Rekombinante Produktion und Reinigung von Hydrophobin SC16 aus Escherichia coli sowie Überwachung ihrer Selbstassemblierung mittels Fluoreszenztests

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die rekombinante Produktion und Reinigung von Hydrophobin SC16 aus Escherichia coli und bietet fluoreszenzbasierte Tests zur Überwachung der Selbstassemblierung.

Zusammenfassung

Hydrophobine sind kleine amphipathische Proteine, die sich an hydrophoben–hydrophilen Grenzflächen selbst zusammensetzen und stabile, wasserdichte Beschichtungen über Pilzsporen bilden. Klasse-I-Hydrophobe bilden besonders stabile "Stablauten", die geordnete, amyloidähnliche Strukturen enthalten, die Oberflächen beschichten. Diese ungewöhnliche Oberflächenchemie bietet ihnen potenzielle Anwendungen in der Arzneimittelabgabe, Schaumstabilisierung, Emulgierung und Oberflächenmodifikation. Um Hydrophobie herzustellen, sind umfassende, ertragreiche Protokolle aus einfachen Expressionssystemen erforderlich. Darüber hinaus ist es notwendig, übersichtliche Methoden zur Charakterisierung der Hydrophobinfunktion nach rekombinanter Produktion und Reinigung bereitzustellen. Hier beschreiben wir Protokolle zur Herstellung und Charakterisierung von SC16, einem Hydrophobin der Klasse IB, das vom Pilz Schizophyllum commune produziert wird, das rekombinant in Escherichia coli exprimiert und anschließend unter nicht-reduzierenden, natürlichen Bedingungen gereinigt werden kann. Dies umfasst die Umwandlung eines Expressionsplasmids, das SC16 codiert und mit einem N-terminalen Fusionsprotein in E. coli fusioniert ist, die Induktion der Proteinexpression, die Zelllyse unter natürlichen Bedingungen, die Affinitätschromatographie und die Proteasespaltung zur Isolierung des Hydrophobins bei Erträgen von ≥5 mg. Die Selbstassemblierung von SC16 kann dann durch Endpunkt- oder kinetische fluoreszenzbasierte Tests mit Thioflavin T überwacht werden. Beide Assays beinhalten die Inkubation von SC16 mit längerer Vermischung, um die Selbstassemblage an Luft-Wasser-Grenzflächen zu fördern, und werden durch Fluoreszenzmessungen überwacht. Zusammen bieten diese Ansätze vereinfachte Protokolle zur Reinigung von SC16 und zur Überwachung seiner Selbstassemblierung und können auf andere Systeme mit ähnlicher Protein-Selbstassemblierung ausgeweitet werden.

Einleitung

Hydrophobine sind oberflächenaktive amphipathische Proteine, die von Pilzen ausgeschieden werden und sich an hydrophob–hydrophilen Grenzflächen (z. B. Luft-Wasser-Grenzflächen an Pilzstrukturen) selbst zusammensetzen. In der Natur bestehen ihre Aufgaben darin, Sporen und Fruchtkörper^zu beschichten ^1,2, sie wasserbeständig zu machen, Wasserstauungen in Luftkanälen zu verhindern und die Verbreitung^{zu erleichtern 1}. Aufgrund ihrer ungewöhnlichen Oberflächenchemie haben Hydrophobine vielfältige industrielle Anwendungen, darunter Beschichtungen zur Erhöhung der Biokompatibilität von Implantaten und Prothesen ^3,4,5, biokompatible Tensiden für Arzneimittelabgabe und medizinische Behandlungen ^6,7,8,9,10 sowie Kandidaten für Nanoplastik-Capture¹¹.

Hydrophobine lassen sich in Klasse I und Klasse II unterteilen, die sich beide an hydrophob–hydrophilen Grenzflächen selbst zusammensetzen, darunter Luft–Wasser, Öl–^{Wasser 12,13,14} und Kunststoff–Wasser 15,16,17. Ein prägendes Merkmal von Klasse-I-Hydrophobinen ist, dass sie an Grenzflächen hochstabile "Rodlet"-Strukturen bilden, die geordnete, amyloidähnliche (β-blattreiche) Merkmale¹⁸ enthalten, was sie besonders für Anwendungen mit Oberflächenmodifikation oder -schutz geeignet macht. Im Gegensatz dazu bilden Klasse-II-Hydrophobine keine amyloidähnlichen Strukturen, sondern Filme, die leicht dissoziiert werden können ^1,18. Interessanterweise existiert auch eine dritte Klasse von Hydrophobinen, deren strukturelle Merkmale von Klasse I und Klasse II^18,19 erhalten sind. Aufgrund dieser Unterschiede ist die Überwachung der Hydrophobin-Selbstassemblierung wichtig für die Klassifikation und zur Bewertung der korrekten Faltung und Funktion rekombinant produzierter Hydrophobine.

