Entwicklung eines zellfreien COPII-Vesikel-Rekonstituierungsprotokolls zur Untersuchung der STING-Sortierung in einem zellbasierten HEK-293-Zellsystem

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein optimiertes, zellfreies System zur Rekonstituierung der STING-Einbindung in COPII-Vesikel, das eine kontrollierte biochemische Analyse der Frachtsortierung während des ER-Exports ermöglicht.

Zusammenfassung

Der cGAS–STING-Weg ist ein zentraler Bestandteil der angeborenen Immunität. Nach der Aktivierung wird das endoplasmatische Retikulum (ER)-residente Protein STING in COPII-Vesikeln verpackt und zum Golgi-Apparat transportiert, um die nachgeschaltete Signalübertragung zu initiieren. Trotz der Bedeutung dieses Prozesses sind die molekularen Mechanismen, die die STING-Sortierung in COPII-Vesikel steuern, weiterhin unvollständig verstanden. Hier wird ein optimierter Arbeitsablauf für die in-vitro-Rekonstituierung von COPII-Vesikeln präsentiert, um eine kontrollierte Analyse der Frachtauswahl zu erleichtern. Eine skalierbare Methode wird beschrieben, um hochkonzentriertes Zytosol (30–40 mg/mL) aus HEK-293F-Suspensionszellen herzustellen, kombiniert mit einem einfachen Verfahren zur Erzeugung halbpermeabilisierter HEK-293T-Zellen als definierte Membranquelle. Im Vergleich zu traditionellen, zellbasierten Adhärent-Systemen verbessert dieser Ansatz die Skalierbarkeit, senkt Kosten und verbessert die Reproduzierbarkeit. Mit STING als Modellladung werden COPII-Vesikelknospen und Ladungseinbau durch Western-Blot-Analyse validiert, mit einer basalen Verpackungseffizienz von etwa 20 % unter definierten Bedingungen. Dieses System ermöglicht eine kontrollierte Manipulation biochemischer Parameter, einschließlich Nukleotidstimulation, um deren Auswirkungen auf die Ladungseinlagerung zu bewerten. Dieses Protokoll bietet eine robuste und anpassungsfähige Plattform zur Untersuchung der COPII-vermittelten Frachtsortierung und kann erweitert werden, um weitere transmembrane Proteine und regulatorische Faktoren beim ER-Export zu untersuchen.

Einleitung

Der cGAS-STING-Signalweg dient als grundlegender Mechanismus des angeborenen Immunsystems, indem er zytosolische doppelsträngige DNA (dsDNA) erkennt, um eine antivirale Reaktion auszulösen. Beim Nachweis von dsDNA produziert das Enzym cGAS das zyklische Dinukleotid cGAMP, das als zweiter Botenstoff an das STING ^1,2 bindet. Entscheidend ist, dass STING als inaktiver Dimer im endoplasmatischen Retikulum (ER) unter stationären Bedingungen³. Seine Aktivierung erfordert eine schnelle, hochregulierte Translokation vom ER zum Golgi-Apparat. Am Golgi rekrutiert und aktiviert STING die nachgeschalteten Kinasen TBK1 und IRF3, was zur Produktion von Typ-I-Interferonen und proinflammatorischen Zytokinen^führt.

Der Transport von STING wird durch COPII-beschichtete Vesikel vermittelt, die universellen Träger für den Proteinexport aus dem ER⁵. Die Montage des COPII-Mantels – bestehend aus der kleinen GTPase Sar1, dem Innenmantel-Komplex Sec23/24 und dem äußeren Schichtkomplex Sec13/31 – ist sowohl verantwortlich für die Verformung der ER-Membran in Vesikel als auch für die selektive Rekrutierung^von Fracht ^6,7. Sec22b wird über ein strukturelles Epitope, das vom Sec23/24-Komplex von COPII⁸ anerkannt ist, in COPII-Vesikel sortiert. Weitere Ladungen sind die p24-Familie und der ERGIC-Marker ERGIC-53, die beide auf einem C-terminalen dihydrophoben φC-Motiv zur Sortierung^{von 9} basieren. Im Gegensatz dazu bleiben bestimmte ER-verankerte Proteine, wie Ritophorin I (RPN1), im ER enthalten und dienen als Marker intakter ER-Strukturen, da sie nicht über COPII-Vesikel¹⁰ transportiert werden. Daher werden in zellfreien COPII-Vesikelrekonstitutionsexperimenten Sec22b und p24 oft als COPII-Ladungen betrachtet, während Ritophorin als Marker zur Überwachung der ER-Kontamination in Vesikelpräparaten dient. Obwohl die allgemeine Maschinerie des COPII-Transports gut charakterisiert ist, bleiben die spezifischen molekularen Hinweise, die die selektive Sequestration aktivierter STING in diese Vesikel auslösen, schwer fassbar. Das Verständnis dieser Sortiermechanismen ist entscheidend, da die Dysregulation des STING-Transports mit verschiedenen autoimmunen und autoinflammatorischen Erkrankungen verbunden ist, wie der STING-assoziierten Vaskulopathie mit Beginn im Säuglingsalter (SAVI) und COPA-Syndrom¹¹. Die Untersuchung dieser vorübergehenden und hochdynamischen Ereignisse in intakten Zellen bleibt jedoch technisch herausfordernd.

Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurde ein optimiertes zellfreies Rekonstitutionssystem entwickelt, um die molekularen Anforderungen der COPII-vermittelten Frachtsortierung zu hinterfragen. Obwohl In-vitro-Knospungsassays schon lange ein Grundgestein der Zellbiologie¹² sind, wird ihre weite Verbreitung oft durch die hohen Kosten und die Komplexität der Herstellung hochwertiger Komponenten begrenzt. In dieser Studie wird ein optimierter Arbeitsablauf eingeführt, der HEK-293F-Suspensionszellen als wirtschaftliche Quelle für aktives Zytosol und semipermeabilisierte HEK-293T-Zellen als robusten Membranspender nutzt. Der gesamte Arbeitsablauf des zellfreien COPII-Vesikel-Rekonstitutionssystems ist in Abbildung 1 dargestellt. In diesem System wurde Sec22b als positive Kontrolle verwendet, um die Einbindung von Ladung in Vesikel zu bestätigen, während RPN1 als negative Kontrolle zur Überwachung und Ausschluss einer ER-Membrankontamination eingesetzt wurde. Mit STING als Proof-of-Concept-Fracht zeigte diese Studie, dass das System wesentliche biochemische Aspekte der STING-Sortierung effektiv modelliert. Diese Plattform bot ein vielseitiges, skalierbares Werkzeug zur Identifizierung zytosolischer Faktoren und Membransignale, die die STING-Sortierung steuern, mit potenziellen Anwendungen für die Untersuchung einer Vielzahl anderer vesikulärer Transportwege.

Protokoll

Die Zelllinien HEK-293F (RRID: CVCL_6642) und HEK-293T (RRID: CVCL_0063) wurden vom Cell Resource Center des Peking Union Medical College gewonnen. Beide Zelllinien wurden durch Short Tandem Repeat (STR)-Profilierung authentifiziert und als frei von Mycoplasma-Kontamination bestätigt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

An dieser Studie waren weder menschliche Teilnehmer noch Wirbeltiere beteiligt. Daher war keine ethische Zustimmung erforderlich. Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß institutionellen Biosicherheitsrichtlinien durchgeführt.

1. Herstellung des HEK-293F-Zellzytosols

1. Samen von HEK-293F-Zellen mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/mL in 100 mL definiertem Säugetierkulturmedium, ergänzt mit 1 % Penicillin–Streptomycin. Kultivieren Sie die Zellen in einem 500-mL konischen Kolben.
2. Inkubieren Sie die Suspensionskultur bei 37 °C mit 5 % CO₂ in einem Schüttelinkubator für 60 Stunden.
3. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C entnommen. Bestimmen Sie die Gesamtzellenzahl mit einem automatisierten Zellzähler.
4. Waschen Sie das Zellpellet mit 50 ml eiskalten phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS). Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
5. Lassen Sie das Zellpellet in einem gleichen Volumen eiskalten B88-Puffers (20 mM HEPES, pH 7,3; 250 mM Sorbitol; 150 mM Kaliumacetat; 5 mM Magnesiumacetat) wieder suspendieren.
6. Lyse die Zellen auf Eis, indem du die Federung durch eine 5-ml-Spritze mit einer 22-Gauge-Nadel für mehr als 100 Schläge führst.
7. Untersuchen Sie die Zelllyse mittels Lichtmikroskopie. Zellreste werden durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C entfernt.
8. Übertragen Sie den Supernatant in Ultrazentrifugenröhren. Zentrifugiere bei 100.000 × g für 1 Stunde bei 4 °C.
   VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass die Ultrazentrifugenröhren richtig ausbalanciert sind, um Geräteschäden und Sicherheitsrisiken zu vermeiden.
9. Sammeln Sie das geklärte Supernatant ein. Konzentrieren Sie die Probe mit einem 3 kDa Molekulargewichts-Cutoff-(MWCO)-Ultrafiltrationsgerät bei 4.000 × g bei 4 °C.
10. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bicinconininsäure-(BCA)-Test. Stellen Sie die Konzentration auf 30–40 mg/ml an.
    VORSICHT: Handhabt flüssigen Stickstoff mit geeigneter Schutzausrüstung, um kryogene Verletzungen zu vermeiden.
11. Aliquot das Zytosol. Schnellfrieren Sie die Aliquots in flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie bei −80 °C (Abbildung 2A)
    VORSICHT: Vermeiden Sie mehr als zwei Einfrier-Tau-Zyklen. Lagern Sie Aliquots bis zu 6 Monate bei −80 °C.

