Immunfluoreszenzbasierter Test zur Detektion von nukleären RAD51-Foci als Marker der homologen Rekombinationsreparatur in Eierstockkrebszellen

Zusammenfassung

RAD51-Kernbrennpunkte sind ein Marker für homologe Rekombinationsaktivität (HR). Dieses Manuskript beschreibt eine einfache Immunfluoreszenzmethode zur Erkennung dieser Foci in Krebszellen, was die Bewertung der HR-Funktion ermöglicht und präklinische Untersuchungen der Reaktionen auf DNA-schädigende Wirkstoffe unterstützt.

Zusammenfassung

RAD51 ist ein zentrales Protein im homologen Rekombinationsweg (HR) und für die genaue Reparatur von DNA-Doppelsträngbrüchen (DSBs) unerlässlich. Nach der DSB-Bildung erzeugt die DNA-Endresektion einzelsträngige DNA-Substrate, die die Rekrutierung und Assemblage von RAD51-Nukleoproteinfilamenten an den Schadensstellen erleichtern. Dieser Prozess führt zur Bildung diskreter nukleärer RAD51-Fokuspunkte, die als weithin anerkannte funktionelle Anzeige der HR-Aktivität und als Ersatzmarker für die HR-Kompetenz dienen. Da HR-Defekte bei mehreren Malignitäten, insbesondere bei Eierstock- und Brustkrebs, häufig auftreten, hat sich die Beurteilung der RAD51-Foci-Bildung als wichtiger Ansatz zur Bewertung der DNA-Reparaturkapazität und zur Vorhersage der Reaktion auf DNA-schädigende Therapien erwiesen, einschließlich Platinverbindungen und Poly(ADP-ribose)-Polymerase-(PARP)-Inhibitoren, deren Wirksamkeit stark vom HR-Reparaturstatus beeinflusst wird. Dieses Manuskript beschreibt ein einfaches, zuverlässiges und reproduzierbares, immunfluoreszenzbasiertes Protokoll zur Erkennung und Quantifizierung von RAD51-Kernbrennpunkten in kultivierten Ovarialkrebszellen. Die Methode beinhaltet die Induktion von DNA-Schäden durch ionisierende Strahlung (IR), gefolgt von Fixierung, Immunfärbung mit Antikörpern gegen RAD51 und γH2AX, konfokaler Mikroskopie und manueller quantitativer Analyse von RAD51/γH2AX kolokalisierten Fokussen. Das Protokoll kann unter basalen Bedingungen oder nach genetischen und pharmakologischen Störungen angewendet werden, um deren Auswirkungen auf die HR-Funktion zu bestimmen. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine robuste Induktion von RAD51-Foci in HR-fähigen Eierstockkrebszellen nach DNA-Schäden, während RAD51-Depletion trotz vergleichbarer DSB-Werte die Focibildung deutlich reduziert und so die Assay-Spezifität bestätigt. Insgesamt bietet dieses Protokoll einen robusten und reproduzierbaren funktionellen Test zur Bewertung der HR-Kompetenz mit breiten Anwendungen in der präklinischen und potenziell translationalen Krebsforschung.

Einleitung

DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) gehören zu den schwerwiegendsten Formen von DNA-Schäden, da ungenaue Reparaturen die Genomstabilität beeinträchtigen und zur Tumorentwicklung oder zum Zelltod beitragen^{können 1,2,3}. Um diesen Bedrohungen entgegenzuwirken, nutzen Zellen mehrere DNA-Reparaturwege, darunter die homologe Rekombination (HR), die als der genaueste Mechanismus zur Reparatur von DSBs ^2,4,5 gilt. Im Gegensatz zu fehleranfälligen Reparaturwegen verwendet HR eine homologe DNA-Sequenz als Vorlage, um genetische Informationen an der beschädigten Stelle wiederherzustellen. Folglich funktioniert HR überwiegend während der S- und G2-Phase des Zellzyklus, wenn Schwesterchromatiden als Reparaturvorlagen ^2,5 zur Verfügung stehen. Bemerkenswert ist, dass HR für die genaue Reparatur von DSBs aus endogenen Quellen wie Replikationsstress sowie exogenen Schäden wie ionisierender Strahlung (IR) und DNA-schädigenden Chemotherapeutika^2,5 unerlässlich ist.

