Plazenta-abgeleitete Exosomen mildern die hypoxieinduzierte Trophoblasten-Apoptose und das Entzündungsprogress durch SASH1

Zusammenfassung

Das Protein 1 mit SAM- und SH3-Domäne (SASH1) wird als Schlüsselregulator der Trophoblasten-Apoptose und -Entzündung bei Präeklampsie (PE) identifiziert. Plazenta-abgeleitete Exosomen (P-EXOS) lindern hypoxieinduzierte Schäden durch Unterdrückung der SASH1-Expression. Diese Ergebnisse zeigen einen neuartigen Mechanismus der PE-Pathogenese auf und legen SASH1 als potenzielles therapeutisches Ziel nahe.

Zusammenfassung

SASH1 ist ein Signaladapterprotein, das an Zellwachstum, Apoptose und Immunregulation beteiligt ist und zunehmend in Tumor- und Immunzellen untersucht wird. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass SASH1 eine wichtige Rolle bei entzündlichen Reaktionen und der zellulären Homöostase spielt, Prozesse, die eng mit der Entwicklung der präeklampsie (PE) assoziiert sind. Ziel dieser Studie war es, zu ermitteln, ob SASH1 zur Trophoblasten-Apoptose und entzündlichen Reaktionen bei PE beiträgt und ob P-EXOS schützende Effekte über die Regulation von SASH1 entfaltet. In dieser Studie wurden drei mit PE assoziierte transkriptomische Datensätze (GSE75010, GSE10588 und GSE60438) analysiert, um gemeinsam differenziell exprimierte Gene (DEGs) zu identifizieren, gefolgt von Genontologie (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen. Maschinelle Lernalgorithmen wurden zusätzlich angewandt, um wichtige Kandidatengene auszuwählen, und Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten wurden verwendet, um die zelluläre Heterogenität im Plazentagewebe zu charakterisieren und zelltypspezifische Expressionsmuster zu bestimmen. SASH1 wurde als konsensuales Kandidatengen identifiziert und war signifikant in Trophoblastenzellen aus PE-Proben hochreguliert. In vitro wurde ein auf Hypoxie behandeltes HTR-8/SVneo-Trophoblastenzellmodell etabliert, kombiniert mit SASH1-Knockdown, SASH1-Überexpression und Co-Kultur mit P-EXOS. Funktionelle Experimente zeigten, dass der Knockdown von SASH1 die hypoxieinduzierte Trophoblasten-Apoptose signifikant unterdrückte und die Sekretion proinflammatorischer Zytokine, einschließlich IL-6, IL-1β und TNF-α, verringerte, während die Überexpression von SASH1 Apoptose und entzündliche Reaktionen förderte. Darüber hinaus reduzierte die Behandlung mit P-EXOS die SASH1-Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene deutlich und milderte die hypoxieinduzierte Trophoblastenschädigung ab, während die Überexpression von SASH1 diese schützenden Effekte weitgehend aufhob. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass SASH1 eine entscheidende Rolle bei der Trophoblasten-Apoptose und entzündlichen Reaktionen bei PE spielt. P-EXOS könnte die hypoxieinduzierte trophoblastäre Schädigung durch Hemmung der SASH1-Expression lindern und liefert neue Einblicke in die molekularen Mechanismen und potenziellen therapeutischen Zielstrukturen für PE.

Einleitung

PE ist eine schwangerschaftsspezifische Multisystemerkrankung, die typischerweise nach der 20. Schwangerschaftswoche auftritt und klinisch durch Hypertonie, Proteinurie und eine Multisystemfunktionsstörung gekennzeichnet ist. Weltweit bleibt sie eine der Hauptursachen für mütterliche und perinatale Morbidität und Mortalität¹. Trotz kontinuierlicher Fortschritte im klinischen Management besteht die definitive Therapie der PE nach wie vor in der Entbindung der Plazenta, was das unvollständige Verständnis ihrer Pathogenese unterstreicht und die dringende Notwendigkeit verdeutlicht, neuartige molekulare und zelluläre Mechanismen sowie potenzielle therapeutische Zielstrukturen zu identifizieren^2,3.

Eine ausreichende Trophoblasteninvasion und die Förderung einer normalen Placentarentwicklung sind entscheidende Mechanismen, die der Pathogenese der Präeklampsie zugrunde liegen⁴. Während einer normalen Schwangerschaft dringen Trophoblastenzellen in die uterine Decidua ein und remodellieren die Spiralarterien, um einen Durchblutungskreislauf mit geringem Widerstand und hoher Kapazität zu etablieren. Eine beeinträchtigte Invasion und Migration der Trophoblastenzellen führt zu einer verminderten Plazentaperfusion, wodurch eine anhaltende hypoxische Umgebung und oxidativer Stress entstehen. Hypoxie beeinflusst direkt die zelluläre Apoptose, und die fehlgeleitete Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren stört die Homöostase an der materno-fetalen Grenzfläche, was die Plazentadysfunktion weiter verschärft⁵. Auch Entzündungen sind ein wichtiger Treiber der Präeklampsie. Es wurde gezeigt, dass IL-17, IL-6 und TNF-α im Gewebe der Plazenta sowie im peripheren Blut von Patientinnen mit Präeklampsie deutlich erhöht sind⁶. Hypoxie und Entzündung verstärken sich gegenseitig und bilden einen Teufelskreis, der die systemische Entzündungsreaktion potenziert, endotheliale Schäden verursacht und zu plazentaren Anomalien beiträgt. Die zugrundeliegenden molekularen Netzwerke, die die Apoptose von Trophoblasten und entzündliche Reaktionen steuern, sind weitgehend unbekannt.

SASH1 ist ein Mitglied der SLy/SASH1-Familie intrazellulärer Gerüstproteine, die als Signaladapter fungieren⁷. SASH1 wurde hauptsächlich als Tumorsuppressor charakterisiert, der den epithelialen-mesenchymalen Übergang (EMT), Zellmigration und Invasion durch Wechselwirkungen mit Signalkomponenten wie CRKL und dem PI3K-Akt-mTOR-Weg hemmt^8,9. Neben diesen tumorsuppressiven Funktionen deuten neuere Befunde darauf hin, dass SASH1 an entzündlichen Signalwegen und der Immunregulation beteiligt ist⁷. Die Expression und Funktion von SASH1 in der Plazenta, insbesondere im Kontext der Trophoblastbiologie und der präeklampsie (PE), wurde jedoch bisher nicht untersucht.

Exosome sind als wichtige zelluläre Mediatoren hervorgetreten und werden zunehmend im Kontext der Schwangerschaft untersucht¹⁰. Exosome transportieren verschiedene bioaktive Frachten, einschließlich Proteine, Lipide und nichtkodierende RNAs, um die Funktion der Zielzellen zu modulieren. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass P-EXOS eine entscheidende Rolle bei der Immunregulation während der Schwangerschaft spielen und dass ihre Aktivität sowie Fracht bei Präeklampsie (PE) erheblich verändert sind, was möglicherweise den entzündlichen Zustand verstärkt¹¹. Exosome sind außerdem an der Regulation des oxidativen Stresses¹² und der Angiogenese¹³ beteiligt und könnten somit günstige Effekte bei schwangerschaftsbedingten Komplikationen entfalten. Ihre molekularen Zielstrukturen und Wirkmechanismen bei PE sind jedoch noch nicht vollständig verstanden.

Es wurde vermutet, dass SASH1 in der PE-Plazenta dysreguliert ist und als zentraler Treiber der Trophoblasten-Apoptose sowie entzündlicher Reaktionen fungiert, und dass P-EXOS schützende Wirkungen gegen Trophoblasten-Schäden durch Modulation der SASH1-Expression entfalten könnten. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden mehrere transkriptomische Datensätze aus PE-Studien integriert und mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten sowie maschinellen Lernens mit mehreren Algorithmen Schlüsselkandidatengene identifiziert. Unter Verwendung eines hypoxiebehandelten HTR-8/SVneo-Trophoblasten-Zellmodells und exosomenbasierter Interventionsversuche wurde die funktionelle Rolle von SASH1 bei der Trophoblasten-Dysfunktion sowie das therapeutische Potenzial von P-EXOS bei PE untersucht.

