Der ZeLan-Extrakt verbesserte endokrine und metabolische Phänotypen bei DHEA-induzierten PCOS-Ratten. Die integrierte 16S-rRNA-Sequenzierung und Serum-Metabolomik zeigten eine teilweise Wiederherstellung der mikrobiellen Alpha-Diversität im Darm, veränderte mikrobielle Zusammensetzung sowie Veränderungen der Metaboliten, die Steroidhormone, Gallensäuren und kurzkettige Fettsäuren betrafen.
Forschungsartikel
Lycopus lucidus-Extrakt verbessert das experimentelle polyzystische Ovarialsyndrom durch Umbau der Darmmikrobiota und des Metaboloms
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Diese Studie untersuchte die therapeutischen Wirkungen eines ZeLan-Extrakts auf das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) und bewertete dessen Zusammenhang mit der Umgestaltung des Mikrobiom-Metaboloms. Vierundzwanzig weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden zufällig in Kontroll-, PCOS-Modellgruppen, induziert durch Dehydroepiandrostendion (DHEA), sowie in ZeLan-Behandlungsgruppen eingeteilt (jeweils n = 8). Nach 28 Tagen Intervention wurden die Serumhormonspiegel mittels ELISA gemessen; die Zusammensetzung der Darmmikrobiota wurde mittels 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung analysiert und die serummetabolischen Profile mittels UHPLC-Q-TOF-MS charakterisiert. Eine Spearman-Korrelationsanalyse mit Kontrolle für Mehrfachvergleiche wurde durchgeführt, um die Assoziationen zwischen Mikrobiota und Metabolom zu untersuchen. ZeLan verbesserte signifikant PCOS-assoziierte Phänotypen, reduzierte Körpergewicht, Testosteron (0,92 vs. 1,85 ng/mL, P < 0,05), das LH/FSH-Verhältnis und Insulinspiegel im Vergleich zur Modellgruppe. Die Sequenzierung zeigte, dass ZeLan die mikrobielle Alpha-Diversität teilweise wiederherstellte (Shannon-Index: 5,79 vs. 4,19) und das Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes verringerte. ZeLan war mit einer Anreicherung von Lactobacillus und Ruminococcus sowie einer geringeren Häufigkeit von Bacteroides, Prevotella und Escherichia assoziiert. Die Metabolomik identifizierte 52 veränderte Metabolitmerkmale, wobei wesentliche Veränderungen Steroidhormone, Gallensäuren wie Lithocholsäure und kurzkettige Fettsäuren wie Buttersäure betrafen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ZeLan endokrine und metabolische Störungen im Zusammenhang mit PCOS verbessert und mit einer Umgestaltung der mikrobiellen Darm- und serummetabolischen Profile assoziiert ist.
Einleitung
Das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) stellt eine der häufigsten endokrinen Erkrankungen bei Frauen im gebärfähigen Alter dar, wobei die weltweite Prävalenz je nach verwendeten diagnostischen Kriterien zwischen 6 % und 20 % geschätzt wird1. Diese komplexe Stoffwechsel- und Fortpflanzungsstörung zeichnet sich durch ein Bündel klinischer Manifestationen aus, darunter Hyperandrogenismus, ovulatorische Dysfunktion und polyzystische Ovarmorphismologie, die gemeinsam zu erheblichen reproduktiven, metabolischen und psychologischen Folgen beitragen2. Über die unmittelbaren Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit hinaus wird PCOS zunehmend als systemische Erkrankung anerkannt, die mit langfristigen gesundheitlichen Komplikationen wie Typ-2-Diabetes mellitus, kardiovaskulären Erkrankungen und Endometriumkarzinom assoziiert ist und dadurch erhebliche Belastungen sowohl für betroffene Patientinnen als auch für Gesundheitssysteme weltweit verursacht3. Die Pathophysiologie von PCOS ist noch nicht vollständig verstanden, obwohl allgemein anerkannt ist, dass komplexe Wechselwirkungen zwischen genetischer Prädisposition, Umweltfaktoren und lebensstilbedingten Determinanten zu den charakteristischen hormonellen und metabolischen Störungen führen, die bei Betroffenen beobachtet werden4.
Aktuelle therapeutische Ansätze bei PCOS konzentrieren sich hauptsächlich auf die symptomatische Behandlung mithilfe pharmakologischer Interventionen, darunter orale Kontrazeptiva zur Regulierung des Menstruationszyklus, Metformin zur Verbesserung der Insulinempfindlichkeit und Antiandrogene zur Kontrolle der Hirsutismus5. Diese herkömmlichen Therapien führen jedoch häufig nur zu einer unvollständigen Linderung der Symptome und sind oft mit Nebenwirkungen verbunden, die ihre langfristige Anwendbarkeit einschränken, insbesondere bei Frauen mit Kinderwunsch6. Folglich hat das Interesse an komplementären und alternativen medizinischen Ansätzen zugenommen, insbesondere an der traditionellen chinesischen Medizin (TCM), die über Jahrhunderte empirische Erfahrung in der Behandlung gynäkologischer Erkrankungen durch ganzheitliche Regulationsmechanismen gesammelt hat7. Unter den zahlreichen pflanzlichen Arzneimitteln, die zur Behandlung von PCOS untersucht wurden, hat Lycopus lucidus Turcz. (im Chinesischen als ZeLan bekannt) aufgrund seiner traditionellen Anwendung zur Förderung der Durchblutung, Auflösung von Stagnationen und Regulierung der Menstruation besonderes Interesse geweckt8. Veröffentlichte phytochemische Studien zeigen, dass L. lucidus Polyphenole und flavonoidreiche Fraktionen mit antioxidativer und entzündungshemmender Wirkung enthält8,9. Daher diente der standardisierte Gesamtgehalt an Flavonoiden in der vorliegenden Studie als chemischer Qualitätskontrollindex für den Extrakt, obwohl die Identifizierung der spezifischen aktiven Monomere, die für die Regulation der Mikrobiota und des Stoffwechsels verantwortlich sind, zukünftig eine gezielte phytochemische Analyse erfordert.
Die Darmmikrobiota hat sich als entscheidender Regulator des Wirtsstoffwechsels und der endokrinen Funktion herauskristallisiert, wobei zunehmende Belege für ihre Beteiligung an der Pathogenese verschiedener Stoffwechselerkrankungen, einschließlich des PCOS10, vorliegen. Das Konzept der Darm-Eierstock-Achse wurde vorgeschlagen, um die bidirektionale Kommunikation zwischen Darmmikroorganismen und der Eierstockfunktion zu beschreiben, die durch mikrobielle Metaboliten, immunologische Signalwege und neuroendokrine Pfade vermittelt wird11. Bei Frauen mit PCOS wurde wiederholt eine Darmdysbiose nachgewiesen, die sich durch eine verminderte mikrobielle Diversität, veränderte Verhältnisse von Firmicutes zu Bacteroidetes sowie einen reduzierten Gehalt an nützlichen Bakterien wie Arten der Gattungen Lactobacillus und Bifidobacterium auszeichnet12. Diese mikrobiellen Störungen tragen vermutlich auf mehrfache Weise zur Pathophysiologie des PCOS bei, unter anderem durch erhöhte intestinale Durchlässigkeit, systemische Entzündungen in niedriger Intensität sowie veränderten Stoffwechsel von Gallensäuren und kurzkettigen Fettsäuren (SCFA), wodurch wiederum die Insulinempfindlichkeit und die Androgenbiosynthese beeinflusst werden13. Wichtig ist, dass therapeutische Maßnahmen, die gezielt auf die Darmmikrobiota abzielen – darunter Probiotika, Präbiotika und Ernährungsmodifikationen – erfolgversprechende Ergebnisse bei der Linderung von PCOS-Symptomen gezeigt haben, was die Darm-Eierstock-Achse als therapeutisches Ziel stützt14.
Die Metabolomik, die umfassende Analyse kleiner Metabolite in biologischen Systemen, bietet einen leistungsfähigen Ansatz zur Charakterisierung metabolischer Störungen im Zusammenhang mit Krankheitszuständen sowie zur Bewertung der biochemischen Wirkungen therapeutischer Interventionen15. Die Kombination der 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung zur Profilierung des Mikrobioms mit der ungerichteten Metabolomik ermöglicht eine systematische Untersuchung der Beziehungen zwischen den mikrobiellen Gemeinschaften im Darm und dem Wirtsstoffwechsel und liefert Erkenntnisse über Mikrobiota-Metabolom-Interaktionen, die sowohl bei der Krankheitsentstehung als auch bei Behandlungsreaktionen eine Rolle spielen können. Trotz der theoretischen Begründung für die gezielte Beeinflussung der Darm-Eierstock-Achse bei der Behandlung von PCOS und der traditionellen Anwendungsgebiete von ZeLan bei gynäkologischen Erkrankungen wurden bislang keine systematischen Untersuchungen durchgeführt, ob ein ZeLan-Extrakt die Schnittstelle zwischen Darmmikrobiota und Metabolom bei PCOS moduliert. Diese Wissenslücke beschränkt unser Verständnis der mit ZeLan verbundenen biologischen Reaktionen und erschwert eine rationale Optimierung dieser pflanzlichen Intervention zur Behandlung von PCOS.