RAD51 ist ein zentraler Effektor des HR-Pfads und spielt eine entscheidende Rolle bei der Homologiesuche und der Stranginvasion während der HR-vermittelten Reparatur von DSBs ^2,5. Nach der DSB-Bildung werden die DNA-Enden resektioniert, ein Prozess, der vom MRE11–RAD50–NBS1 (MRN)-Komplex und zugehörigen Faktoren eingeleitet wird und 3′ einzelsträngige DNA-Überhänge erzeugt. Diese einsträngigen Regionen werden zunächst mit Replikationsprotein A (RPA) beschichtet, das die Bildung sekundärer Strukturen verhindert und das Reparaturzwischenprodukt ^4,5,6 stabilisiert. HR wird dann durch die koordinierten Maßnahmen von BRCA1, PALB2 und BRCA2 initiiert, die die Rekrutierung und das Laden von RAD51 auf resektierte DNA erleichtern, RPA verdrängen und die Bildung der RAD51-haltigen nukleoproteinhaltigen Filamente ^4,5,6 fördern. Nach der Montage suchen diese Filamente nach homologen DNA-Sequenzen innerhalb des Schwesterchromatides und katalysieren den Strangaustausch, wodurch eine getreue Wiederherstellung der beschädigten DNA ^4,5,6 ermöglicht wird. Die Ansammlung von RAD51 an DSB-Stellen erscheint mikroskopisch als punktierte Kernbrennpunkte, die durch Immunfluoreszenz 7,8,9,10 nachgewiesen werden können. Da die Bildung dieser Foci eine erfolgreiche Einbindung der HR-Maschinerie widerspiegelt, ist die RAD51-Foci-Analyse zu einem weit verbreiteten funktionalen Ansatz zur Bewertung der HR-Kapazität und der DNA-Reparaturkompetenz in Zellen 7,8,9,10 geworden. Wichtig ist, dass dieser Test die Fähigkeit der Zellen misst, nach DNA-Schäden eine HR-Reaktion auszuführen, anstatt sich ausschließlich auf die Expressionsniveaus von HR-assoziierten Genen oder Proteinen zu verlassen.

Defekte in der Herzfrequenz werden häufig bei Krebs beobachtet, insbesondere bei Tumoren mit Veränderungen in BRCA1, BRCA2, RAD51-Paralogen oder anderen Gene, die an der Herzfrequenz beteiligt sind, und sind besonders häufig bei Eierstock- und Brustkrebs 4,11,12,13,14. Der HR-Mangel hat wichtige therapeutische Implikationen, da er durch das Prinzip der synthetischen Lethalität eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber DNA-schädigenden Wirkstoffen wie der Platintherapie und Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-(PARP)-Inhibitoren verleiht 4,11,11,12,13,14,15 . Daher sind zuverlässige funktionale Assays zur Bewertung der HR-Aktivität sowohl für mechanistische Studien als auch für translationale Forschung entscheidend.

Dieses Protokoll beschreibt einen immunofluoreszenzbasierten Test zur Erkennung und Quantifizierung von nukleären RAD51-Foci nach DNA-Schäden in Eierstockkrebszellen. Der Arbeitsablauf umfasst die Induktion von DNA-DSBs mittels IR, gefolgt von der immunfluoreszenten Detektion von RAD51 und γH2AX sowie der Quantifizierung kolokalisierter Nuklearbrennpunkte mittels Konfokalmikroskopie. Das Protokoll wird mit HR-fähigen OVCAR-8-Zellen und erworbenen PARP-inhibitor-resistenten^{ABT-R2-Zellen}demonstriert und bietet einen reproduzierbaren funktionellen Ansatz zur Bewertung der HR-Aktivität nach der DSB-Entstehung. Obwohl die RAD51-Fokusanalyse weit verbreitet als funktionelles Maß für die HR-Aktivität verwendet wird, konzentrieren sich verfügbare Methoden oft auf spezifische experimentelle Umgebungen und fehlen häufig detaillierte Hinweise zur Integration kontrollierter DNA-Schädeninduktion, Bestätigung der DNA-DBS-Entstehung, Testvalidierungskontrollen und standardisierter bildbasierter Quantifizierung. Darüber hinaus bieten alternative Ansätze zur Bewertung der HR-Funktion, einschließlich genomischer Narbentests, Mutationssignaturen und Gen- oder Proteinexpressionsanalysen, indirekte Messgrößen des HR-Status und bewerten nicht direkt die zelluläre Kapazität, RAD51 an DNA-Schädigungsstellen zu rekrutieren. Reporterbasierte Assays wie DR-GFP bieten direkte Messungen der HR-Aktivität, erfordern jedoch stabile Gentechnik und sind auf viele experimentelle Modelle nicht leicht anwendbar. Daher kombiniert der hier beschriebene Arbeitsablauf IR-induzierte DNA-Schäden mit dualer RAD51/γH2AX-Immunfluoreszenzfärbung, um gleichzeitig die DSB-Bildung zu überprüfen und die RAD51-Rekrutierung für geschädigtes Chromatin zu quantifizieren. Dieser Ansatz bietet eine praktische, biologisch relevante und breit anwendbare Methode zur direkten funktionalen Bewertung der HR-Kompetenz in kultivierten Krebszellen, wobei dabei Prüfkontrollen, Validierungsschritte und standardisierte Foci-Quantifizierungsverfahren integriert werden.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt, einschließlich Herstellerinformationen, Katalognummern und Antikörperverdünnungen. Ein Überblick über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

