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Amikacin-Schutztest zur Quantifizierung und Visualisierung der Escherichia-coli-Zellinvasion

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DOI:

10.3791/71108

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3. Juli 2026

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1Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, 3Howard Hughes Medical Institute, University of Texas Southwestern Medical Center, 4Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Antibiotikaresistenz bei adhärent-invasiven Escherichia-coli-Stämmen stellt Herausforderungen bei der Beurteilung bakterieller Invasionen mit dem traditionellen Gentamicin-Schutztest dar. Eine verbesserte Methode zur quantitativen Bewertung der bakteriellen Invasion durch Aufzählung koloniebildender Einheiten und qualitativ durch die Visualisierung infizierter Zellen mittels Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopie wird beschrieben.

Zusammenfassung

Die Invasion von Epithelzellen ist ein Schlüsselphänotyp für viele enterische Krankheitserreger, darunter Salmonellen, Shigella und Vibrio. Ein aufkommender invasiver Erreger ist der adhärent-invasive Escherichia coli (AIEC), der an der Pathogenese der entzündlichen Darmerkrankung (IBD) beteiligt ist. AIEC-Stämme fehlen Virulenzfaktoren, die häufig mit anderen invasiven Krankheitserregern assoziiert werden, was die genetische Bestimmung erschwert. Daher werden AIEC-Stämme phenotypisch aufgrund ihrer Fähigkeit klassifiziert, Epithelzellen mit einem feldüblichen Gentamicin-Schutztest zu invizieren. Da AIEC-Stämme jedoch häufig von IBD-Patienten isoliert werden, die im Rahmen ihrer Behandlung verschiedene Antibiotika erhalten, hat der Anstieg gentamicinresistenter Isolate diesen Test für die AIEC-Klassifikation weniger zuverlässig gemacht. Um dieses Problem zu umgehen, wurde ein alternativer Amikacin-Schutztest entwickelt, um die Invasion von AIEC-Zellen zu quantifizieren und zu visualisieren. Dieser Test verwendet Amikacin, ein breitspektriges, halbsynthetisches Aminoglykosid, das effektiv Stämme anspricht, die gegen andere Aminoglykosiden resistent sind, aber extrazellulär zu eukaryotischen Wirtszellen bleibt. So werden extrazelluläre Bakterien während der Infektion getötet, während intrazelluläre Bakterien "geschützt" sind. Dies bildet die Grundlage eines quantitativen Assays zum Vergleich der Stamminvasivität, gemessen als prozentualer Invasionswert mit den nach der Infektion gefundenen Koloniebildenden Einheiten (CFU). Dieser Test kann auch als qualitative Messung der Invasion verwendet werden, indem infizierte Epithelzellen immunfärbt und diese Zellen mittels Konfokalmikroskopie visualisiert werden. Diese Methode dient als diagnostisches Werkzeug, um IBD-Patienten auf AIEC zu screenen, was auch auf andere multiresistente Krankheitserreger angewendet werden kann, um die Zellinvasion zu beurteilen – ein Proxy für Virulenz und Pathogenität.

Einleitung

Die entzündliche Darmerkrankung (IBD), zu der Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa gehören, ist eine chronische gastrointestinale Entzündungserkrankung, die weltweit Millionen von Menschen betrifft1. Trotz der weltweit steigenden Inzidenz von IBD bleibt ihre genaue Ätiologie unklar, bedingt durch das komplexe Zusammenspiel genetischer, umweltbezogener, mikrobieller und immunologischer Faktoren 2,3. Ein charakteristisches Merkmal von IBD ist die veränderte Zusammensetzung der Darmmikrobien, die oft durch Umweltfaktoren verursacht wird, wie etwa eine zuckerreiche, fettreiche Ernährung, die in Industrieländernüblich ist. Die Mikrobiota von IBD-Patienten ist häufig durch eine geringere mikrobielle Vielfalt, die Anreicherung pathogener Gammaproteobakterien und den Verlust schützender Firmicutes 6,7 gekennzeichnet. Bei Patienten mit CD ist Escherichia coli (E. coli) im Darmmikrobiota angereichert, assoziiert mit und dringt in die Darmschleimhaut ein und korreliert positiv mit aktiver und schwerer Erkrankung8,9. Dieser aufkommende Pathotyp von E. coli, der mit CD assoziiert ist, wird als adhärent-invasive Escherichia coli (AIEC) bezeichnet.

AIEC sind gramnegative opportunistische Krankheitserreger, die die ileale Schleimhaut von CD-Patienten mit einer höheren Wahrscheinlichkeit als gesunde Kontrollgruppen10 besiedeln. AIEC-Stämme, die von CD-Patienten isoliert wurden, sind genetisch vielfältig und umfassen oft alle E.-coli-Phylogruppen , zu denen sowohl kommensale als auch pathogene E. coli11 gehören. Im Gegensatz zu Krankheitserregern wie Shigella und Salmonella, die auf den Einsatz von Typ-III-Sekretionssystemen zur Ermöglichung der Invasion der Wirtszellen angewiesen sind, fehlen AIEC diese konservierten Virulenzsysteme12. Daher basiert unser Verständnis der AIEC-Virulenz weitgehend auf ihrem in-vitro-Phänotyp, der durch seine Fähigkeit gekennzeichnet ist, an Epithelzellen zu haften und in Epithelzellen einzudringen, und innerhalb von Makrophagen10 zu überleben.

Die Epithelzellinvasion durch AIEC wird durch mehrere Virulenzfaktoren vermittelt, darunter der Typ-1-Pilus und die langen polaren Fimbrien. FimH, das sich an der Spitze des Typ-1-Pilus befindet, vermittelt die Adhäsion an Mannosereste am stark glykosylierten Wirtsrezeptor CEACAM613. Diese Bindung fördert das Eindringen von AIEC in Enterozyten und unterstützt deren intrazelluläre Replikation14. AIEC haftet auch an Mikrofaltenzellen (M), spezialisierte Epithelzellen, die sich über Peyers Patches befinden, durch Interaktionen zwischen ihren langen polaren Fimbrien und dem M-Zelloberflächenprotein-Glykoprotein 215,16. Diese Adhäsion ermöglicht es AIEC, durch M-Zellen zu translokieren, die darunterliegenden Makrophagen zu erreichen und die Expression proinflammatorischer Zytokine wie TNF-α auszulösen, die nicht nur Entzündungen fördern, sondern auch die bakterielle Replikation in Makrophagenunterstützen 17,18. Diese pathogenen Mechanismen sollen eine chronische Entzündung im Wirt aufrechterhalten, wie bei CD beobachtet wird.