Die Selbstassemblierung von Hydrophobinen kann leicht mit fluorometrischen Methoden überwacht werden, bei denen Amyloid-bindende Farbstoffe wie Thioflavin T (ThT) verwendet werden, das an Kreuz-β Strukturen in Amyloiden²⁰ bindet. ThT enthält eine einzelne kovalente Bindung, die zwei aromatische Ringe trennt, die normalerweise frei rotieren. Beim Binden an Quer-β-Strukturen wird diese Rotation eingeschränkt, was zu Fluoreszenz²⁰ führt. Aufgrund seiner selektiven Fluoreszenz wird ThT weit verbreitet zur Überwachung der Hydrophobin-Selbstassemblierung an den Luft-Wasser-Grenzflächen 21,22,23,24,25,26,27,28 verwendet. ThT-Assays liefern zeitabhängige kinetische Informationen zur Hydrophobin-Selbstassemblierung 23,27,28 und bieten Vorteile gegenüber Techniken wie der Atomkraftmikroskopie (AFM) und Kontaktwinkelmessungen, die einen geringeren Durchsatz haben und weniger für zeitabhängige Analysen geeignet sind. Darüber hinaus zeigt ThT eine starke Fluoreszenzverstärkung bei der Bindung an Kreuz-β-Strukturen, mit minimaler Fluoreszenz in seiner freien^{Form 20}. Diese Eigenschaften machen ThT-Tests zu einfachen und sensiblen Methoden zur Überwachung der Hydrophobin-Selbstassemblierung, die durch umfangreichere strukturelle Techniken ergänzt werden kann.

Angesichts der vielfältigen Anwendungen von Hydrophobinen besteht ein Bedarf an zugänglichen Protokollen zur Überwachung ihrer Selbstassemblierung. Konkret bietet das vorliegende Protokoll einen Rahmen zur Optimierung der Reinigung und funktionellen Charakterisierung rekombinanter Hydrophobine. Zuvor beschrieben Morris und Sunde (2013) Protokolle zur rekombinanten Expression in Escherichia coli, zur Reinigung und zur ThT-basierten Überwachung der Hydrophobin-Selbstassemblierung²¹. Diese Arbeit erweitert diese Methoden, indem sie ein modifiziertes Verfahren zur Reinigung des Hydrophobins SC16 beschreibt. SC16 ist ein Hydrophobin der Klasse I (aus Schizophyllum commune), das leicht aus E. coli gereinigt werden kann, ohne Denaturierung, Reduktion oder Reoxidation von Disulfidbindungen. Das resultierende SC16-Protein ist funktional, wie durch Endpunkt- und kinetische ThT-basierte Selbstassemblierungstests demonstriert werden, die die Stablingsbildung überwachen. Ziel dieses Artikels ist es, ein umfassendes und optimiertes Protokoll für die rekombinante Produktion, Reinigung und funktionelle ThT-basierte Tests der Klasse IB Hydrophobin SC16 darzulegen.

Protokoll

Diese Studie umfasst keine menschlichen Teilnehmer, Wirbeltiere oder Gewebeproben. Daher war keine ethische Genehmigung erforderlich.