HINWEIS: Die Eierstockkrebszelllinien OVCAR-8 und ABT^R2 werden in diesem Protokoll verwendet und wurden zuvor beschrieben^{: 15,16,17,18,19,20}. OVCAR-8-Zellen wurden freundlicherweise von Dr. Larry Karnitz (Mayo Clinic) bereitgestellt, der sie ursprünglich von Dr. Dominic Scudiero (National Cancer Institute, NIH) erhielt. Die ABT^R2-Zellenwurden freundlicherweise von Dr. Scott Kaufmann (Mayo Clinic)²⁰ bereitgestellt. ABT^R2 ist eine PARPi-resistente Ableitung des BRCA2.-mutierte Ovarialkrebszelllinie PEO1, die durch Wiederherstellung der BRCA2-Expression Resistenz erwarb. Da die BRCA2-Wiederherstellung die RAD51-Lade- und Herzfrequenzaktivität wiederhergestellt hat, dienen ABT^R2-Zellen als repräsentatives HR-fähiges Modell. Die Identität der Zelllinie wurde anhand der Herkunft der Quelle und festgestellten Merkmalen in der Literatur 15,16,17,18,19,20 bestätigt. Die Experimente wurden mit Niedrigpassagezellen (Passagen 3–12) durchgeführt, die nicht länger als einen Monat nach dem Auftauen in Kultur gehalten wurden. Zelllinien wurden routinemäßig alle 6 Monate mit einem Mykoplasma-Nachweiskit auf Mykoplasma-Kontamination getestet, und alle in dieser Studie verwendeten Kulturen wurden als mykoplasmafrei bestätigt.

VORSICHT: Paraformaldehyd ist giftig und sollte in einer zertifizierten chemischen Abzugshaube hergestellt und behandelt werden, während geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen wird. Menschlich abgeleitete Zelllinien sollten gemäß institutionellen Biosicherheitsverfahren unter Verwendung geeigneter Eindämmungspraktiken behandelt werden. Triton X-100, Montagemedium und Nagellack sollten gemäß den Sicherheitsempfehlungen des Herstellers behandelt werden. IR sollte ausschließlich von geschultem Personal und gemäß institutionellen Strahlenschutzrichtlinien durchgeführt werden. Entsorgen chemische, biologische und strahlungsbezogene Abfälle gemäß lokalen institutionellen und regulatorischen Vorgaben.