AIEC wird durch ihren in-vitro-Phänotyp definiert, was den Gentamicin-Schutztest für die Stammklassifikation unddie Entdeckung von Virulenzfaktoren unerlässlich macht. Dieser Ansatz kann durch gentamicinresistente Isolate erschwert werden, was zu ihrer Fehlklassifizierung als invasiv11 führen kann. Um dieses Problem zu umgehen, wurden alternative Antibiotika getestet, die gentamicinresistente Isolate effektiv abtöten, ohne die Membranen der Wirtszellen zu durchdringen. Durch diesen Ansatz wurde Amikacin als geeigneter Ersatz für Gentamicin identifiziert, das eine vergleichbare Wirksamkeit und Kompatibilität mit Standard-Invasionstests sowie minimale Zytotoxizität bietet, wie die Trypan-Blue-Färbung in früheren Studien zeigte und hier weiter mit einem Laktatdehydrogenase-Freisetzungstest validiert wurde (ergänzende Abbildung 1)11. Amikacin ist ein semisynthetisches Aminoglykosid, das aus Kanamycin gewonnen wird und das Bakterienwachstum hemmt, indem es die Proteinsynthese19 stört. Amikacin ist besonders wirksam gegen multiresistente gramnegative Bakterien, darunter Pseudomonas, Acinetobacter und Escherichia Art19. Bemerkenswert ist, dass strukturelle Veränderungen am Kanamycin-Rückgrat Amikacin weniger anfällig für bakterielle Aminoglykosid-inaktivierende Enzyme machen19. Daher stellt Amikacin eine robuste Alternative zu Gentamicin dar, um multiresistente Bakterien in Invasionstests zu bekämpfen. Die folgenden Protokolle beschreiben, wie der Invasionsphänotyp von E. coli sowohl mit dem Referenzstamm NRG857c als auch klinischen Isolaten mit dem Amikacin-Schutzassay bewertet werden kann.

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Bewertung der Invasionskapazität von AIEC-Stämmen in Caco-2-Epithelzellen. Die in diesem Protokoll verwendete Amikacin-Konzentration (240 μg/mL) entspricht 10 × der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC), wie sie mit Amikacin-MIC-Teststreifen über ein Panel von 32 repräsentativen AIEC-klinischen Isolaten von 13 Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen11 ermittelt wurde. Forscher sollten das MIC für ihre eigenen AIEC-Isolate bestimmen, bevor sie den Test durchführen (siehe Materialtabelle), da die Antibiotikaanfälligkeit zwischen den Isolaten variieren kann. Abschnitt 1 beschreibt den Amikacin-Schutztest zur Quantifizierung der prozentualen Invasion, und Abschnitt 2 beschreibt den Amikacin-Schutztest für die konfokale Mikroskopie.

1. Amikacin-Schutztest zur Quantifizierung der prozentualen Invasion

  1. Kollagenbeschichtung von 24-Well-Platten
    1. Verdünnen Sie 35,29 μL sterile Gletscheressigsäure (siehe Materialtabelle) in 30 mL 1× PBS (siehe Materialtabelle) in einem 50 mL konischen Rohr.
    2. Pipettieren Sie 300 μL Kollagen (siehe Materialtabelle) in das 1× PBS mit Essigsäurelösung.
    3. Vortexlösung für 10 Sekunden, damit sie gut mischen.
    4. Geben Sie 250 μL der verdünnten Kollagenlösung in jeden Brunnen einer sterilen, 24-Well-Gewebekultur-behandelten Platte.
      HINWEIS: Die 30-mL Kollagenlösung reicht aus, um etwa fünf 24-Well-Platten zu beschichten.
    5. Kippen Sie die Platte in alle Richtungen, um sicherzustellen, dass die Lösung den Boden jedes Bohrlochs gleichmäßig bedeckt hat.
    6. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 2 Stunden, damit das Kollagen an der plastischen Oberfläche haften kann.
    7. Nach Abschluss der Inkubation wird die Kollagenlösung aus jedem Brunnen aspiriert.
    8. Pipettiere 1 ml 1× PBS in jeden Brunnen, um Restkollagen abzuwaschen und jeden Brunnen zu aspirieren. Wiederhole diesen Schritt noch zweimal (insgesamt 3 Waschen).
    9. Trockne Platten in einem biologischen Sicherheitsschrank, um sicherzustellen, dass alle sichtbaren Feuchtigkeiten verdunstet sind.
      HINWEIS: Platten können sofort für die Zellsaat verwendet oder bei Raumtemperatur gelagert werden. Bei der Aufbewahrung der Platten versiegeln Sie den äußeren Rand mit sterilem Parafilm oder legen Sie sie in einen sterilen Ziplock-Beutel.

