Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Forschungsartikel
* These authors contributed equally
Das Protein 1 mit SAM- und SH3-Domäne (SASH1) wird als Schlüsselregulator der Trophoblasten-Apoptose und -Entzündung bei Präeklampsie (PE) identifiziert. Plazenta-abgeleitete Exosomen (P-EXOS) lindern hypoxieinduzierte Schäden durch Unterdrückung der SASH1-Expression. Diese Ergebnisse zeigen einen neuartigen Mechanismus der PE-Pathogenese auf und legen SASH1 als potenzielles therapeutisches Ziel nahe.
SASH1 ist ein Signaladapterprotein, das an Zellwachstum, Apoptose und Immunregulation beteiligt ist und zunehmend in Tumor- und Immunzellen untersucht wird. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass SASH1 eine wichtige Rolle bei entzündlichen Reaktionen und der zellulären Homöostase spielt, Prozesse, die eng mit der Entwicklung der präeklampsie (PE) assoziiert sind. Ziel dieser Studie war es, zu ermitteln, ob SASH1 zur Trophoblasten-Apoptose und entzündlichen Reaktionen bei PE beiträgt und ob P-EXOS schützende Effekte über die Regulation von SASH1 entfaltet. In dieser Studie wurden drei mit PE assoziierte transkriptomische Datensätze (GSE75010, GSE10588 und GSE60438) analysiert, um gemeinsam differenziell exprimierte Gene (DEGs) zu identifizieren, gefolgt von Genontologie (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen. Maschinelle Lernalgorithmen wurden zusätzlich angewandt, um wichtige Kandidatengene auszuwählen, und Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten wurden verwendet, um die zelluläre Heterogenität im Plazentagewebe zu charakterisieren und zelltypspezifische Expressionsmuster zu bestimmen. SASH1 wurde als konsensuales Kandidatengen identifiziert und war signifikant in Trophoblastenzellen aus PE-Proben hochreguliert. In vitro wurde ein auf Hypoxie behandeltes HTR-8/SVneo-Trophoblastenzellmodell etabliert, kombiniert mit SASH1-Knockdown, SASH1-Überexpression und Co-Kultur mit P-EXOS. Funktionelle Experimente zeigten, dass der Knockdown von SASH1 die hypoxieinduzierte Trophoblasten-Apoptose signifikant unterdrückte und die Sekretion proinflammatorischer Zytokine, einschließlich IL-6, IL-1β und TNF-α, verringerte, während die Überexpression von SASH1 Apoptose und entzündliche Reaktionen förderte. Darüber hinaus reduzierte die Behandlung mit P-EXOS die SASH1-Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene deutlich und milderte die hypoxieinduzierte Trophoblastenschädigung ab, während die Überexpression von SASH1 diese schützenden Effekte weitgehend aufhob. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass SASH1 eine entscheidende Rolle bei der Trophoblasten-Apoptose und entzündlichen Reaktionen bei PE spielt. P-EXOS könnte die hypoxieinduzierte trophoblastäre Schädigung durch Hemmung der SASH1-Expression lindern und liefert neue Einblicke in die molekularen Mechanismen und potenziellen therapeutischen Zielstrukturen für PE.
PE ist eine schwangerschaftsspezifische Multisystemerkrankung, die typischerweise nach der 20. Schwangerschaftswoche auftritt und klinisch durch Hypertonie, Proteinurie und eine Multisystemfunktionsstörung gekennzeichnet ist. Weltweit bleibt sie eine der Hauptursachen für mütterliche und perinatale Morbidität und Mortalität1. Trotz kontinuierlicher Fortschritte im klinischen Management besteht die definitive Therapie der PE nach wie vor in der Entbindung der Plazenta, was das unvollständige Verständnis ihrer Pathogenese unterstreicht und die dringende Notwendigkeit verdeutlicht, neuartige molekulare und zelluläre Mechanismen sowie potenzielle therapeutische Zielstrukturen zu identifizieren2,3.