1. Zellkultur und Pflege

1. Kulturzellen im Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 Wachstumsmedium wurden mit 8 % fetalem Rinderserum in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ ergänzt.
   HINWEIS: Diese Kulturbedingungen stimmen mit denen überein, die in unseren früheren Studien der OVCAR-8- undABT R2-Zellen 15,16,17,18,19 verwendet wurden. Unter diesen Bedingungen zeigen beide Zelllinien robustes Wachstum und reproduzierbare DNA-Schadensreaktionsphänotypen.
2. Falls gewünscht, führen Sie Perturbationen durch (z. B. Gen-Knockdown/Knockout) unter optimierten experimentellen Bedingungen^15,17.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wird die siRNA-vermittelte Knockdown von RAD51. als repräsentatives Beispiel für Genstörungen vor der Immunfluoreszenzanalyse bereitgestellt.
   1. Bereiten Sie 5 × 10^{6 Zellen in} 180 μL RPMI-1640 Medium vor, ergänzt mit 8 % fetalem Rinderserum.
   2. Fügen Sie 20 μL 20 μM siRNA-Lösung (2 μM siRNA pro Transfektion) hinzu und mischen Sie vorsichtig.
      HINWEIS: Verwenden Sie folgende siRNAs: Nicht-zielgerichtete Kontroll-Luziferase-siRNA (siLUC): 5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′; RAD51 siRNA (siRAD51.): 5′-GGGAUUUGUGAAGCCAAA-3′. Alle siRNAs wurden von Horizon Discovery gekauft.
   3. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 4-mm-Elektroporationscuvette.
   4. Elektroporatzellen verwenden einen BTX ECM 830 Elektroporator mit zwei 10-ms-Impulsen bei 280 V.
   5. Die Zellen werden in das vollständige Wachstumsmedium umgeleitet und unter Standardkulturbedingungen in einer 10 cm großen Schale 24 Stunden lang inkubiert.
   6. Wiederholen Sie die siRNA-Elektroporation unter denselben Bedingungen wie in den Schritten 1.2.1–1.2.4 beschrieben.
   7. Inkubieren Sie die Zellen unter Standardkulturbedingungen in einer 15 cm großen Schale für weitere 48 Stunden.
   8. Säen Sie einen Teil der Zellen für den Immunfluoreszenz-Test aus, wie in Schritt 2 beschrieben. Reservieren Sie die verbleibenden Zellen für die RAD51-Knockdown-Validierung durch Immunoblotting.
   9. RAD51-Knockdown durch Immunoblotting validieren
      1. Lysezellen im eiskalten Lysepuffer enthalten 50 mM HEPES (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Na₃VO₄, 10 mM β-Glycerophosphat und Proteaseinhibitor-Cocktail (1 Tablette pro 10 mL Lysepuffer).
      2. Klären Sie die Lysate durch Zentrifugation bei 18.800 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Übertragen Sie das Supernatant in ein frisches Mikrozentrifugenrohr und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem geeigneten Proteinassay.
      3. Mische eine angemessene Menge Proteinlysat mit einem Laemmli-Puffer von 4× Laemmli, um eine endgültige Konzentration von 1× zu erreichen.
      4. Fügen Sie β-Mercaptoethanol zu einer Endkonzentration von 20 % hinzu und erhitzen Sie die Proben vor SDS-PAGE 12 Minuten lang bei 95 °C.
      5. Gleiche Proteinmengen durch SDS-PAGE zu trennen und Proteine auf eine geeignete Membran für die Immunblotanalyse zu übertragen.
      6. Blockiere die Membran mit 5 % Milch für 30 Minuten bei Zimmertemperatur mit Schütteln.
      7. Waschen Sie die Membran dreimal (jeweils 5 Minuten) mit 1× Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) bei Zimmertemperatur und schütteln Sie die Membran.
      8. Inkubieren Sie die Membran mit einem polyklonalen Anti-RAD51-Antikörper (1:1.000 Verdünnung) oder Anti-ACTIN-Antikörper (1:1000 Verdünnung) bei 4 °C für 16–18 Stunden mit Schütteln.
      9. Wasche die Membran mit 1 × TST (jeweils 5 Minuten) bei Raumtemperatur und schüttle sie.
      10. Inkubieren Sie die Membran mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper (1:10.000 Verdünnung) für 1 Stunde bei Raumtemperatur und schütteln.
      11. Waschen Sie die Membran mit 1× TBST (jeweils 5 Minuten) bei Raumtemperatur und schütteln Sie die immunreaktiven Bänder mit einer geeigneten chemilumineszenz-Detektionsmethode und bestätigen Sie die RAD51-Depletion relativ zu den mit der nicht zielgerichteten Kontroll-siRNA transfektierten Zellen.