  1. Herstellung von Amikacin-Stocklösungen
    1. Wäge 240 mg Amikacin-Disulfat (siehe Materialtabelle) und übertrage sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
    2. Pipettieren Sie 1 ml steriles Wasser und lösen Sie Amikacin durch Vortex, was eine Endkonzentration von 240 mg/mL (1000× Bestand ergibt.
    3. Stellen Sie 20 μL Aliquot der Amikacin-Lösung her und lagern Sie sie bei -20 °C.
      HINWEIS: Amikacin ist für 6–12 Monate bei -20 °C stabil. Bereiten Sie Einweg-Aliquots vor, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu minimieren.
  2. Herstellung von Caco-2-Zellen
    1. Auftauen von Caco-2-Zellen aus Tiefkühlmaterial
      1. Bereiten Sie das vollständige Wachstumsmedium vor, indem Sie das hochglukosereiche Dulbeccos modifiziertes Adlermedium (DMEM, siehe Materialtabelle) mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS, siehe Materialtabelle) und 1 % antibiotika-antimykotischer Lösung (siehe Materialtabelle) ergänzen.
      2. Vorwarme Medien in einem 37 °C Wasserbad für 30 Minuten.
      3. Stellen Sie das gefrorene Fläschchen mit Caco-2-Zellen in ein 37 °C starkes Wasserbad und inkubieren Sie 1–2 Minuten, bis die Zellen vollständig aufgetaut sind.
      4. Nehmen Sie das Fläschchen aus dem Wasserbad und sprühen Sie die Außenseite mit 70 % Ethanol.
      5. Im Inneren eines biologischen Sicherheitsschranks werden die Zellen in ein 15-mL-konisches Rohr mit 9 mL vollständigem Wachstumsmedium gepipettiert.
      6. Zentrifugiere Zellen bei 500 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
      7. Aspirieren Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml vollständigem Wachstumsmedium.
      8. Transferiere die Zellen in eine 75 cmgroße, 2 cm große Gewebekulturkolbe (T75) mit 10 ml warmem Vollwachstumsmedium.
      9. Drehen Sie die Platte dreimal, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig über den unteren Teil der Platte verteilt sind.
      10. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2, bis sie ~90 % Konfluenz erreichen (6–7 Tage).
        HINWEIS: Die Konfluenz wird durch eine Visualisierungsannäherung der Zellen mit einem Lichtmikroskop geschätzt. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage, während sich die Zellen erholen.
    2. Auszaat von Caco-2-Zellen
      1. Vorwarmes vollständiges Wachstumsmedium und 0,25 % (w/v) Trypsin-EDTA (siehe Materialtabelle) in einem 37 °C Wasserbad.
      2. Sobald Caco-2-Zellen ~90 % Konfluenz erreicht haben, aspirieren Sie Zellkulturmedien und fügen Sie 2 ml Trypsin-EDTA hinzu. Kippen Sie die Flasche, damit die Trypsinlösung die gesamte Unterseite des Kolbens bedeckt, um sicherzustellen, dass alle Spuren von FBS inaktiviert sind.
      3. Aspiratiere Trypsin-EDTA-Lösung und gib 3 ml Trypsin-EDTA hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2für 5 –15 Minuten. Visualisieren Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop zu verschiedenen Zeitpunkten während der Inkubationszeit, um die Zellrundung zu beobachten, was darauf hinweist, dass sich die Zellen abgelöst haben.
        HINWEIS: Vermeiden Sie es, gegen die Seite des Kolbens zu stoßen, um die Zellablösung zu erleichtern, da dies zu einem Verklumpen der Zellen führen kann.
      4. Pipettieren Sie 6 ml Komplettwachstumsmedium, um die Trypsin-EDTA-Lösung zu deaktivieren, und mischen Sie sie durch sanftes Auf- und Abpipettern, um die Zellen wieder aufzuhängen.
      5. Pipettieren Sie die Zellen in ein 15 ml konisches Rohr und zentrifugieren Sie bei 500 × g für 5 Minuten die Pelletzellen.
      6. Aspirieren Sie Medien und resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml vollständigem Wachstumsmedium.
      7. Übertragen Sie 10 μL der suspendierten Caco-2-Zellen in ein 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 10 μL Trypan-blaue Farbstoffe (siehe Materialtabelle) in das 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr und mischen Sie es mehrmals, indem Sie es auf und ab pipetteren.
      8. Pipette 10 μL der Caco-2/Trypan-Blau-Mischung auf eine Zellzähler-Folie (siehe Materialtabelle). Zähle die Anzahl der lebenden Zellen auf, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu berechnen.
        HINWEIS: Bei der Aufzählung der vorhandenen Caco-2-Zellen sollten Sie nur die Anzahl der lebenden Zellen berücksichtigen, nicht die Gesamtzahl der Zellen für die Seeding.
      9. Säe Caco-2-Zellen in einer 24-Well-Platte oder einer T75-Flasche.
      10. Für eine 24-Well-Platte folgen Sie den folgenden Schritten:
        1. Säe Caco-2-Zellen mit einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/mL mit der folgenden Gleichung:
          [(1 × 105 Zellen)(Anzahl der Bohrungen + 2)] / [Lebensfähige Zellanzahl (Zellen/mL)] = Zellen (mL)
        2. Entferne das oben berechnete Zellvolumen aus den aufgehängten Caco-2-Zellen in Schritt 3.2.6 in ein 15-mL konisches Rohr. Berechnen Sie das Volumen des vollständigen Wachstumsmediums, das zu den Zellen hinzugefügt werden soll, mit der folgenden Gleichung:
          (Anzahl der Bohrlöcher + 2 Brunnen) - Zellen (mL) = Medien (mL)
          HINWEIS: Die "+2 Brunnen" in der Berechnung sollen den Pipettierungsfehler berücksichtigen.
        3. Pipettieren Sie das oben berechnete Volumen des Mediums in das 15-mL-Konische mit den Caco-2-Zellen und mischen Sie es mehrmals auf und ab.
        4. Pipettieren Sie 1 ml Caco-2-Zellen in vollständigen Wachstumsmedien (Endkonzentration 1 x 105 Zellen/ml) in jede Welle der kollagenbeschichteten 24-Bohrloch-Platte.
        5. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C mit 5 %CO2 , bis die Zellen ~90 % Konfluenz erreichen (3–4 Tage).
      11. Für eine T75-Flasche folgen Sie den folgenden Schritten:
        1. Übertragen Sie 7,5 x 105 lebensfähige Felder in eine T75-Flasche mit folgender Gleichung:
          [(7,5 × 105 Zellen)] / [lebensfähige Zellanzahl (Zellen/mL)] = Zellen (mL)
          HINWEIS: Die Anzahl der lebensfähigen Zellen, die dem T75-Kolben hinzugefügt werden sollten, wurde anhand der ATCC-Richtlinien für Caco-2-Zellkultur bestimmt.
        2. Entferne das oben berechnete Zellvolumen und übertrage es in eine T75-Flasche. Berechnen Sie das Volumen des vollständigen Wachstumsmediums, das zu den Zellen hinzugefügt werden soll, mit der folgenden Gleichung:
          15 mL – Volumen der Zellen in den Kolben = Medium (mL)
        3. Pipettieren Sie das oben berechnete Medienvolumen auf den T75-Kolben.
        4. Drehen Sie die Platte vorsichtig mehrmals, um die Zellen gleichmäßig über den Boden des Kolbens zu verteilen. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2, bis die Zellen ~90 % Konfluenz erreichen (3–4 Tage).
  3. Amikacin-Schutztest
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Zellkulturmedien vor Beginn des Experiments auf 37 °C vorgewärmt sind.
    1. Herstellung von Bakterien
      1. Mit einem sterilen Holzstab oder einer sterilen Pipettenspitze kratzen Sie vorsichtig Bakterien von einem bei -80 °C gelagerten gefrorenen bakteriellen Glycerolstock ab und streichen Sie auf einer LB-Agarplatte für einzelne Kolonien. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 °C.
