungtiere in ihre Mutter zurückgebracht und während des gesamten Versuchszeitraums täglich auf allgemeinen Zustand, Überleben und Fressverhalten überwacht.

Die experimentellen Ratten wurden zufällig in 3 Gruppen eingeteilt: Scheingruppe: Nur die linke arterie der gemeinsamen Halsschlagader wurde ohne Ligation oder Hypoxie getrennt, und ein gleiches Volumen Lösungsmittel wurde postoperativ verabreicht; Modellgruppe: Hypoxisch-ischämische Hirnschädenmodellierung wurde durchgeführt, und ein gleiches Volumen Lösungsmittel wurde postoperativ verabreicht; Coptisin-Gruppe: Nach der Modellierung wurde Koptisin (10 mg/kg) mittels Gavage verabreicht. Die Dosis von Koptisin (10 mg/kg) wurde als in-vivo-Dosis basierend auf zuvor berichteten in vivo/pharmakokinetischen Studien zu Koptisin¹⁷ ausgewählt. Die Medikamente wurden einmal täglich zu einer festen Zeit für 14 aufeinanderfolgende Tage der Intervention verabreicht.

Erkennung von Tierindikatoren
Die Testausrüstung des Morris-Wasserlabyrinths (MWM) bestand aus einem großen runden Wasserbecken (Durchmesser etwa 150 cm) mit offensichtlichen visuellen Hinweisen an der Poolwand. Das Poolwasser wurde zu undurchsichtigen, milchigem Weiß geschichtet, und die Wassertemperatur wurde bei 23 ± 1 °C kontrolliert. Im Zielquadranten wurde eine transparente Plattform platziert, die 1–2 cm unter der Wasseroberfläche untertauchte. Die Ausbildung fand viermal täglich statt: Die Tiere wurden von vier verschiedenen Einstiegspunkten ins Wasser gelegt, mit Blick auf die Poolwand, und die Zeit, die die Tiere benötigten, um die versteckte Plattform vom Einstieg ins Wasser zu finden und aufzusteigen, nämlich die "Fluchtlatenz", wurde aufgezeichnet. Jede Trainingseinheit war auf 60 Sekunden begrenzt. Wenn das Tier die Plattform innerhalb von 60 Sekunden fand, durfte es 15 Sekunden darauf bleiben, um das Gedächtnis zu konsolidieren. Wurde das Tier nicht gefunden, wurde es sanft zur Plattform geführt und 15 Sekunden bleiben lassen. Nach sieben Tagen Training wurde die versteckte Plattform entfernt. Die Tiere wurden vom Einstiegspunkt gegenüber der ursprünglichen Plattform ins Wasser gesetzt und konnten 60 Sekunden lang frei schwimmen; die Schwimmbahn der Tiere wurde von einem Videosystem aufgezeichnet. Durch den MWM-Test wurden Indikatoren wie die durchschnittliche Fluchtlatenz, die Zeit im Zielquadranten und die Anzahl der Überquerungen über die ursprüngliche Bahnsteigposition erfasst.

Zur Erkennung von Laser-Speckle-Kontrastbildgebung (LSCI): Nach der Anästhesie wurden die Ratten auf einem stereotaxischen Instrument fixiert, der Schädel wurde freigelegt und feucht gehalten. Ein Laser-Speckle-Blutfluss-Bildgebungssystem wurde verwendet, um kontinuierlich rohe Speckle-Bilder direkt über dem Schädel über 30 Sekunden direkt über dem Schädel zu sammeln. Professionelle Software wurde verwendet, um den räumlich und zeitlich variierenden Speckle-Kontrast in eine Verteilungskarte der zerebralen Blutfluss-Perfusionseinheit (PU) umzuwandeln. Für die quantitative Analyse wurde in jedem Bild ein manuell abgegrenzter kortikaler ROI innerhalb der freiliegenden ipsilateralen Hemisphäre entsprechend dem läsionsrelevanten kortikalen Perfusionsbereich und sichtbaren anatomischen Orientierungspunkten ausgewählt, und der durchschnittliche Perfusionswert innerhalb dieses ROI wurde für den Intergruppenvergleich verwendet.

Es wurden Hirngewebe gesammelt und vorgekühltes PBS entsprechend dem Gewichts-Volumen-Verhältnis hinzugefügt. Die mechanische Homogenisierung erfolgte auf Eis, gefolgt von einer Zentrifugation bei 8000 × g bei 4 °C für 10–15 Minuten, und das Überstandsmittel wurde zur Prüfung gesammelt. Hirngewebe wurde schnell in 4%-Paraformaldehyd eingebaut, um mehr als 24 Stunden fixiert zu werden, um die Gewebemorphologie zu erhalten. Die Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung erfolgte durch Operationen wie Dehydration, Clearing und Paraffin-Einbettung, wobei das Ausmaß der Hirnverletzung unter einem optischen Mikroskop beobachtet wurde.