2. Herstellung halbpermeabilisierter HEK-293T-Zellen

1. Platten-HEK-293T-Zellen, die vollständige menschliche STING mit einer Dichte von 3 × 10^{6 Zellen pro} 15 cm Teller in 15 ml DMEM ausdrücken, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 48 Stunden.
2. Entnehmen Sie die Zellen bei etwa 60 % Konfluenz.
3. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml eiskalten PBS.
4. Fügen Sie 2 ml 0,25 % Trypsin–EDTA hinzu. Inkubieren Sie bei Zimmertemperatur 2–3 Minuten, um die Zellen abzutrennen.
5. Fügen Sie 200 μL Sojabohnen-Trypsininhibitor (1 mg/mL) hinzu, um die Trypsinisierung zu stoppen. Die Zellen werden in einem 10 mL eiskalten KHM-Puffer (20 mM HEPES, pH 7,2; 110 mM Kaliumacetat; 2 mM Magnesiumacetat) wieder suspendiert.
6. Pelletiere die Zellen durch Zentrifugation bei 250 × g für 3 Minuten. Entsorge das Supernatant.
   VORSICHT: Digitonin ist toxisch. Führe sie in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung.
7. Die Zellen in einem 6-mL-Eiskalte KHM-Puffer wieder suspendieren. Fügen Sie 6 μL Digitonin-Lagerlösung hinzu (40 mg/mL in DMSO).
8. Sanft durch Inversion mischen. Brüte 5 Minuten auf Eis.
9. Fügen Sie einen 8-ml-KHM-Puffer hinzu, um Digitonin zu verdünnen. Zentrifugiere mit 250 × g für 3 Minuten, um permeabilisierte Zellen zu sammeln.
10. Setzen Sie das Pellet in einen 14-mL eiskalten HEPES-Puffer (50 mM HEPES, pH 7,3; 90 mM Kaliumacetat) wieder auf. 10 Minuten auf Eis bebrüten.
11. Zentrifugiere bei 250 × g für 3 Minuten. Das Pellet in 1 mL eiskaltem KHM· wieder suspendieren. Cl-Puffer (20 mM HEPES, pH 7,3; 110 mM KCl; 2 mM MgCl₂).
12. Zentrifugiere mit 10.000 × g für 15 Sekunden. Entsorge das Supernatant.
13. Die Kugel in 50 μL KHM· wieder aufhängen. CL-Puffer. Missen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Test und stellen Sie die Menge auf 5–7 mg/mL ein.