      2. Mit einem sterilen Holzstab oder einer sterilen Pipettenspitze nehmen Sie eine einzelne Kolonie von der Agarplatte und inokulieren Sie sie in 3 mL LB-Brühe. Die Kultur über Nacht bei 37 °C inkubieren und bei 200 U/min schütteln.
      3. Führen Sie eine 1:10-Verdünnung der Übernachtkultur in 1 mL LB-Brühe durch und messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) der Kultur mit einem Spektrophotometer.
    2. Berechnung der Multiplizität der Infektion (MOI)
      1. Transferiere 100 μL der Übernachtungskultur in ein 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr und zentrifugiere bei 6000 × g für 10 Minuten bei 4 °C.
      2. Saugen Sie das Supernatant vorsichtig an, um das Zellpellet nicht zu stören. Das Pellet wird in 1 ml Serum und antibiotika-antimykotisch-freiem Medium wieder suspendiert.
        HINWEIS: Dies ist eine 1:10-Verdünnung der bakteriellen Kultur über Nacht. Für die MOI-Berechnung verwenden Sie den Rohwert OD600 , der für die verdünnte Übernachtkultur in Schritt 4.1.3 berechnet wurde, nicht den für den Verdünnungsfaktor korrigierten OD600-Wert .
      3. Berechnen Sie das Volumen der bakteriellen Suspension, das aus Schritt 4.2.2 hinzugefügt werden soll, um Caco-2-Zellen bei einem MOI von 10 zu infizieren, mit folgender Berechnung:
        [1 OD-Einheit/2,4 × 109 Bakterien] × [10 Bakterien/Zelle] × [1 mL × OD 1:10] × 1 ×105 ×103 = Volumen (uL)
        HINWEIS: Zeichnen Sie das berechnete Volumen für jede Probe sorgfältig auf, da dieser Wert später zur Berechnung des Inokulum-CFU/mL verwendet wird. Dieses Volumen bakterieller Suspension ist nur für einen Brunnen innerhalb der 24-Well-Platte.
      4. Bereite das Infektionsmedium vor, indem das berechnete Volumen der bakteriellen Suspension aus Schritt 4.2.3 in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr übertragen wird. Fügen Sie 1 ml Serum und antibiotika-antimykotisches freies Medium hinzu. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie mehrmals auf und ab pipetten.
    3. Caco-2-Zellinfektion
      1. Entfernen Sie die 24-Well-Platte mit den Caco-2-Zellmonoschichten aus dem Inkubator und aspirieren Sie das vollständige Medien.
      2. Pipette 1 ml Serum und antibiotisch-antimykotische freie Medien in jedes Bohrloch und aspirieren Sie, um Spuren serumhaltiger Medien zu entfernen. Wiederhole diesen Schritt noch einmal (insgesamt 2 Waschen).
        HINWEIS: Reduzieren Sie den Vakuumdruck beim Aspirieren, um eine Störung der Zellmonoschicht zu vermeiden.
      3. Pipettieren Sie 1 ml des Infektionsmediums aus Schritt 4.2.4 in jede Welle der 24-Bohrloch-Platte, die die Caco-2-Zellen enthält.
      4. Zentrifugieren Sie die 24-Well-Platte bei 500 × g für 15 Minuten bei Raumtemperatur, um den Kontakt der Bakterien mit den Epithelzellen zu synchronisieren.
      5. Inkubieren Sie die 24-Wellen-Platte bei 37 °C mit 5 %CO2 für 3 Stunden, um eine bakterielle Invasion zu ermöglichen.
      6. Während der Inkubationszeit bestimmen Sie die CFU/mL der verdünnten Übernachtkultur aus Schritt 4.2.2 durch 10-fache Serienverdünnungen in sterilem 1× PBS mit einer 96-Well-Platte.
        1. Um jede Verdünnung vorzubereiten, werden 200 μL der verdünnten Übernachtkultur von Schritt 4.2.2 in das erste Bohrloch in der Platte übertragen.
        2. Pipette 20 μL der Kultur in die nächste Reihe, die 180 μL 1× PBS enthält. Mischen Sie, indem Sie zehnmal auf und ab pipetteren. Wiederholen Sie das, bis die Verdünnung 10-6 erreicht, wobei Sie jedes Mal eine frische Pipettenspitze zum Transfert verwenden.
        3. Platte 10 μL Spot-Verdünnungen im Dreifach von den 10-2 bis 10-6 Verdünnungen auf LB-Agarplatten. Lassen Sie die Stellen unter einer Flamme in den Agar einziehen.
        4. Inkubieren Sie Platten über Nacht bei 27–30 °C, um Überwucherung von Kolonien zu verhindern und klare, getrennte einzelne Kolonien zu gewährleisten.
          HINWEIS: Die Punktbeschichtung in dreifacher Form verbessert die Quantifizierungsgenauigkeit und ermöglicht den Nachweis über verschiedene Bakterienkonzentrationen. Eine niedrigere Inkubationstemperatur verlangsamt das Bakterienwachstum und ermöglicht eine genauere CFU-Schätzung aus hochkonzentrierten Proben.
      7. Stellen Sie antibiotikumhaltige Medien vor, indem Sie 240 μg/mL Amikacin zu vorerwärmtem Serum und antibiotikum-antimykotischen freien Medien hinzufügen.
      8. Nach Abschluss der 3-Stunden-Infektion wird das Medium aus den Caco-2-Zellmonoschichten aspiriert. Fügen Sie jedem Brunnen 1 ml Serum und antibiotika-antimykotisches freies Medium hinzu. Wiederhole diesen Schritt noch einmal (insgesamt 2 Waschen).
      9. Pipettieren Sie 1 ml 240 μg/mL amikacinhaltiges Medium in jedes Bohrloch und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2 für 1 Stunde, um extrazelluläre Bakterien zu eliminieren.
      10. Aspirieren Sie das Medium aus jedem Bohrloch und fügen Sie 1 ml 1× PBS hinzu, um durch Amikacin abgetötete Bakterien abzuwaschen. Wiederhole diesen Schritt noch einmal (insgesamt 2 Waschen).
      11. Pipette 200 μL mit 1 % Triton-X-100 (siehe Materialtabelle), verdünnt in 1× PBS in jedes Bohrloch. Inkubieren Sie 10 Minuten lang auf einem Orbitalshaker bei 90 U/min, um die Epithelzellen zu lysieren.
      12. Lösen Sie die Zellen von der 24-Bohrloch-Platte, indem Sie etwa 30 Mal pro Bohrloch auf und ab pipettieren.
        HINWEIS: Da die Beschichtung der Platten mit Kollagen die Zellhaftung verbessert, ist es wichtig sicherzustellen, dass sich die Monoschicht von der Platte gelöst hat. Dies kann visuell bestätigt werden, indem man einen lysierten Brunnen im Vergleich zu einem nicht-lysierten Brunnen und einen ohne Caco-2-Zellen vergleicht, der klar aussieht.
      13. Führen Sie 10-fache serielle Verdünnungen der Zelllysate in einer 96-Well-Platte mit 1× PBS durch.
        HINWEIS: Führen Sie serielle Verdünnungen bis zur 10-3-Verdünnung durch.
      14. Platte 10 μL Punktverdünnungen in dreifacher Schicht, von unverdünnten bis 10-3 Verdünnungen, auf LB-Agarplatten. Lassen Sie die Stellen unter einer Flamme in den Agar einziehen. Inkubieren Sie Platten über Nacht bei 27–30 °C, um Überwucherung der Kolonie zu verhindern und klare, getrennte einzelne Kolonien zu gewährleisten.
    4. Kolonienzählung und Berechnung der prozentualen Invasion
      1. Nach der Übernachtung zählen Sie die Anzahl der Kolonien in jeder Fleckverdünnung aus der verdünnten Übernachtkultur und dem entnommenen Lysat. Wählen Sie eine Verdünnung, bei der jeder Fleck mehr als 7 isolierte Kolonien enthält. Verwenden Sie dieselbe Verdünnung über die Dreifacharten, um die durchschnittliche Anzahl der für diese Verdünnung gewonnenen Bakterienkolonien zu berechnen.
        HINWEIS: Zählen Sie Punktverdünnungen, die gut isolierte Einzelkolonien enthalten, und vermeiden Sie das Zählen von Verdünnungen, die sich berühren.
      2. Berechnen Sie das Inokulum CFU/mL, das gewonnene CFU/mL und die prozentuale Invasion mit den folgenden untenstehenden Gleichungen:
        Inokulum CFU (CFU/mL):
        CFU-Inokulum = (durchschnittliche Anzahl der Kolonien) (Verdünnungsfaktor) (Volumen aus Infektionsmedien (μL ) x 100
        Abgerufen CFU (CFU/mL):
        CFU abgerufen= (durchschnittliche Anzahl der Kolonien ) (Verdünnungsfaktor) x 100
        Prozentuale Invasion (%):
        Invasion (%) = [(CFUabgerufen)/(CFU-Inokulum)] × 100