Eine ausreichende Trophoblasteninvasion und die Förderung einer normalen Placentarentwicklung sind entscheidende Mechanismen, die der Pathogenese der Präeklampsie zugrunde liegen4. Während einer normalen Schwangerschaft dringen Trophoblastenzellen in die uterine Decidua ein und remodellieren die Spiralarterien, um einen Durchblutungskreislauf mit geringem Widerstand und hoher Kapazität zu etablieren. Eine beeinträchtigte Invasion und Migration der Trophoblastenzellen führt zu einer verminderten Plazentaperfusion, wodurch eine anhaltende hypoxische Umgebung und oxidativer Stress entstehen. Hypoxie beeinflusst direkt die zelluläre Apoptose, und die fehlgeleitete Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren stört die Homöostase an der materno-fetalen Grenzfläche, was die Plazentadysfunktion weiter verschärft5. Auch Entzündungen sind ein wichtiger Treiber der Präeklampsie. Es wurde gezeigt, dass IL-17, IL-6 und TNF-α im Gewebe der Plazenta sowie im peripheren Blut von Patientinnen mit Präeklampsie deutlich erhöht sind6. Hypoxie und Entzündung verstärken sich gegenseitig und bilden einen Teufelskreis, der die systemische Entzündungsreaktion potenziert, endotheliale Schäden verursacht und zu plazentaren Anomalien beiträgt. Die zugrundeliegenden molekularen Netzwerke, die die Apoptose von Trophoblasten und entzündliche Reaktionen steuern, sind weitgehend unbekannt.
SASH1 ist ein Mitglied der SLy/SASH1-Familie intrazellulärer Gerüstproteine, die als Signaladapter fungieren7. SASH1 wurde hauptsächlich als Tumorsuppressor charakterisiert, der den epithelialen-mesenchymalen Übergang (EMT), Zellmigration und Invasion durch Wechselwirkungen mit Signalkomponenten wie CRKL und dem PI3K-Akt-mTOR-Weg hemmt8,9. Neben diesen tumorsuppressiven Funktionen deuten neuere Befunde darauf hin, dass SASH1 an entzündlichen Signalwegen und der Immunregulation beteiligt ist7. Die Expression und Funktion von SASH1 in der Plazenta, insbesondere im Kontext der Trophoblastbiologie und der präeklampsie (PE), wurde jedoch bisher nicht untersucht.
Exosome sind als wichtige zelluläre Mediatoren hervorgetreten und werden zunehmend im Kontext der Schwangerschaft untersucht10. Exosome transportieren verschiedene bioaktive Frachten, einschließlich Proteine, Lipide und nichtkodierende RNAs, um die Funktion der Zielzellen zu modulieren. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass P-EXOS eine entscheidende Rolle bei der Immunregulation während der Schwangerschaft spielen und dass ihre Aktivität sowie Fracht bei Präeklampsie (PE) erheblich verändert sind, was möglicherweise den entzündlichen Zustand verstärkt11. Exosome sind außerdem an der Regulation des oxidativen Stresses12 und der Angiogenese13 beteiligt und könnten somit günstige Effekte bei schwangerschaftsbedingten Komplikationen entfalten. Ihre molekularen Zielstrukturen und Wirkmechanismen bei PE sind jedoch noch nicht vollständig verstanden.
Es wurde vermutet, dass SASH1 in der PE-Plazenta dysreguliert ist und als zentraler Treiber der Trophoblasten-Apoptose sowie entzündlicher Reaktionen fungiert, und dass P-EXOS schützende Wirkungen gegen Trophoblasten-Schäden durch Modulation der SASH1-Expression entfalten könnten. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden mehrere transkriptomische Datensätze aus PE-Studien integriert und mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten sowie maschinellen Lernens mit mehreren Algorithmen Schlüsselkandidatengene identifiziert. Unter Verwendung eines hypoxiebehandelten HTR-8/SVneo-Trophoblasten-Zellmodells und exosomenbasierter Interventionsversuche wurde die funktionelle Rolle von SASH1 bei der Trophoblasten-Dysfunktion sowie das therapeutische Potenzial von P-EXOS bei PE untersucht.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ethische Erklärung
Diese Studie wurde vom Ethikkomitee des Vierten Krankenhauses von Shijiazhuang genehmigt (Genehmigungsnummer 20200031). Von allen Spendern von Plazentagewebe wurde vor der Probenentnahme schriftlich informierte Einwilligung eingeholt. Alle Verfahren an menschlichen Probanden wurden gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Eine vollständige Liste der in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien, Verbrauchsmaterialien, Geräte und Software finden Sie in der Tabelle der Materialien.
