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Methodenartikel

Ein In-vitro-Test für den LpxC-Abbau durch den membrangebundenen Protese FtsH und den Adaptor LapB aus Escherichia coli

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DOI:

10.3791/71092

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22. Juni 2026

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1Department of Pharmacology, Yale University School of Medicine, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Escherichia coli reguliert die Biosynthese von Lipopolysacchariden (LPS) hauptsächlich durch die Steuerung des Abbaus von LpxC, der Deacetylase, die den ersten festgelegten Schritt der LPS-Synthese katalysiert. Ziel dieses Protokolls ist es, einen sensiblen, quantitativen In-vitro-Abbautest für LpxC zu etablieren, wobei rekonstituierte AAA+-Protease FtsH und Adaptor LapB in Proteoliposomen verwendet werden.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll präsentiert einen sensiblen, quantitativen in-vitro-Abbautest von LpxC unter Verwendung rekonstituierter AAA+ (ATPase, die mit verschiedenen zellulären Aktivitäten assoziiert ist) Protease FtsH und Adaptor LapB in Proteoliposomen. AAA+-Proteasen sind ATP-abhängige molekulare Maschinen, die die Proteinhomöostase aufrechterhalten und verschiedene zelluläre Prozesse im Zytoplasma oder an zellulären Membranen regulieren. Im Vergleich zu ihren zytoplasmatischen Gegenstücken bleiben membrangebundene AAA+-Proteasen aufgrund technischer Herausforderungen bei der Rekonstituierung und Messung ihrer Aktivität in vitro schlecht charakterisiert. Hier verwenden wir das FtsH–LapB–LpxC-System, um einen fluoreszenzbasierten Abbautest in Proteoliposomen zu entwickeln. FtsH und LapB werden zu Proteoliposomen rekonstituiert, um die natürliche Membranumgebung nachzuahmen, und LpxC wird kovalent mit dem fluoreszierenden Farbstoff Atto488 markiert. Der Abbau wird durch die Kombination von Proteoliposomen mit markierten LpxC und ATP eingeleitet und durch Trichloressigsäure (TCA) beendet. Ein erfolgreicher Test ist definiert durch einen zeitabhängigen Anstieg der Fluoreszenz in der löslichen Supernatantenfraktion nach TCA-Präzipitation, was der Freisetzung fluoreszierender Peptidfragmente entspricht, die durch LpxC-Proteolyse erzeugt werden. Dieses Signal ermöglicht eine direkte Quantifizierung der anfänglichen Verschlechterungsraten unter definierten Bedingungen. Im Vergleich zu herkömmlichen auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-basierten Tests bietet diese Methode eine deutlich verbesserte Sensitivität und ermöglicht quantitative kinetische Analysen. Darüber hinaus ermöglicht das Proteoliposomensystem eine systematische Untersuchung davon, wie Proteinkomponenten wie Adapter und Anti-Adaptoren sowie die Lipidzusammensetzung den Abbau von LpxC beeinflussen. Obwohl für das FtsH–LapB–LpxC-System entwickelt, ist dieser Test leicht an andere membrangebundene AAA+-Proteasen und Substrate anpassbar und bietet eine allgemeine Grundlage für die Untersuchung membranassoziierter Proteolyse in vitro.

Einleitung

AAA+-Proteasen sind konservierte, ATP-abhängige molekulare Maschinen, die zentrale Rollen bei der Proteinqualitätskontrolle und der regulatorischen Proteolysespielen. Diese Maschinen enthalten einen hexameren Ring aus AAA+ ATPasen-Domänen, die ATP hydrolysieren, erkennen, entfalten und in die kompartimentale Proteasedomäne translokieren, um Abbau1 zu ermöglichen. Während zytoplasmatische AAA+-Proteasen wie ClpXP3 und Lon4 umfassend mit gut etablierten In-vitro-Tests charakterisiert wurden, sind membrangebundene AAA+-Proteasen vergleichsweise wenig verstanden. Diese Lücke spiegelt weitgehend die technischen Herausforderungen wider, die mit der Rekonstituierung von Membranproteinen in definierten Lipidumgebungen und der quantitativen Messung ihrer proteolytischen Aktivität in vitro verbunden sind. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, sensible, quantitative Tests zur Untersuchung der proteolytischen Aktivität membrangebundener Proteasen zu etablieren.