2. Amikacin-Schutztest für konfokale Mikroskopie

  1. Herstellung steriler Poly-L-Lysin-beschichteter Deckschlappen
    1. In einem biologischen Sicherheitsschrank verwenden Sie sterile Pinzetten, um Poly-L-Lysin-beschichtete Überdeckfolien (siehe Materialtabelle) auf ein Papiertuch zu legen, das in 70 % Ethanol getränkt ist.
    2. Besprühen Sie beide Verkleidungen der Deckfolien mit 70 % Ethanol und verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Decke zu jeder Seite zu drehen.
    3. Lassen Sie die Deckdeckel unter UV-Licht im biologischen Sicherheitsschrank trocknen, bis sie vollständig trocken sind.
  2. Aussaat von Caco-2-Zellen in einer 6-Well-Platte
    1. In einem biologischen Sicherheitsschrank wird in jedem Schachtel einer 6-Wellen-Platte ein Poly-L-Lysin-beschichteter Deckmantel eingesetzt.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1–3.2.8 aus dem Abschnitt "Aussaat von Caco-2-Zellen".
    3. Seed Caco-2-Zellen mit einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/mL in einer 6-Well-Platte mit der folgenden Gleichung:
      [(1 × 105 Zellen)(Anzahl der Bohrungen + 2)] / [Lebensfähige Zellanzahl (Zellen/mL)] × 2 = Zellen (mL)
      HINWEIS: Dieser Wert wird mit 2 multipliziert, um das Hinzufügen von 2 ml Medium pro Bohrloch bei Verwendung einer 6-Well-Platte zu berücksichtigen.
    4. Entfernen Sie das oben berechnete Zellvolumen in ein 15 mL konisches Rohr. Berechnen Sie das Volumen des vollständigen Wachstumsmediums, das zu den Zellen hinzugefügt werden soll, mit der folgenden Gleichung:
       (Anzahl der Bohrungen zum Säen + 2 Brunnen) x 2 - Zellen (mL) = Medien (mL)
    5. Pipettieren Sie das oben berechnete Volumen des Mediums in das 15-mL-Konische mit den Caco-2-Zellen und mischen Sie es mehrmals auf und ab.
    6. Fügen Sie 2 ml Caco-2-Zellen in vollständigem Wachstumsmedium zu jedem Brunnen der 6-Well-Platte hinzu (Endkonzentration 1 × 105 Zellen/mL).
    7. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C mit 5 % CO2, bis die Zellen ~90 % Konfluenz erreichen (2–3 Tage).
  3. Amikacin-Schutztest
    1. Führen Sie den Amikacin-Schutztest wie in Abschnitt 1, Schritte 4.1-4.3.10 beschrieben durch
  4. Immunfluoreszenzfärbung
    1. Fixierung und Permeabilisierung von Caco-2-Zellen
      1. Cellen fixieren, indem Sie 1 ml 4%-Paraformaldehyd in 1X PBS (siehe Materialtabelle) zu jedem Bohrloch hinzufügen. 10 Minuten bei Zimmertemperatur im Dunkeln bebrüten.
      2. Jeden Brunnen aspirieren und 1 ml 1× PBS zum Waschen der Zellen hinzufügen. Wiederhole diesen Schritt noch zweimal (insgesamt 3 Waschen).
        HINWEIS: Zellen können mehrere Tage in 1x PBS bei 4 °C gelagert werden.
      3. Gib 1 ml 0,1 % Triton-X-100 zu jedem Bohrloch und inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu permeabilisieren.
      4. Aspiratieren Sie die Triton-X-100-Lösung und fügen Sie jedem Bohrloch 1 ml 1× PBS hinzu. Zellen mit 1× PBS für 5 Minuten inkubieren. Wiederhole diesen Schritt noch zweimal (insgesamt 3 Waschen).
    2. Blockieren und Antikörperfärbung
      1. Um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern, bereiten Sie eine Blockierungslösung mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA), 22,52 mg/mL Glycin in 1× PBS + 0,1 % Tween20 (siehe Materialtabelle) vor.
      2. Fügen Sie jedem Brunnen 1 ml Blocklösung hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur.
        HINWEIS: Der Blockschritt kann auch bei 4 °C für 16 Stunden durchgeführt werden.
      3. Aspirieren Sie blockierende Lösung und inkubieren Sie Zellen mit dem Anti-Rabbit E. coli Primärantikörper (siehe Materialtabelle), verdünnt (empfohlene 1:500-Verdünnung) in Blocklösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
        HINWEIS: Die Inkubation mit dem primären Antikörper kann ebenfalls bei 4 °C für 16 Stunden erfolgen.
      4. Primäre Antikörperlösung aspirieren und 1 ml 1× PBS + 0,1 % Tween20 hinzufügen. Zellen in 1× PBS + 0,1 % Tween20 für 5 Minuten inkubieren. Wiederhole diesen Schritt noch zweimal (insgesamt 3 Waschen).
      5. Inkubieren Sie Zellen mit dem Ziegen-Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle), verdünnt (empfohlene 1:1000 Verdünnung) in Blocklösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wickle die Platte in Alufolie, um das Fluorophor vor Licht zu schützen.
      6. Aspirieren Sie die sekundäre Antikörperlösung und fügen Sie 1 mL 1× PBS + 0,1 % Tween20 hinzu. Zellen in 1× PBS + 0,1 % Tween20 für 5 Minuten inkubieren. Wiederhole diesen Schritt noch zweimal (insgesamt 3 Waschen).
    3. Gegenbeizierung und Anbringen des Deckblatts
      1. Um Wirts- und Bakterien-DNA sowie Wirtsaktin zu färben, bereiten Sie eine kombinierte Verdünnung mit 10 mg/mL Hoechst (empfohlene Verdünnung von 1:2000, siehe Materialtabelle) und Rhodamin-Phalloidin (empfohlene Verdünnung von 1:1000, siehe Materialtabelle) in 1× PBS vor.
      2. Gib jedem Brunnen 1 ml Farblösung zu und bebrüte sie 10 Minuten.
      3. Entferne die Farblösung und gib 1 ml 1× PBS zu jedem Brunnen hinzu. Wiederhole diesen Schritt noch einmal (insgesamt 2 Waschen).
      4. Fügen Sie 1 ml 1× PBS hinzu und lassen Sie die Zellen in der Lösung untergetaucht.
      5. Setzen Sie einen Tropfen Montagemedium (siehe Materialtabelle) auf die beschriftete Folie.
      6. Heben Sie vorsichtig den Deckmantel mit einer gebogenen Nadel von der 6-Well-Platte ab und wenden Sie den Deckmantel so, dass die Seite mit den Zellen zur Verkleidung mit dem Montagemedium zeigt.
      7. Legen Sie den Deckdeckel auf das Montagemedium. Stellen Sie sicher, dass das Montagematerial gleichmäßig über den gesamten Deckzettel verteilt ist.
      8. Brüten Sie die montierten Objektträger über Nacht bei Zimmertemperatur im Dunkeln aus.
      9. Versiegeln Sie die Ränder des Deckzettels mit klarem Nagellack und bewahren Sie die Folien bei 4 °C in einer Folienbox auf.
      10. Fotografieren Sie die montierten Proben mit den entsprechenden Kanälen, die den Farbstoffen/Fluorophoren eines Konfokalmikroskops entsprechen.