Datenerhebung
RNA-Seq-Daten wurden aus der GEO-Datenbank bezogen. Die Datensätze umfassten GSE75010, das Genexpressionsdaten von 157 PE-Plazentas und 173 nicht an PE erkrankten Plazentas enthält (N = 330). GSE10588 enthält Genexpressionsdaten von 26 normalen Plazentas und 17 schweren PE-Plazentas (N = 43). GSE60438 enthält Transkriptom-Profilierungsdaten des Decidua-basalis-Gewebes von Patientinnen mit Präeklampsie und normotensiven Schwangerschaften (N = 125). Einzelzell-Transkriptomdaten wurden aus dem GEO-Datensatz GSE183338 bezogen. Dieser umfasst Einzelkernproben aus den Chorionzotten/dem Mutter-Kind-Interface von Schwangerschaften mit Präeklampsie und gesunden Schwangerschaften.
Analyse differentiell exprimierter Gene
Zunächst wurden die mit PE assoziierten DEGs aus den Datensätzen GSE75010, GSE10588 und GSE60438 vorverarbeitet und normalisiert. Anschließend wurde die differentielle Analyse mithilfe des R-Pakets „limma“14 basierend auf den Stichprobengruppierungsinformationen durchgeführt. Gene mit einem p < 0,05 und |log2FC| > 0,5 wurden ausgewählt. Die Volcano-Plots der DEGs wurden mit dem R-Paket ggplot2 erstellt. Heatmaps der 20 am stärksten differentiell exprimierten Gene wurden mit dem R-Paket pheatmap generiert. Danach wurde der Durchschnitt der aus den drei Datensätzen ausgewählten DEGs gebildet, und ein Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) für die Kandidatengene wurde mittels der Online-Plattform STRING mit einem Interaktionsscore ≥0,15 konstruiert. Die 20 wichtigsten Hub-Gene wurden anschließend aus diesem PPI-Netzwerk basierend auf ihrem Vernetzungsgrad identifiziert und mittels der Software Cytoscape rangiert. Die PPI-Netzwerk-Ergebnisse wurden mit der Software Cytoscape oder STRING visualisiert.
Anreicherungsanalyse
Die Genanreicherungsanalyse wurde unter Verwendung der ClusterProfiler- und DOSE-Pakete in Kombination mit der Metascape-Website durchgeführt. Die Datenbanken wurden aus GO und KEGG bezogen. Die Anreicherungsanalyse wurde mithilfe der Funktion „EnrichGO“ durchgeführt. Wege mit p < 0,05 galten als signifikant angereichert. Die Ergebnisse der Anreicherung wurden mit den Paketen „ggplot2“ und „ggpubr“ visualisiert.
Maschinelles Lernen
Um robuste und biologisch aussagekräftige differentiell exprimierte Gene (DEGs), die mit Präeklampsie assoziiert sind, zu identifizieren, wurde eine mehrmodellbasierte Analyse zur Merkmalsauswahl mittels maschinellen Lernens anhand des öffentlich zugänglichen Transkriptom-Datensatzes GSE60438 (Plattform: GPL6884) durchgeführt. Dieser Datensatz enthält die Expressionsprofilerstellung von Decidua-basalis-Proben, die bei Präeklampsie und normotensiven Schwangerschaften während eines Kaiserschnitts gewonnen wurden. Die vorbereinigten DEGs wurden standardisiert, und die Expressionsmatrix zusammen mit den entsprechenden klinischen Gruppierungsinformationen diente als Eingabedaten für vier verschiedene Algorithmen des maschinellen Lernens, um die Modellverzerrung zu verringern und die Stabilität der Merkmalsauswahl zu erhöhen.
Die vier Algorithmen wurden gleichzeitig angewendet, ohne eine bestimmte Reihenfolge. LASSO wurde mithilfe des „glmnet“-Pakets zur Durchführung der Regressionsanalyse und zur Auswahl wichtiger Merkmalsgene verwendet. Ein L1-Regularisierungsterm wurde der Verlustfunktion hinzugefügt, wodurch die Koeffizienten weniger wichtiger Merkmale auf null geschrumpft werden, wodurch eine Merkmalsauswahl erreicht wird. SVM-RFE wurde mit dem „e1071“-Paket implementiert, um eine Support-Vektor-Maschine mit rekursiver Merkmalseliminierung aufzubauen. Zunächst wurde ein Klassifizierer mittels SVM trainiert, und die am wenigsten aussagekräftigen Merkmale wurden iterativ basierend auf den Merkmalsgewichten entfernt, wodurch eine optimale Teilmenge von Merkmalen erhalten wurde. XGBoost wurde mit dem „xgboost“-Paket angewendet, um mehrere Entscheidungsbäume zu erstellen. Jeder Baum passte die Residuen des vorherigen Baums an, und die gewichteten Ausgaben wurden kumuliert, um die endgültige Vorhersage zu erhalten. Boruta wurde mit dem „randomForest“-Paket durchgeführt und erzeugte Schattenmerkmale, die mit echten Merkmalen bei der Schulung eines zufälligen Waldes konkurrierten. Merkmale mit einer Bedeutung, die signifikant über dem Zufallsrauschen lag, wurden beibehalten.