1. Expression von Hydrophobin SC16 in E. coli

1. Transformieren Sie SHuffle T7 Express E. coli-Zellen durch Hitzeschock bei 42°C für 45 Sekunden unter Verwendung eines pET-21-Expressionsplasmids, das eine hexahistotidin-markierte B1-Domäne des Proteins G codiert, das mit SC16 fusioniert ist (H-GB1-SC16).
   HINWEIS: SHuffle T7 Express-Zellen wurden aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt, die korrekte Disulfidbindungsbildung²⁹ zu fördern. Das H-GB1-SC16-Plasmid kann durch Klonierung des Restriktionsenzyms wie zuvor^{beschrieben 30} erzeugt werden.
2. Inokulieren Sie 2 ml Lysogeniebrühe (LB) mit 100 μg mL⁻¹ Ampicillin mit einer einzigen Kolonie. Über Nacht bei 37°C mit Schütteln inkubieren.
3. Inokulieren Sie 1 L LB (in einem 2,8-Liter-Baffling mit Rundboden) mit 1 ml der Übernachtkultur. Wachsen Sie die Kultur bei 37°C mit Shake (~120–135 U/min, kreisförmige Umlaufbahn von 19 mm), bis die optische Dichte bei 600 nm 0,6 ± 0,1 erreicht.
4. Fügen Sie Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid zu einer Endkonzentration von 0,5 mM hinzu, um die Expression von H-GB1-SC16 zu induzieren. Über Nacht bei 20°C mit Schütteln inkubieren.
   HINWEIS: Diese Temperatur wurde gewählt, um das Risiko von Körperbildung und falscher^{Faltung zu} verringern.
5. Entnehmen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4000 × g für 20 Minuten. Gieß das Supernatant ab.
   PAUSENPUNKT: Lagern Sie das Zellpellet bis zu 3 Wochen bei −20°C, bevor Sie mit der Reinigung beginnen. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.

2. Reinigung von Hydrophobin SC16

1. Das Zellpellet wird in 30 mL Lysepuffer (20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan [Tris], pH 8, 250 mM NaCl) wieder suspendiert.
2. Lyse die Zellen, indem du die Suspension 15 Minuten lang in einem 80°C-Wasserbad inkubierst. Während der Brützeit alle 5 Minuten sanft mischen.
   HINWEIS: Dieser Schritt beruht auf der Wärmestabilität von SC16 und ist möglicherweise nicht für andere Proteine geeignet.
   VORSICHT: Verwenden Sie hitzebeständige Handschuhe beim Umgang mit Schläuchen und Wasserbädern bei 80°C. Vermeiden Sie es, heiße Flüssigkeit beim Mischen und Entfernen der Röhrchen zu spritzen.
3. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 25.000 × g für 20 Minuten bei 4°C. Laden Sie das Supernatant auf eine Gravitationssäule, die 2–3 mL Ni²⁺-geladenes immobilisiertes Metallaffinitätschromatographie (IMAC) Harz enthält.
4. Waschen Sie die Säule mit einem Lysispuffer, der 30 mM Imidazol enthält. Elutieren Sie das Protein mit 10 mL Lysepuffer mit 300 mM Imidazol.
5. Dialyse die eluierte Fraktion gegen 1 L Puffer, der Tris (pH 8; 20 mM) und NaCl (50 mM) enthält, für 3 Stunden mit 3500 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Dialyserohr und Rühren bei 100 U/min.
   HINWEIS: Die Rührgeschwindigkeit während der Dialyse kann je nach Aufbau variieren (zum Beispiel Rohrvolumen und Bechergeometrie). Rühren Sie mit der minimalen Drehzahl um, die notwendig ist, um eine sanfte Drehung des Dialysebeutels zu ermöglichen.
6. Geben Sie Thrombinprotease (20 U mg⁻¹ Fusionsprotein) direkt in den Dialysebeutel (insgesamt 10 ml Reaktionsvolumen), um das Fusionsprotein zu spalten. Ersetze den Puffer.
   PAUSENPUNKT: Nach Proteasezugabe und Pufferersatz wird die Dialyse über Nacht bei 4 °C fortgesetzt. Am nächsten Tag die Reinigung fortsetzen. Verifizieren Sie den Abschluss der Spaltung mit SDS-PAGE (erwarten Sie das Verschwinden des ~18 kDa-Bandes und das Auftreten von Bändern bei ~10 und ~8 kDa).
7. Die dialysierte Probe wird auf die Ni²⁺-geladene IMAC-Säule geladen. Waschen und elutieren Sie jeweils etwa 12 ml Puffer, die jeweils 30 mM bzw. 300 mM Imidazol enthalten.
8. Analyse der gesammelten Fraktionen durch Natriumdodecylsulfat–Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter Reduktionsbedingungen (unter Verwendung von β-Mercapttoethanol im Ladepuffer). Identifizieren Sie SC16 anhand des Vorhandenseins eines Bandes in der Waschfraktion beim erwarteten Molekulargewicht (~10 kDa). Dialyse die Wash-Fraktion, die SC16 enthält, vollständig gegen 1 L Puffer mit Tris (pH 8; 20 mM) und NaCl (50 mM) für 3 Stunden, um Restimidazol zu entfernen.
   HINWEIS: SC16 wird typischerweise in der Waschfraktion nachgewiesen, während H-GB1 typischerweise im Eluat angereichert ist. Eine kleine Menge Rest-SC16 kann ebenfalls im Eluat vorhanden sein.
9. Quantifizieren Sie SC16 mit einer bevorzugten Methode (z. B. Aminosäureanalyse mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, Bradford-Assay oder Absorption bei 280 nm). Mit dieser Methode werden Erträge von ≥5 mg SC16 pro Liter Kultur erwartet.
   HINWEIS: Unsere Gruppe quantifiziert SC16 routinemäßig durch Absorption bei 280 nm mit einem vorhergesagten Extinktionskoeffizienten von 3480 M⁻¹ cm^{−1 32} . Dies ist die bevorzugte Methode zur SC16-Quantifizierung aufgrund ihrer Einfachheit.
10. Proben während der gesamten Reinigung für die SDS-PAGE-Analyse entnehmen.