Protokoll

Ethische Erklärung

Diese Studie wurde vom Ethikkomitee des Vierten Krankenhauses von Shijiazhuang genehmigt (Genehmigungsnummer 20200031). Von allen Spendern von Plazentagewebe wurde vor der Probenentnahme schriftlich informierte Einwilligung eingeholt. Alle Verfahren an menschlichen Probanden wurden gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Eine vollständige Liste der in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien, Verbrauchsmaterialien, Geräte und Software finden Sie in der Tabelle der Materialien.

Datenerhebung

RNA-Seq-Daten wurden aus der GEO-Datenbank bezogen. Die Datensätze umfassten GSE75010, das Genexpressionsdaten von 157 PE-Plazentas und 173 nicht an PE erkrankten Plazentas enthält (N = 330). GSE10588 enthält Genexpressionsdaten von 26 normalen Plazentas und 17 schweren PE-Plazentas (N = 43). GSE60438 enthält Transkriptom-Profilierungsdaten des Decidua-basalis-Gewebes von Patientinnen mit Präeklampsie und normotensiven Schwangerschaften (N = 125). Einzelzell-Transkriptomdaten wurden aus dem GEO-Datensatz GSE183338 bezogen. Dieser umfasst Einzelkernproben aus den Chorionzotten/dem Mutter-Kind-Interface von Schwangerschaften mit Präeklampsie und gesunden Schwangerschaften.

Analyse differentiell exprimierter Gene

Zunächst wurden die mit PE assoziierten DEGs aus den Datensätzen GSE75010, GSE10588 und GSE60438 vorverarbeitet und normalisiert. Anschließend wurde die differentielle Analyse mithilfe des R-Pakets „limma“¹⁴ basierend auf den Stichprobengruppierungsinformationen durchgeführt. Gene mit einem p < 0,05 und |log2FC| > 0,5 wurden ausgewählt. Die Volcano-Plots der DEGs wurden mit dem R-Paket ggplot2 erstellt. Heatmaps der 20 am stärksten differentiell exprimierten Gene wurden mit dem R-Paket pheatmap generiert. Danach wurde der Durchschnitt der aus den drei Datensätzen ausgewählten DEGs gebildet, und ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) für die Kandidatengene wurde mittels der Online-Plattform STRING mit einem Interaktionsscore ≥0,15 konstruiert. Die 20 wichtigsten Hub-Gene wurden anschließend aus diesem PPI-Netzwerk basierend auf ihrem Vernetzungsgrad identifiziert und mittels der Software Cytoscape rangiert. Die PPI-Netzwerk-Ergebnisse wurden mit der Software Cytoscape oder STRING visualisiert.

Anreicherungsanalyse

Die Genanreicherungsanalyse wurde unter Verwendung der ClusterProfiler- und DOSE-Pakete in Kombination mit der Metascape-Website durchgeführt. Die Datenbanken wurden aus GO und KEGG bezogen. Die Anreicherungsanalyse wurde mithilfe der Funktion „EnrichGO“ durchgeführt. Wege mit p < 0,05 galten als signifikant angereichert. Die Ergebnisse der Anreicherung wurden mit den Paketen „ggplot2“ und „ggpubr“ visualisiert.

Maschinelles Lernen

Um robuste und biologisch aussagekräftige differentiell exprimierte Gene (DEGs), die mit Präeklampsie assoziiert sind, zu identifizieren, wurde eine mehrmodellbasierte Analyse zur Merkmalsauswahl mittels maschinellen Lernens anhand des öffentlich zugänglichen Transkriptom-Datensatzes GSE60438 (Plattform: GPL6884) durchgeführt. Dieser Datensatz enthält die Expressionsprofilerstellung von Decidua-basalis-Proben, die bei Präeklampsie und normotensiven Schwangerschaften während eines Kaiserschnitts gewonnen wurden. Die vorbereinigten DEGs wurden standardisiert, und die Expressionsmatrix zusammen mit den entsprechenden klinischen Gruppierungsinformationen diente als Eingabedaten für vier verschiedene Algorithmen des maschinellen Lernens, um die Modellverzerrung zu verringern und die Stabilität der Merkmalsauswahl zu erhöhen.

Die vier Algorithmen wurden gleichzeitig angewendet, ohne eine bestimmte Reihenfolge. LASSO wurde mithilfe des „glmnet“-Pakets zur Durchführung der Regressionsanalyse und zur Auswahl wichtiger Merkmalsgene verwendet. Ein L1-Regularisierungsterm wurde der Verlustfunktion hinzugefügt, wodurch die Koeffizienten weniger wichtiger Merkmale auf null geschrumpft werden, wodurch eine Merkmalsauswahl erreicht wird. SVM-RFE wurde mit dem „e1071“-Paket implementiert, um eine Support-Vektor-Maschine mit rekursiver Merkmalseliminierung aufzubauen. Zunächst wurde ein Klassifizierer mittels SVM trainiert, und die am wenigsten aussagekräftigen Merkmale wurden iterativ basierend auf den Merkmalsgewichten entfernt, wodurch eine optimale Teilmenge von Merkmalen erhalten wurde. XGBoost wurde mit dem „xgboost“-Paket angewendet, um mehrere Entscheidungsbäume zu erstellen. Jeder Baum passte die Residuen des vorherigen Baums an, und die gewichteten Ausgaben wurden kumuliert, um die endgültige Vorhersage zu erhalten. Boruta wurde mit dem „randomForest“-Paket durchgeführt und erzeugte Schattenmerkmale, die mit echten Merkmalen bei der Schulung eines zufälligen Waldes konkurrierten. Merkmale mit einer Bedeutung, die signifikant über dem Zufallsrauschen lag, wurden beibehalten.

Analyse von Einzelzell-Transkriptomdaten

Einzelzell-Transkriptomdaten wurden aus der GEO-Datenbank bezogen, und die rohe Zählmatrix wurde aus GSE183338 abgerufen. Die Zählmatrix wurde mithilfe der „Read10X“-Funktion des Seurat-Pakets importiert und in das dgCMatrix-Format konvertiert. Einzelne Objekte wurden mit der „merge“-Funktion zu einem einzigen aggregierten Objekt zusammengeführt, und die Zellbeschriftungen wurden mithilfe von „RenameCells“ eindeutig gemacht. Zellen geringer Qualität wurden anhand folgender Kriterien herausgefiltert: Gene, die in weniger als drei Zellen exprimiert wurden, wurden entfernt, und Zellen mit weniger als 200 exprimierten Genen wurden ausgeschlossen. Die qualitätsgeprüften Zellen wurden normalisiert, und hochvariable Gene wurden identifiziert. Eine globale Skalierungsnormalisierung wurde mithilfe von „LogNormalize“ (Skalierungsfaktor = 10.000) durchgeführt, hochvariable Gene (n = 2.000) wurden mit „FindVariableFeatures“ ausgewählt, und die Daten wurden mit „ScaleData“ skaliert. Eine Hauptkomponentenanalyse wurde an den hochvariablen Merkmalen durchgeführt, wobei die 30 wichtigsten Hauptkomponenten beibehalten wurden. Batch-Effekte zwischen den Proben wurden mit der Harmony-Methode korrigiert. Die Zellen wurden mittels UMAP visualisiert und herunterskaliert. Gemeinsame nächstgelegene Nachbargraphen wurden mithilfe von „FindNeighbors“ und „FindClusters“ basierend auf dem Louvain-Algorithmus erstellt. Der Auflösungsparameter in „FindClusters“ wurde zwischen 0,1 und 1 optimiert. Der Clusterbaum wurde mit der „clustree“-Funktion visualisiert, und eine Auflösung von 0,9 wurde gewählt, um Zellcluster zu definieren. Mögliche Doubletts wurden mithilfe des Scrublet-Algorithmus entfernt. Die Zellcluster wurden durch Identifizierung differenziell exprimierter Markergene mit der „FindAllMarkers“-Funktion annotiert. Der nichtparametrische Wilcoxon-Rangsummentest wurde mit Bonferroni-Korrektur angewandt. Die Zellidentitäten wurden basierend auf Oberflächenmarkern, relevanter Literatur und der Cell Classification Database¹⁵ zugewiesen.