Analyse von Einzelzell-Transkriptomdaten
Einzelzell-Transkriptomdaten wurden aus der GEO-Datenbank bezogen, und die rohe Zählmatrix wurde aus GSE183338 abgerufen. Die Zählmatrix wurde mithilfe der „Read10X“-Funktion des Seurat-Pakets importiert und in das dgCMatrix-Format konvertiert. Einzelne Objekte wurden mit der „merge“-Funktion zu einem einzigen aggregierten Objekt zusammengeführt, und die Zellbeschriftungen wurden mithilfe von „RenameCells“ eindeutig gemacht. Zellen geringer Qualität wurden anhand folgender Kriterien herausgefiltert: Gene, die in weniger als drei Zellen exprimiert wurden, wurden entfernt, und Zellen mit weniger als 200 exprimierten Genen wurden ausgeschlossen. Die qualitätsgeprüften Zellen wurden normalisiert, und hochvariable Gene wurden identifiziert. Eine globale Skalierungsnormalisierung wurde mithilfe von „LogNormalize“ (Skalierungsfaktor = 10.000) durchgeführt, hochvariable Gene (n = 2.000) wurden mit „FindVariableFeatures“ ausgewählt, und die Daten wurden mit „ScaleData“ skaliert. Eine Hauptkomponentenanalyse wurde an den hochvariablen Merkmalen durchgeführt, wobei die 30 wichtigsten Hauptkomponenten beibehalten wurden. Batch-Effekte zwischen den Proben wurden mit der Harmony-Methode korrigiert. Die Zellen wurden mittels UMAP visualisiert und herunterskaliert. Gemeinsame nächstgelegene Nachbargraphen wurden mithilfe von „FindNeighbors“ und „FindClusters“ basierend auf dem Louvain-Algorithmus erstellt. Der Auflösungsparameter in „FindClusters“ wurde zwischen 0,1 und 1 optimiert. Der Clusterbaum wurde mit der „clustree“-Funktion visualisiert, und eine Auflösung von 0,9 wurde gewählt, um Zellcluster zu definieren. Mögliche Doubletts wurden mithilfe des Scrublet-Algorithmus entfernt. Die Zellcluster wurden durch Identifizierung differenziell exprimierter Markergene mit der „FindAllMarkers“-Funktion annotiert. Der nichtparametrische Wilcoxon-Rangsummentest wurde mit Bonferroni-Korrektur angewandt. Die Zellidentitäten wurden basierend auf Oberflächenmarkern, relevanter Literatur und der Cell Classification Database15 zugewiesen.
Zellkultur
Die Trophoblasten-Zelllinie HTR-8/SVneo-Zellen wurde in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum und 1 % Penicillin/Streptomycin, kultiviert. Hypoxische Bedingungen wurden durch die Kultivierung der Zellen bei 1 % O₂, 5 % CO₂ und 94 % N₂ für 24 h erzeugt; normoxische Kontrollen wurden bei 20 % O₂ und 5 % CO₂16 aufrechterhalten. Alle Zellkulturverfahren sollten in einem Biosicherheitswerkbank der Klasse II unter Verwendung aseptischer Techniken durchgeführt werden. Kulturmedien, Transfektionsreagenzien und zellulärer Abfall sind gemäß den institutionellen Richtlinien für Biosicherheit zu entsorgen.