2. Zell-Seeding

1. Wenn die Zellen die logarithmische Wachstumsphase erreichen (ca. 70–80 % Konfluenz), aspirieren Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen vorsichtig einmal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um Restserum zu entfernen.
2. Fügen Sie ausreichend 0,25%ige Trypsin–EDTA-Lösung hinzu, um die Zellmonoschicht zu bedecken (z. B. 1–2 ml pro T175-Kolben) und inkubieren Sie bei 37 °C für 2–5 Minuten, wobei die Zellablösung unter dem Mikroskop überwacht wird.
3. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin sofort durch Zugabe eines gleichen Volumens vollständigen Kulturmediums mit FBS.
4. Sammeln Sie die Zellsuspension in ein 15-mL konisches Rohr
5. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit und Konzentration der Zellen mithilfe des Trypan-Blue-Ausschlusses und eines Hämozytometers oder automatisierten Zellzählers vor der Aussaat.
6. Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension in einem vollständigen Wachstumsmedium mit einer Konzentration von 4 × 10⁴ Zellen/ml vor.
7. Seed 200 μL der Zellsuspension in jede Mulde eines 8-Well-Glaskammer-Objektträgers, um eine Enddichte von 8.000 Zellen pro Bohrloch zu erreichen.
8. Inkubieren Sie die Kammer-Objektträger 24 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO₂, um eine Zellbindung zu ermöglichen.
   HINWEIS: Die Anzahl der Zellen, die gesät werden, kann je nach Zelltyp variieren. Bereiten Sie eine überschüssige Zellsuspension vor, die für mindestens einen weiteren Brunnen ausreichend ist, um die Pipettenvariabilität zu berücksichtigen. Säen Sie jede Bedingung doppelt oder mehr, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Wenn eine pharmakologische Modulation der Herzfrequenz gewünscht ist, sollten die Zellen nach der Übernachtung (12–16 Stunden nach der Aussaat) behandelt werden. Die Aussaatdichte sollte bei Bedarf angepasst werden, um sicherzustellen, dass die Zellen zum Zeitpunkt der Behandlung und der nachgelagerten Analyse die passende Konfluenz erreichen, wobei die erwarteten Auswirkungen des pharmakologischen Wirkstoffs auf die Zellproliferation oder -lebensfähigkeit berücksichtigt werden. Da HR überwiegend während der S- und G2-Phasen des Zellzyklus auftritt, sollten Kulturen im logarithmischen Wachstum erhalten bleiben und Überkonfluenz vermieden werden. Für Experimente mit Behandlungen, die den Zellzyklusverlauf verändern können, können EdU-Einbau, DNA-Gehaltsanalyse oder andere Zellzyklusmessungen durchgeführt werden, um die Interpretation der RAD51-Foci-Ergebnisse zu erleichtern. Beziehen Sie in jedes Experiment unbehandelte (–IR) und bestrahlte (+IR) Kontrollgruppen ein, um die Basal- bzw. DNA-bedingte RAD51-Foci-Bildung zu etablieren. Bei der Durchführung von siRNA-vermittelten Störungen werden nicht-zielorientierte Kontroll-siRNA (z. B. siLUC) und zielspezifische siRNA-Bedingungen (z. B. siRAD51) einbezogen. Bei der Antikörperoptimierung werden bei der Antikörperoptimierung empfohlen, um die unspezifische Färbung und Hintergrundfluoreszenz zu beurteilen.

3. Induzierung von DNA-Schäden durch IR

1. Expositions-Zellen auf den Kammer-Slides mit IR bei einer Dosis von 6 Gy²¹ sind, um DNA-DSBs zu induzieren.
2. Bringen Sie die Objektträger sofort zurück in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂.
3. Inkubiere die Zellen 6 Stunden nach der IR.
   HINWEIS: IR wurde mit einem RS-2000 Biological Irradiator geliefert, der mit 160 kV und 25,0 mA (Regalposition 5) betrieben wurde. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur mit einer einzigen 6-Gy-Dosis (ca. 4,8 Gy/min) bestrahlt und sofort in einen 37 °C-Inkubator mit 5 % CO₂ zurückgegeben. Der Bestrahler wurde routinemäßig gemäß den Herstellerempfehlungen kalibriert, und alle Verfahren wurden gemäß den institutionellen Strahlenschutzrichtlinien durchgeführt. Die 6-Stunden-Inkubation nach der IR-Inkubation wurde zuvor festgelegt^{: 15,17,22}. Das optimale Timing kann je nach Zelltyp variieren und sollte für jede Zelllinie optimiert werden.

4. Fixierung und Permeabilisierung

1. Aspirieren Sie das Kulturmedium vorsichtig aus den Brunnen, ohne die Zellen zu stören.
2. Fixiere die Zellen mit frisch hergestelltem 3%-Paraformaldehyd in 1× PBS für 12 Minuten bei Zimmertemperatur.
3. Aspirieren Sie das Fixativ vorsichtig und waschen Sie die Brunnen dreimal mit 500 μL 1× PBS pro Bohrloch.
4. Permeabilizieren von Zellen mit 0,2 % Triton X-100 in 1× PBS für 12 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Wasche die Brunnen dreimal mit 1× PBS.
   HINWEIS: Führen Sie Fixierungs-, Permeabilisierungs- und Waschschritte vorsichtig durch, indem Sie Lösungen entlang der Wand jedes Bohrlochs hinzufügen und entfernen, um die Zellablösung zu minimieren. Sofern nicht anders angegeben, verwenden Sie 500 μL 1× PBS pro Wasch.