Zellkultur

Die Trophoblasten-Zelllinie HTR-8/SVneo-Zellen wurde in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin, kultiviert. Hypoxische Bedingungen wurden durch die Kultivierung der Zellen bei 1 % O₂, 5 % CO₂ und 94 % N₂ für 24 h erzeugt; normoxische Kontrollen wurden bei 20 % O₂ und 5 % CO₂¹⁶ aufrechterhalten. Alle Zellkulturverfahren sollten in einem Biosicherheitswerkbank der Klasse II unter Verwendung aseptischer Techniken durchgeführt werden. Kulturmedien, Transfektionsreagenzien und zellulärer Abfall sind gemäß den institutionellen Richtlinien für Biosicherheit zu entsorgen.

Transfektion von Zellen

Plasmide, die sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 und OE-NC enthielten, wurden synthetisiert. HTR-8/SVneo-Zellen wurden mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in 6-Loch-Platten ausgesät. Anschließend wurden die Zellen mit jeweils 2 µg sh-SASH1-, sh-NC-, OE-SASH1- oder OE-NC-Plasmid pro Vertiefung unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes gemäß den Herstelleranweisungen transfiziert. Kurz gesagt, wurden Plasmid-DNA und P3000-Reagenz in Opti-MEM verdünnt, mit Lipofectamine 3000, das separat in Opti-MEM verdünnt wurde, vermischt, 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und Zellen mit 70–80 % Konfluenz zugegeben. 48 Stunden nach der Transfektion wurde die Expression von SASH1 mittels RT-qPCR und Western Blot überprüft. Die für die SASH1-Genstummschaltung verwendeten shRNA-Zielsequenzen sind in Zusatz-Tabelle 1 aufgeführt.

Quantitative Echtzeit-PCR

Gesamt-RNA wurde aus HTR-8/SVneo-Zellen isoliert und mit einem Reverse-Transkriptionskit bei 42 °C für 30 min in cDNA umgeschrieben, gefolgt von 85 °C für 5 min. Die echtzeitnahe quantitative PCR (qPCR) wurde mit SYBR Green Mastermix unter folgenden Zyklenbedingungen durchgeführt: 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 15 s und 60 °C für 1 min. Die relative mRNA-Expression wurde nach der ΔΔCt-Methode berechnet, wobei β-Aktin als interne Referenz diente. Die in diesem Experiment verwendeten Primersequenzen sind in Supplementary Table 2 aufgeführt.

Western-Blot-Assay

Gesamtprotein wurde aus HTR-8/SVneo-Zellen unter Verwendung des Lysepuffers extrahiert. Die Zelllysate wurden gesammelt, auf Eis inkubiert und bei 4 °C 30 min bei 12.000 × g zentrifugiert, um unlösliche Bestandteile zu entfernen. Die Proteinmenge wurde mithilfe eines Spektrophotometers bestimmt. Gleichmäßige Proteinmengen (50 µg) wurden mittels SDS-PAGE getrennt und anschließend auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch blockiert und über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Membranen mit den entsprechenden sekundären Antikörpern inkubiert, und die Proteinbanden wurden mittels eines verbesserten Chemilumineszenz-Detektionssystems sichtbar gemacht.

Zur Proteinnachweis wurden die primären Antikörper anti-SASH1 und β-Aktin verwendet. Passende mit Horseradish-Peroxidase (HRP) konjugierte sekundäre Antikörper – Ziegen-anti-Kaninchen und Ziegen-anti-Maus – kamen zum Einsatz. β-Aktin diente als interne Ladekontrolle, um eine gleichmäßige Proteinbeladung sicherzustellen. Die Intensität der Proteinbanden wurde mithilfe der ImageJ-Software gemessen und quantifiziert.

Isolierung von P-EXOS

P-EXOS wurden aus Plazentavillengewebe isoliert, das von gesunden Frauen stammte, die eine geplante Kaiserschnittentbindung erhielten. Das Plazentavillengewebe wurde gründlich mit steriler PBS gewaschen, in etwa 1 mm große Stücke zerkleinert und anschließend weiterverarbeitet.³ Fragmente und kultiviert in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % exosomenfreiem FBS, bei 37 °C in 5 % CO₂₂ für 48 h. Das konditionierte Medium wurde einer differenziellen Zentrifugation unterzogen, wie folgt: 300 × g 10 min, um Zellen und Gewebeabfälle zu entfernen; 2.000 × g für 20 min, um Zelltrümmer zu entfernen; und 10.000 × g für 30 min, um Mikrovesikel zu entfernen, jeweils bei 4 °C. Das resultierende Überstand wurde bei 120.000 × g 70 min bei 4 °C, um Exosomen zu pelletieren. Der Pellet wurde einmal mit PBS gewaschen und erneut bei 120.000 × g 70 min bei 4 °C. Das endgültige Pellet wurde in PBS resuspendiert. Die isolierten Exosomen wurden mittels Western-Blot-Analyse auf Exosomenmarker (PLAP, CD63 und TSG101, mit GM130 als negativer Kontrolle) charakterisiert und zusätzlich mittels Transmissionselektronenmikroskopie zur morphologischen Beurteilung untersucht.

P-EXOS-Zellaufnahmeversuch

Um die zelluläre Aufnahme von P-EXOS zu bestätigen, wurden Exosomen gemäß der Herstelleranleitung mit dem lipophilen Membranfarbstoff PKH67 fluoreszenzmarkiert. Kurz gesagt, wurden P-EXOS 5 min bei Raumtemperatur mit PKH67 (4 µM) in Verdünnungsmittel C inkubiert, und die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens von 1 % bovinem Serumalbumin (BSA) gestoppt. Markierte Exosomen wurden durch Ultrazentrifugation (120.000 × g, 70 min, 4 °C) erneut isoliert, um nicht gebundenen Farbstoff zu entfernen. Anschließend wurden PKH67-markierte P-EXOS (50 µg/mL) HTR-8/SVneo-Zellen zugegeben und 24 h unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen (1 % O₂) gemeinsam inkubiert. Die Zellen wurden danach dreimal mit PBS gewaschen, 15 min mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und die Kerne mit DAPI (1 µg/mL) kontragefärbt. Die Aufnahme der PKH67-markierten Exosomen wurde mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM; Anregung 490 nm, Emission 502 nm) visualisiert. Für funktionelle Kokulturversuche wurden HTR-8/SVneo-Zellen 24 h lang unter hypoxischen Bedingungen (1 % O₂) mit P-EXOS in einer Konzentration von 50 µg/mL (Proteinäquivalent) in vollständigem RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % exosomenfreiem FBS, behandelt.

Enzymgebundener Immunosorbens-Assay (ELISA)

Kulturüberstände von Zellen wurden gesammelt, und die Konzentrationen von IL-6, IL-1β und TNF-α wurden entsprechend den Herstelleranweisungen mithilfe eines IL-6-ELISA-Sets, eines IL-1β-ELISA-Sets und eines TNF-α-ELISA-Sets gemessen. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät gemessen, und die tatsächlichen Konzentrationen wurden anhand der Standardkurven berechnet.

TdT-vermittelte dUTP-Nick-End-Labeling (TUNEL)

Apoptotische Zellen wurden mit dem TUNEL-Assay-Kit gemäß den Herstelleranweisungen nachgewiesen. Kurz gesagt wurden die Zellen 15 min bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, auf Eis für 5 min mit 0,1 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert und anschließend 60 min bei 37 °C im Dunkeln mit der TUNEL-Reaktionsmischung inkubiert. Die Kerne wurden mit DAPI kontrastgefärbt, und die TUNEL-positiven Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und durch Bestimmung des Prozentsatzes an TUNEL-positiven Zellen in mindestens fünf zufällig ausgewählten Feldern pro Probe quantifiziert.