3. Zellfreies COPII-Vesikelrekonstitutionsexperiment

1. Bereiten Sie alle in der Materialtabelle aufgeführten Reagenzien vor. Aliquot und bei −80 °C lagern.
2. Bereiten Sie eine 50 μL Reaktionsmischung vor, die 110 mM KCl, 20 mM HEPES (pH 7,2), 2 mM MgCl₂, Proteaseinhibitorcocktail (1×), 0,2 mM GTP und ein ATP-Regenerationssystem (40 mM Kreatinphosphat, 0,2 mg/mL Kreatinphosphokinase, 1 mM ATP) enthält.
3. Fügen Sie cGAMP zu einer Endkonzentration von 10 μM hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 15 Minuten.
4. Fügen Sie 50 μg semipermeabilisierte HEK-293T-Zellen hinzu. Mische vorsichtig.
5. Fügen Sie 80 μg HEK-293F Cytosol hinzu, um die Vesikelbildung einzuleiten. Inkubiere bei 37 °C für 45 Minuten.
6. Legen Sie die Reaktion auf Eis, um die Knospung zu beenden. Zentrifugiere bei 12.000 × g für 20 Minuten bei 4 °C.
7. Sammle das Supernatant mit den Vesikeln. Behalten Sie die Pellets mit den Organellen auf.
8. Ultrazentrifugieren Sie das Überstandsmittel bei 100.000 × g für 1 Stunde bei 4 °C. Das Vesikelpellet wird in einem 30-μL-Proteinladepuffer wieder suspendiert.
9. Proben bei 95 °C 5 Minuten erhitzen. Zentrifugiere bei 20.000 × g für 5 Minuten, um Niederschläge zu entfernen.
10. SDS-PAGE durchführen und Proteine auf PVDF-Membranen übertragen. Probe mit Antikörpern gegen Sec22b, STING und RPN1.

Ergebnisse

Während der Vorbereitung des HEK-293F-Zellzytosols wurden zwei Parameter zur Bewertung der Cytosolqualität bewertet. HEK-293F-Zellen wurden mit hoher Dichte kultiviert, was zytosolische Extrakte mit hohen Proteinkonzentrationen ergab. Zusätzlich wurde das Ausmaß der Zellstörung nach einer spritzenbasierten Lyse mittels Lichtmikroskopie bewertet, was eine effiziente Zelllyse unter den angewandten Bedingungen bestätigte (Abbildung 2B).

Diskussion

Die Wiederaufbau wesentlicher biochemischer Reaktionen in vitro hat die Grundlage für zellfreie Systeme gelegt, die maßgeblich an zahlreichen bahnbrechenden Entdeckungen beteiligt waren. Dazu gehören die Identifikation von cGAS als zytosolischer DNA-Sensor^14,15, die Aufklärung der Rolle von Cytochrom c bei der Apoptose und die Entdeckung der ersten Histondemethylase, JHDM1^16,17

