Die diagnostische Wirksamkeit von Plasma miR-362-3p in Kombination mit Doppler-Ultraschall bei der Diagnose von Brustkrebs

Zusammenfassung

Die Diagnoserate von Brustkrebs ist relativ niedrig. Die Fourfold-Table-Methode wurde verwendet, um den diagnostischen Wert von miR-362-3p in Kombination mit Doppler-Ultraschall für Brustkrebs zu analysieren. Die Kombination aus Doppler-Ultraschall und miR-362-3p verbesserte die diagnostische Wirksamkeit effektiv und bot eine vielversprechende Methode zur Brustkrebsdiagnose.

Zusammenfassung

Brustkrebs ist der zweithäufigste bösartige Tumor der Welt, bedroht das Leben von Frauen ernsthaft und stellt eine enorme wirtschaftliche Belastung dar. Diese Studie zielt darauf ab, den Wert von miR-362-3p in Kombination mit Doppler-Ultraschall bei der Diagnose von Brustkrebs zu untersuchen. Insgesamt wurden 182 Brustkrebspatientinnen und 147 Patienten mit gutartiger Brusterkrankung in diese Studie eingeschlossen. Die Plasma-miR-362-3p-Spiegel der Patienten wurden mittels Echtzeit-fluoreszenz-quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) gemessen. Der Chi-Quadrat-Test wurde verwendet, um die Unterschiede in den Parametern des Doppler-Ultraschalls zwischen den beiden Patientengruppen zu analysieren. Die Empfängeroperator-Charakteristik (ROC)-Kurve wurde verwendet, um die diagnostische Wirksamkeit von miR-362-3p, dem Widerstandsindex (RI) und dem Pulsatilitätsindex (PI) zu bewerten. Die diagnostische Effizienz des Doppler-Ultraschalls in Kombination mit Plasma miR-362-3p bei Brustkrebs wurde mit der Vierfachtabellenmethode analysiert. Die miR-362-3p-Spiegel waren bei Brustkrebspatientinnen deutlich gesunken. Es gab signifikante Unterschiede in den zweidimensionalen Ultraschallparametern. miR-362-3p, RI und PI haben einen diagnostischen Wert für Brustkrebs. Der kombinierte Diagnosewert der drei Faktoren war höher. Ultraschall in Kombination mit miR-362-3p verbesserte signifikant die Sensitivität, Genauigkeit und den negativen Prädiktionswert bei der Brustkrebsdiagnose. Doppler-Ultraschall in Kombination mit miR-362-3p könnte die diagnostische Effizienz von Brustkrebs verbessern, was ein nicht-invasives und potenziell ergänzendes diagnostisches Werkzeug für Brustkrebs bieten könnte.

Einleitung

Laut den Statistiken der Internationalen Agentur für Krebsforschung überstieg die Inzidenzrate von Brustkrebs im Jahr 2020 die von Lungenkrebs¹. Brustkrebs ist ein bösartiger Tumor, der häufig auftritt und weltweit eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle bei Frauen ist¹. Eine rechtzeitige Diagnose von Brustkrebs ist vorteilhaft für die Prognose der Patienten. Die Gewebebiopsie ist der Goldstandard für die Diagnose von Brustkrebs. Dies ist jedoch eine Art invasive Diagnose und gilt nicht für Patienten mit Brustkrebs im Frühstadium².