Statistische Analyse

Alle Daten wurden mit R und GraphPad Prism analysiert. Stetige Variablen werden als Mittelwert ±SD angegeben. Der Vergleich von zwei Gruppen erfolgte mittels Students t-Test, während der Vergleich mehrerer Gruppen mittels einfaktorieller ANOVA mit anschließendem Tukey’schen Post-hoc-Test durchgeführt wurde. Die statistische Signifikanz kategorialer Variablen wurde mittels Chi-Quadrat-Test oder exaktem Fisher-Test bewertet. Sofern nicht anders angegeben, wurden Korrelationen zwischen Molekülen mittels Spearman-Korrelationsanalyse berechnet. Experimente zur Charakterisierung von Exosomen wurden mit P-EXOS durchgeführt, die aus drei unabhängigen Plazentaspenderinnen isoliert worden waren. Zellbasierte Experimente wurden in drei unabhängigen biologischen Wiederholungen durchgeführt, die jeweils unabhängige Experimente zu verschiedenen Zeitpunkten mit HTR-8/SVneo-Zellen unterschiedlicher Passage darstellen; jede Wiederholung verwendete P-EXOS, die aus einer anderen plazentalen Spenderin isoliert worden waren. Ein p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Transkriptomische Analyse von gesunden Personen und Patienten mit Präeklampsie

Für die Genexpressionsunterschiede zwischen der normalen (Normal) Gruppe und PE-Patienten wurde die differentielle Expression mittels des R-Pakets limma in den zusammengeführten Datensätzen analysiert. Insgesamt wurden 89 DEGs identifiziert (p < 0,05 und |log₂FC| > 0,5), darunter 69 hochregulierte Gene und 20 herunterregulierte Gene für GSE75010 (Abbildung 1A). Es gibt 2.097 differentiell exprimierte Gene, davon 1.121 hochregulierte und 976 herunterregulierte Gene (Abbildung 1B). Für den Datensatz GSE60438 wurden 7.633 DEGs gefunden, mit 3.371 hochregulierten und 4.262 herunterregulierten Genen (Abbildung 1C). Die erheblichen Unterschiede in der Anzahl der DEGs zwischen den drei Datensätzen spiegeln wahrscheinlich Unterschiede in der Stichprobengröße, dem Gewebetyp (plazentare Zotten vs. Decidua basalis) und der Klassifizierung der PE-Schwere wider, was weiterhin die Bedeutung unterstreicht, den Durchschnitt der Datensätze zu bilden, um robuste gemeinsame DEGs zu identifizieren.

Funktionelle Anreicherungsanalyse von DEGs

Zur systematischen Identifizierung zentraler DEGs im Zusammenhang mit PE wurde eine Venn-Analyse der DEGs aus den PE-Datensätzen GSE75010, GSE10588 und GSE60438 durchgeführt, wodurch letztendlich 56 gemeinsame DEGs identifiziert wurden (Abbildung 2A). Mithilfe der Online-Plattform STRING (Interaktionsscore ≥0,15) wurde ein PPI-Netzwerk für diese 56 gemeinsamen DEGs erstellt, und basierend auf ihrem Vernetzungsgrad wurden die 20 wichtigsten Hub-Gene ermittelt, die mittels der Software Cytoscape rangiert wurden (Abbildung 2B). Auf Grundlage dieser Gene wurde außerdem eine GO-Enrichment-Analyse durchgeführt, um potenzielle Funktionen in biologischen Prozessen (BP), zellulären Komponenten (CC) und molekularen Funktionen (MF) zu untersuchen (Abbildung 2C). Die DEGs zeigten eine stärkste Anreicherung in der Hormonsekretion sowie in der Regulation der Transmembranrezeptor-Serin/Threonin-Kinase-Signalübertragung. Auf zellulärer Ebene waren die Gene hauptsächlich in fokalen Adhäsionen, Zell-Substrat-Verbindungen und einer Vielzahl von vesikel- und lysosomenbezogenen Genen lokalisiert. In Bezug auf molekulare Funktionen umfassten die angereicherten Terme Prolylhydroxylase-Aktivität, Hormonaktivität und den transmembranen Transport lipidbezogener Moleküle. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die DEGs möglicherweise wichtige Rollen bei der Signalübertragung in Plazentazellen, der Interaktion zwischen Zelle und Matrix sowie der Aufrechterhaltung endokrinbezogener Funktionen spielen. Gleichzeitig zeigte die KEGG-Pfad-Anreicherung, dass die DEGs am stärksten in der Interaktion von Zytokinen und Zytokinrezeptoren, der Interaktion von Adhäsionsmolekülen auf Zellen sowie in den Signalwegen von TGF-β und HIF-1 angereichert waren (Abbildung 2D). Die Anreicherung bestimmter virusbezogener Terme (z. B. Hepatitisviren, Ebolavirus) spiegelt vermutlich eine unspezifische Überlappung mit gemeinsamen immunregulatorischen Genen wider und nicht eine direkte biologische Assoziation mit PE; der interpretative Fokus liegt daher auf entzündungs-, adhäsions- und hypoxiebezogenen Wegen. Diese Signalwege sind mit entzündlichen Reaktionen, der adhäsionsvermittelten Zellinteraktion und hypoxiebezogenen Signalvorgängen assoziiert und könnten den Fortschritt von PE beeinflussen, indem sie den immun-entzündlichen Status und die Zell-Zell-Kommunikation im mikrobiologischen Umfeld der Plazenta verändern.

Das maschinelle Lernen identifiziert SASH1 als ein Schlüsselgen bei PE

Zur Identifizierung wichtiger prognostischer Gene wurden vier maschinelle Lernverfahren für die Merkmalsauswahl angewandt. Die LASSO-Regression mit Kreuzvalidierung zeigte, dass das Modell den minimalen Kreuzvalidierungsfehler erreichte, wenn log(λ.min) = -3,8075 betrug. Gene mit nicht-null Koeffizienten bei diesem λ-Wert wurden als Schlüsselmerkmale ausgewählt, die mittels LASSO identifiziert wurden (Abbildung 3A–B). Der Boruta-Algorithmus bewertet die Wichtigkeit von Merkmalen durch Vergleich mit Schattenmerkmalen. Gene mit Wichtigkeitswerten über shadowMax wurden als Bestätigt gekennzeichnet und als wichtige Kandidatengene betrachtet, während jene mit Wichtigkeitswerten unter shadowMin als Abgelehnt markiert und als nicht signifikant beitragend eingestuft wurden. Gene zwischen diesen beiden Schwellenwerten wurden als Vorläufig klassifiziert, was auf eine mögliche, aber unsichere Bedeutung hinweist (Abbildung 3C). Die SVM-RFE-Analyse zeigte, dass bei Beibehaltung von 40–50 Merkmalen die Kreuzvalidierungsgenauigkeit ihr höchstes oder nahezu höchsten Niveau erreichte, was auf eine optimale Vorhersageleistung bei diesem Merkmalsumfang hindeutet (Abbildung 3D). Die moderate Kreuzvalidierungsgenauigkeit (~0,6) zeigt an, dass kein einzelner Algorithmus für diesen Datensatz optimal abschnitt; daher wurde eine Strategie des multiplen Algorithmus-Schnitts angewandt, um die Robustheit der Merkmalsauswahl zu erhöhen. XGBoost quantifizierte die relative Wichtigkeit der Gene anhand von Gain-Werten und identifizierte so Merkmale mit höherem Beitrag zur Modellvorhersage (Abbildung 3E). Die Venn-Schnittmengenanalyse der Ergebnisse der vier Methoden identifizierte SASH1 als einziges überlappendes Gen. Obwohl SASH1 im Boruta-Algorithmus als Vorläufig klassifiziert wurde, stützt die konsistente Auswahl durch alle drei anderen Algorithmen seine Einstufung als konsensbasiertes Kandidatengen (Abbildung 3F).

Einzelzellanalyse

Die zelluläre Heterogenität und die molekularen Prozesse in PE-Plazentageweben wurden untersucht. Die Zellen wurden anhand der Anzahl der nachgewiesenen Gene, der Anzahl der RNA-Zählungen und des Prozentsatzes der mitochondrialen Genexpression qualitätsgefiltert. Niedrigqualitative Zellen (weniger als 200 nachgewiesene Gene oder mehr als 20 % mitochondriale Genexpression) wurden entfernt, um eine hochwertige Einzelzellprobe für die nachgeschaltete Analyse zu erhalten. Die Qualitätskontrollkennzahlen und die Identifizierung hochvariabler Gene sind in Supplementary Figure 1A–B dargestellt. Nach der Normalisierung und Identifizierung hochvariabler Gene wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) unter Verwendung der 2.000 am stärksten variablen Gene sowie signifikanter Hauptkomponenten mithilfe der JackStraw-Analyse und der ElbowPlot-Analyse durchgeführt (Supplementary Figure 2A–B).