FtsH ist die einzige essentielle AAA+-Protease in Escherichia coli und dient als prototypisches membrangebundenes AAA+-Protease 5,6,7. An der inneren Membran durch N-terminale Transmembranhelixen verankert, baut FtsH eine vielfältige Reihe von zytoplasmatischen und membranassoziierten Substraten ab und reguliert so die Qualitätskontrolle der Membranproteine, Stressreaktionen und die Lipidhomöostase 8,9,10,11. Eines seiner am besten charakterisierten Substrate ist LpxC, eine lösliche Deacetylase, die den ersten festgelegten Schritt in der Biosynthese der Lipopolysaccharid (LPS)katalysiert 12,13. Für den effizienten Abbau von LpxC durch FtsH ist das Membranprotein LapB erforderlich, das als Adapter fungiert, um LpxC gezielt zu erkennen und an die Protease 14,15,16,17,18 zu liefern.

Trotz ihrer physiologischen Bedeutung war die quantitative Analyse der FtsH-vermittelten Proteolyse in vitro begrenzt, insbesondere bei zytoplasmatischen Substraten wie LpxC. Traditionelle in vitro Abbautests verwenden FtsH, gereinigt in Detergent-Micellen13,19, die nicht die Membranumgebung für die membranverankerte Protease bieten. Darüber hinaus basieren die Abbautests oft auf SDS–PAGE-basierter Erkennung des Substratverschwindens13, der arbeitsintensiv, niedrigdurchsetzt und für kinetische Analysen nicht ausreichend empfindlich sein kann. In jüngerer Zeit wurde FtsH, das zu Bizellen rekonstituiert wurde, zur Untersuchung des Abbaus von Membransubstraten eingesetzt, wie es von Heedeok Hongs Gruppe20 entwickelt wurde; ein vergleichbares System zur Analyse zytoplasmatischer Substrate fehlt jedoch weiterhin. Hier passen wir Heedeok Hongs Bicelle-Rekonstitution an die Proteoliposom-Rekonstitution an, um die Membranumgebung nachzuahmen. Darüber hinaus ist das wasserlösliche Substrat LpxC fluoreszenzmarkiert, was eine sensible und quantitative Messung der Kinetik der FtsH/LapB-abhängigen Degradierung von LpxC in vitro ermöglicht.

Diese Methode sollte verwendet werden, wenn Forscher die FtsH-vermittelte Proteolyse wasserlöslicher Substrate quantitativ messen müssen. Sie bietet mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Ansätzen. Erstens verbessert die fluoreszenzbasierte Detektion proteolytischer Produkte statt des Substratverschwindens die Empfindlichkeit und den dynamischen Bereich erheblich und erleichtert quantitative Vergleiche der proteolytischen Aktivität. Zweitens erhält die Verwendung von Proteoliposomen den für die Funktion erforderlichen Membrankontext und ermöglicht eine präzise Kontrolle über die Protein- und Lipidzusammensetzung18. Schließlich ist dieses Protokoll, obwohl es mit dem FtsH–LapB–LpxC-System entwickelt wurde, leicht an andere membrangebundene AAA+-Proteasen und deren zytoplasmatische Substrate anpassbar, die membranassoziierte Abbaumaschinen erfordern.