Transfektion von Zellen
Plasmide, die sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 und OE-NC enthielten, wurden synthetisiert. HTR-8/SVneo-Zellen wurden mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen pro Vertiefung in 6-Loch-Platten ausgesät. Anschließend wurden die Zellen mit jeweils 2 µg sh-SASH1-, sh-NC-, OE-SASH1- oder OE-NC-Plasmid pro Vertiefung unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes gemäß den Herstelleranweisungen transfiziert. Kurz gesagt, wurden Plasmid-DNA und P3000-Reagenz in Opti-MEM verdünnt, mit Lipofectamine 3000, das separat in Opti-MEM verdünnt wurde, vermischt, 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und Zellen mit 70–80 % Konfluenz zugegeben. 48 Stunden nach der Transfektion wurde die Expression von SASH1 mittels RT-qPCR und Western Blot überprüft. Die für die SASH1-Genstummschaltung verwendeten shRNA-Zielsequenzen sind in Zusatz-Tabelle 1 aufgeführt.
Quantitative Echtzeit-PCR
Gesamt-RNA wurde aus HTR-8/SVneo-Zellen isoliert und mit einem Reverse-Transkriptionskit bei 42 °C für 30 min in cDNA umgeschrieben, gefolgt von 85 °C für 5 min. Die echtzeitnahe quantitative PCR (qPCR) wurde mit SYBR Green Mastermix unter folgenden Zyklenbedingungen durchgeführt: 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 15 s und 60 °C für 1 min. Die relative mRNA-Expression wurde nach der ΔΔCt-Methode berechnet, wobei β-Aktin als interne Referenz diente. Die in diesem Experiment verwendeten Primersequenzen sind in Supplementary Table 2 aufgeführt.
Western-Blot-Assay
Gesamtprotein wurde aus HTR-8/SVneo-Zellen unter Verwendung des Lysepuffers extrahiert. Die Zelllysate wurden gesammelt, auf Eis inkubiert und bei 4 °C 30 min bei 12.000 × g zentrifugiert, um unlösliche Bestandteile zu entfernen. Die Proteinmenge wurde mithilfe eines Spektrophotometers bestimmt. Gleichmäßige Proteinmengen (50 µg) wurden mittels SDS-PAGE getrennt und anschließend auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Milch blockiert und über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Membranen mit den entsprechenden sekundären Antikörpern inkubiert, und die Proteinbanden wurden mittels eines verbesserten Chemilumineszenz-Detektionssystems sichtbar gemacht.
Zur Proteinnachweis wurden die primären Antikörper anti-SASH1 und β-Aktin verwendet. Passende mit Horseradish-Peroxidase (HRP) konjugierte sekundäre Antikörper – Ziegen-anti-Kaninchen und Ziegen-anti-Maus – kamen zum Einsatz. β-Aktin diente als interne Ladekontrolle, um eine gleichmäßige Proteinbeladung sicherzustellen. Die Intensität der Proteinbanden wurde mithilfe der ImageJ-Software gemessen und quantifiziert.
Isolierung von P-EXOS
P-EXOS wurden aus Plazentavillengewebe isoliert, das von gesunden Frauen stammte, die eine geplante Kaiserschnittentbindung erhielten. Das Plazentavillengewebe wurde gründlich mit steriler PBS gewaschen, in etwa 1 mm große Stücke zerkleinert und anschließend weiterverarbeitet.3 Fragmente und kultiviert in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % exosomenfreiem FBS, bei 37 °C in 5 % CO₂2 für 48 h. Das konditionierte Medium wurde einer differenziellen Zentrifugation unterzogen, wie folgt: 300 × g 10 min, um Zellen und Gewebeabfälle zu entfernen; 2.000 × g für 20 min, um Zelltrümmer zu entfernen; und 10.000 × g für 30 min, um Mikrovesikel zu entfernen, jeweils bei 4 °C. Das resultierende Überstand wurde bei 120.000 × g 70 min bei 4 °C, um Exosomen zu pelletieren. Der Pellet wurde einmal mit PBS gewaschen und erneut bei 120.000 × g 70 min bei 4 °C. Das endgültige Pellet wurde in PBS resuspendiert. Die isolierten Exosomen wurden mittels Western-Blot-Analyse auf Exosomenmarker (PLAP, CD63 und TSG101, mit GM130 als negativer Kontrolle) charakterisiert und zusätzlich mittels Transmissionselektronenmikroskopie zur morphologischen Beurteilung untersucht.