Die vorliegende Studie wurde durchgeführt, um die therapeutische Wirksamkeit eines ZeLan-Extrakts in einem DHEA-induzierten Rattenmodell des PCOS zu untersuchen und assoziierte Veränderungen des Mikrobiom-Metaboloms durch integrierte 16S-rRNA-Sequenzierung und ungerichtete Metabolomik-Analyse zu bewerten. Insbesondere untersuchten wir die Wirkungen des ZeLan-Extrakts auf PCOS-bezogene Phänotypen, darunter Körpergewicht, Serum-Testosteron, Verhältnis von luteinisierendem Hormon zu follikelstimulierendem Hormon (LH/FSH) sowie Insulinspiegel; charakterisierten Veränderungen in der Zusammensetzung und der alpha-Diversität der Darmmikrobiota nach Behandlung mit ZeLan; identifizierten differenzielle serummetabolitische Merkmale und angereicherte Stoffwechselwege im Zusammenhang mit der ZeLan-Intervention; und untersuchten Korrelationen zwischen spezifischen Darmmikrobiota-Taxa und Schlüsselmetaboliten. Durch die Bearbeitung dieser Zielsetzungen strebten wir an, assoziative multimetabolomische Hinweise auf eine ZeLan-vermittelte Modulation der Darm-Ovar-Achse beim PCOS zu liefern.
Protokoll
Alle experimentellen Verfahren in der vorliegenden Studie wurden gemäß den Richtlinien des National Institutes of Health zum Schutz und zur Verwendung von Laborversuchstieren durchgeführt und von dem Institutionellen Ausschuss für Tierversuche genehmigt (Genehmigungsnummer IACUC-2023-0156).
Tiere
Weibliche Sprague-Dawley-Ratten (n = 24, 6 Wochen alt, Körpergewicht 180–200 g) wurden vom Laboratoriumstierzentrum der angeschlossenen Einrichtung bezogen und unter kontrollierten Umweltbedingungen (Temperatur 22 ± 2°C, Luftfeuchtigkeit 50 ± 10%, 12-Stunden-Licht/Dunkel-Wechsel) gehalten, mit freiem Zugang zu Standardfutter für Nager und gereinigtem Wasser. Nach einer einwöchigen Akklimatisierungsphase wurden die Tiere zufällig drei Versuchsgruppen zugewiesen (n = 8 pro Gruppe): Kontrolle, PCOS-Modell und ZeLan-Behandlung. Die Stichprobengröße wurde basierend auf früheren Studien zur Untersuchung von Veränderungen der Darmmikrobiota in PCOS-Modellen festgelegt; eine Power-Analyse ergab, dass 8 Tiere pro Gruppe eine statistische Power von 80 % ermöglichen, einen 1,5-fachen Unterschied in den Alpha-Diversitätsindizes bei α = 0,05 nachzuweisen.
Herstellung des PCOS-Modells und Behandlungsprotokoll
Das PCOS-Modell wurde mithilfe eines gut validierten Protokolls etabliert, das die subkutane Injektion von Dehydroepiandrosteron (DHEA; Sigma-Aldrich, USA), gelöst in Sesamöl, in den dorsalen Nackenbereich in einer Dosis von 6 mg/100 g Körpergewicht täglich über 21 aufeinanderfolgende Tage umfasst. Kontrolltiere erhielten äquivalente Volumina des Sesamöl-Fahrzeugs. Der vollständige experimentelle Zeitplan umfasste 7 Tage Akklimatisierung, 21 Tage Modellinduktion und 28 Tage Intervention, wobei die Endpunktprobenahme am Tag 56 des Protokolls erfolgte, einschließlich der Akklimatisierungsphase (Abbildung 1). Der ZeLan-Extrakt wurde aus authentifiziertem Kraut von Lycopus lucidus Turcz. durch wässrige Extraktion hergestellt und standardisiert, um gesamte Flavonoide in einer Konzentration von mindestens 2,5 % gemäß Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zu enthalten, was als chemisches Qualitätskontrollkriterium für den pflanzlichen Extrakt diente. Nach Abschluss der DHEA-induzierten Modellbildung erhielten die Ratten der ZeLan-Gruppe täglich über 28 aufeinanderfolgende Tage eine orale Gavage mit ZeLan-Extrakt in einer Dosis von 200 mg/kg Körpergewicht, während die Kontroll- und Modellgruppen äquivalente Volumina destillierten Wassers erhielten. Die Dosis von 200 mg/kg wurde als explorative pharmakologische Dosis basierend auf früheren Tierversuchserfahrungen mit pflanzlichen Extrakten und vorläufigen Überlegungen zur Verträglichkeit gewählt; eine formale Dosis-Wirkungs-Untersuchung war nicht Bestandteil des vorliegenden Versuchsdesigns. Das Körpergewicht wurde während des gesamten Experimentzeitraums wöchentlich erfasst. In diesem experimentellen Design wurde die erfolgreiche Etablierung des PCOS-Modells anhand des DHEA-Induktionsprotokolls sowie der endokrinen und metabolischen Phänotypen am Versuchsende bewertet, einschließlich Körpergewicht, Serum-Testosteron, LH/FSH-Verhältnis und nüchtern Insulin. Die histopathologische Untersuchung der Ovarien, die Follikelzählung, die Quantifizierung des Corpus luteum sowie die kontinuierliche Überwachung des Östruszyklus wurden nicht als Endpunkte zur Bestätigung des Modells einbezogen, sodass die Interpretation einer ovariellen Dysfunktion auf endokrinen und metabolischen Messgrößen und nicht auf einer direkten Gewebeanalyse beruhte.
Probensammlung und -aufbereitung
Proben (Serum und Fäzes) wurden von allen drei Gruppen (n = 8 pro Gruppe) zur anschließenden biochemischen, mikrobiotischen und metabolomischen Analyse entnommen. Die Endpunktprobenahmen erfolgten morgens nach einer nächtlichen Fastenperiode, um zirkadiane und ernährungsbedingte Variabilität zu minimieren. Blutproben wurden unter Anästhesie aus der Aorta abdominalis entnommen und bei 4 °C 15 Minuten lang bei 3.000 × g zentrifugiert, um das Serum zu gewinnen. Dieses wurde portioniert und bis zur Hormon- und Metabolomanalyse bei -80 °C gelagert. Frische Fäkalproben wurden direkt aus dem Zäkum unter aseptischen Bedingungen in sterile Kryoröhrchen gesammelt, während des Transports auf Trockeneis aufbewahrt, innerhalb von 10 Minuten nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung bei -80 °C gelagert.
Bestimmung von Hormonen im Serum
Die Serumkonzentrationen von Testosteron, luteinisierendem Hormon (LH), follikelstimulierendem Hormon (FSH) und Insulin wurden mithilfe kommerziell erhältlicher ELISA-Kits (Cusabio Biotech, Wuhan, China) gemäß den Herstelleranweisungen quantifiziert. Das LH/FSH-Verhältnis wurde als zusammengesetzter Index einer gonadotropen Dysbalance, die für das PCOS charakteristisch ist, berechnet. Alle Proben wurden im Duplikat analysiert, und Messungen mit einem Variationskoeffizienten der Duplikate von mehr als 15 % wurden wiederholt. Die intraassay- und interassay-Variationskoeffizienten mussten unter 10 % bzw. 15 % liegen. Mögliche Ausreißer wurden anhand der Originaldatensätze und der Informationen zur Assay-Performance überprüft, und kein Wert wurde ausschließlich aus statistischen Gründen ohne dokumentierten technischen Grund ausgeschlossen.