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Protokoll

1. Beschriftung von LpxC mit Atto488

  1. LpxC-Zubereitung
    1. Exprimieren und reinigen Sie das LpxC-Protein, wie zuvor berichtet18. Tauschen Sie den Puffer aus gereinigtem LpxC von Tris auf 50 mM Phosphatpuffer mit pH 7,6 (6 mM NaH2PO4, 44 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) durch Gelfiltration mit einer hochauflösenden Gelfiltersäule aus (z. B. Superdex 200 Increase 10/300 GL).
    2. Konzentrieren Sie LpxC mit einer Ultrafiltrationssäule auf eine Endkonzentration von mindestens 5 mg/mL bei 4 °C.
  2. Beschriftung von LpxC mit Atto488
    1. Verdünnen Sie 0,5 mg LpxC in 50 mM Phosphatpuffer mit pH 7,6 auf ein Endvolumen von 225 μL. Fügen Sie 25 μL 1 M Natriumbicarbonat hinzu, um den pH-Wert auf etwa 8,3 anzupassen.
    2. 0,24 mg des Atto488-reaktiven Farbstoffs in 20 μL eines 0,1 M Natriumbicarbonatpuffers auflösen, um eine Lagerlösung (0,012 mg/μL) herzustellen. Eine Arbeitslösung wird hergestellt, indem man 2 μL der Lagerlösung mit 18 μL 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer verdünnt, was eine Endkonzentration von 0,0012 mg/μL ergibt.
    3. Fügen Sie sofort 4 μL der Atto488-Arbeitslösung zur Proteinlösung hinzu (entsprechend einem molaren Verhältnis von LpxC: Atto488 von 3:1). Wickle das Rohr mit Alufolie um und inkubiere bei 4 °C 2 Stunden lang mit sanftem Rühren (18 U/min).
      HINWEIS: Sowohl das Atto488-Material als auch die Arbeitslösungen können in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80 °C gelagert werden.
  3. Trennung von LpxC–Atto488 vom freien Farbstoff
    1. Eine PD-10-Entsalzungssäule mit 10 ml ultrareinem Wasser ausgleichen, gefolgt von 15 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,6.
    2. Tragen Sie das Etikettierungs-Reaktionsgemisch auf die Säule auf und lassen Sie es vollständig in das Harz eindringen.
    3. Elutieren Sie mit 5 mL 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,6. Zwei unterschiedliche Bänder, die LpxC–Atto488 (erster Band) und freier Atto488-Farbstoff (zweites Band) entsprechen, sollten sichtbar werden. Sammelt Bruchteile aus dem ersten Band in ~0,5 mL Aliquots.
    4. Analysieren Sie elutierte Fraktionen mit SDS-PAGE. Visualisieren Sie Fluoreszenz unter UV-Beleuchtung vor der Coomassie Brilliant Blue (CBB)-Färbung.
    5. Sammelt Fraktionen mit LpxC–Atto488 und konzentriert das markierte Protein auf etwa 2 mg/mL.
    6. Bewerten Sie die Markierungseffizienz durch Messung der Proteinkonzentration und der Atto488-Konzentration mit einem Mikrovolumenspektrophotometer.
      HINWEIS: Ein Verhältnis von Atto488-Konzentration (in pmol/μL) zur LpxC-Konzentration (in mg/mL) im Bereich von 2–5 gibt einen geeigneten Kennzeichnungswert an. Dies entspricht einem molaren Verhältnis von Atto488 zu LpxC, das nach der Markierung von 1:15 bis 1:6 liegt.
    7. Aliquot LpxC–Atto488 in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhren, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern. Zu diesem Zeitpunkt kann das Protokoll bis zu 3 Monate pausiert werden.
      VORSICHT: Flüssigstickstoff ist extrem kalt; Behandle es mit der richtigen Schutzausrüstung (Kryohandschuhe, Augenschutz).