3. Endpunkt-Fluoreszenz-Assay der SC16-Selbstassemblierung

1. Bereiten Sie dreifache Reaktionsmischungen vor, die jeweils 50 μg mL⁻¹ SC16, 50 mM NaCl und 20 mM aus 2-(N-morpholino)ethanesulfonsäure (MES), Tris und Natriumphosphat enthalten. Bereiten Sie im Voraus einen Lagerpuffer vor, der MES, Tris und Natriumphosphat enthält, angepasst auf einen endgültigen pH-Wert von 6,5 durch tropfenweise Zugabe von konzentriertem HCl oder 1 M NaOH. Füge Protein und NaCl unmittelbar vor Beginn des Tests hinzu.
   HINWEIS: Steuerungen können in diesem Schritt vorbereitet werden. Zum Beispiel sollten positive Steuerungen mit SC16 eingebaut werden, die keine End-over-End-Rotation durchlaufen, sowie negative Steuerungen, die nur einen Puffer enthalten. SC16-Konzentrationen von 25–100 μg mL⁻¹ wurden getestet, wobei die Ergebnisse am konsistentesten bei 50 μg mL⁻¹ liegen. Optimieren Sie diesen Parameter nach Bedarf.
2. Die Mischungen werden in 2–5 mL Röhren übertragen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Probenröhrchen bis zu 50 % gefüllt ist, um beim Inversieren ein richtiges Mischen zu ermöglichen.
3. Drehen Sie die Rohre 2 Stunden lang mit 20 U/min Ende über Ende. Übertragen Sie 100 μL jeder Probe in eine undurchsichtige schwarze 96-Well-Platte mit runden, schornartigen Bohrungen.
4. Fügen Sie gefiltertes ThT zu einer Endkonzentration von 20 μM zu allen Proben hinzu.
5. Stellen Sie den Mikroplattenleser auf Anregungs- und Emissionswellenlängen im entsprechenden Bereich für ThT-Fluoreszenz 33,34,35,36 ein. Stellen Sie die Verstärkung auf 55 und die Integrationszeit auf 20 μs ein. Messen Sie die Fluoreszenzintensität für jede Probe unmittelbar nach der 2-Stunden-Rotationsperiode.
   HINWEIS: Die gemeldeten Anregungs- und Emissionsmaxima von ThT betragen jeweils 450 nm bzw. 490 nm³⁷. Dieses Experiment verwendete Anregungs- und Emissionswerte von 438 bzw. 494 nm, basierend auf der optischen Filterverfügbarkeit. Die End-over-End-Rotation wurde mit einem gefertigten Rotationsgerät durchgeführt.