Ergebnisse

Um die Wirksamkeit der Amikacin-Behandlung bei der Eliminierung extrazellulärer Bakterien zu bewerten und die intrazelluläre Invasion zu visualisieren, wurden Infektionsexperimente mit Caco-2-Zellmonoschichten durchgeführt. Wie in Abbildung 1 dargestellt, führte die Behandlung mit entweder Gentamicin oder Amikacin nach einer Infektion mit E. coli NRG857c (positive Kontrolle) oder E. coli DH5α (negative Kontrolle) zu ähnlichen Invasionsprofilen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Amikacin ebenso wirksam wie Gentamicin bei der Eliminierung von extrazellulären Bakterien ist und die intrazelluläre Bakterienbelastung genau widerspiegelt, was seine Verwendung als alternatives Antibiotikum für Invasionstests unterstützt. Ein Erzielungsbereich von ~4–10 % Erzielung von NRG857c und <1 % für E. coli DH5α gilt als akzeptabel für eine genaue Interpretation von Invasionsphänotypen im Vergleich zu mutierten Stämmen oder anderen klinischen Isolaten, was mit früheren Beobachtungen11 übereinstimmt. Wenn die prozentualen Invasionswerte für die positiven und negativen Kontrollen außerhalb dieses erwarteten Erholungsbereichs liegen, sollten die Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert und der Test wiederholt werden.

Um zu zeigen, dass Amikacin wirksam gentamicinresistente klinische E.-coli-Isolate angreifen kann, wurden parallel Gentamicin- und Amikacin-Schutztests durchgeführt und die Invasionsprofile der Isolate untersucht. Wie in Abbildung 2 dargestellt, führte die Behandlung von gentamicinresistenten Isolaten mit Gentamicin zu sehr unterschiedlichen Erholungswerten, die von 21,52 % bis 2788,50 % reichten. Im Gegensatz dazu reduzierte die Behandlung mit Amikacin die Genesung in allen Isolaten dramatisch, was ihre Wirksamkeit unterstrich und genauere sowie zuverlässigere Invasionsmessungen ermöglichte.

Schließlich wurden Caco-2-Zellen zur Beurteilung des intrazellulären Phänotyps von AIEC während der Invasion mit E. coli NRG857c infiziert. Abbildung 3 zeigt ein repräsentatives Bild einer infizierten Caco-2-Zelle mit Bakterien (grün), die durch Immunfluoreszenz gefärbt sind, Wirtsaktin (rot) und DNA (blau), sichtbar durch Gegenfärbung mit Rhodamin-Phalloidin bzw. Hoechst. 4 Stunden nach der Infektion wird beobachtet, dass NRG857c sich im Zytoplasma repliziert, sich in der Nähe des Zellkerns und innerhalb der Aktingrenzen lokalisiert, was die intrazelluläre Natur dieser Bakterien bestätigt.