Doppler-Ultraschall ist eine häufig verwendete bildgebende Technik zur Brustkrebsvorsorge und zur Zusatzdiagnose³. Doppler-Ultraschall kann die Größe der Knoten, die Blutflusssignale und den Status der Lymphknotenmetastasen^genau beurteilen. Der Brust-Doppler-Ultraschall ist aufgrund seiner Vorteile wie keiner ionisierenden Strahlung, Sicherheit und Nicht-Invasivität sowie der Möglichkeit wiederholbarer Untersuchungen zu einer der am weitesten verbreiteten Bildgebungstechniken bei der Brustkrebsvorsorge und -diagnose^geworden. Allerdings wird der Doppler-Ultraschall beim Nachweis von Brustkrebs mit geringer Dichte oder kleinem Volumen häufig durch den Gewebe-Hintergrund beeinträchtigt, was zu einem deutlichen Rückgang der diagnostischen Sensitivität führt und es erschwert, die klinischen Anforderungen für eine frühzeitige Diagnose⁶ zu erfüllen. Daher ist es notwendig, Plasma-Biomarker zu entwickeln, die die Einschränkungen der Doppler-Ultraschalltechnologie überwinden können. Wenn die Kombination der beiden Methoden die Sensitivität der Brustkrebsdiagnose erhöhen kann, wird dies einen erheblichen klinischen und praktischen Wert haben.

MikroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse nicht-kodierender RNA-Moleküle mit einer Länge von etwa 20 bis 24 Nukleotiden ^7,8. Eine der Eigenschaften von miRNAs ist ein hoher Grad an Konservierung während des evolutionären Prozesses. miRNAs haben eine weite Gewebeverteilung, die nicht nur spezifisch in verschiedenen menschlichen Gewebezellen exprimiert wird, sondern auch stabil in mehreren Körperflüssigkeiten wie Blut und Speichel⁹ existieren kann. Diese Verbreitungsmerkmale bieten Vorteile für die Entwicklung nicht-invasiver diagnostischer Marker. Funktional bauen miRNAs mRNA durch komplementäre Bindung an die 3' Untranslated Regions (UTR)^10,11 ab und nehmen an einer Reihe von zentralen pathologischen und physiologischen Prozessen teil, wie zellulären Entzündungsreaktionen, oxidativem Stress, Apoptose sowie Proliferation und Differenzierung¹². Eine große Anzahl von Studien hat bestätigt, dass die abnormen Veränderungen der miRNA-Expressionsprofile eng mit dem Auftreten und der Entwicklung von Brustkrebs zusammenhängen^13,14. Die Dysregulation der miRNA-Expression kann die bösartige Transformation von Brustepithelzellen fördern, indem sie die Expressionsnetzwerke von Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen reguliert. miR-362-3p ist ein typischer Faktor, der das Tumorfortschreiten hemmt. Mehrere Berichte zeigten, dass miR-362-3p das Fortschreiten von Brustkrebs hemmte 15,16,17. Assiri et al. berichteten, dass eine niedrige Expression von miR-362-3p eng mit einer schlechten Prognose und einer kürzeren Gesamtüberlebensrate bei Brustkrebspatientinnen assoziiert^{war. 15}. Mechanistisch hatte miR-362-3p eine antitumorale Wirkung bei Brustkrebs, indem es DEAD-box helicase 5 (DDX5) angriff, um die Proliferation, Invasion und Migration von Krebszellen zu fördern¹⁶. Darüber hinaus stellte das von Kang geleitete Team fest, dass miR-362-3p in Brustkrebsgeweben signifikant herunterreguliert ist und eine gezielte Regulation der Expression von miR-362-3p als neuartige therapeutische Strategie für das Brustkrebsmanagement^{dienen könnte}. Es gibt jedoch keine Berichte darüber, ob miR-362-3p als früher diagnostischer Marker für Brustkrebs dienen kann.

Diese Studie maß das Expressionsniveau von miR-362-3p im Plasma und analysierte gleichzeitig die Kernbildparameter des Doppler-Ultraschalls bei Brustkrebspatientinnen. Die Studie untersuchte gründlich den kombinierten Anwendungswert von Plasma-miR-362-3p-Expressionswerten und Doppler-Ultraschallbildparametern und zeigte eindeutig die Wirksamkeit dieses kombinierten diagnostischen Ansatzes bei der Screening von Brustkrebs sowie bei der Differenzialdiagnose von gutartigen und bösartigen Brusterkrankungen.