4. Kinetischer Fluoreszenztest der SC16-Selbstassemblage

1. Bereiten Sie dreifache 100-μL-Reaktionsgemische in einer schwarzen 96-Well-Platte vor.
2. Enthalten Sie 50 μg mL⁻¹ SC16, 50 mM NaCl, 20 μM gefiltertes ThT und jeweils 20 mM MES, Tris und Natriumphosphat. Bereite negative Steuerungen vor, die nur ThT enthalten und nur puffern (ohne SC16).
3. Stellen Sie den pH-Wert des Puffers (der Tris, MES und Natriumphosphat enthält) auf 5,5, 6,5, 7,5 oder 8,5 mit konzentriertem HCl oder 1 M NaOH an, bevor SC16 und ThT hinzugefügt werden. Das gemischte Puffersystem ermöglicht eine pH-Anpassung, ohne die Pufferidentität zu ändern.
4. Setze die Platte in den Mikroplattenleser.
5. Stellen Sie Anregungs- und Emissionswellenlängen im entsprechenden Bereich für ThT-Fluoreszenz 33,34,35,36 ein.
6. Programmiere den Leser für zyklische Messungen alle 70 Sekunden.
7. Beinhaltet 60 Sekunden Orbital-Schütteln bei 432 U/min, gefolgt von einer 10-sek-Ruhephase pro Zyklus.
8. Stellen Sie die Integrationszeit auf 20 μs und die Verstärkung auf 55 μs ein.
9. Führen Sie den Test über 120 Zyklen durch, um die Fluoreszenzänderungen über 2 Stunden Schütteln zu überwachen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das orbitale Schütteln ausgewählt ist; lineares Schütteln kann zu inkonsistenten oder suboptimalen Selbstassemblierungsergebnissen führen.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt ein Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel, das die Reinigung von SC16 überwacht. Die Codes stehen für den Marker (M), vor der Induktion (B), nach der Induktion (A), lösliche Fraktion (S), Durchfluss (F), Wash (W), Eluat (E) und Dialysierung (D). Im ersten IMAC-Eluat entspricht ein Band mit einem geschätzten Molekulargewicht von ~18 kDa dem H-GB1-SC16-Protein vor der Thrombinspaltung. Nach dem Spalten mit Thrombin gibt es kein Protein mehr im zweiten IMAC-Durchflussanteil und ein ~10 kDa-Band, das SC16 entspricht, im Wash. Im zweiten IMAC-Eluat gibt es etwas Rest-SC16 und ein kleineres ~8 kDa-Protein, das H-GB1 entspricht. Gereinigtes SC16 wurde dann für Endpunkt- und kinetische Selbstassemblierungstests verwendet. Diese Ergebnisse bestätigen die erfolgreiche Reinigung von SC16, was durch das Vorhandensein des erwarteten Molekulargewichtsbandes und die Trennung des H-GB1-Fusionspartners nach der Thrombinspaltung hinweist.

Abbildung 1. SDS-PAGE-Analyse der Reinigung von SC16 für die erste (vor der Thrombinspaltung) und zweite (nach der Thrombinspaltung) IMAC-Trennungen. Ein Molekulargewichtsmarker (M) wird gezeigt, zusammen mit Proben, die vor der Induktion (B), nach der Induktion (A), dem Zelllysis-Supernatant (S), Durchfluss (F), Wash (W) und Eluat-(E)-Fraktionen sowie der dialysierten Probe (D) entnommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Der Endpunkt-ThT-Test der SC16-Selbstassemblierung, der in Tabelle 1 dargestellt wird, zeigt eine 11-fache Erhöhung der ThT-Fluoreszenzintensität nach 2 Stunden Tischrotation im Vergleich zu proteinhaltigen Kontrollen, die nicht rotiert wurden. Ebenso beobachten wir keine signifikante Veränderung der Fluoreszenzintensität bei der Rotation der Pufferproben. Dieser Anstieg der ThT-Fluoreszenz bei der Bewegung von SC16 stellt die Bildung von amyloidartigen β-Schichten dar, die auf die SC16-Selbstassemblierung ^24,25 hinweisen. Diese Ergebnisse zeigen, dass der beschriebene fluoreszenzbasierte Test die SC16-Selbstassemblage unter den getesteten Bedingungen effektiv überwacht.

Beispiel	ThT-Fluoreszenz (zählt ± SD)
SC16 ohne Rotation	2679 ± 177
SC16 nach der Rotation	30315 ± 2141
Puffer nach der Rotation	665 ± 888

Tabelle 1. ThT-Fluoreszenzmessungen, die nach einer anschließenden Rotation von SC16-Proben gesammelt wurden. SC16 (50 μg mL⁻¹) Proben wurden entweder ohne Umrührung inkubiert oder 2 Stunden lang gedreht. ThT (20 μM) wurde vor Fluoreszenzmessungen hinzugefügt. Die Fluoreszenz wurde bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 438 bzw. 494 nm gemessen und als Rohzählungen angegeben. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt.