figure-results-1
Abbildung 1: Die Zugabe von Gentamicin oder Amikacin zu Caco-2-Zellen, die mit dem AIEC-Stamm NRG857c infiziert sind, führt zu vergleichbaren Invasionsprofilen. Caco-2-Zellmonoschichten wurden mit dem AIEC-Stamm NRG857c und E. coli DH5α bei einem MOI von 10 infiziert. Nach 3 Stunden Infektion wurden die Zellen 1 Stunde lang mit Gentamicin (100 μg/mL) oder Amikacin (240 μg/mL) behandelt, um extrazelluläre Bakterien zu eliminieren. Die Zellen wurden anschließend mit 1 % Triton-X-100 lysiert, und Homogenate wurden seriell verdünnt und auf LB-Agar für die CFU-Enumeration plattiert. Die Invasion wurde als Prozentsatz der wiedergewonnenen Bakterien im Verhältnis zum ursprünglichen Inokulum angegeben. Die Daten stellen drei unabhängige Experimente dar (n = 3); Fehlerbalken zeigen eine Standardabweichung des Mittelwerts an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Amikacin zielt effektiv auf gentamicinresistente E. coli-Stämme ab. Caco-2-Zellmonoschichten wurden mit E.-coli-Stämmen infiziert, die von IBD-Patienten mit einem MOI von 10 isoliert wurden. Nach 3 Stunden Infektion wurden die Zellen 1 Stunde lang mit Gentamicin (100 μg/mL) oder Amikacin (240 μg/mL) behandelt, um extrazelluläre Bakterien zu eliminieren. Die Zellen wurden anschließend mit 1 % Triton-X-100 lysiert, und Homogenate wurden seriell verdünnt und auf LB-Agar für die CFU-Enumeration plattiert. Die Invasion wurde als Prozentsatz der wiedergewonnenen Bakterien im Verhältnis zum ursprünglichen Inokulum angegeben. Die Daten stellen drei unabhängige Experimente dar (n = 3); Fehlerbalken zeigen eine Standardabweichung des Mittelwerts an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Visualisierung der Epithelzellinvasion durch E. coli. Repräsentative konfokale Mikrographographien von Caco-2-Zellen infizierten E. coli NRG857c. Caco-2-Zellen waren 3 Stunden lang infiziert, gefolgt von 1 Stunde Inkubation mit Amikacin (240 μg/mL). Wirtsaktin wurde mit Rhodamin-Phallodin (rot) gefärbt, und Wirts- und Bakterien-DNA wurden mit Hoechst (blau) gefärbt. E. coli (grün) wurde mit einem Anti-Kaninchen-E. coli-Primärantikörper und einem Ziegen-Antikaninchen-Sekundärantikörper Alexa Fluor 488 nachgewiesen. Die Bilder wurden mit einem 63×-Objektiv mit 3× Zoom und einem Leica-Konfokalmikroskop aufgenommen. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 4: Flussdiagramm der Studie. (A) AIEC-Stämme wurden über Nacht gezüchtet, gewaschen und zu Caco-2-Monolayern mit einem MOI von 10 hinzugefügt. Nach 3 Stunden Infektion und 1 Stunde Amikacin-Behandlung wurden die intrazellulären Bakterien durch Plattenverdünnungen in dreifacher Form gesichert und quantifiziert. (B) Infizierte Monoschichten wurden fixiert, mit Antikörpern gefärbt und mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Die Amikacin-Behandlung führt zu minimaler Zytotoxizität in Epithelzellen. Caco-2-Zellen wurden 1 Stunde lang mit Gentamicin (100 μg/mL) oder Amikacin (240 μg/mL) behandelt. Die Zytotoxizität wurde durch Messung der Laktatdehydrogenase, die in das Kulturmedium freigesetzt wurde, bestimmt. Fehlerbalken zeigen eine Standardabweichung des Mittelwerts an (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Der Amikacin-Schutztest ist ein modifizierter Ansatz zur Bewertung der E.-coli-Invasion in Epithelzellen. Mehrere Schritte sind für den Erfolg dieses Tests entscheidend, darunter die Kollagenbeschichtung der Platten, die Aufrechterhaltung der Monoschicht-Integrität und eine effiziente Zelllyse. Caco-2-Zellen sind eine adhärente Zelllinie, die sich an mit Gewebekultur behandeltem Kunststoff anheften und Monoschichtenbilden kann. Während einer Infektion kann jedoch die Verwendung von serumfreiem Medium und wiederholtes Waschen die Zellablösung beeinflussen, was zu einer Unterrepräsentation der bakteriellen Invasion21 führt. Um dies zu beheben, kann das Beschichten von Platten mit extrazellulären Matrixkomponenten, wie Typ-IV-Kollagen, die Zellanhaftung und die Bildung einer stabilen, konfluenten Monoschicht während der Infektion21 fördern. Dies ist wichtig, da gezeigt wurde, dass der AIEC-Stamm LF82 enge Verbindungen während der Invasion stört und eine unvollständige Monoschichtbildung diesen Schritt umgehen kann, was zu verzerrten Ergebnissenführt. Schließlich ist eine effiziente Zelllyse ein weiterer wichtiger Schritt, der die bakterielle Erholung beeinflusst, da unvollständige Lyse Invasivität verschleiern und die Testergebnisse störenkönnte. Um dies zu umgehen, ist es wichtig, das Zelllysat nach der Inkubation mit Triton-X-100 gründlich wieder aufzuhängen.

Neben den technischen Herausforderungen, die zur Variation der Invasionstests beitragen könnten, wurde gezeigt, dass der Anteil des nach der Infektion für den AIEC-Stamm LF82 gefundenen Inokulum zwischen 0,61 und 17,25 % liegt. Diese Variabilität könnte durch das Fehlen bestimmter Umweltsignale beeinflusst werden, wie Gallesalze, Mucin und andere Darmmetaboliten in diesem in vitro Assay, die bekannt sind, zur AIEC-Virulenzbeizutragen 24,25,26. Konkret wurde gezeigt, dass Gallensalze die Expression langer polarer Fimbrien induzieren, die die AIEC-Bindung und -Translokation über M-Zellen27 erhöhen. Andere gastrointestinale Krankheitserreger wie Vibrio und Shigella sind dafür bekannt, ihre Typ-III-Sekretionssysteme als Reaktion auf Galle zu regulieren, um die Epithelzellinvasion zu vermitteln28,29. Die Subkultivierung mit Gallensalzen zur Induzierung der Expression von Virulenzfaktoren ist Standard in Gentamicin-Schutzprotokollen für andere Krankheitserreger, und das Wachstum von AIEC mit diesen Umweltsignalen kann die Invasion stabilisieren und konsistentere Profileerzielen 30,31.