Basierend auf den Hauptkomponenten wurde die Uniforme Mannigfaltigkeitsapproximation und Projektion (UMAP) zur Dimensionsreduktion und Durchführung einer unbeaufsichtigten Clusterung verwendet, wobei alle Zellen in 22 Cluster klassifiziert wurden, was die hohe zelluläre Heterogenität im Plazentagewebe verdeutlicht (Abbildung 4A). Durch die Untersuchung der cluster-spezifischen Expression von Markergenen und die Visualisierung differentiell exprimierter Gene (DEGs) in einer Heatmap (Abbildung 4B) wurde jeder Cluster anhand eines kanonischen Markers annotiert und anschließend zurück in das UMAP-Embedding projiziert (Abbildung 4C). Basierend auf diesen Hauptpopulationen plazentaler Zellen konnten B-Zellen/Plasmazellen, endotheliale Zellen, Fibroblasten/Stromazellen, Makrophagen/Dendritische Zellen, natürliche Killerzellen, T-Zellen sowie Trophoblastenzellen identifiziert werden. Vergleiche zwischen Kontroll- und PE-Gruppen zeigen, dass mehrere Zelltypen in PE-Plazentas eine erhebliche relative Verteilung aufweisen, was auf eine Umgestaltung des plazentaren Mikromilieus hindeutet (Abbildung 4D).

Die Gewebeherkunft und der Krankheitsstatus wurden verwendet, um Zellen in derselben UMAP-Einbettung basierend auf der Gewebequelle (Decidua vs. Villi) und der Krankheitsgruppierung (Kontrolle vs. PE) zu verfolgen (Abbildung 4E). Die Verteilung der Zellanzahl war teilweise nach Gewebeherkunft getrennt, während Zellen aus unterschiedlichen Krankheitsgruppen stark miteinander verbunden waren. Dies legt nahe, dass PE die gesamte transkriptomische Struktur nicht wesentlich umgestaltet, jedoch möglicherweise Auswirkungen auf einzelne Zellpopulationen oder bestimmte molekulare Merkmale hat. Die Expression von SASH1 wurde auf das UMAP abgebildet, um ihre Verteilung unter den plazentaren Zellpopulationen zu untersuchen (Abbildung 4F–G). SASH1 zeigt eine stark zelltypspezifische Expression mit bemerkenswerten Unterschieden zwischen den decidualen und villösen Zellpopulationen. Der statistische Vergleich der SASH1-Expression zwischen PE- und Kontrollgruppen über verschiedene Zelltypen hinweg (Wilcoxon-Rangsummentest) ergab signifikante Unterschiede in mehreren plazentaren Zellpopulationen, wobei die stärkste Erhöhung in Trophoblastenzellen aus PE-Proben beobachtet wurde (Abbildung 4H). Dieser Befund liefert Einzelzell-Evidenz dafür, dass die Dysregulation von SASH1 im Trophoblasten-Kompartiment besonders ausgeprägt ist, und unterstützt die Verwendung der HTR-8/SVneo-Trophoblastenzelllinie für nachfolgende funktionelle Experimente.

Die Absenkung von SASH1 hemmt die hypoxieinduzierte Apoptose von Trophoblasten und entzündliche Reaktionen

Zur Validierung der bioinformatischen Vorhersagen wurde ein PE-bezogenes Trophoblasten-Zellmodell unter hypoxischen Bedingungen (1 % O₂) etabliert. qPCR- und Western-Blot-Analysen wurden durchgeführt, um die SASH1-Expression zu bewerten (Abbildung 5A–B). Im Vergleich zu normoxischen HTR-8/SVneo-Zellen zeigten hypoxiebehandelte Zellen signifikant erhöhte SASH1-mRNA- und Proteinexpressionsniveaus, was eine vorläufige experimentelle Bestätigung der bioinformatischen Ergebnisse darstellt. Um den Effekt der SASH1-Reduktion auf PE-bezogene pathologische Prozesse zu untersuchen, wurde SASH1 in hypoxiebehandelten HTR-8/SVneo-Zellen stillgelegt. Quantitative PCR- und Western-Blot-Analysen (Abbildung 5C–D) zeigten, dass die SASH1-Expression in allen sh-SASH1-Gruppen im Vergleich zur sh-NC-Gruppe signifikant verringert war. Unter diesen erwies sich sh-SASH1#3 als am effizientesten in der Knockdown-Wirkung und wurde daher für nachfolgende Experimente ausgewählt. TUNEL-Färbung und ELISA wurden unter drei Bedingungen durchgeführt: normoxische Kontrolle (Normal), Hypoxie mit negativer Kontroll-shRNA (Hypoxia + sh-NC) und Hypoxie mit SASH1-Knockdown (Hypoxia + sh-SASH1). Im Vergleich zur Normal-Gruppe zeigte die Hypoxia + sh-NC-Gruppe signifikant erhöhte Apoptose sowie erhöhte Sekretion der proinflammatorischen Zytokine IL-1β, IL-6 und TNF-α, was eine hypoxieinduzierte Trophoblastenschädigung bestätigt. Die SASH1-Reduktion verminderte diese Effekte deutlich und senkte die Apoptose (Abbildung 5E) sowie die Zytokinspiegel (Abbildung 5F) auf Werte, die jenen der Normal-Gruppe nahekamen, was darauf hindeutet, dass die SASH1-Reduktion die hypoxieinduzierte Trophoblastenapoptose und entzündlichen Reaktionen weitgehend kompensieren kann. Um die kausale Rolle von SASH1 weiter zu belegen, wurden Gain-of-Function-Experimente durchgeführt. qPCR und Western Blot bestätigten eine erfolgreiche Überexpression von SASH1 in HTR-8/SVneo-Zellen (Abbildung 5G–H). Unter normoxischen Bedingungen führte die SASH1-Überexpression (OE-SASH1) im Vergleich zur OE-NC-Gruppe zu einer signifikanten Zunahme der Trophoblastenapoptose und der Sekretion proinflammatorischer Zytokine, wodurch das hypoxieinduzierte Phänotyp nachgeahmt wurde (Abbildung 5I–J). Insgesamt zeigen die Verlust- und Gewinn-an-Funktion-Daten, dass SASH1 sowohl notwendig als auch ausreichend ist, um die Trophoblastenapoptose und entzündlichen Reaktionen anzutreiben, und bestätigen damit seine kausale Rolle in der PE-bezogenen Pathologie.

P-EXOS unterdrückt die Hypoxie-induzierte Apoptose von Trophoblasten und entzündliche Reaktionen durch die Modulation von SASH1

P-EXOS gelten als therapeutisch vielversprechend bei PE. In dieser Studie deutete eine Bioinformatik-Analyse darauf hin, dass SASH1 mit exosomenbezogenen Signalwegen assoziiert ist (wie durch GO- und KEGG-Anreicherung gezeigt, Abbildung 2C–D), was uns zu der Hypothese führte, dass P-EXOS bei PE einen schützenden Effekt über die Regulation von SASH1 entfalten könnten. Vor funktionellen Untersuchungen wurden die isolierten P-EXOS zunächst charakterisiert. Eine Western-Blot-Analyse bestätigte das Vorhandensein der Exosomen-Markerproteine PLAP, CD63 und TSG101, während kein nachweisbarer Ausdruck des Golgi-Markers GM130 festgestellt wurde, was auf eine hohe Reinheit der isolierten Vesikel hindeutet. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte zudem typische tassenförmige vesikuläre Strukturen (Abbildung 6A–B). Um zu überprüfen, ob P-EXOS effizient von Zielzellen aufgenommen werden können, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt, um die zelluläre Aufnahme von P-EXOS zu bewerten. Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten HTR-8/SVneo-Zellen, die mit P-EXOS behandelt wurden, in den überlagerten Bildern deutliche Kolokalisationssignale, was darauf hindeutet, dass P-EXOS effektiv von HTR-8/SVneo-Zellen internalisiert wurden (Abbildung 6C).

Anschließend wurden HTR-8/SVneo-Zellen unter hypoxischen Bedingungen mit P-EXOS koinkubiert. Sowohl quantitative PCR- als auch Western-Blot-Analysen zeigten eine deutliche Verringerung der SASH1-mRNA- und Proteinspiegel in der mit P-EXOS behandelten Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen (Abbildung 6D–E), was erste Hinweise auf eine regulatorische Interaktion zwischen P-EXOS und SASH1 liefert. In Übereinstimmung mit diesen molekularen Veränderungen zeigte die TUNEL-Färbung eine erhebliche Abschwächung der hypoxieinduzierten Apoptose in HTR-8/SVneo-Zellen nach Behandlung mit P-EXOS (Abbildung 6F). Gleichzeitig wiesen ELISA-Analysen eine deutlich verminderte Sekretion proinflammatorischer Zytokine, darunter IL-6, IL-1β und TNF-α, nach (Abbildung 6G).