16S-rRNA-Gen-Sequenzierung und bioinformatische Analyse
Die gesamte bakterielle genomische DNA wurde aus Zäkum-Inhalten mit dem QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Deutschland) gemäß dem Herstellungsprotokoll isoliert. Die DNA-Qualität und -menge wurde mittels NanoDrop-Spektrophotometrie und Agarose-Gelelektrophorese überprüft, und die DNA-Extrakte wurden vor der Bibliothekskonstruktion bei -80 °C gelagert. Die hypervariablen Regionen V3-V4 des 16S-rRNA-Gens wurden mit universellen Primern 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') und 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') unter Hinzufügung von Illumina-Adaptersequenzen amplifiziert. Die Amplikon-Bibliotheken wurden konstruiert, gereinigt, quantifiziert, in äquimolaren Konzentrationen gepoolt und auf der Illumina NovaSeq 6000-Plattform (Novogene, Peking, China) mit paired-end 250-bp-Lesungen sequenziert.
Rohsequenzierungsdaten wurden mit der QIIME2-Pipeline (Version 2022.2) verarbeitet. Paar-endige Reads wurden demultiplexed, zusammengeführt, anhand einer Phred-Score-Schwelle von mindestens 20 qualitätsgefiltert und mit DADA2 bearbeitet, um chimäre Sequenzen zu entfernen und Amplikonsequenzvarianten (ASVs) zu generieren. Die taxonomische Klassifizierung erfolgte anhand der Referenzdatenbank SILVA 138 unter Verwendung eines Naive-Bayes-Klassifikators. Alpha-Diversitätsmetriken, darunter Shannon-Index, Simpson-Index und Chao1-Schätzer, wurden berechnet, um die Diversität und Artenvielfalt innerhalb der Proben zu bewerten. Ergebnisse zur Sequenzierungstiefe, einschließlich Lesezusammenfassungen, ASV-Häufigkeitstabellen, Good's Coverage und Dateien mit Rarefaktionskurven, wurden als Teil des im Abschnitt „Data Availability“ beschriebenen Mikrobiomdatensatzes betrachtet. Die lineare Diskriminanzanalyse der Effektgröße (LEfSe) wurde verwendet, um krankheitsassoziierte Taxa im Vergleich zwischen Kontrolle und Modellgruppe zu identifizieren, wobei eine LDA-Score-Schwelle von mehr als 2,0 und ein P < 0,05 angewandt wurden; die mit ZeLan assoziierte Umkehrung wurde durch Vergleich der Richtung der taxonomischen Häufigkeitsverschiebungen in der ZeLan-Gruppe relativ zur Modellgruppe bewertet.
Untargetierte Metabolomik-Analyse
Die serummetabolomische Profilierung wurde mittels ultra-hochleistungsflüssigkeitschromatographiegekoppelt mit Quadrupol-Time-of-Flight-Massenspektrometrie (UHPLC-Q-TOF-MS; Agilent 1290 Infinity II/6550, USA) durchgeführt. Serumproben (100 μL) wurden mit 400 μL kaltem Methanol:Acetonitril (1:1, v/v), das interne Standards enthielt, versetzt, verwirbelt und zur Proteinfällung eine Stunde bei -20 °C inkubiert. Nach Zentrifugation bei 14.000 × g für 15 Minuten wurden die Überstände unter einem Stickstoffstrom eingeengt und zur Analyse in 100 μL Acetonitril:Wasser (1:1, v/v) rekonstituiert. Die chromatographische Trennung erfolgte an einer ACQUITY UPLC HSS T3-Säule (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) bei 40 °C unter Verwendung von Wasser mit 0,1 % Ameisensäure als mobile Phase A und Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure als mobile Phase B bei einer Flussrate von 0,30 mL/min. Zur Trennung der Metaboliten wurde ein Gradientenprogramm verwendet, das den Anteil der organischen Phase von 5 % auf 95 % erhöhte, gefolgt von einer Säulenspülung und Re-Äquilibration. Die massenspektrometrischen Daten wurden sowohl im positiven als auch im negativen Elektrospray-Ionisationsmodus im Bereich von m/z 50–1200 erfasst; zu den Quellparametern gehörten eine Kapillarspannung von 3,5 kV, ein Trockengasfluss von 10 L/min, eine Trockengastemperatur von 325 °C, ein Nebuliserdruck von 35 psi sowie eine Fragmentor-Spannung von 120 V.
Rohdatendateien wurden in das mzXML-Format konvertiert und mit dem XCMS-Paket in R zur Peakdetektion, Retentionszeit-Korrektur und Integration der Peakfläche verarbeitet. Qualitätskontrollproben, die durch Mischen gleicher Anteile aller Serum-Extrakte hergestellt wurden, wurden während der gesamten Analytesequenz eingefügt, um die Gerätestabilität zu überwachen. Merkmale mit übermäßigen fehlenden Werten oder instabiler Reproduzierbarkeit in der Qualitätskontrolle wurden vor der statistischen Modellierung entfernt. Die Metabolitenidentifizierung erfolgte durch Abgleich der exakten Masse, der Retentionszeit und der MS/MS-Fragmentierungsmuster mit der Human Metabolome Database (HMDB), METLIN und internen Spektralbibliotheken. Multivariate statistische Analysen wurden mit MetaboAnalyst 5.0 durchgeführt. Metabolitenmerkmale, die für die nachfolgende Berichterstattung beibehalten wurden, wurden anhand eines kombinierten Kriteriums priorisiert, das den multivariaten Diskriminierungsbeitrag, die Richtung der Fold-Change und die statistische Signifikanz einbezog; P-Werte wurden mittels der Benjamini-Hochberg-Methode angepasst, um Mehrfachvergleiche zu berücksichtigen. Die vollständige annotierte Berichtstabelle mit 52 Metabolitenmerkmalen ist als ergänzende Tabelle 1 enthalten. Die Pfad-Enrichment-Analyse wurde anhand der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Datenbank durchgeführt.
Statistische Analyse
Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS Version 26.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) und R-Software (Version 4.2.1) durchgeführt. Stetige Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben und vor der inferenzstatistischen Prüfung mittels des Shapiro-Wilk-Tests auf Normalverteilung überprüft. Bei normalverteilten Daten wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey’s post-hoc-Test für den Vergleich mehrerer Gruppen verwendet; bei nicht normalverteilten Daten kam der Kruskal-Wallis-Test mit Dunn’s post-hoc-Test zum Einsatz. Zusammenhänge zwischen Darmmikroben-Taxa und serumgebundenen Metaboliten wurden mittels des Spearman-Rangkorrelationskoeffizienten bewertet und als hierarchisch geclusterte Heatmaps dargestellt. Die Korrelations-P-Werte wurden für Mehrfachvergleiche mittels der False-Discovery-Rate-Methode nach Benjamini-Hochberg korrigiert, und nur Korrelationen, die in ihrer Richtung konsistent und statistisch signifikant waren, wurden interpretiert. Ein zweiseitiger P-Wert < 0,05 galt als statistisch signifikant, sofern nicht eine angepasste P-Wert-Schwelle angegeben wurde.
Ergebnisse
Wirkungen des ZeLan-Extrakts auf klinische PCOS-Phänotypen
Die Verabreichung von DHEA induzierte bei Ratten PCOS-ähnliche endokrine und metabolische Phänotypen, was sich in signifikanten Erhöhungen von Körpergewicht, Serum-Testosteronkonzentration, LH/FSH-Verhältnis und nüchternen Insulinspiegeln im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte (alle P < 0,05). Die Verteilungsbeurteilung mittels des Shapiro-Wilk-Tests unterstützte die parametrische Analyse der primären Endpunkte für Körpergewicht und Hormone, die in Tabelle 1 zusammengefasst sind. Die Behandlung mit ZeLan-Extrakt über 28 Tage verbesserte diese metabolischen und hormonellen Störungen signifikant. Das Körpergewicht wurde am Ende der Behandlungsphase am Studientag 56 erfasst, einschließlich der 7-tägigen Eingewöhnungsphase. Wie in Tabelle 1 dargestellt, war das Körpergewicht in der Modellgruppe (291,12 ± 15,35 g) deutlich höher als in der Kontrollgruppe (227,45 ± 10,12 g, P < 0,05), während die Behandlung mit ZeLan das Körpergewicht signifikant auf 245,25 ± 10,21 g senkte (P < 0,05 gegenüber Modell). Die Serum-Testosteronspiegel waren bei den PCOS-Modellratten (1,85 ± 0,21 ng/mL) im Vergleich zu den Kontrollen (0,51 ± 0,05 ng/mL) deutlich erhöht, und die Gabe von ZeLan senkte den Testosteronspiegel auf 0,92 ± 0,12 ng/mL. Das LH/FSH-Verhältnis war in der Modellgruppe (3,28 ± 0,25) im Vergleich zur Kontrollgruppe (1,25 ± 0,11) signifikant erhöht und wurde durch die Behandlung mit ZeLan teilweise normalisiert (1,85 ± 0,15). Die nüchternen Insulinspiegel waren bei den Modelltieren erhöht (28,95 ± 2,35 mIU/L gegenüber 12,55 ± 1,12 mIU/L bei den Kontrollen) und signifikant reduziert nach Verabreichung von ZeLan (18,82 ± 1,55 mIU/L) (Abbildung 2). Diese Ergebnisse bestätigten die erfolgreiche Erzeugung eines endokrin-metabolischen, PCOS-ähnlichen Phänotyps; jedoch wurden in dieser Studie keine ovarielle Histopathologie, Follikelzählungen, Analysen des Corpus luteum oder Zyklusüberwachung durchgeführt.