Protokoll

Diese Studie wurde im Einklang mit den Grundsätzen der Helsinkier Erklärung durchgeführt. Die Genehmigung wurde vom Ethikausschuss des angeschlossenen Krankenhauses der Zweiten Medizinischen Universität von Shandong, Fakultät für Klinische Medizin, Zweite Medizinische Universität Shandong (Genehmigungsnummer: wyfy-2023-ky-124) erteilt. Von allen an der Studie beteiligten Probanden wurde eine informierte Zustimmung eingeholt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Versuchsprobanden

Die Berechnung der Stichprobengröße wurde mit der G*Power 3.1-Software durchgeführt, die auf einem unabhängigen Stichproben-t-Test basierte. Es wurden eine mittlere Effektgröße (Cohens d = 0,5, weit verbreitet in klinischen Beobachtungsstudien), ein zweiseitiger Test, α = 0,05, und eine Leistung (1 − β) = 0,95 gesetzt. Die Berechnung ergab, dass pro Gruppe mindestens 105 Teilnehmer erforderlich waren. Schließlich wurden 182 Brustkrebspatientinnen und 147 Patienten mit gutartigen Brustläsionen aufgenommen, und die tatsächliche Stichprobengröße beider Gruppen überstieg die erforderliche Mindeststichprobe bei weitem, was eine ausreichende statistische Stärke zur Unterstützung der Studienergebnisse gewährleistete und das Risiko eines Typ-II-Fehlers innerhalb eines akzeptablen Bereichs kontrollierte. Alle Teilnehmer wurden streng und nacheinander nach einheitlichen Ein- und Ausschlusskriterien eingeschrieben.

Von 2023 bis 2024 waren alle Patienten im angeschlossenen Krankenhaus der Shandong Second Medical University, School of Clinical Medicine, Shandong Second Medical University, eingeschrieben. Gutartige Läsionen: Nicht-bösartige Läsionen wurden durch Pathologie bestätigt. Brustkrebs: Bösartige Tumore wurden pathologisch bestätigt. Venöse Blutproben wurden von allen Teilnehmern nach nächtlichem Fasten entnommen. Die venösen Blutproben wurden antikoaguliert und zentrifugiert, um das Plasma zu trennen, wobei die Standardverfahren strikt befolgt wurden, und anschließend auf −80 °C für die Langzeitlagerung transferiert, was anschließend für die miRNA-Extraktion verwendet wurde. Alle Plasmaproben waren streng auf maximal zwei Gefrier-Tau-Zyklen vor der RNA-Extraktion beschränkt, um den MiRNA-Abbau zu verhindern. Alle Patienten wurden vollständig über das Studienprotokoll informiert und gaben vor der Einschreibung freiwillig eine schriftliche informierte Einwilligung ab.

Einschlusskriterien für Brustkrebspatientinnen: (1) Patienten mit pathologisch bestätigtem primärem Brustkrebs. (2) Keine chirurgische Behandlung vor der Einschreibung. (3) Vor der Probenentnahme keine Strahlen- oder Chemotherapie erhalten.

Einschlusskriterien für Patienten mit gutartiger Brusterkrankung: (1) Pathologisch bestätigte gutartige Brustläsionen. (2) Ohne andere systemische bösartige Tumore oder Vorstufenläsionen. (3) Nicht schwanger und nicht laktierend. (4) Keine schwere akute Infektion oder chronisch entzündliche Erkrankung.

Ausschlusskriterien für Brustkrebs- und gutartige Brustläsionen: (1) Schwere Brustinfektion oder akute kritische Erkrankung. (2) Schwere Leber- oder Nierenfunktionsstörungen oder Autoimmunerkrankungen. (3) Patienten, die innerhalb von 6 Monaten eine Hormontherapie erhielten.