Um zu bestimmen, ob die schützenden Wirkungen von P-EXOS mechanistisch von der Unterdrückung von SASH1 abhängen, wurde ein Rescue-Experiment unter hypoxischen Bedingungen durchgeführt. Zellen mit Überexpression von SASH1 (OE-SASH1 + P-EXOS) wurden mit negativen Kontrollzellen (OE-NC + P-EXOS) verglichen. Die Überexpression von SASH1 beseitigte die schützenden Effekte von P-EXOS signifikant, wie durch erhöhte Apoptose (Abbildung 6H) und gesteigerte Sekretion proinflammatorischer Zytokine (Abbildung 6I) im Vergleich zur OE-NC + P-EXOS-Gruppe belegt wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass die schützende Wirkung von P-EXOS spezifisch über die Unterdrückung von SASH1 vermittelt wird und nicht über parallele Signalwege, was das therapeutische Potenzial von P-EXOS bei PE unterstreicht.

VERFÜGBARKEIT VON DATEN:

Die Datensätze, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, sind öffentlich zugänglich und wurden aus der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) mit den Zugangsnummern GSE75010, GSE10588, GSE60438 und GSE183338 bezogen. Die Zelltyp-Annotation wurde unter Bezugnahme auf die Cell Classification Database (https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/) durchgeführt. Ungeschwärzte Western Blot-Bilder und alle weiteren rohen experimentellen Daten, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, sind im Ordner Supplementary Raw Data enthalten.

Abbildung 1: Identifizierung differentiell exprimierter Gene (DEGs) in Plazenta- und Dezidualgeweben bei Präeklampsie (PE) anhand von drei unabhängigen Datensätzen. (A) Volcano-Plot der DEGs zwischen 157 Plazentaproben von Präeklampsiefällen und 173 Plazentaproben ohne Präeklampsie aus dem kombinierten Datensatz GSE75010. (B) Volcano-Plot der DEGs zwischen schweren Präeklampsie-Proben der Plazenta (n = 17) und normalen Plazentaproben (n = 26) aus dem Datensatz GSE10588. (C) Volcano-Plot der DEGs zwischen Dezidualproben bei Präeklampsie und normotensiven Kontrolldezidualproben aus dem Datensatz GSE60438. Die DEGs wurden anhand eines p-Werts < 0,05 und eines |log₂FC| > 0,5 identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Funktionsanreicherung und PPI-Analyse gemeinsamer DEGs im Zusammenhang mit Präeklampsie. (A) Mengendiagramm der aus den präeklampsiebezogenen Datensätzen GSE75010, GSE10588 und GSE60438 identifizierten DEGs. (B) PPI-Netzwerk der 20 wichtigsten Hub-Gene, ausgewählt aus den 56 gemeinsamen DEGs basierend auf dem Grad der Vernetzung, sortiert mithilfe der Cytoscape-Software (STRING-Interaktionsscore ≥0,15). (C) GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen der gemeinsamen DEGs, dargestellt als Balkendiagramme. (D) GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen der gemeinsamen DEGs, dargestellt als Sehnendiagramme. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Maschinelle Lernbasierte Screening-Untersuchung von Kandidaten-Hub-Genen, die mit Präeklampsie assoziiert sind. (A) LASSO-Regressionsanalyse, die die Koeffizientenprofile der Kandidatengene zeigt. (B) Auswahl des optimalen Regularisierungsparameters (λ) mittels LASSO-Regression mit Kreuzvalidierung. (C) Boruta-Algorithmus. (D) SVM-RFE-Analyse. (E) XGBoost-Algorithmus. (F) Venn-Diagramm, das den Durchschnitt der von den Algorithmen LASSO, Boruta, SVM-RFE und XGBoost identifizierten Kandidatengene zeigt. Abkürzungen: LASSO = least absolute shrinkage and selection operator; SVM-RFE = support vector machine recursive feature elimination. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Die Einzelzell-Transkriptom-Analyse zeigt zelltypspezifische SASH1-Expressionsmuster bei Präeklampsie. (A) UMAP-Clustering des Einzelzell-Datensatzes. (B) Analyse der fünf stärksten Marker zur Annotation des Einzelzell-Transkriptom-Datensatzes GSE183338 aus Präeklampsie-Proben. (C) Annotation der Zellsubpopulationen. (D) Balkendiagramm zur Darstellung der Verteilung der Zellanteile in Kontroll- und Präeklampsie-Proben. (E) UMAP-Diagramm, eingefärbt nach Gewebekompartiment (Decidua und Villi) und Krankheitsstatus (Kontrolle und Präeklampsie). (F) UMAP-Diagramm zur Darstellung der SASH1-Expression in plazentaren Zellpopulationen, gruppiert nach Gewebekompartiment (Decidua und Villi). (G) UMAP-Diagramm zur Darstellung der SASH1-Expression in plazentaren Zellpopulationen, gruppiert nach Krankheitsstatus (Kontrolle und Präeklampsie). (H) Violindiagramm zur Darstellung der Expressionsverteilung von SASH1 über verschiedene plazentare Zelltypen hinweg. ns p > 0,05; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Abkürzungen: UMAP = uniform manifold approximation and projection; ns = nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5SASH1 reguliert die hypoxieinduzierte Apoptose und Entzündungsreaktion in Trophoblasten. (AqPCR-Analyse der SASH1-mRNA-Expression und dichtometrische Quantifizierung der SASH1-Proteinspiegel in HTR-8/SVneo-Zellen unter normalen und hypoxischen Bedingungen.B) Repräsentative Western-Blot-Bilder, die den in (A) gezeigten dichtometrischen Daten entsprechen. (CqPCR-Analyse der SASH1-mRNA-Expression und dichtometrische Quantifizierung der SASH1-Proteinspiegel in unter Hypoxie behandelten HTR-8/SVneo-Zellen, die mit sh-NC- oder sh-SASH1-Konstrukten (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 und sh-SASH1#3) transfiziert wurden. (D) Repräsentative Western-Blot-Bilder, die den in (C) gezeigten dichtometrischen Daten entsprechen. (E) TUNEL-Färbung von HTR-8/SVneo-Zellen in den Gruppen Normal, Hypoxie + sh-NC und Hypoxie + sh-SASH1(#3). Maßstabsbalken = 20 µm. (FELISA-Analyse entzündungsfördernder Zytokine (IL-1β, IL-6 und TNF-α) in den Gruppen Normal, Hypoxie + sh-NC und Hypoxie + sh-SASH1(#3). (GqPCR-Analyse der SASH1-mRNA-Expression und dichtometrische Quantifizierung der SASH1-Proteinspiegel in HTR-8/SVneo-Zellen, die mit OE-NC- oder OE-SASH1-Konstrukten transfiziert wurden.H) Repräsentative Western-Blot-Bilder, die den in (G) gezeigten dichtometrischen Daten entsprechen. (I) TUNEL-Färbung von HTR-8/SVneo-Zellen in den Gruppen Normal + OE-NC und Normal + OE-SASH1. Maßstabsbalken = 20 µm. (J) ELISA-Analyse entzündungsfördernder Zytokine (IL-1β, IL-6 und TNF-α) in den Gruppen Normal + OE-NC und Normal + OE-SASH1. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0,001. Die Daten sind als Mittelwert dargestellt ± SD aus drei unabhängigen biologischen Wiederholungen (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: P-EXOS lindern hypoxieinduzierte Trophoblastenschäden durch Hemmung von SASH1. (A) Western-Blot-Analyse der P-EXOS-Markerproteine PLAP, CD63 und TSG101, wobei GM130 als negativer Kontrollmarker diente. (B) Analyse der P-EXOS-Morphologie mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Maßstab = 1,0 µm. (C) Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopiebilder, die die Aufnahme von PKH67-markierten P-EXOS (grün) in HTR-8/SVneo-Zellen (rot) zeigen. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) kontragefärbt. Maßstab = 20 µm. (D) qPCR-Analyse der SASH1-mRNA-Expression sowie dichtometrische Quantifizierung der SASH1-Proteinmengen in HTR-8/SVneo-Zellen der Kontroll- und P-EXOS-Gruppen. (E) Repräsentative Western-Blot-Bilder, die den dichtometrischen Daten aus (D) entsprechen. (F) TUNEL-Färbung von HTR-8/SVneo-Zellen in der Kontroll- und P-EXOS-Gruppe. Maßstab = 20 µm. (G) ELISA-Analyse entzündungsfördernder Zytokine (IL-1β, IL-6 und TNF-α) in hypoxiebehandelten HTR-8/SVneo-Zellen der Kontroll- und P-EXOS-Gruppen. (H) TUNEL-Färbung von HTR-8/SVneo-Zellen in den Gruppen OE-NC + P-EXOS und OE-SASH1 + P-EXOS. Maßstab = 20 µm. (I) ELISA-Analyse entzündungsfördernder Zytokine (IL-1β, IL-6 und TNF-α) in hypoxiebehandelten HTR-8/SVneo-Zellen der Gruppen OE-NC + P-EXOS und OE-SASH1 + P-EXOS. Abkürzungen: P-EXOS = plazentabasierte Exosome; TEM = Transmissionselektronenmikroskopie; PLAP = plazentares alkalines Phosphatase; TSG101 = Tumorsuszeptibilitätsgen 101. *p < 0,05; **p < 0,01. Die Daten sind als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen biologischen Wiederholungen dargestellt (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 1, Ergänzendes Material: Qualitätskontrolle der Einzelzell-RNA-Seq-Daten. (A) Violin-Plot der Genexpressionsniveaus nach der Qualitätskontrolle. (B) Plot der variablen Merkmale, der die nach der Qualitätskontrolle identifizierten hochvariablen Gene zeigt.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweiterte Abbildung 2: Bestimmung statistisch signifikanter Hauptkomponenten für die Einzelzell-Clustering-Analyse. (A) JackStraw-Punktdiagramm zur Identifizierung statistisch signifikanter Hauptkomponenten. (B) Ellbogen-Punktdiagramm, das die von den Hauptkomponenten erklärte Varianz zeigt.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweiterte Tabelle 1: shRNA-Zielsequenzen zur SASH1-Abschaltung. shRNA-Zielsequenzen (5′–3′) für die negative Kontrolle (sh-NC) und drei SASH1-gerichtete Konstrukte (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 und sh-SASH1#3), die für die Genstilllegung verwendet wurden.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweiterte Tabelle 2: Primersequenzen für die quantitative PCR. Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen (5′–3′) für SASH1 und β-Aktin (interne Referenzkontrolle), die in der qPCR-Analyse verwendet wurden.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