ZeLan-Extrakt stellte die alpha-Diversität der Darmmikrobiota wieder her
Die Analyse von Alpha-Diversitätsindizes zeigte erhebliche Veränderungen der Struktur der mikrobiellen Darmgemeinschaft in Verbindung mit PCOS und dessen Behandlung. Wie in Tabelle 2 und Abbildung 3 dargestellt, war der Shannon-Diversitätsindex bei PCOS-Modellratten (4,19 ± 0,35) signifikant niedriger als bei gesunden Kontrollen (6,51 ± 0,28; P < 0,05), was auf eine verminderte mikrobielle Alpha-Diversität im Krankheitszustand hinweist. Die Behandlung mit ZeLan führte zu einer teilweisen Wiederherstellung der mikrobiellen Diversität, wobei der Shannon-Index auf 5,79 ± 0,26 anstieg (P < 0,05 gegenüber Modell). Konsistente Ergebnisse ergaben sich für den Simpson-Index, der von 0,98 ± 0,01 in der Kontrollgruppe auf 0,82 ± 0,03 bei den Modelltieren sank und nach der Gabe von ZeLan auf 0,93 ± 0,02 zurückkehrte. Der Chao1-Schätzer, der die Artenvielfalt widerspiegelt, zeigte ein ähnliches Muster: Die Induktion von PCOS verringerte Chao1 deutlich von 1215,3 ± 45,4 auf 665,8 ± 52,1, während die Behandlung mit ZeLan die Artenvielfalt auf 963,5 ± 38,6 erhöhte. Insgesamt deuten diese Befunde darauf hin, dass PCOS mit einer Darmdysbiose assoziiert ist, die durch verminderte Alpha-Diversität und geringere Artenvielfalt gekennzeichnet ist, und dass der ZeLan-Extrakt die Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft teilweise in Richtung des Kontrollprofils wiederherstellen kann.
Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota
Die taxonomische Profilierung auf Phylum-Ebene zeigte deutliche Unterschiede in der Zusammensetzung zwischen den Versuchsgruppen. Wie in Abbildung 4 dargestellt, waren Firmicutes und Bacteroidetes die dominierenden Phyla in allen Gruppen und machten zusammen über 85 % der gesamten bakteriellen Gemeinschaft aus. Die Modellgruppe wies einen deutlich erhöhten Anteil an Firmicutes (ca. 75 %) sowie einen verminderten Anteil an Bacteroidetes (ca. 15 %) im Vergleich zur Kontrollgruppe (Firmicutes ca. 40 %, Bacteroidetes ca. 45 %) auf, was zu einem signifikant erhöhten Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes (F/B-Verhältnis) führte, das charakteristisch für eine metabolische Dysbiose ist. Die Behandlung mit ZeLan milderte dieses Ungleichgewicht ab, indem sie den Firmicutes-Anteil auf ca. 52 % senkte und gleichzeitig den Bacteroidetes-Anteil auf ca. 35 % erhöhte, wodurch das F/B-Verhältnis teilweise wieder in Richtung des Kontrollniveaus normalisiert wurde.
Die LEfSe-Analyse wurde verwendet, um bakterielle Taxa zu identifizieren, die die Kontroll- und Modellgruppen unterscheiden, und definierte somit die krankheitsassoziierte mikrobielle Signatur. Wie in Abbildung 5 dargestellt, wies die PCOS-Modellgruppe auf Gattungsebene signifikant erhöhte Häufigkeiten von Bacteroides (LDA-Score > 3,5), Prevotella (LDA-Score > 3,0) und Escherichia (LDA-Score > 2,5) auf, die im Allgemeinen bereits früher mit metabolischer Dysfunktion und Entzündungen in Verbindung gebracht wurden. Umgekehrt zeigte die Kontrollgruppe eine Anreicherung nützlicher Gattungen, darunter Lactobacillus (LDA-Score > 3,0) und Ruminococcus (LDA-Score > 2,5), die beide für ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmbarrierefunktion und der Produktion nützlicher Metaboliten wie kurzkettiger Fettsäuren bekannt sind. Die ZeLan-Gruppe wurde in Abbildung 5 nicht als separate LEfSe-Klasse dargestellt, da diese Analyse auf Taxa ausgerichtet war, die Krankheit und Gesundheit unterscheiden; zeLan-assoziierte Effekte wurden aus der Verschiebung der Häufigkeiten in Richtung des Kontrollprofils sowie aus Korrelationen zwischen Mikrobiom und Metabolom abgeleitet.
Metabolomisches Profiling und Identifizierung differenzieller Metabolite
Die ungerichtete Metabolomik-Analyse identifizierte erhebliche metabolische Störungen, die mit PCOS und dessen Behandlung mit ZeLan-Extrakt assoziiert sind. Das Volcano-Plot in Abbildung 6 zeigt die Verteilung der Metabolitenmerkmale zwischen den Gruppen Modell und Kontrolle, wobei hoch- und herunterregulierte Merkmale anhand der Richtung der Fold-Change und der statistischen Signifikanz hervorgehoben sind. Insgesamt wurden 52 annotierte Metabolitenmerkmale in der vollständigen Metabolomik-Ergebnistabelle für den Vergleich Modell versus Kontrolle beibehalten. Die vollständige Liste, einschließlich Metabolitenname, HMDB-Identifier, biochemische Klasse, log2 Fold-Change, P-Wert und Regulierungsrichtung, ist als ergänzende Tabelle 1 angegeben. Tabelle 3 stellt repräsentative annotierte Metaboliten mit hoher biologischer Relevanz für PCOS dar.
Tabelle 3 fasst repräsentative wichtige differenzielle Metaboliten mit hohen VIP-Scores und biologischer Relevanz für die Pathophysiologie des PCOS zusammen. Steroidhormone, darunter Testosteron (VIP = 2,56, P < 0,001) und Androstendion (VIP = 2,34, P < 0,001), waren bei PCOS-Modelltieren signifikant erhöht, was mit dem hyperandrogenen Zustand übereinstimmt, der für diese Erkrankung charakteristisch ist. Auch der Fettsäurestoffwechsel war gestört: Palmitinsäure (VIP = 2,12) und Arachidonsäure (VIP = 1,89) zeigten signifikante Zunahmen, während der proinflammatorische Lipidmediator Prostaglandin E2 ebenfalls hochreguliert war (VIP = 2,05). Umgekehrt waren Metaboliten, die mit einer vorteilhaften mikrobiellen Darmaktivität assoziiert sind, bei PCOS-Tieren vermindert: Lithocholsäure, eine sekundäre Gallensäure, die durch mikrobielle Biotransformation entsteht, nahm deutlich ab (VIP = 2,45), ebenso wie die kurzkettige Fettsäure Buttersäure (VIP = 2,21). Zusätzlich zeigten sich im Modellgruppenansatz eine Verringerung von Bernsteinsäure und der essentiellen Aminosäure L-Tryptophan, was auf eine beeinträchtigte mikrobielle Fermentation und einen veränderten Aminosäurestoffwechsel hindeutet.