Eine weitere Einschränkung dieses Tests ist, dass die bakterielle Invasion zu einem einzigen Zeitpunkt bewertet wird, was zwar Standard im Feld ist, aber den Invasionsprozess12 wahrscheinlich zu sehr vereinfacht. Die bakterielle Invasion ist ein dynamischer Prozess, der Adhärenz, Internalisierung, intrazelluläre Replikation und Flucht aus der Wirtszelle32 umfasst. Da neuartige Gene, die zur AIEC-Invasion beitragen, schwer zu identifizieren waren, könnte der Einsatz eines einzelnen Zeitpunkt-Tests die Anzahl der zu diesem Prozess beitragenden Geneunterrepräsentiert 12. Zeitverlauf-Invasionstests wurden daher verwendet, um zu bewerten, wie spezifische Gene zur Invasion beitragen, und um die AIEC-Replikation in I-407- und Hep-2-Zellen 8,33 zu untersuchen. Obwohl der Einsatz eines Zeitverlauf-Invasionstests wertvoll ist, um den Beitrag einzelner Gene zur Invasion zu charakterisieren, ist er arbeitsintensiv, insbesondere beim Screening vieler klinischer Isolate. Aus diesem Grund wird ein einzelner Zeitpunkt zur Bewertung der Invasion verwendet.

Außerdem ist der intrazelluläre Lebensstil von AIEC nicht sehr gut charakterisiert. Die meisten Studien verwenden prozentuale Invasion als primäre Anzeige, um Veränderungen in der CFU verschiedener Virulenzfaktor-Deletionsmutanten zu erkennen.14,34. Die Visualisierung infizierter Wirtszellen kann einzigartige Einblicke in die AIEC-Biologie liefern, die bei der Verwendung nur der CFU-Enumeration35 übersehen werden. Daher sollte zur umfassenden Bewertung der Rolle verschiedener Gene bei der Zellinvasion eine Immunfluoreszenzmikroskopie infizierter Zellen parallel zur CFU-Erfassung durchgeführt werden. Dies ist wichtig, da es dazu führen kann, Gene zu identifizieren, die für das endosomale Überleben und Entkommen wirken, das Zytoskelett des Wirts angreifen oder Unterschiede in der bakteriellen Belastung pro Zelle aufweisen, was allein durch die CFU-Wiederherstellung übersehen werden könnte. Es ist wichtig zu beachten, dass mit dem hier beschriebenen Immunfluoreszenz-Färbungsprotokoll zur Erkennung intrazellulärer Bakterien nicht zwischen wirklich internalisierten Bakterien und an der Zelloberfläche haftenden Bakterien unterschieden wird. Ein differentieller Färbungsansatz, bei dem extrazelluläre Bakterien vor der Permeabilisierung mit einem bestimmten sekundären Antikörper markiert und intrazelluläre Bakterien nach der Permeabilisierung gefärbt werden, würde diese Einschränkung beheben und könnte in zukünftigen Studien umgesetzt werden, um diese Populationen eindeutiger zu unterscheiden36.

Die Bedeutung dieser Methode liegt vor allem in der Fähigkeit, multiresistente E. coli-Isolate von IBD-Patienten zu screenen, die eine vielfältigeAntibiotikabehandlung durchlaufen. Gentamicin wird zur Behandlung von Patienten mit früh einsetzendem IBD verwendet und kann zur Behandlung anderer bakterieller Infektionen verabreichtwerden. Das Aufkommen von gentamicinresistenten Isolaten würde die Verwendung des Standardtests ausschließen, was Amikacin zu einer zuverlässigeren Alternative11 macht. Die Verwendung der in diesem Artikel beschriebenen Protokolle ermöglicht eine gründlichere Charakterisierung der AIEC-Infektionsbiologie und hilft, neue Gene zu identifizieren, die zur Invasion beitragen können. Diese Methoden sind im Kontext der bakteriellen Pathogenese und der Forschung zur Wirts-Pathogen-Interaktion von Bedeutung, da sie die Entdeckung neuartiger Virulenzfaktoren, die Charakterisierung des bakteriellen intrazellulären Lebenszyklus und die Untersuchung der während der Infektion anvisierten Wirtswege ermöglichen. Darüber hinaus sind sie breit anwendbar, um andere invasive Krankheitserreger mit In-vitro-Epithelzellmodellen zu untersuchen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Howard Hughes Medical Institute Emerging Pathogens Initiative (K.O., J.N.), Welch Foundation Grant 1-561 (K.O.), Once Upon a Time Foundation (K.O.), NIH grant R35 GM134945 (K.O.), NIH grant NIDDK K08-DK-123316 (J.N.), Burroughs Wellcome Fund Career Awards for Medical Scientists - 1020904 (J.N.) und NIH T32 AI007520 (S.F.).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
75 cm2 GewebekulturkolbenFisher Scientific FB012937
Amikacin-Disulfat Research Products International A20540-25.0
Antibiotisch-Antimykotikum (100x)Gibco15240062
Anti-E.coli AntikörperAbcamab137967
BioLite Mikrotiterplatten - 6 WellFisher Scientific 12-556-004
Bovines SerumalbuminSigma-AldrichA7906
Kollagen I, Rattenschwanz, 100 mgCorning354236
Countess Zellzählkammer-ObjektträgerInvitrogenC10312
DMEM, hohe GlukoseGibco11965118
Fötales bovines SerumCorning35-011-CV
EissigsäureSigma-AldrichA6283
Ultrareines GlycinUSBiologicalG8165
Gegen-Kaninchen-IgG (H + L) gekreuzt-adsorbiertes sekundäres Antikörper, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Hoechst 33342, trihydrochlorid trihydratInvitrogenH3570
Liofilchem MTS Amikacin [AK] 0,016-256 μg/mLFisher Scientific 22-777-704Amikacin MIC Teststreifen
Paraformaldehyd-Lösung, 4% in PBSFisher Scientific J19943.K2
PBS, 1xCorning21-040-CV
Poly-L-Lysin beschichtete sterile deutsche Glasdeckgläser für ZellkulturNeuvitroNC1327375
ProLong Gold Antifade Montierungsmittel InvitrogenP36934
Rhodamin-PhalloidinInvitrogenR415Rot-orange 540/565 nm
Oberflächenbehandelte sterile GewebekulturplattenFisher Scientific FB01292924-Well Platten
Triton X-100 (Elektrophorese)Fisher Scientific BP151-100
TrypanblauInvitrogenT10282
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotGibco25200056
Tween-20Fisher Scientific BP337-100

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