Der kinetische Selbstassemblierungstest von SC16 bei mehreren Stunden in unterschiedlichen Puffern ist in Abbildung 2 dargestellt. Typische S-förmige kinetische Selbstassemblierungskurven für Amyloid-Fibrillation umfassen charakteristische Verzögerung, Wachstum und Plateauperioden³⁸. Bei SC16 wird bei den ersten Messwerten keine wesentliche Verzögerungsphase beobachtet, obwohl dieses Verhalten bei anderen Hydrophobinen wie EAS^21,23 dokumentiert wurde. Selbstassemblierungskurven für jeden pH sind vergleichbar, mit starken, positiven Steigungen, die der Stablingsbildung entsprechen. Nach etwa 20 Minuten Rühren stabilisiert die Fluoreszenzintensität und verlangsamt sich dann langsam. In Kontrollproben ohne SC16 gibt es während des gesamten Experiments keine wesentlichen Veränderungen der Fluoreszenz.

Abbildung 2. Selbstassemblierungskurven von SC16, gemessen mit einem kinetischen ThT-Fluoreszenzassay. SC16 wurde bei 50 μg mL⁻¹ in einem Mehrkomponentenpuffer hergestellt, der 20 μM ThT, 50 mM NaCl, 20 mM Natriumphosphat, 20 mM MES und 20 mM Tris enthielt. Messungen wurden nach 60 Sekunden Umlaufbahn und einer Ruhephase von 10 Sekunden durchgeführt. Die x-Achse stellt die Schüttelzeit dar (insgesamt 2 Stunden). Die Fluoreszenz wurde mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 438 nm bzw. 494 nm gemessen und als Zählungen × 10⁻³ angegeben. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar (n = 3). Die Panels entsprechen pH-Wert 5,5 (oben links), 6,5 (oben rechts), 7,5 (unten links) und 8,5 (unten rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für suboptimale Ergebnisse für den kinetischen Selbstassemblierungsassay. In diesem Fall wurde der Test wie im Protokollabschnitt beschrieben durchgeführt, jedoch mit einer "linearen" Schütteleinstellung anstelle der "orbitalen" Schütteleinstellung.

Abbildung 3. Beispiel für suboptimale kinetische Selbstassemblierungsdaten von SC16, gewonnen mit dem kinetischen ThT-Fluoreszenzassay. In diesem Fall wurde das Schütteln in einer linearen Einstellung statt im orbitalen Shake durchgeführt. Die Proben wurden wie in Abbildung 2 beschrieben vorbereitet. Messungen wurden nach 60 Sekunden linearem Schütteln und einer 10-Sekunden-Ruhephase durchgeführt. Die x-Achse stellt die Schüttelzeit dar (insgesamt 2 Stunden). Die Fluoreszenz wurde mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 438 nm bzw. 494 nm gemessen und als Zählungen × 10^⁻³ angegeben. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Hier fassen wir Protokolle zur Expression und Reinigung des Hydrophobins SC16 sowie für Niedrig- und Hochdurchsatz-Fluoreszenz-Assays der SC16-Selbstassemblierung zusammen, die jeweils unterschiedliche Vor- und Nachteile aufweisen. Diese Workflows können auf verwandte Systeme angewendet werden, um die Selbstassemblierung von Proteinen zu überwachen. In diesem Protokoll wird Wärme verwendet, um Zellen vor der SC16-Reinigung zu lysieren, im Gegensatz zu den meisten Protokollen, die traditionellere Methoden zur Lyseierung von E. coli verwenden. Wir haben festgestellt, dass H-GB1-SC16 löslich und hitzebeständig bis zu 80°C ist und dass die Wärmelyse als erster Reinigungsschritt dient, indem nicht-hitzestabile Proteasen und andere Schadstoffe im Zelllysat³⁹ ausgefällt werden. SC16 stellt jedoch einen Sonderfall dar, da Hydrophobine oft unlöslich in Inklusionskörpern 12,21,40 exprimiert werden. Wenn sie als Inklusionskörper ausgedrückt werden, sind typischerweise Denaturierungsbedingungen erforderlich, gefolgt von einer Neufaltung nach etablierten Protokollen 21,40,41.

In diesem Protokoll wird SDS-PAGE verwendet, um die SC16-Reinigung in jedem Schritt zu bewerten, einschließlich des Zellpellets vor und nach der Induktion, der löslichen Fraktion nach der Zelllyse und aller nachfolgenden Säulenfraktionen. Dies ist in Abbildung 1 dargestellt; im Vergleich zu H-GB1 ist das Band zu SC16 jedoch relativ schwach. Wir haben festgestellt, dass es für viele Hydrophobine, einschließlich SC16, eine Herausforderung ist, eine gleichbleibende und intensive Coomassie-Färbung zu erreichen. SC16 erscheint typischerweise als mittleres Intensitätsband, wenn β-Mercapttoethanol als Reduktionsmittel verwendet wird (Abbildung 1). In manchen Fällen ist eine Silberfärbung erforderlich, um Hydrophobine klarer sichtbar zu machen.