5. Blocken

1. Bereiten Sie eine Blockierlösung vor, indem Sie 5 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in 1× PBS auflösen.
2. Inkubieren Sie die Zellen in einer blockierenden Lösung für 60 Minuten bei Raumtemperatur, um die unspezifische Antikörperbindung zu reduzieren.

6. Primäre Antikörperinkubation

1. Entferne die Blockierlösung und wasche die Zellen dreimal mit 1× PBS.
2. Bereiten Sie primäre Antikörper bei geeigneten Verdünnungen in der Blocklösung vor. Rabbit polyklonale Anti-RAD51 (1:1000) und maus-monoklonale antiphospho-Histon H2AX (γH2AX) (1:1000) Antikörper werden verwendet, wobei γH2AX als Marker für DSBs^23,24 dient.
3. Fügen Sie jedem Bohrloch 100 μL verdünnte primäre Antikörperlösung hinzu.
4. Inkubieren Sie die Objektträger bei Raumtemperatur 16–18 Stunden in einer befeuchteten Kammer, um Verdunstung zu verhindern.
   HINWEIS: Die beiden Hauptantikörper können zur gleichzeitigen Färbung in derselben Lösung kombiniert werden.

7. Sekundäre Antikörperinkubation

1. Sekundäre Antikörper bei geeigneten Verdünnungen in Blocklösung vorbereiten. Alexa Fluor 488-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:350) wird verwendet, um RAD51 zu erkennen, und Alexa Fluor 594-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:350) wird zur Erkennung von γH2AX verwendet.
2. Aspirieren Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Zellen dreimal mit 1× PBS.
3. Fügen Sie jedem Bohrloch 100 μL verdünnte sekundäre Antikörperlösung hinzu.
4. Inkubiere die Objektträger 1 Stunde bei Zimmertemperatur im Dunkeln.
   HINWEIS: Die beiden sekundären Antikörper können zur gleichzeitigen Detektion kombiniert werden. Ab diesem Abschnitt führen Sie alle Schritte in einem lichtgeschützten Raum aus, um das Photobleaching zu minimieren.

8. Nukleare Gegenfärbung und Montage

1. Bereiten Sie die Hoechst 33342-Lösung mit einer Verdünnung von 1:1.000 in 1× PBS vor, um die Kerne zu färben.
2. Aspirieren Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie die Zellen einmal mit 1× PBS.
3. Inkubieren Sie Zellen mit verdünnter Hoechst 33342-Lösung für 90 Sekunden bei Raumtemperatur.
4. Aspirieren Sie die Hoechst 33342-Lösung und waschen Sie die Zellen dreimal mit 1× PBS.
5. Entfernen Sie das 1× PBS und lösen Sie die obere Kammer von den Glasträgern und fügen Sie jedem Bohrloch etwa 25 μL Antifade-Halterung hinzu.
6. Platzieren Sie Glasabdeckfolien über die montierten Zellen, um gleichmäßigen Kontakt mit dem Montage zu gewährleisten.
7. Entferne die Luftblasen vorsichtig und versiegele die Ränder mit Nagellack.
   HINWEIS: Die nukleare Gegenfärbung dient als Referenz für Kerne und ermöglicht so eine genaue Lokalisierung und Quantifizierung der nuklearen RAD51- und γH2AX-Brennpunkte.