2. Doppler-Ultraschalluntersuchung

Die beidseitigen Brüste der Patientin wurden in vier Quadranten gründlich mit Doppler-Ultraschall untersucht. Zweidimensionale Ultraschalluntersuchung wurde verwendet, um die Läsionsmerkmale zu dokumentieren, einschließlich Grenzen, Form, innerem Echo, hinteren Echowellen und Seitenverhältnis der Läsion. Eine Farb-Doppler-Flussbildgebung wurde angewendet, um die Blutflussparameter der Läsion zu bestimmen, einschließlich Widerstandsindex (RI), Pulsatilitätsindex (PI) und maximaler Blutflussgeschwindigkeit (V_max). Blutflusssignale wurden nach einem zuvor berichteten Klassifikationssystem bewertet:¹⁸: Grad 0: Kein Blutflusssignal; Grad I: minimales Blutflusssignal; Grad II: Die Länge des Blutflusssignals übersteigt die Hälfte des Läsionsdurchmessers; Grad III: Reichlich Blutflusssignal.

3. Positive Definition der Ultraschalldiagnose von Brustkrebs

Dazu gehörten (1) Mehrdeutige Grenzen; (2) Unregelmäßige Form; (3) Ungleichmäßiges internes Echo; (4) Geschwächtes hinteres Echo; (5) Seitenverhältnis >1; (6) RI > 0,70; (7) PI > 1,50; (8) Maximale Durchblutungsrate (Vmax)> 18,00 cm/s; (9) Blutflusssignal ≥ Grad II. Jede Läsion, die eines der oben genannten verdächtigen Kriterien erfüllt, wird als Ultraschall-positiv eingestuft, während solche ohne verdächtige Merkmale als ultraschall-negativ gelten.

4. Echtzeit-Fluoreszenz-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

Plasma-miRNAs wurden mit einem spezialisierten miRNA-Extraktionsset extrahiert. Die erfolgreich extrahierten RNA-Proben wurden verwendet, um cDNA mit spezialisierten miRNA-Reverse-Transkriptions-Kits zu synthetisieren. Reverse-Transkriptionsreaktionsbedingungen für miR-362-3p: Das Gesamtvolumen dieser Reaktion betrug 20 μL. Das PCR-Reaktionsverfahren war wie folgt: (1) Das Gemisch wurde bei 37 °C für 15 Minuten inkubiert, (2) Die Reverse-Transkriptionsreaktion erfolgte 50 Minuten bei 42 °C, (3) Das Enzym wurde für 5 Minuten bei 95 °C inaktiviert. Das Produkt wurde bei 4 °C gelagert. Die qPCR-Reaktionsbedingungen: Das Gesamtvolumen des Reaktionssystems betrug 20 μL. Die Amplifikationsbedingungen wurden wie folgt durchgeführt: (1) Die cDNA wurde vordenaturiert, und die DNA-Polymerase wurde bei 95 °C für 2 Minuten aktiviert. (2) Die DNA-Stränge glühen und dehnen sich 30 Sekunden bei 60 °C aus. Die oben genannten beiden Schritte wurden insgesamt 40 Zyklen durchgeführt. Die Genrelativexpression wurde mit der Formel 2^-(ΔΔCt) berechnet. Der relative Ausdruck von miR-362-3p wurde mit U6 kalibriert. Um die Verwendung von U6 als endogenes Kontrollmittel zu rechtfertigen, wurde die Stabilität von U6 mit dem BestKeeper-Algorithmus in der Plasmakohorte bewertet. Der Variationskoeffizient (CV) der U6-Ct-Werte über alle Proben lag unter 2 %, was auf eine hohe Ausdrucksstabilität hinweist. Daher wurde U6 validiert und als Referenzgen für die Normalisierung der miR-362-3p-Expression in der vorliegenden Studie ausgewählt. Die nachgeschaltete Reihenfolge der Zündhütchen wurde vom Bausatz bereitgestellt. Die Primer-Sequenzen waren wie folgt:

miR-362-3p: GCCGAGAACACCTATTCA.

U6: CTCGCTTCGGCAGCAKATATAKT.

5. Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC)-Kurve

Der Youden-Index wurde verwendet, um den optimalen Cut-off-Wert für miR-362-3p bei der Diagnose von Brustkrebs zu bestimmen, indem die Sensitivitäts- und Spezifitätswerte der ROC-Kurve berechnet wurden. Das kombinierte diagnostische Modell wurde mithilfe binärer logistischer Regression in SPSS konstruiert, wobei miR-362-3p, RI und PI als unabhängige Variablen eingegeben wurden. Variablen wurden durch die Enter-Methode einbezogen, um den vorhergesagten Wahrscheinlichkeitswert der kombinierten Diagnose für jeden Versuchsperson zu erzeugen. Die Formel für die Vorhersagewahrscheinlichkeit (PRE): . ROC-Kurven wurden basierend auf dem PRE dargestellt. Der Delong-Test wurde verwendet, um die Unterschiede in den Area Under Curve (AUC)-Werten zwischen verschiedenen ROC-Kurven zu vergleichen.

6. Definition der Ergebnisparameter

Der primäre Endpunktparameter war die allgemeine diagnostische Wirksamkeit des kombinierten Modells aus Plasma miR-362-3p und Doppler-Ultraschall bei Brustkrebs, wobei die pathologische Diagnose der Goldstandard war. Die sekundären Endpunkte umfassten die diagnostische Leistung des Doppler-Ultraschalls allein und des Plasmas miR-362-3p allein.

7. Datenstatistik

Die Expressionswerte von miR-362-3p und die ROC-Kurven der beiden Patientengruppen wurden mit statistischer und grafischer Software analysiert. Der t-Test wurde verwendet, um die Unterschiede in kontinuierlichen Variablen zwischen den beiden Gruppen zu vergleichen. Der Chi-Quadrat-Test und die Vierfachtabellenmethode wurden mit SPSS 26.0 analysiert. Der Chi-Quadrat-Test wurde verwendet, um die statistischen Unterschiede kategorischer Variablen zu bewerten; die Zwei-Index-Kombination (miR-362-3p + Doppler-Ultraschall) galt als primäre Analyse und stellte eine routinemäßige qualitative diagnostische Schlussfolgerung in der klinischen Praxis dar; wenn verdächtige Merkmale aus der Breast Imaging Reporting and Data System (BI-RADS)-Klassifikation vorlagen, wurde die Läsion als positiv definiert; die Vierfachtabellenmethode wurde verwendet, um die Spezifität, den positiven Prädiktionswert, den negativen Prädiktionswert und die Genauigkeit der kombinierten Diagnose von Doppler-Ultraschall und miR-362-3p zu berechnen. Die diagnostischen Ergebnisse zwischen Doppler-Ultraschall und miR-362-3p umfassten wahr-positiv (a), falsch-positiv (b), falsch-negativ (c) und echt-negativ (d). Berechnungsformel: Empfindlichkeit = a / (a + c); Spezifität = d / (d + b); Positiver Prädiktionswert = a / (a + b); Negativer Prädiktionswert = d / (d + c); Genauigkeit = (a + d) / (a + b + c + d). Die drei diagnostischen Methoden (miR-362-3p, Ultraschall und kombinierte Diagnose) wurden mit dem Pearson-χ-2-Test für R×C-Kontingenztabellen durchgeführt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Der Spiegel von miR-362-3p war bei Brustkrebspatientinnen signifikant verringert

Die klinischen Basisinformationen und die klinischen pathologischen Eigenschaften von 182 Brustkrebspatientinnen und 147 Patienten mit gutartigen Brustläsionen wurden verglichen. Die detaillierten Daten wurden in Tabelle 1 zusammengefasst. Das RT-qPCR wurde verwendet, um die Plasmaspiegel von miR-362-3p in zwei Patientengruppen zu messen. Die Erge...