2. Umstrukturierung von FtsH/LapB in Proteoliposome

  1. Liposomenpräparation
    1. Übertragen Sie 100 mg 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) in Chloroform in ein Glasrezentglas. Verdampfen Sie das Lösungsmittel unter einem sanften Strom von N₂, gefolgt von einer nächtlichen Trocknung unter Vakuum.
      HINWEIS: POPC hat eine Phasenübergangstemperatur von ~-2 °C und wird weit verbreitet in der Membranbiophysik, Liposomenformulierungen und Zellmodellsystemen verwendet.
      VORSICHT: Chloroform kann Augen, Haut, Leber, Nieren und Nervensystem schädigen. Geeignete Schutzausrüstung (Handschuhe, Augenschutz, Maske) ist bei der Handhabung erforderlich. Handhabt es in einer Haube mit einer Glasspritze.
    2. Fügen Sie 1.315 μL Puffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) zur getrockneten POPC-Folie hinzu. Replizieren Sie die Lipide, indem Sie 1 Minute Wasserbad-Sonikation mit 1 Minute Vortex bei maximaler Geschwindigkeit abwechseln, insgesamt ~15 Minuten oder bis sie vollständig disperginn sind. (Endfettkonzentration: 100 mM).
      HINWEIS: Um die Lipidresuspension zu verbessern, passen Sie die Eintauchtiefe des Glasreagenzglases im Wasserbad-Sonikator an, um die Bewegung zu maximieren. Resuspendierte Lipide können bei -20 °C gelagert werden. Zu diesem Zeitpunkt kann das Protokoll für bis zu einen Monat pausiert werden.
    3. Aliquot die Liposomensuspension in 200 μL Portionen aufteilen und bei -20 °C lagern.
  2. Liposomenextrudion
    1. Taue ein 200 μL Liposom Aliquot in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auf und verdünne mit 800 μL Puffer A auf ein Endvolumen von 1 mL.
    2. Unterziehen Sie die Liposomen drei Gefrier-Tau-Zyklen, indem Sie bei Zimmertemperatur zwischen flüssigem Stickstoff und einem Wasserbad wechseln.
    3. Spüle Spritzen, zwei Filterstützen und eine 200 nm Polycarbonatmembran mit Puffer A. Setze den Mini-Extruder zusammen und extrudiere die Liposomen 20 Mal.
      HINWEIS: Die Liposomensuspension sollte nach der Extrudion transparent erscheinen.
    4. Teilen Sie die 1 mL extrudierte Liposomensuspension in drei Röhren (330 μL pro Röhre) und verdünnen Sie jedes mit 600 μL Puffer A.
  3. Triton X-100 Schwellungstitration
    HINWEIS: Triton X-100 ist ein Waschmittel mit niedriger kritischer Mizellenkonzentration (CMC) und hat sich in vielen Fällen als besonders erfolgreich erwiesen21
    VORSICHT: Triton X-100 ist eine gefährliche Chemikalie, die vor allem schwere Augenschäden, Hautreizungen und schädliche Auswirkungen verursacht, wenn sie eingenommen wird. Beim Umgang ist geeignete Schutzausrüstung (Handschuhe, Augenschutz) erforderlich.
    1. Bereiten Sie 10 % (v/v) Triton X-100 vor, indem Sie 100 μL Triton X-100 mit 900 μL ultrareinem Wasser mischen und in einem Schüttler inkubieren, um Triton X-100 vollständig aufzulösen.
    2. Missen Sie die Absorption von Liposomen bei 540 nm (A₅₄₀) mit einem Spektrophotometer.
    3. Fügen Sie 5 μL-Aliquoten mit 10 % Triton X-100 nacheinander hinzu, mischen Sie nach jeder Addition vorsichtig und messen Sie A₅₄₀. Fügen Sie weiterhin Triton X-100 hinzu, bis A₅₄₀ ein Maximum erreicht hat, und fügen Sie dann Triton X-100 weitere 4–5 Mal hinzu, bis die Absorption auf etwa 60 % des Spitzenwerts sinkt.
    4. Basierend auf der Titrationskurve schwellt man die Liposomen an, indem man 35 μL 10 % Triton X-100 zufügt und bei Zimmertemperatur 1 Stunde mit sanfter Bewegung inkubiert.
  4. Rekonstitution von FtsH/LAPB in Liposomen
    1. Sprengen und reinigen Sie FtsH- und LapB-Proteine, wie zuvorbeschrieben 18.
    2. Waschen Sie ~2 g eines unpolaren Polystyroladsorbents (z. B. Bio-Beads SM-2) einmal mit 10 Bänden Methanol, einmal mit 10 Bänden Ethanol und zehnmal mit 10 Bänden ultrareines Wasser. Das gewaschene Adsorbent in Puffer A bei 4 °C aufbewahren.
    3. Für jede Tube mit Triton X-100–geschwollenen Liposomen werden 3 μL 500 mM Tris(2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP), 22,5 μg FtsH und 22,5 μg LapB hinzugefügt. Stelle das Gesamtvolumen mit Puffer A auf 1 ml ein und inkubiere bei RT für 1 Stunde mit sanfter Bewegung.
      HINWEIS: Protein-Lipid-Verhältnisse von 1:20 bis 1:200 (Wt/wt) wurden routinemäßig während der Rekonstitution der Proteoliposome21 verwendet. Hier wird ein Verhältnis von 1:100 verwendet.
    4. Entfernen Sie das Waschmittel durch sequentielle Inkubation mit unpolarem Polystyroladsorbent: 40 mg bei RT für 0,5 Stunden, gefolgt von 40 mg RT für 1 Stunde, dann 40 mg bei 4 °C über Nacht und schließlich 40 mg bei 4 °C für 1 Stunde.
    5. Kurz zentrifugieren, um das unpolare Polystyroladsorpmiddel bei 4 °C (400 × g für 3 Sekunden zu pelletieren. Übertragen Sie den Supernatant in Ultrazentrifugenröhren. Waschen Sie das unpolare Polystyroladsorgement mit 1 ml Puffer A und kombinieren Sie das Wash mit dem Supernatant. Fügen Sie zusätzlichen Puffer A zu einem Endvolumen von ~6 ml hinzu.
      HINWEIS: Zur Sicherheit müssen Ultrazentrifugenröhren mindestens 6 mL Flüssigkeit enthalten.
    6. Die Röhren und die Ultrazentrifuge bei 250.000 × g bei 4 °C für 45 Minuten in einem Rotor mit festem Winkel (z. B. MLA-80) ausbalancieren, um Proteoliposomen zu pelletieren.
    7. Entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Proteoliposom-Pellet in 70 μL Puffer A, ergänzt mit 1 mM TCEP.
      HINWEIS: Das endgültige Volumen des Proteoliposoms beträgt ungefähr 100 μL.
    8. Die Proteoliposome werden in flüssigem Stickstoff gefriert und bei -80 °C gelagert.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann das Protokoll bis zu einem Monat pausiert werden.
  5. SDS-PAGE-Analyse von Proteoliposomen
    1. Proteoliposome gründlich mischen und 5 μL der Probe mit 5 μL 2× SDS Ladepuffer kombinieren (0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, 5 % SDS, 20 % Glycerol, 0,01 % Bromophenolblau, 200 mM DTT).
    2. Laden Sie Proteoliposomproben zusammen mit 525 ng FtsH (entsprechend 0,06 μM FtsH-Hexamer in 20 μL) auf ein 4–20 % SDS-PAGE-Gel.
    3. Färbe das Gel mit CBB.
    4. Scannen Sie das Gel und quantifizieren Sie die Bandintensität von FtsH für jede Probe. Berechnen Sie das Volumen der Proteoliposom-Suspension, das 525 ng FtsH entspricht.