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5-mL sterile Spritzen	WEGO	V526273	Verwendet zur mechanischen Zelllyse
Adenosin 5&Prim;-Triphosphat (ATP)	MCE	HY-B2176	100 mM Bestand in Wasser, pH 7,3, gelagert bei & minus; 80 & Grad; C
Adobe Illustrator	Adobe Systems Incorporated	SCR_010279	Verwendet zur Erstellung konzeptioneller Illustrationen und Schaltpläne
ATP-Regenerationssystem (10 & Mal;)	—	—	Energieregenerierendes Gemisch mit Kreatinphosphat, Kreatinkinase und ATP
BCA-Protein-Assay-Kit	Thermo Fisher	23227	Kolorimetrischer Protein-Assay
BioRender	BioRender	SCR_018361	Verwendet zur Erstellung konzeptioneller Illustrationen und Schaltpläne
BSA	Biorigin	BN20815	Blockierendes Reagenz
Kohlendioxid-Schüttel-Inkubator	ZhiChu	ZCZY-CS8	Erhält Temperatur, CO2 und Rührung für die Suspensionskultur
CO2 Inkubator	Thermo Fisher	3110	Hält Temperatur und CO2 für eine haftende Kultur
Konventionelles Mikroskop	Olympus	CX43	Verwendet zur Beurteilung der Zelllyse und -morphologie
Kreatin-Kinase	Roche	CKRO	20 mg/mL Vorrat im Puffer, gelagert bei & minus; 80 & Grad; C
Kreatinphosphat	Roche	CRPHO-RO	Komponente des ATP-Regenerationssystems
Desktop-Zentrifuge	Eppendorf	5810R	Verwendet für die Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit
Digitonin	Sigma	D5628	40 mg/mL Vorrat in DMSO, gelagert bei & minus; 20 & Grad; C
DMEM	Corning	10-013-CMR	Wachstumsmedium für HEK-293T-Zellen
D-Sorbitol	Sangon	A100691	1 M Serienlösung in Wasser, gelagert bei 4 °C; C
ECL-Detektionsreagenz	Biorigin	BN16009	Chemilumineszentes Substrat
Elektrophorese-Tank	Bio-Rad	1658001	Gerät für SDS-PAGE
Fetales Rinderserum (FBS)	Corning	35-015-CV	Serumpräparat
Rotor mit festem Winkel (TFT 80.2)	Thermo Fisher	54456	Rotor für Ultrazentrifugation
FreeStyle 293-F-Zellen	Thermo Fisher	R79007	Verwendet zur Zytosolpräparation
Ziegen-Maus-IgG (H+L)	Invitrogen	31430	HRP-konjugierter sekundärer Antikörper
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)	Invitrogen	31460	HRP-konjugierter sekundärer Antikörper
GraphPad-Prisma	GraphPad-Software	SCR_002798	Verwendet zur Durchführung statistischer Analysen (Einweg-ANOVA) und zur Erstellung des quantitativen Balkendiagramms in Abbildung 4D.
Guanosin 5&prim;-Triphosphat (GTP)	MCE	HY-113225	10 mM Bestand in Wasser, pH 7,3, gelagert bei & minus; 80 & Grad; C
HEK-293T-Zellen exprimieren menschliche STING	—	—	Intern generiert; Verwendet als Membranquelle
HEPES-Puffer (1 M, pH 7,3)	Beyotime	C0215	Pufferkomponente zur Lösungsvorbereitung
Bildgebungssystem	Bio-Rad	12003153	Verwendung zur Signalerkennung
Magnesiumacetattetrahydrat	Hampton Research	HR2-561	Pufferkomponente für die B88-Vorbereitung
Magnesiumchloridhexahydrat	Hampton Research	HR2-559	Pufferkomponente
Mikrozentrifuge	Eppendorf	5420R	Verwendet für die Zentrifugation mit mittlerer Geschwindigkeit
Mikrozentrifuge	Eppendorf	5420	Verwendung für routinemäßige Zentrifugation
NanoDrop-Spektrophotometer	Thermo Fisher	840-317400	Verwendung zur Proteinquantifizierung
OPM-CD Trans293-Medium	OPM	P82019	Serumfreies Medium für HEK-293F-Suspensionskultur
Penicillin– Streptomycin (100&Times;)	Servicebio	G4003	Antibiotikumpräparat zur Zellkultur
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)	Sangon	A610425	Proteaseinhibitor
Phosphataseinhibitoren	Lablead	C0104	Proteindephosphorylierung verhindern
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Servicebio	G4202	Puffer zum Waschen von Zellen
Kaliumacetat	Sigma	236497	1 M Serienlösung in Wasser, gelagert bei 4 °C; C
Stromversorgung	Bio-Rad	1645052	Liefert Spannung für die Elektrophorese
Proteaseinhibitor-Cocktail, EDTA-frei	Roche	4693132001	Breitband-Proteaseinhibitor-Gemisch
PVDF-Membran	Millipore	ISEQ00010	Membran für Western-Blotting
RPN1-Antikörper (Kaninchen-mAb)	Abcam	ab197888	Notaufnahme-Markierung
SDS-PAGE Gel (4 & Strich; 20%)	—	—	Verwendet zur Proteintrennung
SDS-PAGE Ladepuffer (5×)	Solarbio	P1040	Puffer zur Proteinprobenvorbereitung
Sec22b-Antikörper (Rabbit mAb)	Abcam	ab181076	COPII-Frachtmarker
Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI)	Sigma	T9128	1 mg/mL Vorrat in PBS, gelagert bei & minus; 20 & Grad; C
STING-Antikörper (Kaninchen-MAb)	CST	13647	Primärer Antikörper
TBST-Puffer	Servicebio	G0004	Waschpuffer für Immunblotting
Thermischer Zykler	Bio-Rad	186-1096	Verwendet zum Heizen und Inkubieren
Thermostatisches Metallbad	DLAB	5062102100	Halten die konstante Temperatur
Transferzelle	Bio-Rad	1703930	Verwendet für den Proteintransfer
Trypsin-EDTA (0,25 %)	Servicebio	G4011	Verwendet zur Zellabtrennung
Ultrazentrifuge	Thermo Fisher	75000100	Verwendet für Hochgeschwindigkeitszentrifugation
Ultrazentrifugenröhren (2 mL)	Thermo Fisher	54460	Röhren, die mit Ultrazentrifugation kompatibel sind
Ultrafiltrationsröhrchen (4 mL, 10 kDa MWCO)	Millipore	UFC8010	Verwendet zur Zytosolkonzentration