Endpunkt- und kinetische Fluoreszenztests können zur Überwachung der SC16-Selbstassemblierung verwendet werden. Der Endpunkt-ThT-Test ist vorteilhaft, da er eine schnelle und einfache Bewertung der Selbstassemblierung ermöglicht. Neben der erhöhten Fluoreszenz nach 2 Stunden Werkbankrotation geht die Selbstassemblierung oft mit sichtbarer weißer Trübung im Reaktionsrohr einher. Dieser Test verwendet einen einfachen Rotator auf der Werkbank zum Mischen und minimiert den Verschleiß an Mikroplattenleserkomponenten. Nach unserer Erfahrung ist dieser Test relativ unempfindlich gegenüber instrumentellen Parametern, wie z. B. den Schütteln in einem Mikroplattenleser.

Der kinetische ThT-Test liefert detailliertere Informationen zur Selbstassemblierung. Zum Beispiel hängt die SC16-Selbstassemblierung nicht wesentlich von den Pufferbedingungen²⁴ ab, obwohl bei höheren pH-Werten größere Unterschiede zwischen den Replikaten beobachtet werden. Dieses Verhalten ist jedoch nicht universell bei Hydrophobinen, und Faktoren wie Salzkonzentration, pH 24,27,42 und Zusatzstoffe (z. B. Reinigungsmittel oder Alkohole) beeinflussen die Selbstassemblierung ^von Hydrophobin. Zum Beispiel zeigt das Hydrophobin SLH4 eine effizientere Selbstassemblierung bei niedriger Ionenfestigkeit und niedrigem^{pH-Wert 24}, während HFBII-Selbstassemblierung als unabhängig vom pH-Wert und der Elektrolytkonzentration⁴² berichtet wurde, ähnlich wie SC16. Andere Studien haben die Auswirkungen von Additiven auf die Stabtenbildung mit Veränderungen der Oberflächenspannung^27,28 korreliert. Angesichts dieser Unterschiede ist es wichtig, die Pufferzusammensetzung und den pH-Wert für jedes System zu berücksichtigen und deren Einfluss auf die Selbstassemblierungskurve zu überwachen, einschließlich Verzögerungsphase, Wachstum und Plateauregionen.

Eine wichtige Einschränkung ist, dass der kinetische ThT-Test hochempfindlich auf die instrumentellen Parameter des Mikroplattenlesers reagiert und je nach Instrument variieren kann. Beispielsweise wird ein erheblicher Unterschied in der SC16-Selbstassemblierung zwischen orbitalen (kreisförmigen Bewegungen) und linearen (hin und her) Schütteln beobachtet (Abbildung 2 bzw . Abbildung 3). Während ThT-basierte Assays eine effektive Methode zur Modellierung der Hydrophobin-Selbstassemblierung bieten, haben sie aufgrund variabler Selektivität inhärente Einschränkungen, die zu falsch-positiven oder falsch-negativen Signalen^führen können. Darüber hinaus kann die Lichtstreuung von Hydrophobinaggregaten die gemessene Fluoreszenzintensität⁴⁴ beeinflussen und die Messgenauigkeit verringern. Probenverdünnung und verkürzte Weglänge können helfen, diese Effekte abzumildern.