3. In-vitro-Abbau von LpxC–Atto488

  1. Durchführung von In-vitro-Abbauassays in einer 20-μL-Reaktion mit FtsH/LapB-Proteoliposomen (entsprechend 0,06 μM FtsH) und 0,5, 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 40 μM LpxC-Atto488 im Abbaupuffer (50 mM Tris-Acetat, pH 8,0, 10 mM Mg-Acetat, 5 mM ATP, 25 μM Zn-Acetat, 80 mM NaCl, 1,4 mM β-Mercaptoethanol).
  2. Für die Messung jeder Substratkonzentration bereiten Sie eine Reaktion von 70 μL vor.
    1. Nehmen Sie eine 20 μL Fraktion und dämpfen Sie sie, indem Sie sie sofort mit 48 μL 5 % Trichloressigsäure (TCA) in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren mischen (0 Min). Nehmen Sie den zweiten und dritten Bruchteil und löschen Sie sie bei 10 bzw. 20 Minuten ab.
    2. Parallel bereiten Sie entsprechende Kontrollreaktionen ohne Proteoliposome für die Hintergrundsubtraktion vor.
      HINWEIS: Drei Replikationsmessungen werden empfohlen, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen.
      Minimiere die Lichteinsetzung beim Umgang mit LpxC–Atto488.
      VORSICHT: TCA ist eine hochgradig ätzende Chemikalie, die beim Einatmen schwere Hautverbrennungen, dauerhafte Augenschäden und starke Atemreizungen verursacht. Behandle es mit der richtigen Schutzausrüstung (Handschuhe, Augenschutz, Maske).
  3. Proben bei 37 °C für 30 Minuten inkubieren, um Proteine auszufällen, dann bei 18.800 × g bei Raumtemperatur 20 Minuten zentrifugieren.
  4. Proben werden neutralisiert, indem 50 μL Supernatant in ein Rohr mit 60 μL 500 mM Tris-HCl, pH 8,8, übertragen werden. Gut mischen und 100 μL auf eine schwarze 96-Well-Platte übertragen. Messung der Fluoreszenz mit einem Plattenleser mit Anregung bei 498 nm und Emission bei 520 nm.