P-EXOS-Zellaufnahmeversuch
Um die zelluläre Aufnahme von P-EXOS zu bestätigen, wurden Exosomen gemäß der Herstelleranleitung mit dem lipophilen Membranfarbstoff PKH67 fluoreszenzmarkiert. Kurz gesagt, wurden P-EXOS 5 min bei Raumtemperatur mit PKH67 (4 µM) in Verdünnungsmittel C inkubiert, und die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens von 1 % bovinem Serumalbumin (BSA) gestoppt. Markierte Exosomen wurden durch Ultrazentrifugation (120.000 × g, 70 min, 4 °C) erneut isoliert, um nicht gebundenen Farbstoff zu entfernen. Anschließend wurden PKH67-markierte P-EXOS (50 µg/mL) HTR-8/SVneo-Zellen zugegeben und 24 h unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen (1 % O₂) gemeinsam inkubiert. Die Zellen wurden danach dreimal mit PBS gewaschen, 15 min mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und die Kerne mit DAPI (1 µg/mL) kontragefärbt. Die Aufnahme der PKH67-markierten Exosomen wurde mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM; Anregung 490 nm, Emission 502 nm) visualisiert. Für funktionelle Kokulturversuche wurden HTR-8/SVneo-Zellen 24 h lang unter hypoxischen Bedingungen (1 % O₂) mit P-EXOS in einer Konzentration von 50 µg/mL (Proteinäquivalent) in vollständigem RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % exosomenfreiem FBS, behandelt.
Enzymgebundener Immunosorbens-Assay (ELISA)
Kulturüberstände von Zellen wurden gesammelt, und die Konzentrationen von IL-6, IL-1β und TNF-α wurden entsprechend den Herstelleranweisungen mithilfe eines IL-6-ELISA-Sets, eines IL-1β-ELISA-Sets und eines TNF-α-ELISA-Sets gemessen. Die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät gemessen, und die tatsächlichen Konzentrationen wurden anhand der Standardkurven berechnet.
TdT-vermittelte dUTP-Nick-End-Labeling (TUNEL)
Apoptotische Zellen wurden mit dem TUNEL-Assay-Kit gemäß den Herstelleranweisungen nachgewiesen. Kurz gesagt wurden die Zellen 15 min bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, auf Eis für 5 min mit 0,1 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert und anschließend 60 min bei 37 °C im Dunkeln mit der TUNEL-Reaktionsmischung inkubiert. Die Kerne wurden mit DAPI kontrastgefärbt, und die TUNEL-positiven Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und durch Bestimmung des Prozentsatzes an TUNEL-positiven Zellen in mindestens fünf zufällig ausgewählten Feldern pro Probe quantifiziert.
Statistische Analyse
Alle Daten wurden mit R und GraphPad Prism analysiert. Stetige Variablen werden als Mittelwert ±SD angegeben. Der Vergleich von zwei Gruppen erfolgte mittels Students t-Test, während der Vergleich mehrerer Gruppen mittels einfaktorieller ANOVA mit anschließendem Tukey’schen Post-hoc-Test durchgeführt wurde. Die statistische Signifikanz kategorialer Variablen wurde mittels Chi-Quadrat-Test oder exaktem Fisher-Test bewertet. Sofern nicht anders angegeben, wurden Korrelationen zwischen Molekülen mittels Spearman-Korrelationsanalyse berechnet. Experimente zur Charakterisierung von Exosomen wurden mit P-EXOS durchgeführt, die aus drei unabhängigen Plazentaspenderinnen isoliert worden waren. Zellbasierte Experimente wurden in drei unabhängigen biologischen Wiederholungen durchgeführt, die jeweils unabhängige Experimente zu verschiedenen Zeitpunkten mit HTR-8/SVneo-Zellen unterschiedlicher Passage darstellen; jede Wiederholung verwendete P-EXOS, die aus einer anderen plazentalen Spenderin isoliert worden waren. Ein p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Transkriptomische Analyse von gesunden Personen und Patienten mit Präeklampsie
Für die Genexpressionsunterschiede zwischen der normalen (Normal) Gruppe und PE-Patientinnen wurde die differentielle Expression mittels des R-Pakets limma in den zusammengeführten Datensätzen analysiert. Insgesamt wurden 89 DEGs identifiziert (p < 0,05 und |log2FC| > 0,5), darunter 69 hochregulierte Gene und 20 herunterregulierte Gene für GSE75010 (Abb...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
In dieser Studie wurde SASH1 durch integrierte transkriptomische Analysen, Einzelzellsequenzierung und maschinelles Lernen mit mehreren Algorithmen als Schlüsselgen identifiziert, das bei Präeklampsie dysreguliert ist – ein Ansatz, der besonders relevant ist, da für Präeklampsie bislang keine gezielten Therapien verfügbar sind17. Es wurde gezeigt, dass SASH1 in hypoxischen Trophoblastenzellen signifikant hochreguliert ist und im Trophoblastenkompartiment von Präeklampsie-Plazentas auf Einzelzellau...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Es besteht kein Interessenkonflikt in dieser Studie.