Anreicherungsanalyse von KEGG-Pfaden
Die Pfad-Enrichment-Analyse unter Verwendung der KEGG-Datenbank zeigte mehrere serummetabolische Wege, die bei PCOS signifikant gestört sind und durch die ZeLan-Behandlung moduliert werden. Wie in Abbildung 7 dargestellt, erwies sich die Biosynthese von Steroidhormonen als der am stärksten angereicherte Pfad (Rich Factor = 0,80, P < 0,01), was mit dem Hyperandrogenismus-Phänotyp von PCOS übereinstimmt. Der Weg der ovariellen Steroidogenese war ebenfalls stark angereichert (Rich Factor = 0,75, P < 0,01) und spiegelt die Beteiligung einer veränderten Androgensynthese an der ovariellen Dysfunktion wider. Die Biosynthese primärer Gallensäuren zeigte eine signifikante Anreicherung (Rich Factor = 0,62, P < 0,02), was auf eine gestörte enterhepatische Gallensäure-Zirkulation hinweist, die möglicherweise mit Veränderungen der Darmmikrobiota zusammenhängt. Der Arachidonsäure-Stoffwechsel (Rich Factor = 0,56, P < 0,03) und der Insulinresistenz-Pfad (Rich Factor = 0,40, P < 0,04) waren ebenfalls signifikant angereichert, was die Existenz entzündlicher und metabolischer Störungen unterstützt, die für PCOS charakteristisch sind. Der Fettsäure-Biosynthese-Pfad zeigte eine moderate Anreicherung (Rich Factor = 0,30), was auf eine Beteiligung der Dysregulation des Lipidstoffwechsels hindeutet.
Korrelationsanalyse von Mikrobiom und Metabolom
Um funktionelle Beziehungen zwischen der Zusammensetzung der Darmmikrobiota und metabolischen Veränderungen zu bewerten, wurde eine Spearman-Korrelationsanalyse mit Kontrolle der falschen Entdeckungsrate zwischen unterschiedlich häufig vorkommenden bakteriellen Gattungen und Schlüsselmetaboliten durchgeführt. Die hierarchisch geclusterte Korrelations-Heatmap in Abbildung 8 zeigt deutliche Muster der Assoziationen zwischen Mikrobiota und Metabolom. Nützliche Bakterien, darunter Lactobacillus und Ruminococcus, wiesen starke positive Korrelationen mit Lithocholsäure (r = 0,72 bzw. 0,68) und Buttersäure (r = 0,65 bzw. 0,60) auf, während negative Korrelationen mit Testosteron (r = -0,75 und -0,80) und Androstendion (r = -0,68 und -0,72) bestanden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die in der taxonomischen Analyse identifizierten nützlichen Bakterien mit androgenbezogenen Metaboliten sowie mit der SCFA-bezogenen metabolischen Aktivität assoziiert waren.
Umgekehrt zeigten die mit PCOS assoziierten Gattungen Bacteroides, Prevotella und Escherichia entgegengesetzte Korrelationsmuster. Diese Bakterien waren positiv korreliert mit Testosteron (r = 0.85, 0.82 bzw. 0.60), Androstendion (r = 0.78, 0.75 bzw. 0.55) und Palmitinsäure (r = 0.65, 0.60 bzw. 0.45), wiesen hingegen negative Korrelationen mit vorteilhaften Metaboliten wie Lithocholsäure und Buttersäure auf. Diese Korrelationsmuster stützen funktionelle Zusammenhänge zwischen spezifischen Darmmikrobiota und den metabolischen Störungen, die für PCOS charakteristisch sind, belegen jedoch keine direkte Kausalität.
Datenverfügbarkeit:
Die in dieser Studie generierten und analysierten Datensätze umfassen Probendaten, Quelldaten zu Phänotypen, 16S-Alpha-Diversitätsindizes, Zusammenfassungen der Abundanz auf Phyla-Ebene, Ergebnisse zu differentiell exprimierten Bakterientaxa, Tabellen zur differentiellen Metabolomik-Analyse, repräsentative Metabolit-Ergebnisse, Ergebnisse zur KEGG-Pfad-Anreicherung sowie die Korrelationsmatrix zwischen Mikrobiota und Metaboliten. Diese zugrundeliegenden Quelldaten sind als ergänzende Supplementary File 1 beigefügt. Der verarbeitete Datensatz zu differentiell exprimierten Metaboliten ist als Supplementary Table 1 bereitgestellt.
Abbildung 1: Experimenteller Aufbau und Behandlungszeitplan. Schematische Darstellung des experimentellen Ablaufs mit einer 7-tägigen Eingewöhnungsphase, einer 21-tägigen Injektionsphase mit DHEA oder Trägersubstanz, einer 28-tägigen Behandlung mit ZeLan-Extrakt oder Trägersubstanz und der Entnahme von Serum- und Fäkalproben am Ende des Protokolls am Tag 56. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2: Wirkungen des ZeLan-Extrakts auf endokrine und metabolische Parameter. Boxplots, die (A) die Konzentration von Testosteron im Serum, (B) das LH/FSH-Verhältnis und (C) das Körpergewicht in den Gruppen Kontrolle, Modell und ZeLan-Behandlung nach der Interventionsphase zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3: Alpha-Diversität der Darmmikrobiota. Vergleich des Shannon-Diversitätsindex zwischen den Kontroll-, Modell- und ZeLan-Behandlungsgruppen, der Unterschiede in der mikrobiellen Alpha-Diversität des Darms veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 4: Zusammensetzung der Darmmikrobiota auf Phylum-Ebene. Gestapeltes Balkendiagramm, das die relative Häufigkeit der vorherrschenden bakteriellen Phyla in der Darmmikrobiota der Kontroll-, Modell- und ZeLan-Behandlungsgruppen zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 5: Unterschiedlich verteilte bakterielle Taxa, identifiziert durch LEfSe-Analyse. Lineare Diskriminanzanalyse der Effektgröße (LEfSe) zur Identifizierung bakterieller Gattungen, die die Kontroll- und Modellgruppen unterscheiden. Die LDA-Scores zeigen die Effektgröße der unterschiedlich häufig vorkommenden Taxa an. ZeLan-assoziierte Veränderungen werden in den Ergebnissen basierend auf Verschiebungen der Häufigkeit im Vergleich zur Modellgruppe beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 6: Differenzielle Metabolitenprofilierung. Vulkandiagramm, das differenzielle Metabolitenmerkmale zwischen den Gruppen Modell und Kontrolle zeigt. Rote und blaue Punkte repräsentieren signifikant hoch- bzw. herunterregulierte Metabolitenmerkmale, basierend auf Fold-Change und statistischer Signifikanz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 7: KEGG-Pfaderichungsanalyse. Bubble-Plot, das signifikant angereicherte Stoffwechselwege zeigt, die aus differenziellen Metaboliten identifiziert wurden. Die Größe der Blasen repräsentiert die Anzahl der zugeordneten Metaboliten, und die Farbe der Blasen zeigt die statistische Signifikanz (P-Wert) der Pfaderichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 8: Korrelation zwischen Darmmikrobiota und Serummetaboliten. Hierarchisch gruppierte Heatmap, die die Spearman-Korrelationskoeffizienten zwischen unterschiedlich häufig vorkommenden bakteriellen Gattungen und repräsentativen Serummetaboliten zeigt. Rote Farbe kennzeichnet positive Korrelationen, während blaue Farbe negative Korrelationen anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
| Gruppe | N | Körpergewicht (g) | Testosteron (ng/mL) | LH/FSH-Verhältnis | Insulin (mIU/L) |
| Kontrolle | 8 | 227,45 ± 10,12 | 0,51 ± 0,05 | 1,25 ± 0,11 | 12,55 ± 1,12 |
| Modell | 8 | 291,12 ± 15,35a | 1,85 ± 0,21a | 3,28 ± 0,25a | 28,95 ± 2,35a |
| ZeLan | 8 | 245,25 ± 10,21b | 0,92 ± 0,12b | 1,85 ± 0,15b | 18,82 ± 1,55b |
| Hinweis: Die Daten sind als Mittelwert ± SD angegeben. a = p < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe; b = p < 0,05 im Vergleich zur Modellgruppe. | |||||
Tabelle 1: Endokrine und metabolische Parameter bei PCOS-Ratten. Körpergewicht, Serum-Testosteron, LH/FSH-Verhältnis und nüchtern Insulinwerte wurden in den Kontroll-, Modell- und ZeLan-Behandlungsgruppen gemessen. Die Daten sind als Mittelwert ± SD angegeben.
| Gruppe | Shannon-Index | Simpson-Index | Chao1-Schätzer |
| Kontrolle | 6.51 ± 0.28 | 0.98 ± 0.01 | 1215,3 ± 45,4 |
| Modell | 4,19 ± 0,35a | 0,82 ± 0,03a | 665,8 ± 52,1a |
| ZeLan | 5,79 ± 0,26b | 0,93 ± 0,02b | 963,5 ± 38,6b |
| Hinweis: Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. a = p < 0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe; b = p < 0,05 im Vergleich zur Modellgruppe. | |||
Tabelle 2: Alpha-Diversitätsindizes der Darmmikrobiota. Vergleich des Shannon-Index, des Simpson-Index und des Chao1-Schätzers zwischen den Kontroll-, Modell- und ZeLan-Behandlungsgruppen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben.