Diskussion

Brustkrebs ist eine der häufigsten Arten bösartiger Tumore und wird zu einem großen Gesundheitsproblem, das die menschliche Gesundheit bedroht ^19,20. Die hohen Inzidenz- und Sterblichkeitsraten verursachen nicht nur schwere psychische Traumata für die Familien der Patienten, sondern verursachen auch eine enorme Belastung für Gesellschaft und Wirtschaft. Die meisten Brustkrebspatientinnen haben zum Zeitpunkt der Diagnose

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BD Vacutainer K2EDTA Blutentnahmeröhrchen (lila Kappe)	USA	367861	Für venöse Blutentnahme und Plasmazubereitung für miRNA-Analyse.
CFX96 Touch Echtzeit-PCR-Detektionssystem	Bio-Rad Laboratories	1855195	96-Well 6-Kanal-Fluoreszenz-Quantitative-PCR-Gerät, das Lichtleiter-Leitung und kalte CCD-Bildgebung verwendet, mit synchroner Fluoreszenzsammlung in jedem Brunnen ohne Verzögerung. Der dynamische Bereich erreicht 10 Größenordnungen und ist sowohl mit herkömmlichen qPCR als auch mit High-Resolution-Melting-Curve (HRM)-Analyse kompatibel. Die Software unterstützt RDML-Format-Export, ist sowohl für die Forschung als auch für klinische Tests geeignet und wird häufig in Experimenten wie Genexpressionsquantifizierung, SNP-Typisierung und Methylierungsanalyse verwendet.
Kirgen 0,1 mL PCR-Röhrchen (oder 8-Streifen-PCR-Röhrchen), steril	Shanghai, China	KG0811	Zum Vorbereiten und Durchführen von qPCR-Reaktionen verwendet.
Kirgen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, steril	Kirgen Biotech Co., Ltd.	KG2911	Zum Probenspeichern, Reagenzzubereitung und Zentrifugieren während der miRNA-Extraktion und Reverse-Transkription verwendet.
miRcute miRNA-Isolierungskit (Spin-Column)	Beijing, China	DP501	Zur Isolierung und Reinigung von Gesamt-RNA einschließlich miRNA aus menschlichen Plasmaproben unter Verwendung einer Spin-Column-basierten Technologie.
miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit	Beijing, China	KR211	Für die reverse Transkription von gereinigtem miRNA in First-Strand cDNA mittels Poly(A)-Tailing-Methode.
miRcute Plus miRNA qPCR Kit (SYBR Green)	Beijing, China	FP411	Für die quantitative Echtzeit-PCR-Erkennung von miRNA unter Verwendung einer SYBR Green I-basierten Chemie.
Roche LightCycler 480 Multiwellplatte 96, Weiß	Mannheim, Deutschland	4729692001	Zum quantitativen Echtzeit-PCR-Assay auf dem Roche LightCycler 480-Gerät.
Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP Linear-Array-Sonde	Siemens Healthineers	10041226	Hochfrequente Linear-Array-Sonde mit einem Frequenzbereich von 5–14 MHz, speziell für die Untersuchung oberflächlicher Organe wie Brust und Schilddrüse entwickelt. Sie zeichnet sich durch hohe Auflösung und ausgezeichneten Gewebekontrast aus und unterstützt Elastographie und automatisches Brustvolumen-Scanning.
Siemens Acuson S2000/S3000/S1000 Ultraschallsystem	Siemens Healthineers	/	Das Farbdoppler-Ultraschall-Diagnosesystem unterstützt Echtzeit-3D/4D-Bildgebung und Elastizitätsbildgebungsfunktionen und wird in mehreren Abteilungen wie Abdomen, Herz-Kreislauf, Gynäkologie und Geburtshilfe sowie Brust eingesetzt.
Veriti 96-Well-Thermocycler	Thermo Fisher Scientific	4375786	96-Kanal-Gradienten-PCR-Instrument, unterstützt Gradiententemperatur-Optimierung; hat hohe Temperatursteuerungsgenauigkeit; wird für cDNA-Synthese und konventionelle PCR-Amplifikation verwendet.