Die hier zusammengefassten Protokolle bieten effektive Methoden zur Reinigung und Überwachung der Selbstassemblage von SC16. Der Endpunkt-Test ist unkompliziert und weniger von der Instrumentierung abhängig, während der kinetische Test detaillierte, zeitaufgelöste Informationen liefert, allerdings mit größerer Empfindlichkeit gegenüber instrumentellen Parametern. Dieses Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz zur Reinigung von SC16 und könnte auf andere korrekt gefaltete Hydrophobine anwendbar sein, die in E. coli exprimiert werden. Obwohl die beschriebenen ThT-Tests inhärente Einschränkungen haben, liefern sie im Vergleich zu Techniken wie AFM oder Kontaktwinkelmessungen zugängliche, zeitabhängige Selbstassemblierungsinformationen. Diese Arbeitsabläufe können für verwandte Proteine angepasst werden und sind besonders relevant für Anwendungen in der Biomaterialentwicklung, der Arzneimittelabgabe und anderen Bereichen, in denen das Verständnis der Selbstassemblierung von Proteinen wichtig ist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-(N-morpholino)ethansulfonsäure (MES)	Sigma-Aldrich	145224-94-8	Pufferkomponente für Selbstmontage-Assays
5 mL Rundboden-Polystyrol-Röhrchen	Falcon	352054	Verwendet für Selbstmontage-Assays mit niedriger Durchsatzleistung
96-Well schwarze Polystyrol-Mikrotiterplatte	Grenier	655076	Verwendet für Fluoreszenzmessungen im Mikroplattenleser
Acryl/Bis-acrylamid (29:1) Lösung (40%)	BioShop	ACR004.500	Verwendet zur Herstellung von SDS-PAGE-Gelen
Agar	BioShop	AGR002.1	Agar zur Herstellung von Ampicillin-resistenten LB-Platten
Ampicillin	IBI Scientific	IB02040	Antibiotikum, das in LB-Agarplatten verwendet wird
Baffled 2,8 L Fernbach-Kolben	Fisher Scientific	955239	Verwendet für den Wachstums von Bakterienkulturen in großen Volumina
β-Mercaptoethanol	TCI Chemicals	60-24-2	Reduktionsmittel, das bei der SDS-PAGE-Stichprobenvorbereitung verwendet wird
Säule (1,5 cm Durchmesser Schwerkraftsäule)	Bio-Rad	7371522	Verwendet für Nickel-Affinitätsreinigung
Dialyseschlauch (3500 kDa MWCO)	BioDesign	D302	Verwendet für Pufferaustausch während der Reinigung
Emissionsfilter	Edmund Optics	84080	Verwendet für ThT-Assays (494 nm, Bandbreite 20 nm)
Anregungsfilter	Edmund Optics	67012	Verwendet für ThT-Assays (438 nm, Bandbreite 24 nm)
Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader	Tecan	Infinite F200 Pro	Verwendet zur Messung der ThT-Fluoreszenzintensität
Heizplatte	Lab Fish	HS5C	Verwendet für Wasserbad-Einrichtung mit Temperaturüberwachung
Salzsäure (HCl)	Fisher Chemical	A144-212	Verwendet für pH-Wert-Anpassung von Puffern
Imidazol	TCI Chemicals	288-32-4	Verwendet in IMAC-Reinigung (Wasch- und Elutionspuffern)
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)	Sigma-Aldrich	367-93-1	Induziert Proteinexpression in E. coli
LB-Bouillon (Lennox)	BioShop	LBL405.5	Wachstumsmedium für Bakterienkultur
Niedrig-Geschwindigkeits-Kühlzentrifuge	Beckman Coulter	360291	Verwendet zum Pelletieren von Zellen vor der Lagerung
Nickel NTA Agarose-Perlen	GoldBio	H-350-50	Harz, das für die Affinitätsreinigung von His-markierten Proteinen verwendet wird
SC16 Plasmid	BioBasic	N/A	Benutzerdefinierter DNA-Konstrukt, der für H-GB1-SC16 Fusionsprotein kodiert
SHuffle T7 Express kompetentes E. coli	New England Biolabs	C3029J	Gaststamm, der für rekombinante Proteinexpression verwendet wird
Natriumchlorid (NaCl)	BioShop	SOD001.5	Pufferkomponente und Ionenstärkeregler
Natriumhydroxid (NaOH)	Fisher Chemical	SS255-1	Verwendet für pH-Wert-Anpassung von Puffern
Natriumphosphat	BioShop	SPD579.1	Pufferkomponente zur pH-Wert-Aufrechterhaltung
Spektrophotometer	Pharmacia Biotech	5096	Verwendet für die Quantifizierung von SC16
Thioflavin T (ThT)	Acros Organics	2390-54-7	Fluoreszierende Farbstoff, der zur Überwachung der Proteinselbstmontage verwendet wird
Thrombin-Protease	Sigma-Aldrich	04-04-9002	Verwendet zum Schneiden des H-GB1-SC16 Fusionsproteins
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)	BioShop	TRS001.5	Puffer, der in Reinigungs- und Assay-Lösungen verwendet wird
Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge	Sorvall	46915	Verwendet zur Klärung des Lysats nach Zelllyse
SDS-PAGE-Setup	Bio-Rad	1658000EDU	Verwendet zur Herstellung und Durchführung von SDS-PAGE-Gelen