| Name des Metaboliten | HMDB-ID | Klasse | Trend (Modell vs. Kontrolle) | p-Wert | VIP-Score |
| Testosteron | HMDB0000286 | Steroid | Up ↑ | < 0.001 | 2.56 |
| Androstendion | HMDB0000055 | Steroid | Up ↑ | < 0.001 | 2.34 |
| Palmitinsäure | HMDB0000220 | Fettsäure | Up ↑ | < 0.001 | 2.12 |
| Arachidonsäure | HMDB0001043 | Fettsäure | Up ↑ | 0.003 | 1.89 |
| Prostaglandin E2 | HMDB0001036 | Lipid | Up ↑ | < 0.001 | 2.05 |
| Lithocholsäure | HMDB0000752 | Gallensäure | Down ↓ | < 0.001 | 2.45 |
| Buttersäure | HMDB0000039 | SCFA | Down ↓ | < 0.001 | 2.21 |
| Bernsteinsäure | HMDB0000254 | Organische Säure | Down ↓ | 0.021 | 1.65 |
| L-Tryptophan | HMDB0000929 | Aminosäure | Down ↓ | 0.015 | 1.58 |
| Hinweis: VIP = Variable Importance in Projection (VIP > 1 wird als signifikant angesehen). | |||||
Tabelle 3: Repräsentative differentielle Serummetaboliten. Repräsentative annotierte Metaboliten, die mit PCOS assoziiert sind und durch ZeLan-Extrakt reguliert werden, einschließlich HMDB-Identifikatoren, Metabolitenklasse, Regulationsrichtung, P-Wert und VIP-Score. Die vollständige Liste der 52 annotierten Metabolitenmerkmale ist in Ergänzungstabelle 1 enthalten.
Zusatz-Tabelle 1: Vollständiger annotierter Metabolit-Datensatz. Vollständige Liste der 52 annotierten Metabolit-Merkmale, die für die Metabolomik-Berichterstattung beibehalten wurden, einschließlich Metabolit-Name, HMDB-Identifier, biochemische Klasse, Fold-Change, P-Wert und Regulationsrichtung.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatzdatei 1: Quelldaten zur Unterstützung der experimentellen, Mikrobiom- und Metabolom-Analysen. Diese Arbeitsmappe enthält die Probeninformationen, klinische Phänotyp-Messungen, Diversitätsindizes der 16S-rRNA-Sequenzierung, mikrobielle relative Abundanz auf Phyla-Ebene, LEfSe-Analyse differentieller Taxa, Metabolom-Differenzialanalyse, repräsentative Metaboliten, KEGG-Pfad-Enrichment-Analyse, Korrelationsmatrixdaten und eine Zusammenfassung der Datenverifizierung, die zur Erstellung der in der Publikation dargestellten Abbildungen und Tabellen verwendet wurden.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Die vorliegende Studie liefert Hinweise darauf, dass der ZeLan-Extrakt endokrine und metabolische Phänotypen im Zusammenhang mit PCOS in einem DHEA-induzierten Rattenmodell verbessert und dass diese Wirkungen mit günstigen Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota und in den serummetabolischen Profilen assoziiert sind. Der integrierte Multi-Omics-Ansatz zeigte, dass die Behandlung mit ZeLan eine Hyperandrogenämie, ein erhöhtes LH/FSH-Verhältnis und eine Insulinresistenz verbesserte, gleichzeitig die alpha-Diversität der Darmmikrobiota teilweise wiederherstellte, die mikrobielle Zusammensetzung neu ausglich und mehrere metabolische Signalwege, die an der PCOS-Pathophysiologie beteiligt sind, normalisierte. Diese Ergebnisse erweitern das gegenwärtige Verständnis biologischer Reaktionen auf traditionelle chinesische pflanzliche Arzneimittel und stützen weitere Untersuchungen der Darm-Eierstock-Achse als potenziellen therapeutischen Ansatzpunkt bei PCOS.
Die Abnahme des Serum-Testosterons und des LH/FSH-Verhältnisses nach Behandlung mit ZeLan steht im Einklang mit früheren Untersuchungen, die antiandrogene Eigenschaften von pflanzlichen Extrakten belegen, die Flavonoide und phenolische Verbindungen enthalten16. Eine umfassende Übersicht klinischer Studien zu pflanzlichen Arzneimitteln bei PCOS hat endokrine und metabolische Verbesserungen im Rahmen verschiedener pflanzlicher Interventionen zusammengefasst17. Der Mechanismus, durch den ZeLan die Androgenbiosynthese moduliert, könnte direkte Effekte auf ovariale steroidogene Signalwege, systemische antiinflammatorische und insulinempfindlichkeitssteigernde Wirkungen oder indirekte Effekte im Zusammenhang mit mikrobiellen Metaboliten des Darms umfassen; das vorliegende Studiendesign kann diese Möglichkeiten nicht vollständig voneinander trennen. Die Verbesserung des LH/FSH-Verhältnisses weist auf eine teilweise Wiederherstellung der Funktion der hypothalamisch-hypophysär-gonadalen Achse hin, die bei PCOS häufig gestört ist18. Systematische Übersichten zu Tierversuchen mit traditionellen chinesischen Arzneiformeln bei PCOS berichteten ebenfalls über Verbesserungen reproduktiver und endokriner Parameter19. Die gleichzeitige Verbesserung insulinbezogener Parameter legt nahe, dass ZeLan metabolische Vorteile über die alleinige endokrine Regulation hinaus entfalten könnte, möglicherweise durch eine verbesserte periphere Insulin-Signalübertragung oder eine Verringerung entzündungsfördernder Mediatoren, die die Funktion des Insulinrezeptors beeinträchtigen20.
Die Wiederherstellung der mikrobiellen Alpha-Diversität im Darm nach Behandlung mit ZeLan ist vereinbar mit einer mikrobiomassoziierten Reaktion. Die beobachtete verminderte Alpha-Diversität bei Ratten im PCOS-Modell stimmt mit der wachsenden Anzahl an Publikationen überein, die eine Darmdysbiose sowohl in experimentellen PCOS-Modellen als auch in klinischen Populationen dokumentieren21. Insenser et al. berichteten zudem, dass die Profilbildung der Darmmikrobiota beim PCOS von Geschlecht, Sexualhormonen und Adipositas beeinflusst wird22. Unsere Beobachtung, dass die Behandlung mit ZeLan den Shannon-Index von 4,19 auf 5,79 teilweise wiederherstellte, legt nahe, dass dieser pflanzliche Extrakt die Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft unterstützen könnte. Ähnliche, die Diversität wiederherstellende Effekte wurden bereits für andere polyphenolreiche Pflanzenextrakte beschrieben, die möglicherweise gezielt nützliche Bakterienpopulationen fördern, während sie potenziell pathogene Taxa hemmen23. Die auf Phylum-Ebene beobachteten taxonomischen Verschiebungen, insbesondere die verminderte Firmicutes-zu-Bacteroidetes-Ratio nach der Behandlung mit ZeLan, sind vor dem Hintergrund der bekannten Assoziation zwischen erhöhten F/B-Verhältnissen und metabolischen Störungen – einschließlich Adipositas und Insulinresistenz – von Bedeutung24. Weitere Studien, darunter die Arbeit von Jobira et al. an Jugendlichen mit PCOS, berichteten über veränderte mikrobielle Biodiversität im Magen-Darm-Trakt und untermauern damit die biologische Relevanz der mikrobiellen Zusammensetzung für den Stoffwechsel des Wirts25.
Die Identifizierung spezifischer bakterieller Gattungen, die unterschiedlich mit PCOS und der ZeLan-Behandlung assoziiert sind, liefert einen biologischen Kontext für die in dieser Studie beobachteten Mikrobiota-Metabolom-Assoziationen. Die Anreicherung von Lactobacillus und Ruminococcus bei gesunden Kontrollen sowie deren Verringerung bei PCOS-Tieren entspricht früheren Berichten, die die schützende Rolle dieser Gattungen hervorheben26. Lactobacillus-Arten sind bekannt für die Produktion von Milchsäure und antimikrobiellen Peptiden, die die Darmbarrierefunktion aufrechterhalten und pathogene Bakterien hemmen, während Ruminococcus-Arten wichtige Produzenten von kurzkettigen Fettsäuren durch Fermentation von Ballaststoffen sind27. Die Wiederherstellung dieser vorteilhaften Gattungen nach ZeLan-Behandlung könnte die Darmbarrierefunktion verbessern und die mit kurzkettigen Fettsäuren assoziierte metabolische Aktivität steigern, was sich in den erhöhten Buttersäurespiegeln widerspiegelt, die in der Metabolomanalyse beobachtet wurden. Umgekehrt stimmt die erhöhte Häufigkeit von Bacteroides, Prevotella und Escherichia bei PCOS-Tieren mit Studien überein, die diese Gattungen mit entzündlichen und Stoffwechselstörungen in Verbindung bringen28. Escherichia-Arten, insbesondere Escherichia coli, können Lipopolysaccharid produzieren, das systemische Entzündungen und Insulinresistenz über die Signalkaskade des Toll-ähnlichen Rezeptors 4 auslösen kann, was einen plausiblen Zusammenhang zwischen Darmdysbiose und den mit PCOS assoziierten Stoffwechselstörungen darstellt29.