In dieser Studie wurde SASH1 durch integrierte transkriptomische Analysen, Einzelzellsequenzierung und maschinelles Lernen mit mehreren Algorithmen als Schlüsselgen identifiziert, das bei Präeklampsie dysreguliert ist – ein Ansatz, der besonders relevant ist, da für Präeklampsie bislang keine gezielten Therapien verfügbar sind¹⁷. Es wurde gezeigt, dass SASH1 in hypoxischen Trophoblastenzellen signifikant hochreguliert ist und im Trophoblastenkompartiment von Präeklampsie-Plazentas auf Einzelzellauflösung spezifisch erhöht vorliegt. Durch Funktionsverlust- und Funktionsgewinn-Experimente wurde nachgewiesen, dass SASH1 sowohl notwendig als auch ausreichend ist, um Apoptose der Trophoblasten und die Sekretion proinflammatorischer Zytokine zu induzieren. Darüber hinaus milderte die Behandlung mit P-EXOS die hypoxieinduzierte Trophoblastenschädigung ab, und dieser protektive Effekt wurde durch die Überexpression von SASH1 aufgehoben, was bestätigt, dass der durch P-EXOS vermittelte zytoprotektive Effekt mechanistisch von der Suppression von SASH1 abhängt.

Zusätzlich wurden bei der Präeklampsie Veränderungen im Verhältnis mehrerer plazentarer Zelltypen beobachtet, darunter B-Zellen/Plasmazellen, endotheliale Zellen, Fibroblasten/stromale Zellen, Makrophagen/dendritische Zellen, NK-Zellen, T-Zellen und Trophoblastenzellen. Diese Befunde deuten darauf hin, dass die mikrobielle Umgebung der Plazenta während der Präeklampsie einer erheblichen Umgestaltung unterliegt. Ein solches entzündliches Mikromilieu verschlechtert nicht nur die Trophoblastenfunktion, sondern könnte auch den Krankheitsverlauf durch Interaktionen zwischen dem Immunsystem und der extrazellulären Matrix beschleunigen¹⁸. Darüber hinaus wurden kürzlich neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) als Faktor identifiziert, der die plazentare Entzündung bei der Präeklampsie verstärkt¹⁹. SASH1 wird aufgrund seiner Beteiligung an entzündlichen Signalwegen, der Zelladhäsion und hypoxiebezogenen Prozessen als wesentlicher Faktor bei der Entstehung der Präeklampsie angesehen. In dieser Studie wurden Genexpressionsprofile aus Plazentaproben von Präeklampsie-Patientinnen und normotensiven Schwangerschaften mithilfe des limma-Pakets extrahiert und verschiedene maschinelle Lernalgorithmen – LASSO-Regression, SVM-RFE, XGBoost und Boruta – zur Merkmalsauswahl eingesetzt. Bei allen Algorithmen zeigte sich SASH1 durchgängig als konsensuell identifiziertes Kandidatengen. Auf Einzelzell-Ebene wies SASH1 eine zelltypspezifische Expression in verschiedenen plazentaren Zellpopulationen auf und behielt in Präeklampsie-Proben eine erhöhte Expression bei, wobei der stärkste Unterschied in den Trophoblastenzellen festgestellt wurde. Dies legt nahe, dass SASH1 in unterschiedlichen plazentaren Zellkontexten jeweils spezifische funktionelle Effekte entfalten könnte.

SASH1 ist ein Signaladapterprotein, von dem berichtet wurde, dass es an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt ist, einschließlich Zellmigration und -invasion, epithelial-mesenchymalem Übergang sowie der Regulation stressbedingter Signalwege^8,9. Um die funktionelle Rolle von SASH1 in der mit Präeklampsie assoziierten Pathologie zu untersuchen, wurde ein hypoxieinduziertes Trophoblastenmodell unter Verwendung von HTR-8/SVneo-Zellen etabliert. Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine hypoxische Exposition die Expression von SASH1 signifikant hochregulierte, während die Reduktion von SASH1 die hypoxieinduzierte Apoptose deutlich abschwächte und die Sekretion proinflammatorischer Zytokine, darunter IL-1β, IL-6 und TNF-α, verringerte. Umgekehrt reichte die Überexpression von SASH1 unter normoxischen Bedingungen aus, um das hypoxieinduzierte Phänotyp zu reproduzieren, wodurch die kausale Rolle von SASH1 bei der Induktion von Trophoblastenschäden belegt wurde. Diese Befunde legen nahe, dass SASH1 den funktionellen Status von Trophoblasten negativ regulieren könnte, indem es entzündliche Reaktionen moduliert. Da Trophoblasten eine wesentliche Quelle plazentarer entzündungsfördernder Mediatoren darstellen²⁰, könnte eine fehlerhafte SASH1-Expression eine entscheidende molekulare Grundlage für die Verstärkung der Entzündungsreaktion bei Präeklampsie darstellen. Bemerkenswert ist, dass die pro-apoptotischen und proinflammatorischen Funktionen von SASH1, die in Trophoblastenzellen beobachtet wurden, im Gegensatz zu seiner kanonischen tumorsuppressiven Rolle in Krebszellen stehen, wo es typischerweise EMT und Migration hemmt^8,9. Diese kontextabhängige funktionelle Dualität könnte zelltypspezifische Unterschiede in den SASH1-Interaktionspartnern und den nachgeschalteten Signalnetzwerken widerspiegeln und bedarf weiterer Untersuchungen.