9. Bildgebung und Quantifizierung von RAD51-Brennpunkten an DSBs

1. Bildfolien werden sofort aufgenommen oder bei 4 °C in einer Diabox im Dunkeln gespeichert, bis die Analyse durchgeführt wird.
   HINWEIS: Um mögliche Signalverschlechterung und Photobleaching zu minimieren, sollten Sie Bilder so früh wie möglich aufnehmen, vorzugsweise innerhalb einer Woche nach der Montage.
2. Aufnahme von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop mit geeigneten Laserlinien und Filtersätzen: Hoechst 33342 (405 nm) für Kerne, Alexa Fluor 488 (488 nm) für RAD51 und Alexa Fluor 594 (561/594 nm) für γH2AX.
3. Führen Sie konfokale Bildgebung mit einem Hochvergrößerungsobjektiv durch, das zur Auflösung subzellulärer Strukturen geeignet ist.
4. Quantifizieren Sie manuell RAD51-Brennpunkte, indem diskrete Kernbrennpunkte gezählt werden, die mit γH2AX kolokalisieren; schließen Brennpunkte aus, die nicht mit γH2AX kolokalisiert sind.
   HINWEIS: Validierung der Antikörperleistung vor der quantitativen Analyse durch Bestätigung der IR-induzierten RAD51- und γH2AX-Kernbrennpunkte in Kontrollzellen sowie des reduzierten RAD51-Signals nach der RAD51-siRNA-Behandlung. Quantifizieren Sie nur diskrete nukleare RAD51-Brennpunkte, die mit γH2AX in Kerne mit intakter Morphologie und klaren Färbungsmustern kolokalisieren; diffuse oder nicht-nukleare Färbung, nicht-kolokalisierte RAD51-Signale, überlappende oder mehrkernige Zellen, mitotische Zellen und apoptotische Zellen ausschließen. Halten Sie innerhalb jedes Experiments identische Bildeinstellungen bei und wenden Sie unter allen Bedingungen einheitliche manuelle Bewertungskriterien an. Analysieren Sie ~50 Kerne pro Bedingung aus mehreren Sichtfeldern für jede biologische Replikation und führen Sie mindestens drei unabhängige biologische Replikationen durch. Melde die Anzahl der RAD51/γH2AX ko-lokalisierten Brennpunkte pro Kern mittels einer entsprechenden statistischen Analyse.

10. Statistische Analyse

1. Quantifizieren Sie RAD51/γH2AX kolokalisierte Brennpunkte aus etwa 50 Kerne pro Bedingung.
2. Präsentieren Sie Daten als Mittelwert ± SD von mindestens drei unabhängigen biologischen Replikaten.
3. Führen Sie statistische Vergleiche mit einem geeigneten statistischen Test durch (z. B. einen ungepaarten zweiseitigen Studenten-t-Test für Zweigruppenvergleiche oder eine Einweg-ANOVA für Mehrgruppenvergleiche)
4. Betrachten wir p. < 0,05 als statistisch signifikant.
5. Führen Sie statistische Analysen und Graphgenerierung mit GraphPad Prism (Version 10.6.1) durch.

Ergebnisse

IR induziert die Bildung von RAD51-Foci an DNA-DSBs in OVCAR-8-Zellen
Zur funktionellen Bewertung der HR-Aktivität wurde die Bildung von RAD51-Foci in HR-fähigen OVCAR-8-Eierstockkrebszellen nach der Induktion von DNA-DSBs durch IR untersucht. Um die Assay-Spezifität festzustellen und zu bestätigen, dass beobachtete Foci echte RAD51-abhängige HR-Ereignisse darstellen, wurden die Zellen entweder mit nicht-zielgerichteter Kontroll-Luciferase-siRNA (siLUC