Diese Studie wurde durch das Medizinische Wissenschaftsforschungs-Hauptprogramm der Gesundheitskommission der Provinz Hebei, China (Nr. 20210075), finanziert.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640-Medium | Gibco | 11875085 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco | 16140071 | |
| Exosomenfreies FBS | System Biosciences | EXO-FBS-50A-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, CN | 15140122 | |
| Lipofectamin-3000-Transfektionsreagenz (mit P3000-Reagenz) | Thermo Fisher Scientific, CN | L3000150 | |
| Opti-MEM-Medium mit reduziertem Serum | Thermo Fisher Scientific, CN | 31985070 | |
| SASH1-shRNA-Plasmid (HuSH) | origene | TL301836 | |
| SASH1-ORF-Expressionsplasmid | origene | RC218866 | |
| Leerer Vektor-Kontrolle | origene | PS100001 | |
| Reverse-Transkriptionskit | Thermo Fisher Scientific, CN | 4368814 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific, CN | A46110 | |
| SASH1-Primer | Sangon Biotech | Individuell synthetisiert | |
| β-Aktin-Primer | Sangon Biotech | Individuell synthetisiert | |
| Zelllysepuffer | Beyotime | P0013B | |
| NanoDrop-Spektrophotometer | Thermo Fisher Scientific, CN | NanoDrop Ultra | |
| PVDF-Membran | Thermo Fisher Scientific, CN | 88518 | |
| Anti-SASH1-Antikörper | ABclonal | A15248 | |
| Anti-β-Aktin-Antikörper | Abcam | ab6276 | |
| HRP-konjugierter sekundärer Ziegen-Anti-Kanin-/Anti-Maus-Antikörper | Beyotime | A0208 | |
| ImageJ-Software | NIH (Public Domain) | ImageJ | |
| PKH67 grünes fluoreszierendes Zellmarkierungskit (einschließlich Verdünnungsmittel C) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | MINI67 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | 10711454001 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Menschliches IL-6 Quantikine ELISA-Kit | R&D Systems | D6050B | |
| Menschliches IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY201 | |
| Menschliches TNF-α Quantikine ELISA-Kit | R&D Systems | DTA00D | |
| Mikroplattenreader | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| In-situ-Zelltod-Detektionskit (TUNEL-Assay-Kit) | Roche | 11684795910 | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 | |
| Paraformaldehyd (4 %) | Beyotime | P0099 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Olympus | BX53 | |
| Kühlzentrifuge (12.000 ×g-Kapazität) | Eppendorf | Eppendorf 5430 R | |
| Ultrazentrifuge (120.000 ×g-Kapazität) | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| R-Software | The R Foundation | v4.2.1 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v10.0 | |
| Seurat (R-Paket) | Satija Lab (Open-Source) | v4.0.4 | |
| Harmony (R-Paket, Batch-Korrektur) | Open-Source | v1.2.0 | |
| Scrublet (Python-Paket, Doublet-Detektion) | Open-Source | v0.2.3 | |
| clustree (R-Paket) | Open-Source | v0.5.1 | |
| glmnet (R-Paket, LASSO) | Open-Source | v4.1.8 | |
| e1071 (R-Paket, SVM-RFE) | Open-Source | v1.7-14 | |
| xgboost (R-Paket) | Open-Source | v1.7.7.1 | |
| randomForest (R-Paket, Boruta) | Open-Source | v4.7-1.1 | |
| Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| STRING-Datenbank | string-db.org | https://www.string-db.org/ | |
| Metascape | metascape.org | https://metascape.org/ | |
| Cytoscape-Software | Cytoscape Consortium | v3.10.4 | |
| ggplot2 (R-Paket) | Open-Source | v3.5.1 | |
| limma (R-Paket) | Open-Source | v3.58.1 | |
| pheatmap (R-Paket) | Open-Source | v1.0.12 | |
| ClusterProfiler (R-Paket) | Open-Source | v4.8.3 | |
| DOSE (R-Paket) | Open-Source | v3.28.2 | |
| ggpubr (R-Paket) | Open-Source | v0.6.0 |
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.