Exosome gelten als wichtige Mediatoren der interzellulären Kommunikation und sind an der Pathogenese der Präeklampsie beteiligt²¹. Insbesondere könnten P-EXOS eine wichtige Rolle bei der Immunregulation während einer normalen Schwangerschaft spielen, beispielsweise durch die Aufrechterhaltung der mütterlich-fötalen Immunotoleranz, was einen Schutz vor Präeklampsie vermitteln könnte²². In dieser Studie zeigte eine bioinformatische Analyse einen Zusammenhang zwischen SASH1 und exosombezogenen Signalwegen, was weitere Untersuchungen zur Rolle von P-EXOS bei der Regulation der Trophoblastenfunktion motivierte. Ko-Kultivierungsversuche zeigten, dass die Behandlung mit P-EXOS die mRNA- und Proteinspiegel von SASH1 in unter Hypoxie behandelten Trophoblastzellen signifikant verringerte und hypoxieinduzierte Apoptose sowie entzündliche Reaktionen deutlich abschwächte. Wichtig ist, dass die Überexpression von SASH1 diese schützenden Effekte aufhob und damit bestätigte, dass der P-EXOS-vermittelte zytoprotektive Effekt mechanistisch von der Suppression von SASH1 abhängt und nicht über parallele Signalwege wirkt.

Die molekularen Mechanismen, durch die P-EXOS die Expression von SASH1 unterdrücken, müssen noch aufgeklärt werden. Bekanntermaßen enthalten P-EXOS vielfältige bioaktive Frachten, darunter Mikro-RNAs, Proteine und Lipide, die die Genexpression in Zielzellen modulieren können¹⁰. Eine Möglichkeit besteht darin, dass P-EXOS spezifische miRNAs abgeben, die SASH1 direkt oder indirekt angreifen. Alternativ könnten P-EXOS übergeordnete Signalwege – wie NF-κB oder PI3K-Akt – modulieren, die auf die transkriptionelle Regulation von SASH1 einwirken. Da SASH1 in Krebszellen mit dem PI3K-Akt-mTOR-Signalweg assoziiert wurde⁸, ist es denkbar, dass eine exosomvermittelte Modulation dieses Signalpfads zur Herabregulation von SASH1 in Trophoblastenzellen beiträgt. Zukünftige Studien, die die Sequenzierung exosomaler Frachten und spezifische Hemmstoffe für Signalwege einsetzen, werden erforderlich sein, um die genaue molekulare Kaskade zu entschlüsseln, über die P-EXOS die Expression von SASH1 regulieren.

In dieser Studie wurde die Transkriptom-Profilierung mit der Einzelzell-RNA-Sequenzierung kombiniert, um die molekularen Veränderungen im Plazentagewebe bei Präeklampsie (PE) zu untersuchen. Es wurde gezeigt, dass SASH1 eine Schlüsselrolle bei der hypoxieinduzierten Trophoblasten-Apoptose und entzündlichen Reaktionen spielt und dass P-EXOS durch die Unterdrückung der SASH1-Expression eine schützende Wirkung entfalten kann. Dies liefert neue Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen, die PE zugrunde liegen, und legt eine mögliche therapeutische Strategie nahe. Diese Studie weist jedoch mehrere Limitationen auf. Erstens stammten die funktionellen Ergebnisse hauptsächlich aus der immortalisierten Trophoblastenzelllinie HTR-8/SVneo; eine Validierung an primären Trophoblastenzellen ist erforderlich. Zweitens wurde die SASH1-Proteinexpression in klinischen Plazentageweben von PE-Patientinnen mittels Immunhistochemie nicht validiert, was die translationalen Schlussfolgerungen einschränkt und in zukünftigen Studien adressiert werden sollte. Drittens zeigte der SVM-RFE-Klassifikator eine moderate Kreuzvalidierungsgenauigkeit (~0,6), was die inhärente Heterogenität des Datensatzes widerspiegelt; größere unabhängige Kohorten werden benötigt, um robustere diagnostische Modelle zu entwickeln. Viertens bleibt der genaue molekulare Mechanismus, durch den P-EXOS die SASH1-Expression unterdrückt, unklar. Fünftens wurden unspezifische Färbungen in der SASH1-Western-Blot-Detektion beobachtet, was auf eine suboptimale Antikörperspezifität zurückzuführen sein könnte. Der in diesem Experiment verwendete Antikörper ist ein polyklonaler Antikörper, der im Vergleich zu monoklonalen Antikörpern generell eine geringere Spezifität in der Immunodetektion aufweist. Dennoch beeinträchtigen diese unspezifischen Banden die Ergebnisse bezüglich des SASH1-Proteins oder die Schlussfolgerungen dieser Studie nicht. Zukünftige Studien, die in vivo-Experimente, die Analyse klinischer Proben sowie die Charakterisierung der exosomalen Fracht einbeziehen, sind erforderlich, um die funktionelle Rolle der P-EXOS-SASH1-Achse bei PE weiter aufzuklären und ihr translationalen Potenzial zu bewerten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RPMI-1640-Medium	Gibco	11875085
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco	16140071
Exosomenfreies FBS	System Biosciences	EXO-FBS-50A-1
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, CN	15140122
Lipofectamin-3000-Transfektionsreagenz (mit P3000-Reagenz)	Thermo Fisher Scientific, CN	L3000150
Opti-MEM-Medium mit reduziertem Serum	Thermo Fisher Scientific, CN	31985070
SASH1-shRNA-Plasmid (HuSH)	origene	TL301836
SASH1-ORF-Expressionsplasmid	origene	RC218866
Leerer Vektor-Kontrolle	origene	PS100001
Reverse-Transkriptionskit	Thermo Fisher Scientific, CN	4368814
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific, CN	A46110
SASH1-Primer	Sangon Biotech	Individuell synthetisiert
β-Aktin-Primer	Sangon Biotech	Individuell synthetisiert
Zelllysepuffer	Beyotime	P0013B
NanoDrop-Spektrophotometer	Thermo Fisher Scientific, CN	NanoDrop Ultra
PVDF-Membran	Thermo Fisher Scientific, CN	88518
Anti-SASH1-Antikörper	ABclonal	A15248
Anti-β-Aktin-Antikörper	Abcam	ab6276
HRP-konjugierter sekundärer Ziegen-Anti-Kanin-/Anti-Maus-Antikörper	Beyotime	A0208
ImageJ-Software	NIH (Public Domain)	ImageJ
PKH67 grünes fluoreszierendes Zellmarkierungskit (einschließlich Verdünnungsmittel C)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN	MINI67
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN	10711454001
DAPI	Beyotime	C1002
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM)	Leica	Leica TCS SP8
Menschliches IL-6 Quantikine ELISA-Kit	R&D Systems	D6050B
Menschliches IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY201
Menschliches TNF-α Quantikine ELISA-Kit	R&D Systems	DTA00D
Mikroplattenreader	Thermo Scientific	Multiskan FC
In-situ-Zelltod-Detektionskit (TUNEL-Assay-Kit)	Roche	11684795910
Triton X-100	Beyotime	P0096
Paraformaldehyd (4 %)	Beyotime	P0099
Fluoreszenzmikroskop	Olympus	BX53
Kühlzentrifuge (12.000 ×g-Kapazität)	Eppendorf	Eppendorf 5430 R
Ultrazentrifuge (120.000 ×g-Kapazität)	Beckman Coulter	Optima MAX-XP
R-Software	The R Foundation	v4.2.1
GraphPad Prism	GraphPad Software	v10.0
Seurat (R-Paket)	Satija Lab (Open-Source)	v4.0.4
Harmony (R-Paket, Batch-Korrektur)	Open-Source	v1.2.0
Scrublet (Python-Paket, Doublet-Detektion)	Open-Source	v0.2.3
clustree (R-Paket)	Open-Source	v0.5.1
glmnet (R-Paket, LASSO)	Open-Source	v4.1.8
e1071 (R-Paket, SVM-RFE)	Open-Source	v1.7-14
xgboost (R-Paket)	Open-Source	v1.7.7.1
randomForest (R-Paket, Boruta)	Open-Source	v4.7-1.1
Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
STRING-Datenbank	string-db.org	https://www.string-db.org/
Metascape	metascape.org	https://metascape.org/
Cytoscape-Software	Cytoscape Consortium	v3.10.4
ggplot2 (R-Paket)	Open-Source	v3.5.1
limma (R-Paket)	Open-Source	v3.58.1
pheatmap (R-Paket)	Open-Source	v1.0.12
ClusterProfiler (R-Paket)	Open-Source	v4.8.3
DOSE (R-Paket)	Open-Source	v3.28.2
ggpubr (R-Paket)	Open-Source	v0.6.0