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Ergebnisse

Um die Empfindlichkeit des in-vitro-Abbautests zu verbessern, wurde das Substrat LpxC mit dem fluoreszierenden Farbstoff Atto488 markiert. Die Succinimidylestergruppe von Atto488 reagiert unter mild alkalischen Bedingungen effizient mit den primären Aminogruppen von LpxC. Da der Tris-Puffer primäre Amine enthält, die diese Reaktion stören, wurde LpxC, gereinigt im Tris-Puffer, vor der Markierung durch Gelfiltration in den Phosphatpuffer umgewandelt. Für die Markierungsreaktion w...

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Diskussion

Der erste kritische Schritt dieses Protokolls ist die Atto488-Kennzeichnung von LpxC. Eine moderate Kennzeichnung ist entscheidend, um die In-vitro-Abbauaktivität genau zu messen. Basierend auf unseren Optimierungsexperimenten ist ein molares Verhältnis von LpxC zu Atto488 zwischen 9:1 und 3:1 optimal. Übermäßiges Atto488 führt zu einer Überkennzeichnung, was wahrscheinlich den ursprünglichen Zustand von LpxC stört. Unter diesen Bedingungen ist der Unterschied im Abbau von LpxC–...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Alle Forschungen wurden an der Yale University durchgeführt. W.M. wird vom National Institute of General Medical Sciences mit den Stipendiennummern R01GM137068 und RM1GM149406 sowie von der Richard and Susan Smith Family Foundation durch den Odyssey Award unterstützt.

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Materialien

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Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenUSA scientific1415-2500
200 nm PolycarbonatmembranAvanti Polar Lipids610006
4-20% SDS-PAGESelbstgemacht
Adenosin 5'-triphosphat Dinatriumsalz-HydratSigmaA26209
Atto 488 Protein-Markierungs-KitSigma38371
Bio-Beads SM-2Bio-Rad152-8920Nichtpolares Polystyrol-Adsorbens
Schwarze 96-Well-PlatteCostar3915
BromophenolblauSigma114391
Coomassie Brilliantblau R250Sigma1.12553
DTTSigmaD9779
EthanolSigma459844
FilterunterstützungAvanti Polar Lipids610014
GlasspritzeAvanti Polar Lipids610017
GlasteströhrchenKIMBLE45066-16150
GlycerolAvantor2136-01
Magnesiumacetat-TetrahydratSigma228648
MethanolSigma179337
MikrozentrifugeThermo Fisher Scientific75-002-436
Mini-ExtrudiererAvanti Polar Lipids610000
MLA-80 RotorBeckman367096Festwinkelrotor
PlattenleserTecanInfinite M1000 PRO
POPCAvanti Polar Lipids850457C
KühlzentrifugeThermo Fisher Scientific75002559
SDSAmerican BioAB01920-00500
NatriumbicarbonatSigmaS6014
NatriumchloridSigmaS9888
NatriumdihydrogenphosphatSigma38400100
Natriumphosphat dibasischSigma567547
SonigatorFisherbrandFB-11201
SpektrophotometerSCILOGEXSCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva28990944Hochauflösende Gelfiltrationssäule
TischzentrifugeBeckmanOptima MAX-XP
TCEP HClGold BiotechnologyTCEP1
TrichloressigsäureSigmaT6399
Tris BaseSigma252859
Triton X-100SigmaT8787
UltrazentrifugenröhrchenBeckman355647
UltrafiltrationssäuleMilliporeUFC8030
Vortex-Genie 2 MischerScientific IndustriesSI-0236
Zinkacetat-DihydratSigma379786
β-MercaptoethanolSigma444203
```

Referenzen

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