Die metabolomischen Befunde liefern Hinweise auf metabolische Assoziationen zwischen Darmmikrobiota und Wirt im Zusammenhang mit der ZeLan-Behandlung. Veränderungen sekundärer Gallensäuren, wie beispielsweise der Lithocholsäure, sind biologisch relevant, da diese Metaboliten durch bakterielle enzymatische Aktivität entstehen30. Gallensäuren erfüllen nicht nur eine Funktion bei der Lipidaufnahme, sondern wirken auch als Signalmoleküle, die über den Farnesoid-X-Rezeptor und den Takeda-G-Protein-gekoppelten Rezeptor 5 den Glukose- und Lipidstoffwechsel regulieren, was darauf hindeutet, dass eine Normalisierung des Gallensäureprofils zur Verbesserung der metabolischen Homöostase beitragen könnte. Ebenso ist die Wiederherstellung der Buttersäurespiegel von Bedeutung, angesichts ihrer vielfältigen positiven Wirkungen, einschließlich der Stärkung der Darmbarrierefunktion, entzündungshemmender Eigenschaften und der Förderung der Insulinempfindlichkeit. Die beobachteten Korrelationen zwischen nützlichen Bakterien und schützenden Metaboliten im Gegensatz zu Assoziationen zwischen pathogenen Bakterien und schädlichen Metaboliten stützen die Hypothese der Darm-Eierstock-Achse, unterstreichen jedoch gleichzeitig die Notwendigkeit einer direkten mechanistischen Validierung.
Die klinischen Implikationen dieser Befunde sollten angesichts der Grenzen des präklinischen explorativen Designs interpretiert werden. Die Ergebnisse stützen eine weitere Bewertung des ZeLan-Extrakts als komplementäre Strategie zur Behandlung von PCOS, insbesondere im Kontext botanischer Interventionen, die sowohl endokrin-metabolische Parameter als auch das intestinale Mikromilieu beeinflussen könnten. Die Identifizierung mikrobieller und metabolischer Biomarker, die mit der Behandlungsantwort assoziiert sind, könnte zukünftige mechanistische und translationswissenschaftliche Studien leiten. Zudem könnte die Darm-Eierstock-Achse langfristig Kombinationsstrategien unterstützen, die ZeLan mit Probiotika oder Ernährungsmodifikationen verbinden; solche Strategien bedürfen jedoch einer kontrollierten Validierung, bevor sie klinisch angewendet werden können.
Mehrere Einschränkungen der vorliegenden Studie müssen anerkannt werden. Erstens, obwohl das DHEA-induzierte Rattenmodell mehrere Merkmale des menschlichen PCOS nachbildet, erfasst es die Heterogenität der menschlichen PCOS-Phänotypen – einschließlich schlanker, adipöser, insulinresistenter und entzündlicher Subtypen – nicht vollständig; daher erfordert die klinische Übertragung eine Validierung an gut charakterisierten Patientengruppen. Zweitens wurde im Versuch eine einzige ZeLan-Dosis ohne Dosis-Wirkungs-Gradienten oder eine positive Arzneimittelkontrolle wie Metformin verwendet, sodass der wirksame Dosisbereich, die vergleichende Wirksamkeit und der optimale Verabreichungszyklus noch zu bestimmen sind. Drittens erfolgte die Probennahme ausschließlich am Versuchsende, was die Interpretation dynamischer zeitlicher Veränderungen in der Mikrobiota, den Metaboliten und Hormonprofilen während der Interventionsphase einschränkt. Viertens waren in diesem experimentellen Design keine Untersuchungen der ovariellen Histopathologie, Follikelzählungen, Quantifizierung des Corpor luteum oder serielle Überwachung des Östruszyklus enthalten; daher wurde die funktionelle Erholung der Ovarien anhand endokriner und metabolischer Indizes und nicht anhand direkter Gewebe- und Zyklusbewertungen abgeleitet. Fünftens identifizierte die Studie Korrelationen zwischen mikrobiellen Taxa und Metaboliten, enthielt jedoch keine fäkale Mikrobiota-Transplantation, Versuche an keimfreien Tieren, gezielte Supplementierung von Metaboliten, Assays für Entzündungsmarker oder Messungen ovarieller steroidogener Enzyme wie CYP17A1, CYP19A1 und StAR; folglich können kausale Mechanismen anhand der vorliegenden Daten nicht bestätigt werden. Sechstens liefert die ungerichtete Metabolomik Hinweise auf Entdeckungsebene, und eine gezielte quantitative Validierung zentraler Metaboliten wie Lithocholsäure, Buttersäure und Testosteron ist in zukünftigen Arbeiten erforderlich. Siebtens standen für die vorliegende Einreichung keine Visualisierung der Beta-Diversität, Vorhersage mikrobieller Funktionen oder integrierte Modellierung von Mikrobiota-Metabolit-Gen-Wegverläufen zur Verfügung, was die Fähigkeit einschränkt, ein vollständiges regulatorisches Netzwerk aufzubauen. Schließlich wurde der ZeLan-Extrakt anhand des Gesamtgehalts an Flavonoiden standardisiert, doch eine umfassende qualitative und quantitative phytochemische Charakterisierung aktiver Monomere bleibt notwendig.
Zusammenfassend verbesserte der ZeLan-Extrakt endokrine und metabolische Phänotypen im Zusammenhang mit PCOS in einem Rattenmodell und war mit einer teilweisen Wiederherstellung der mikrobiellen Alpha-Diversität im Darm, veränderter mikrobieller Zusammensetzung sowie einer Modulation serumbasierter Stoffwechselwege verbunden, darunter die Biosynthese von Steroidhormonen, der Gallensäurestoffwechsel und der Stoffwechsel kurzkettiger Fettsäuren. Die beobachteten Korrelationen zwischen nützlichen Bakterien und schützenden Metaboliten im Gegensatz zu Assoziationen zwischen PCOS-angereicherten Bakterien und schädlichen Metaboliten stützen eine biologisch plausible Verbindung über die Darm-Eierstock-Achse. Diese Ergebnisse legen eine Grundlage für zukünftige mechanistische und translationsorientierte Studien zum ZeLan-Extrakt bei der Behandlung von PCOS, betonen jedoch gleichzeitig die Notwendigkeit einer kausalen Validierung und einer umfassenderen Charakterisierung der Phytochemikalien.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Danksagungen
Diese Studie wurde durch das Wissenschaftliche Forschungsplanungsprojekt der Provinzverwaltung für Traditionelle Chinesische Medizin von Hebei finanziert (Förderkennzeichen Nr. 2021316).