Diskussion

Die hier beschriebene immunfluoreszenzbasierte Detektion von nukleären RAD51-Foci bietet einen zuverlässigen und funktionalen Ansatz zur Bewertung der HR-Aktivität in kultivierten Ovarialkrebszellen. Im Gegensatz zu genomischen oder transkriptomischen Analysen, die den HR-Status indirekt ableiten, spiegelt die Bildung von RAD51-Foci direkt die Fähigkeit der Zelle wider, die Kern-HR-Maschinerie an Stellen der DNA-DSBs zu rekrutieren und zusammenzusetzen. Daher dient dieser Test als sensib...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10% Polyacylamide gel recipe (Lower gel buffer 20 ml,ddH2O 33.4 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 26.6 mL. 10% APS (fresh) 200 µL  TEMED 70 µL)	Selbst gemacht	NICHT VERFÜGBAR	Auflösungsgel für SDS-PAGE
10% Polyacylamide gel recipe (Upper gel buffer 10 mL, ddH2O 23.6 mL, 30% Acrylamide/Bis-acrylamide (29:1) 6.4 mL 10% APS (fresh) 160 µL  TEMED 40 µL)	Selbst gemacht	NICHT VERFÜGBAR	Stacking-Gel für SDS-PAGE
100 mL Trypsin EDTA 1X, 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA in Sodium Bicarbonate	Corning	25-053-C1	Zum Lösen adhäsiver Zellen während der routinemäßigen Passage und vor der Zellbebrütung verwendet.
10x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio-Rad	1610780	Auf 1× verdünnt und verwendet für Waschschritte, Blocking-Lösung, Antikörperverdünnungen, Fixierung und Permeabilisierung.
10X Running buffer (6 L) Tris 181.8 g +Glycene 864.0 g+SDS 60 g	Selbst gemacht	NICHT VERFÜGBAR	Läuft mit Proteinproben im Gel
10X Transfer (6 L) Tris 181.8 g+ Glycene 864 g	Selbst gemacht	NICHT VERFÜGBAR	Übertragen des Proteins von Gel auf Membran
10x Tris Buffered saline	Bio-Rad	1706435	Puffer
30%  (w/v)Acrylamide ;0.8(w/v)/Bis-acrylamide stock solution (37.5:1)	Ultrapure EC-890	EC-890	Für SDS-PAGE
ABTR2 Zellen	Mayo clinic	NICHT VERFÜGBAR	erworbene PARPi-resistente Ovarialkarzinom-Zellinien
AKT Lysis Buffer Recipe (50 mM HEPES (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF, 30 mM sodium pyrophosphate, 1 mM Na3VO4, 10 mM 2-glycerophosphate, 10 μg/mL leupeptin, 5 μg/mL aprotinin, 5 μg/mL pepstatin, und 20 mM microcystin-LR.)	Selbst gemacht	NICHT VERFÜGBAR	Zelllysepuffer
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	16107000	Als Polymerisationsmittel für Gele verwendetes Oxidationsmittel, das als Radikalstarter verwendet wird
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	Primärantikörper zum Nachweis von γH2AX-Foci. Verwendet bei einer Verdünnung von 1:1000
Anti-Rad51 (Ab-1) Rabbit pAb	Sigma-Aldrich	PC130	Primärantikörper zum Nachweis von RAD51-Kernfoci als Marker für homologe Rekombinationsaktivität. Verwendet bei einer Verdünnung von 1:1000
Bovine serum albumin Protease free	GoldBio	A-420-250	Verwendet zur Herstellung einer Blocking-Lösung (5% BSA in PBS), um die nichtspezifische Antikörperbindung während der Immunfluoreszenz-Färbung zu reduzieren.
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	12003154	Bildgebungssystem
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	ZEISS	Zeiss LSM 780	Immunfluoreszenz-Bildgebung, γH2AX-Foci-Analyse, RAD51-Foci-Quantifizierung, Protein-Co-Lokalisation und 3D-Bildaufnahme
Countess II FL Automatischer Zellzähler	Life Technologies	AMQAF1000	Automatischer Zellzähler
Deckgläser	Cardinal Health	M6045-10A	Über aufgebrachte Proben gelegt, um gefärbte Zellen zu schützen und eine hochauflösende Bildgebung zu ermöglichen.
ECM 830 Square Wave Elektroporationssystem	Hbio-BTX	45-2052	Elektroporationssystem, geeignet für Anwendungen zur Genübertragung in Säugerzellen
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Zu RPMI-1640 (als 8%) hinzugefügt, um das Zellwachstum und die Zellvitalität zu unterstützen.
Glycine	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	Puffer
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	Sekundärantikörper zum Nachweis des γH2AX-Primärantikörpers. Verwendet bei einer Verdünnung von 1:350
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	Sekundärantikörper zum Nachweis des RAD51-Primärantikörpers. Verwendet bei einer Verdünnung von 1:350
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 10.6.1	Statistische Analyse, Grafikerstellung und Datenvisualisierung.
HEPES 1M	Corning	25060-C1	pH-Puffer für den pH-Wert im Bereich von 7,2-7,6
Hoechst 33342-Lösung (20 mM, 5 mL)	Thermo Fisher Scientific	62249	wurde zur Kernfärbung verwendet
Pferderadischenperoxidase-konjugierter Anti-Maus-Immunglobulin G	Cell Signaling Technology	7076S	Sekundärantikörper zum Nachweis des Maus-(β-Aktin)-Primärantikörpers im Western Blot.
Pferderadischenperoxidase-konjugierter Anti-Kaninchen-Immunglobulin G	Cell Signaling Technology	7074S	Sekundärantikörper zum Nachweis des Kaninchen-Primärantikörpers (RAD51) im Western Blot.
Instant non-fat dry milk	Hyvee	G461A323	Blocking-Reagenz
Laemmli Sample Buffer (4×)	Bio-Rad	1610747	Stichprobe-Puffer
Lonza's MycoAlert Mycoplasma Detection Assays	Lonza Bioscience	LT07-218	Zum routinemäßigen Nachweis der Freiheit von Zellkulturen von Mycoplasma-Kontamination verwendet.
Lower gel Recipe is (1 L)(Tris 181.7 g+SDS 4.0 g)PH to 8.8 w/cenc HCl