Zur Messung der AChE-Aktivität wurde der Großhirnrinde aus der verletzten (ipsilateralen) Hemisphäre gemäß den Anweisungen des Herstellers entnommen und homogenisiert. Gewebeproben wurden im Extraktionspuffer homogenisiert und bei 8000 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, wobei der Supernatant zur Analyse entnommen wurde. Die AChE-Aktivität wurde mit einem kommerziellen Acetylcholinesterase-Aktivitätstest (Mikroplatten-/Kolorimetrie-Methode) bestimmt. Dieser Test basiert auf der Hydrolyse von Acetylcholin mittels AChE, gefolgt von einer Reaktion mit DTNB zur Erzeugung eines chromogenen Produkts, und die Absorption wurde bei 412 nm gemessen, um die Enzymaktivität zu berechnen. Da es sich bei diesem Kit um einen enzymaktivitätsbasierten kolorimetrischen Test handelt und nicht um ein herkömmliches antigen-quantifizierendes, enzymgebundenes Immun-Sorbent-Assay-Kit (ELISA), bot der Hersteller keinen standardisierten Nachweisbereich und keine analytische Empfindlichkeit. In der vorliegenden Studie lagen die gemessenen AChE-Aktivitätswerte im kortikalen Gewebe ungefähr im Bereich von 25–80 nmol/min/mg.

Statistische Analyse
Alle experimentellen Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben und mit der GraphPad Prism-Software analysiert. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt vom Tukey-Mehrfachvergleichstest. Für den Morris-Wasserlabyrinthtest wurden das endgültige Trainingsergebnis und die Probe-Testparameter mittels Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt vom Tukey-Mehrfachvergleichstest. Ein Wert von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant¹⁸ angesehen. Die Korrelation zwischen der Perfusion des zerebralen Blutflusses im ROI und der AChE-Aktivität im ipsilateralen Großhirnrinden wurde mittels Pearson-Korrelationsanalyse analysiert. Ein Wert von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Analyse chemischer Komponenten im C. chinensis-Extrakt
Alkaloide sind die Hauptansammlungsbestandteile und auch die wichtigsten aktiven Bestandteile der medizinischen Stoffe von C. chinensis . In dieser Studie wurde chromatographische Technologie eingesetzt, um die Hauptbestandteile der chemischen Bestandteile von C. chinensis zu analysieren (Abbildung 1A). Wie in Tabelle 1 gezeigt, zeigten alle...

Diskussion

Derzeit wurden verschiedene Methoden und Technologien zur Prävention und Behandlung von Hirnerkrankungen^entwickelt 20,21,22. In dieser Studie wurde eine integrierte Strategie aus In-vitro-Screening, computergestützter Simulation und In-vivo-Verifikation verfolgt, um systematisch die materielle Grundlage und den Multi-Ziel-Mechanismus von C. chinensis zur Verbesserung d...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB)	CATO Research Chemicals Inc.	416046844	Acetylcholinesterase-Hemmtest
Acetylcholinesterase (AChE)	Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd	C1682	Acetylcholinesterase-Hemmtest
Acetylthiocholiniodid (ATChI)	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	1037408	Acetylcholinesterase-Hemmtest
Aetonitril	Thermo Fisher Scientific Inc	1162577	Flüssigkeitschromatographie-Mobilphase
AutoDock Vina	AutoDock	Version 1.2.5
Berberin-Standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	110713-201814	Chemische Zusammensetzungsanalyse
Columbamin-Standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180712	Chemische Zusammensetzungsanalyse
Coptisin-Standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180309	Chemische Zusammensetzungsanalyse
E-916 beschleunigter Lösungsmittelextraktor	Büchi Labortechnik AG, Schweiz	E916-008	Extraktion der n-Butanolfraktion
Epiberberin-Standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180309	Chemische Zusammensetzungsanalyse
Ameisensäure	Thermo Fisher Scientific Inc	1270563	Flüssigkeitschromatographie-Mobilphase
GaussView 6	Gaussian	https://gaussian.com/gaussview6/
Glaucin-Standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180615	Chemische Zusammensetzungsanalyse
Jatrorrhizin-Standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180607	Chemische Zusammensetzungsanalyse
Magnoflorin-Standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180205	Chemische Zusammensetzungsanalyse
Methanol	Thermo Fisher Scientific Inc	1162578	Flüssigkeitschromatographie-Mobilphase
Mikroporöse Membran	Millipore Filter Company	2139547	Filtrieren von Extrakten
Palmatin-Standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180226	Chemische Zusammensetzungsanalyse
Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
PyMOL	PyMOL	https://pymol.org/
Natriumcarbonat	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	15138805	Acetylcholinesterase-Hemmtest
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	11019349	Acetylcholinesterase-Hemmtest