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Acetonitril | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A955-4 | Optima LC-MS-Reinheitsgrad, 4 L; mobile Phase und Probenrekonstitution |
| ACQUITY UPLC HSS T3-Säule | Waters Corporation | 186003539 | 100 Å, 1,8 μm, 2,1 × 100 mm; UHPLC-Trennung |
| Agarose-Gelelektrophorese-System | Bio-Rad Laboratories | 1704486 | Mini-Sub Cell GT horizontales Elektrophorese-System; DNA-Qualitätsbeurteilung |
| Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MS | Agilent Technologies | G7120A/G7167B/G7116B/G6550B | 1290 Infinity II UHPLC-Modulsatz gekoppelt an 6550 iFunnel Q-TOF MS; Plattform für ungerichtete Metabolomik in Serum |
| DADA2-Algorithmus | Bioconductor | Version 1.24.0 | ASV-Erzeugung und Entfernung von Chimären; Version abgeleitet entsprechend R 4.2.1/Bioconductor 3.15 Workflow |
| Dehydroepiandrostero | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | D4000 | Induktion des PCOS-Modells; 6 mg/100 g Körpergewicht; CAS 53-43-0 |
| Destilliertes Wasser | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | 10977015 | UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser; Trägersubstanz für orale Gavage in Kontroll- und Modellgruppen |
| Ameisensäure | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A117-50 | Optima LC-MS-Reinheitsgrad, 50 mL; 0,1 % Zusatz für LC-MS-Mobilphasen |
| Human Metabolome Database | University of Alberta / HMDB | HMDB 5.0 | Datenbank zur Metabolitenannotation |
| Illumina NovaSeq 6000-Plattform | Illumina | 20012850 | Sequenziersystem, verwendet vom Sequenzierungsdienstleister für paired-end 250 bp 16S rRNA-Sequenzierung |
| Lycopus lucidus Turcz. Kraut | Beijing Tongrentang Chinese Medicine Co., Ltd. | Charge ZL-20230315 | Authentisches botanisches Rohmaterial für wässrigen ZeLan-Extrakt |
| Methanol | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A456-4 | Optima LC-MS-Reinheitsgrad, 4 L; Proteinfällung für die Serum-Metabolomik |
| METLIN-Datenbank | Scripps Research | METLIN Classic 2023 | Massenspektrometrische Metabolitenannotatationsdatenbank |
| NanoDrop-Spektrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | NanoDrop One Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer; Beurteilung von DNA-Menge und -Reinheit |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51604 | DNA-Extraktion aus Zäkalinhalten; 50-Präparationen-Stuhl-DNA-Kit |
| QIIME2 | QIIME2-Entwicklungsteam | Version 2022.2 | Verarbeitung von 16S rRNA-Sequenzen |
| R-Software | R Foundation | Version 4.2.1 | Statistische Analyse und XCMS-Verarbeitung |
| ELISA-Kits für Testosteron, LH, FSH und Insulin in Serum | Cusabio Biotech | CSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070r | Ratten-ELISA-Kits für Testosteron, LH, FSH und Insulin zur Quantifizierung von Serumhormonen und Insulin |
| Sesamöl | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | S3547 | Trägersubstanz für DHEA-Injektion |
| Natriumpentobarbital | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | P3761 | Anästhesie; 50 mg/kg intraperitoneal |
| SPSS-Software | IBM Corporation | Version 26.0 | Statistische Analyse |
| Universelle 16S rRNA-Primer 338F/806R | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Individuelle Synthese: 338F/806R | Amplifikation der V3-V4-Regionen; 338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG, 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT |
| XCMS-Paket | Bioconductor / R | Version 3.18.0 | Peakdetektion, Retentionszeit-Korrektur und Integration |
| ZeLan-Extrakt | Eigene wässrige Extraktion | Charge ZLE-20230402 | Behandlung per oraler Gavage; standardisierte Gesamtflavonoide ≥2,5 % |
Referenzen
- Joham AE, Norman RJ, Stener-Victorin E, et al. Polycystic ovary syndrome. Lancet Diabetes Endocrinol. 2022;10(9):668-680.
- Islam H, Masud J, Islam YN, et al. An update on polycystic ovary syndrome: a review of the current state of knowledge in diagnosis, genetic etiology, and emerging treatment options. Womens Health (Lond). 2022;18:17455057221117966.
- Azziz R, Carmina E, Chen Z, et al. Polycystic ovary syndrome. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16057.
- Fahs D, Salloum D, Nasrallah M, et al. Polycystic ovary syndrome: pathophysiology and controversies in diagnosis. Diagnostics (Basel). 2023;13(9):1559.
- Conway G, Dewailly D, Diamanti-Kandarakis E, et al. The polycystic ovary syndrome: a position statement from the European Society of Endocrinology. Eur J Endocrinol. 2014;171(4):P1-P29.
- Huddleston HG, Dokras A. Diagnosis and treatment of polycystic ovary syndrome. JAMA. 2022;327(3):274-275.
- Zhang J, Xin X, Zhang H, et al. The efficacy of Chinese herbal medicine in animal models of polycystic ovary syndrome: a systematic review and meta-analysis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022;2022:4892215.
- Chen J, Na E, Lim SY. Effect of fractions from Lycopus lucidus Turcz. leaves on genomic DNA oxidation and matrix metalloproteinase activity. Comb Chem High Throughput Screen. 2022;25(10):1778-1784.
- Ślusarczyk S, Hajnos M, Skalicka-Woźniak K, et al. Antioxidant activity of polyphenols from Lycopus lucidus Turcz. Food Chem. 2009;113(1):134-138.
- Qi X, Yun C, Sun L, et al. Gut microbiota-bile acid-interleukin-22 axis orchestrates polycystic ovary syndrome. Nat Med. 2019;25(8):1225-1233.
- He FF, Li YM. Role of gut microbiota in the development of insulin resistance and the mechanism underlying polycystic ovary syndrome. J Ovarian Res. 2020;13(1):73.
- Chadchan SB, Singh V, Kommagani R. Female reproductive dysfunctions and the gut microbiota. J Mol Endocrinol. 2022;69(3):R81-R94.
- Puspitasari VD, Lestari ES, Pramono N. Testosterone induced Wistar rat model for gut microbiota dysbiosis of polycystic ovarian syndrome research. J Indones Med Assoc. 2024;74(3):132-140.
- Zhang J, Sun Z, Jiang S, et al. Probiotic Bifidobacterium lactis V9 regulates the secretion of sex hormones in polycystic ovary syndrome patients. mSystems. 2019;4(2):e00017-19.
- Xuan Y, Hong X, Zhou X, et al. The vaginal metabolomics profile with features of polycystic ovary syndrome: a pilot investigation in China. PeerJ. 2024;12:e18194.
- Hu M, Zhang Y, Guo X, et al. Hyperandrogenism and insulin resistance induce gravid uterine defects in association with mitochondrial dysfunction and aberrant ROS production. Endocrinology. 2019;160(9):2208-2223.
- Moini Jazani A, Nasimi Doost Azgomi H, Nasimi Doost Azgomi A, et al. A comprehensive review of clinical studies with herbal medicine on polycystic ovary syndrome (PCOS). DARU J Pharm Sci. 2019;27(2):863-877.
- McCartney CR, Marshall JC. Polycystic ovary syndrome. N Engl J Med. 2016;375(1):54-64.
- Cui Y, Zhang C, Li X, et al. Systematic review and meta-analysis of animal experiments on Bushen formulas for the treatment of polycystic ovary syndrome. Sci Rep. 2025;15(1):7648.
- Thackray VG. Sex, microbes, and polycystic ovary syndrome. Trends Endocrinol Metab. 2019;30(1):54-65.
- Torres PJ, Siakowska M, Banaszewska B, et al. Gut microbial diversity in women with polycystic ovary syndrome correlates with hyperandrogenism. J Clin Endocrinol Metab. 2018;103(4):1502-1511.
- Insenser M, Murri M, Del Campo R, et al. Gut microbiota and the polycystic ovary syndrome: influence of sex, sex hormones, and obesity. J Clin Endocrinol Metab. 2018;103(7):2552-2562.
- Guo Y, Qi Y, Yang X, et al. Association between polycystic ovary syndrome and gut microbiota. PLoS One. 2016;11(4):e0153196.
- Liu R, Zhang C, Shi Y, et al. Dysbiosis of gut microbiota associated with clinical parameters in polycystic ovary syndrome. Front Microbiol. 2017;8:324.
- Jobira B, Frank DN, Pyle L, et al. Obese adolescents with PCOS have altered biodiversity and relative abundance in gastrointestinal microbiota. J Clin Endocrinol Metab. 2020;105(6):e2134-e2144.
- Bai X, Ma J, Wu X, et al. Impact of visceral obesity on structural and functional alterations of gut microbiota in polycystic ovary syndrome (PCOS): a pilot study using metagenomic analysis. Diabetes Metab Syndr Obes. 2023;16:1-14.
- Rizk MG, Thackray VG. Intersection of polycystic ovary syndrome and the gut microbiome. J Endocr Soc. 2021;5(2):bvaa177.
- He S, Li H, Yu Z, et al. The gut microbiome and sex hormone-related diseases. Front Microbiol. 2021;12:711137.
- Chu W, Han Q, Xu J, et al. Metagenomic analysis identified microbiome alterations and pathological association between intestinal microbiota and polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2020;113(6):1286-1298.
- Yurtdaş G, Akdevelioğlu Y. A new approach to polycystic ovary syndrome: the gut microbiota. J Am Coll Nutr. 2020;39(4):371-382.
Nachdrucke und Genehmigungen
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragen