Ein kosteneffizienter Workflow für Mono- und Multiplex-Immunfluoreszenz in adhärenten zweidimensionalen Zellkulturen auf Glasschnittpräparaten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen kostengünstigen Arbeitsablauf für mono- und multiplex Immunfluoreszenz (IF) von anhaftenden zweidimensionalen Zellkulturen, der die experimentellen Kosten durch preiswerte Glasdecken, Standard-24-Loch-Platten und Niedrigvolumen-Färbungsbedingungen reduziert, wodurch der Antikörpereinsatz minimiert wird, und gleichzeitig einen repräsentativen Ansatz für die Proteinlokalisierung mittels Standard-Fluoreszenzmikroskopie bietet.

Zusammenfassung

Die Immunfluoreszenzmikroskopie (IF) ist eine weit verbreitete Technik zur Visualisierung der Proteinsublokalisierung und -ko-Verteilung mit Einzelzellauflösung, wobei die zelluläre Morphologie und die subzelluläre Organisation erhalten bleiben. Ziel dieses Protokolls ist es, einen praktischen und kostengünstigen Arbeitsablauf für die mono- und multiplex Immunfluoreszenz-Färbung von adhärenten zweidimensionalen Zellkulturen unter Verwendung standardmäßiger Laborartikel vorzustellen. Die Methode basiert auf dem Kultivieren von Zellen auf kostengünstigen Glasdeckgläsern, die in herkömmlichen 24-Loch-Platten platziert werden, und ermöglicht Multiplexing durch die Trennung der Primärantikörper nach Wirtsart, spektral unterschiedliche Fluorophore sowie robuste Kontrollbedingungen, einschließlich Kontrollen ohne Primärantikörper, ohne Antikörper, mit Einzelfärbung und Übersprechkontrollen, um die Interpretierbarkeit der multiplex IF sicherzustellen. Es werden Färbeschritte mit geringem Volumen verwendet, um den Reagenzien- und Antikörpereinsatz zu reduzieren, ohne die Signalqualität zu beeinträchtigen. Dieser Arbeitsablauf erfordert keine speziellen Bildgebungsplatten oder -kammern und ist kompatibel mit routinemäßiger Weitfeld- oder konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Insgesamt bietet dieses Protokoll einen zugänglichen und praktischen Immunfluoreszenz-Arbeitsablauf zur repräsentativen Beurteilung der Proteinsublokalisierung und -ko-Verteilung in adhärenten Zellkulturen. Eine Anpassung an andere Zelltypen oder Antikörper-Panels erfordert zielgerichtete Optimierungen, einschließlich Antikörpervalidierung, Fixierungs- und Permeabilisierungsbedingungen, Fluorophorauswahl sowie Kompatibilität mit Mikroskop und Filtern.

Einleitung

Die Immunfluoreszenz-(IF-)Mikroskopie wird häufig verwendet, um die subzelluläre Lokalisation, die relative Häufigkeit und die Kolokalisation von Proteinen in fixierten Zellen sichtbar zu machen und so molekulare Marker mit der zellulären Morphologie und dem subzellulären Kontext zu verknüpfen^1,2. Im Gegensatz zu Gesamtauslesungen (z. B. Immunblotting) oder dissoziativen Einzelzell-Assays (z. B. Durchflusszytometrie) erhält die IF die räumliche Organisation der Zelle und ist besonders nützlich, um die zellübergreifende phänotypische Heterogenität sowie Veränderungen in der subzellulären Proteindistribution mit Einzelzellauflösung zu bewerten^3,4,5. Da experimentelle Fragestellungen zunehmend die gleichzeitige Analyse mehrerer Marker erfordern, ermöglicht die multiplex IF den parallelen Nachweis von zwei oder mehr Zielstrukturen in derselben Probe, üblicherweise durch Kombination von Primärantikörpern aus verschiedenen Wirtsarten mit spektral unterschiedlichen Fluorophoren⁶ (Abbildung 1), unter Verwendung direkter und/oder indirekter Nachweismethoden (Abbildung 2). Die Multiplexierung bringt jedoch wichtige technische Herausforderungen mit sich, insbesondere Antikörper-Überkreuzreaktivität und spektrale Übersprechen, die die Interpretierbarkeit beeinträchtigen können, sofern sie nicht durch sorgfältige Panelplanung und strikte Kontrollbedingungen adressiert werden^7,8.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, einen praktischen, kostengünstigen Arbeitsablauf bereitzustellen, der breit anwendbar ist für immunfluoreszenzbestätigte Antikörper und für die routinemäßige Bildgebung von adhärenten zweidimensionalen Kulturen optimiert wurde. Die Multiplexing-Strategie basiert auf der Trennung nach Wirtsarten, spektral unterschiedlichen Fluorophoren und Kontrollgruppen, die Hintergrundniveaus und die Färbungsleistung überprüfen^9,10. Indem 12-mm-Glaskovergläser in standardmäßigen 24-Loch-Platten anstelle spezialisierter Kammerobjektträger verwendet werden, vermeidet dieser Arbeitsablauf einen dedizierten, teuren Verbrauchsmaterialtyp und setzt stattdessen auf Materialien, die in den meisten Zellkulturlaboren üblich sind. Der Arbeitsablauf benötigt außerdem deutlich weniger Färbelösung pro Wachstumsfläche (150 µL für ≈1,13 cm², oder ≈133 µL/cm²) im Vergleich zu herkömmlichen Formaten mit Kammerobjektträgern^11,12, die typischerweise 300–500 µL/cm² erfordern, was einer etwa 2- bis 4-fachen Reduktion des Antikörper- und Reagenzverbrauchs pro Fläche entspricht. Demzufolge ermöglicht das Protokoll eine qualitative Mehrfachziel-Analyse der Lokalisation und Ko-Verteilung von Markern mittels Standard-Weitfeld- oder konfokaler Mikroskope sowie zytoskelettaler und nukleärer Gegenfärbungen. Dieser Arbeitsablauf ist für konventionelle, fixierte Zell-Multiplex-IF-Verfahren ausgelegt, die auf der Trennung nach Wirtsarten und spektraler Unterscheidung beruhen, und nicht für iterative oder hochdimensionale Multiplex-Ansätze konzipiert.

Protokoll

Diese Studie umfasste keine menschlichen Probanden oder Tierexperimente. Alle Experimente wurden unter Verwendung der D17-kaninen Osteosarkomzelllinie durchgeführt, einer etablierten Zelllinie, die von einer öffentlichen Zellbank bezogen wurde (Banco de Células do Rio de Janeiro, Kat.-Nr. 0276). Daher war keine ethische Genehmigung erforderlich.

1. Kultur von Zelllinien

1. Hinhangige Zellen unter Standardkulturbedingungen (37 °C, 5% CO₂, befeuchteter Inkubator) in dem für die verwendete Zelllinie geeigneten kompletten Medium kultivieren.
   ANMERKUNG: Als repräsentatives Beispiel werden D17-Hunde-Osteosarkom-Zellen (Banco de Células do Rio de Janeiro [BCRJ], Kat.-Nr. 0276) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS) und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum, kultiviert, bei 70–80 % Konfluenz mit Trypsin-EDTA (Ethylen-diamin-tetraessigsäure) umgesät und innerhalb eines validierten Passagebereichs verwendet (z. B. Passagen 5–20).
2. Vor Experimenten den mykoplasmafreien Status mittels eines validierten Mykoplasma-Detektionsassays bestätigen.

2. Herstellung der 24-Loch-Platte und Glasdecken

HINWEIS: Deckgläser sollten durch Einweichen in 70 %igem Ethanol gereinigt werden (5 min, dreimal wiederholt)×) vor der Sterilisation nach einer der unten beschriebenen Methoden; nach der Sterilisation sollten die Deckgläser bis zur Verwendung in einem geschlossenen Behälter bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.

1. Legen Sie saubere 12-mm-runde Glasdeckgläser in eine Glas-Petri-Schale (oder einen Deckglasbehälter) und autoklavieren Sie sie. Autoklavieren Sie außerdem ein Paar feine Metallspitzzangen.
2. Alternative: Reinigen Sie Deckgläser und Zangen mit 70 %igem Ethanol, lassen Sie sie an der Luft trocknen und entkeimen Sie die Oberfläche durch Bestrahlung mit ultraviolettem (UV) Licht (30 min) innerhalb eines Sicherheitswerksatzes vor der Verwendung. Bewahren Sie sterilisierte Deckgläser bis zur Verwendung in einem geschlossenen Behälter bei Raumtemperatur auf.
3. Verwenden Sie im Sicherheitswerkschrank die sterilen Zangen, um ein steriles Deckglas in jede für die experimentellen Gruppen vorgesehene Vertiefung einer 24-Loch-Gewebekulturplatte zu überführen.
4. Optional: Beschichten Sie Deckgläser bei Bedarf für den verwendeten Zelltyp gemäß Herstelleranweisungen oder etablierten Laborrichtlinien mit haftungsfördernden Beschichtungen.
   HINWEIS: Beschichtungsoptionen (Poly-L-Lysin, Kollagen I oder Fibronectin) und ihre Arbeitskonzentrationen sind in der Materialtabelle aufgeführt. Für die meisten adhärenten Zelllinien, die auf Glas kultiviert werden, sind unbehandelte, sterilisierte Deckgläser ausreichend; da Bestandteile der Beschichtung antigenisch wirken können, sollte die gewählte Beschichtung keine Kreuzreaktionen mit Antikörpern im Panel hervorrufen.
5. Falls die Deckgläser beschichtet wurden, saugen Sie die überschüssige Beschichtungslösung ab, spülen Sie einmal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und lassen Sie die Deckgläser vor der Zellseeding im Sicherheitswerkschrank an der Luft trocknen.

3. Versuchsgruppen

1. Verwenden Sie eine Reihe von Kontrollen, die dem Multiplex-Design angemessen sind.
   HINWEIS: Eine Antikörper-freie Kontrolle (weder primärer noch sekundärer Antikörper) zeigt die intrinsische Autofluoreszenz an, und eine Kontrolle ohne primären Antikörper (sekundäres Antikörper-Cocktail ohne primären Antikörper) bewertet unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers und Hintergrund in allen Kanälen gleichzeitig; da dieses Protokoll ausschließlich spektral getrennte sekundäre Antikörper verwendet, beurteilt diese einzige Kontrolle jeden sekundären Antikörper unabhängig innerhalb seines jeweiligen Kanals und erfüllt damit denselben Zweck wie eine sekundär-allein-Kontrolle pro Fluorophor. Einzel-Färbekontrollen, bei denen jedes Primär–Sekundär-Antikörper-Paar einzeln angewendet wird, überprüfen die Leistungsfähigkeit jedes Antikörpers vor der Multiplex-Kombination und ermöglichen durch Vergleich mit der Multiplex-Bedingung die Beurteilung von Spektralübersprechen für jedes Fluorophor-Paar. Wenn immer möglich, wird eine positive Kontrolle, die das Zielantigen exprimiert, verwendet, um die Leistung des Assays zu bestätigen.

4. Ansäen von Zellen auf Deckgläsern

1. Lösen Sie die Zellen im Sicherheitswerkbank mittels Trypsin (oder einer anderen geeigneten Dissoziationsmethode), neutralisieren und resuspendieren Sie sie in vollständigem Kulturmedium.
2. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler oder einem Hämozytometer.
3. Verdünnen Sie die Zellen auf 6 × 10⁴–1 × 10⁵ Zellen/mL.
4. Geben Sie 0,5 mL Zellsuspension pro Vertiefung (endgültig: 3 × 10⁴–5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) hinzu.
   HINWEIS: Gegebenenfalls kann eine sterile Pipettenspitze verwendet werden, um vorsichtig sicherzustellen, dass die Deckgläser plan auf dem Boden der Vertiefung liegen, wobei Kratzer vermieden werden sollten.
5. Inkubieren Sie die Zellen unter Standardbedingungen (37 °C, 5 % CO₂), bis die Zellen angeheftet sind und die gewünschte Konfluenz oder der experimentelle Zeitpunkt erreicht ist.

5. Zellbehandlung (optional)

1. Wählen Sie den Behandlungszeitpunkt gemäß dem Versuchsdesign. Die Behandlung kann pharmakologische Therapien, Zytokinstimulation, genetische Modifikation zur Induktion oder Herunterregulation der Zielgenexpression oder andere experimentelle Interventionen umfassen, je nach Anwendbarkeit.
2. Kennzeichnen Sie die Vertiefungen, um Kontroll- und behandelte Gruppen zu unterscheiden.
3. Inkubieren Sie für die erforderlichen Zeitpunkte; vermeiden Sie eine Überkonfluenz, da eine Überwucherung den Hintergrund erhöht und die Morphologie beeinträchtigt.
   HINWEIS: Die Zellen sollten vor der Fixierung an der Deckglasoberfläche haften, es sei denn, das Versuchsdesign erfordert eine Fixierung unmittelbar nach der Aussaat.
4. Fügen Sie bei schnell sekretierten Zielstrukturen (z. B. Zytokine) Brefeldin A (BFA) dem Kulturmedium in einer Endkonzentration von 1–10 µg/mL (üblicherweise 5 µg/mL) hinzu und inkubieren Sie 4–6 h bei 37 °C, 5 % CO₂, bevor die Fixierung erfolgt.
5. Entfernen Sie das BFA-haltige Medium und fahren Sie unverzüglich mit der Fixierung fort.

6. Immunfluoreszenzfärbung

HINWEIS: Ab der Fixierung ist keine sterile Technik mehr erforderlich; die Färbung kann auf der Laborbank durchgeführt werden, wobei immer dann, wenn ein VORSICHT-Warnhinweis genanntes Reagenz verwendet wird, ein chemischer Abzug genutzt werden muss. Die Proben dürfen zu keinem Zeitpunkt austrocknen; beim Absaugen bleibt ein dünner Pufferfilm zurück, und die nächste Lösung wird unverzüglich hinzugefügt.

1. Fixierung (eine Option auswählen):
   HINWEIS: Der Fixierungsmittel wird je nach Zielstrukturlokalisation und Empfindlichkeit des Epitops ausgewählt (siehe Diskussion): Paraformaldehyd (PFA) (aus Paraformaldehyd hergestelltes Formaldehyd) eignet sich für die meisten Zielstrukturen und ist kompatibel mit Phalloidin; Methanol kann bestimmte nukleäre/phosphorylierte Epitope verbessern, beeinträchtigt jedoch die F-Aktin-Färbung.
   1. PFA-Fixierung (empfohlen für die meisten Zielstrukturen):
      1. Medium abpipettieren und die Zellen vorsichtig einmal mit Tris-Pufferlösung (TBS) (0,5 mL/Vertiefung) spülen.
      2. Geben Sie 4 % PFA in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) (0,5 mL/Vertiefung) hinzu und inkubieren Sie 10 min bei Raumtemperatur (≈25 °C).
      3. PFA abpipettieren und 3-mal waschen× mit TBS (sorgfältig absaugen; vermeiden, dass die Wells austrocknen).
         HINWEIS: VORSICHT: PFA ist toxisch und möglicherweise krebserregend. PFA-Lösungen stets in einer zertifizierten chemischen Abzugshaube unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe und Augenschutz) handhaben. Eine Inhalation und Hautkontakt vermeiden und Abfälle gemäß den chemischen Sicherheitsrichtlinien der Institution entsorgen.
2. Alternativ Fixierung mit Methanol (nützlich für einige nukleäre Antigene und bestimmte Phospho-Epitope):
   1. Methanol 100 % vorab auf −20 °C.
   2. Geben Sie eiskalte Methanol direkt zu den Zellen (0,5 mL/Vertiefung) und inkubieren Sie 5 min bei −20 °C.
   3. 3 mal waschen× mit TBS (ansaugen, sobald wie möglich; vermeiden, dass die Mulden austrocknen).
      HINWEIS: Nach Methanol-Fixierung ist eine zusätzliche Permeabilisierung möglicherweise nicht erforderlich und sollte für jeden Antikörper/Epitop separat optimiert werden. Die Methanol-Fixierung kann Membranepitope beschädigen und die Färbung mit fluorophor-konjugiertem Phalloidin/F-Aktin beeinträchtigen. VORSICHT: Methanol ist toxisch, flüchtig und hochentzündlich. Im gut belüfteten Bereich oder unter chemischem Abzug arbeiten; geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen; offenem Feuer und Wärmequellen fernhalten. OPTIONALER AUFHALTEPUNKT: Nach der Fixierung Proben bei 4 °C in PBS mit geringer Konzentration eines Fixierungsmittels (z. B. PBS + 0,1 % PFA) bis zu einer Woche lang; die Lagerdauer für jedes Antigen muss validiert werden.
3. Aldehyd-Quenching (optional)
   1. Inkubieren Sie mit 50 mM Glycin in TBS (0,5 mL/Vertiefung) für 5 min bei Raumtemperatur (≈25 °C).
   2. Waschen Sie dreimal× mit TBS + 0,05 % Polysorbat 20
      HINWEIS: Glycin neutralisiert verbleibende freie Aldehydgruppen nach der PFA-Fixierung, wodurch die fixierungsbedingte Autofluoreszenz verringert und die Spezifität der Antikörperanfärbung verbessert wird.
4. Permeabilisierung
   1. Wenn Membranproteine gezielt werden, wird die Permeabilisierung übersprungen und mit Schritt 6.5.1 fortgefahren.
   2. Falls intrazelluläre oder nukleäre Proteine gezielt werden sollen, permeabilisieren Sie mit 0,1–0,3 % nichtionischem Detergens in TBS (0,5 mL/Vertiefung) für 5–10 min bei Raumtemperatur (≈25 °C).
   3. 3× waschen× mit TBS + 0,05 % Polysorbat 20 (TBST)
      HINWEIS: Die Konzentration und Einwirkzeit des Octylphenolethoxylat- nichtionischen Tensids werden an das jeweilige Ziel angepasst; die Angemessenheit wird beurteilt anhand eines korrekten Kompartiment-Signals, erhaltener Morphologie, gut definierter F-Aktin-Strukturen und eines geringen Hintergrunds (siehe Diskussion). Falls Saponin verwendet wird, bleibt es in allen nachfolgenden Antikörper- und Waschpuffern enthalten. VORSICHT: Octylphenolethoxylat-nichtionisches Tensid ist schädlich bei Einatmen oder Hautkontakt und kann Augenreizungen verursachen. Handschuhe tragen und Aerosolbildung vermeiden.
5. Blockierung
   1. Geben Sie 0,5 mL/Loch Blockinglösung (5 % Rinderserumalbumin (BSA) in TBS) und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren (≈25 °C).
   2. Blockierpuffer abpipettieren.
   3. Fahren Sie direkt mit der Inkubation mit dem primären Antikörper fort (nicht waschen).
6. Inkubation mit dem primären Antikörper
   HINWEIS: Die Verdünnungen von primären und sekundären Antikörpern werden empirisch durch Titration bestimmt (siehe Diskussion).
   1. Einzelne oder multiplex Primärantikörper-Panels in Tris-gepufferter Salzlösung mit 0,05 % Polysorbat 20 und 1 % BSA (TBST-BSA) herstellen 1 %) unter Verwendung voroptimierter Antikörperkonzentrationen für jedes Target.
   2. Für die multiplex Immunfluoreszenz kombinieren Sie alle nicht konjugierten primären Antikörper, die gegen unterschiedliche Antigene aus verschiedenen Wirtsarten gerichtet sind (z. B. Maus-anti-Interferon-β (IFN-β) + Kaninchen-anti-p14ARF + Ziege-anti-Aktin) zu einem einzigen Antikörpercocktail.
   3. Hinzufügen 150 µL pro Vertiefung, wobei sichergestellt werden muss, dass die gesamte Deckglasfläche vollständig mit der Antikörperlösung bedeckt ist.
      HINWEIS: Um Verdunstung bei geringen Volumina zu verhindern, wird die Platte in einer befeuchteten Kammer (z. B. einem verschlossenen Behälter mit feuchtem Papier) inkubiert.
   4. Inkubieren Sie 1,5 h bei Raumtemperatur (≈25 °C) oder 12–16 h bei 4 °C.
   5. 3 mal waschen× mit TBST je 3 min bei Raumtemperatur (≈25 °C), nach jedem Waschschritt sofort absaugen.
7. Inkubation mit sekundärem Antikörper (und direkt konjugierten primären Antikörpern, falls zutreffend)
   HINWEIS: Ab diesem Schritt werden die Proben lichtgeschützt aufbewahrt, um eine Photobleiche zu verhindern. Es werden spektral unterschiedliche Fluorophore bei sekundären Antikörpern sowie bei direkt konjugierten primären Antikörpern eingesetzt, um Übersprechen zu minimieren, und artenspezifische, hochgradig kreuzadsorbierte sekundäre Antikörper verwendet, um eine Bindung an nicht-passende primäre Antikörper zu verhindern. Die Gestaltung des Fluorophor-Panels, einschließlich nukleärer und zytoskelettaler Marker, sowie die Kompatibilität mit Anregungs- und Emissionswellenlängen des Mikroskops werden in der Diskussion behandelt.
   1. Sekundäre Antikörper in TBST-BSA 1 %-Lösung mit vorab optimierten Konzentrationen verdünnen. Für die Multiplex-Detektion alle sekundären Antikörper entsprechend der Wirtsarten der verwendeten primären Antikörper (ein sekundärer Antikörper pro Wirtsart) zu einem einzigen Cocktail kombinieren.
   2. Hinzufügen 150 µL pro Bohrung, wobei sichergestellt werden muss, dass die gesamte Deckplatte vollständig bedeckt ist.
   3. Inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur (≈25 °C).
      HINWEIS: Falls das Panel ein oder mehrere direkt konjugierte primäre Antikörper enthält, geben Sie diese zusammen mit dem sekundären Antikörper-Cocktail dazu und verlängern Sie die Inkubationszeit auf 1,5 h bei Raumtemperatur (ca. 25 °C).
   4. 3 mal waschen× mit TBST je 3 min bei Raumtemperatur (≈25 °C), wobei unmittelbar nach jeder Wäsche abgesaugt wird.

7. Kern-Färbung und F-Aktin-Färbung

1. Geben Sie die Kernfärbung mit Hoechst 33342 (1:5000) in TBS verdünnt hinzu und inkubieren Sie 15 min bei Raumtemperatur (≈25 °C), lichtgeschützt. Wenn F-Aktin statt mit einem Anti-Aktin-Antikörper mit Phalloidin markiert werden soll, Phalloidin (1:400) in derselben Lösung zugeben.
2. 3 mal waschen× mit TBST, wobei nach jedem Waschschritt rasch abgesaugt wird (die Mulden dürfen nicht austrocknen).
3. Geben Sie 0,5 mL TBS in jede Vertiefung, um die Deckgläser bis zur Entnahme/Anbringung unter Flüssigkeit zu halten.

8. Abnahme der Deckgläser und Eindecken der Objektträger

1. Während die Deckgläser weiterhin in TBS eingetaucht bleiben, führen Sie die Spitze einer feinen Nadel oder eines Skalpells unter die Kante des Deckglases und heben es vorsichtig an, bis eine Seite teilweise angehoben ist. Greifen Sie das Deckglas mit feinen Pinzetten und entfernen Sie es aus der Mulde.
   HINWEIS: Das Entfernen eines Deckgläschens, wenn es nicht untergetaucht ist, kann dazu führen, dass es aufgrund der Oberflächenspannung fest am Boden der Vertiefung haftet, was das Risiko von Bruch erhöht.
2. Halten Sie die Deckglas mit einer Pinzette und entfernen Sie vorsichtig überschüssiges TBS von den Rändern mit einem Vakuum-Aspirator oder absorbierendem Papier. Vermeiden Sie es, die zellbedeckte Oberfläche zu berühren.
   HINWEIS: Überschüssige Restflüssigkeit sollte vermieden werden, da sie das Einbettungsmedium verdünnen und die Bildklarheit sowie den Kontrast beeinträchtigen kann.
3. Legen Sie die Deckglas-Zellseite nach unten auf eine saubere Glasobjektträger, die einen kleinen Tropfen (≈3 µL) Eindeckmedium.
   HINWEIS: Es kann ein kommerzielles, selbsthärtendes Antifade-Medium oder ein selbst hergestelltes Medium auf Basis von 80 % Glycerin/Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) verwendet werden; Montagen auf Glycerinbasis werden mit klarem Nagellack versiegelt, und nach der Kontrastfärbung werden Medien ohne Kernanfärbung ausgewählt. Hinweise zu Lagerungsbeschränkungen und der Stabilität der Fluorochrome sind in der Diskussion enthalten.
4. Lassen Sie die Objektträger horizontal aushärten für ≈24 h, vor Licht geschützt, vor der Bildaufnahme.

Ergebnisse

Dieses Protokoll ermöglicht die mono- und multiplex Immunfluoreszenz-Färbung von adhärenten, auf Deckgläsern kultivierten Hunde-Tumorzellen, wodurch eine gleichzeitige Visualisierung von nukleären, zytoplasmatischen und zytoskelettalen Markern unter Erhaltung der zellulären Morphologie ermöglicht wird. Die repräsentativen Ergebnisse sind in Abbildung 3. dargestellt.

In erfolgreichen Experimenten zeigten genetisch veränderte D17-Kaninchen-Osteosarkomzellen, die mittels genetischer Manipulation (Abschnitt 5.1) kanines p14ARF und kanines IFN-β exprimierten, starke, räumlich korrekte Fluoreszenzsignale mit geringem Hintergrundrauschen und minimaler unspezifischer Färbung. Bei den p14ARF-exprimierenden Zellen (Abbildung 3A) zeigte die Immunfluoreszenz eine vorwiegend nukleäre Lokalisation, was mit der bekannten subzellulären Verteilung von p14ARF übereinstimmt. Die Verwendung von 0,3 % Octylphenol-Ethoxylat als nichtionisches Tensid zur Permeabilisierung ermöglichte einen effizienten Antikörperzugang zu nukleären Epitopen, während die nukleäre Morphologie und die Integrität des Zytoskeletts erhalten blieben, wie durch eine klare nukleäre Gegenfärbung und sichtbare Aktinstrukturen, dargestellt mit einem Anti-Aktin-Antikörper (orangefarbener Fluorophor), bestätigt wurde.

Bei Zellen, die IFN-β exprimieren (Abbildung 3A), wurde nach Inkubation mit BFA zur Blockade der Proteinausschüttung ein zytoplasmatisches Signal beobachtet, wodurch die intrazelluläre Anreicherung und Nachweis dieses löslichen Zytokins ermöglicht wurde. Unter diesen Bedingungen genügte eine schonendere Permeabilisierung, um den Antikörpern den Zugang zu ermöglichen, ohne eine übermäßige Extraktion zytoplasmatischer Bestandteile zu verursachen. Ein erfolgreicher Nachweis zeichnete sich durch punktförmige bis diffuse zytoplasmatische Fluoreszenz, minimale Kernübersprechung und erhaltene Aktinarchitektur aus.

Suboptimale Ergebnisse wurden beobachtet, wenn wichtige Parameter nicht ordnungsgemäß optimiert wurden. Unzureichende Permeabilisierung führte zu einem schwachen oder fehlenden nukleären p14ARF-Signal, wie unter der nichtpermeabilisierten Bedingung gezeigt (0 % Octylphenolethoxylat-Nonionisches Tensid; Abbildung 3B und Abbildung 1, Zusatzmaterial). Umgekehrt kann eine übermäßige Permeabilisierung (≥0,5 % Octylphenolethoxylat-Nonionisches Tensid oder verlängerte Inkubationszeiten) zu einem teilweisen Verlust der Zytoskelett-Färbung, erhöhter Hintergrundfluoreszenz und beeinträchtigter zellulärer Morphologie führen. Bei Experimenten mit schnell sekretierten Proteinen (z. B. IFN-β) führte das Weglassen von BFA häufig zu einem schwächeren intrazellulären Signal, was auf eine schnelle Sekretion und nicht auf einen Fehler im Protokoll hinweist.

Einzel-Färbekontrollen (Ergänzende Abbildung 2) zeigten ein Signal nur in dem Kanal, der jedem Zielantigen entspricht, was die Spezifität der beobachteten Immunfluoreszenzfärbung untermauert. Negative Kontrollbedingungen, einschließlich Kontrollen ohne Primärantikörper und ohne Antikörper (Ergänzende Abbildung 2), zeigten die erwartete Kernfärbung mit vernachlässigbarem Signal in antikörperabhängigen Kanälen, was auf eine geringe Autofluoreszenz und eine minimale unspezifische Bindung des Sekundärantikörpers hinweist.

Zusammen zeigen diese repräsentativen Ergebnisse, dass das Protokoll die Detektion von Proteinen mit unterschiedlichen subzellulären Lokalisationen ermöglicht, wenn die Fixierung, die Permeabilisierungsstärke und zielgerichtete, auf das jeweilige Target abgestimmte Strategien (z. B. Sekretionsblockade) an die Biologie des Targets angepasst werden. Eine geeignete Optimierung führt zu starker, spezifischer Fluoreszenz mit geringem Hintergrund und erhaltener zellulärer Morphologie, während nicht optimale Bedingungen zu schwächeren oder verrauschten Signalen sowie veränderter Zellstruktur führen.

Abbildung 1: Übersichtsflussdiagramm des mono- und multiplex Immunfluoreszenz-Arbeitsablaufs. Wesentliche Schritte von der Zellkulturpflege bis zur Bildaufnahme, einschließlich der beiden Entscheidungspunkte, die eine zielabhängige Auswahl erfordern: Fixierungsmethode (PFA gegenüber Methanol) und Permeabilisierung (basierend auf der subzellulären Lokalisation des Targets). Ein optionaler experimenteller Eingriff, einschließlich der Vorbehandlung mit Brefeldin A (BFA) bei schnell sekretierten Targetmolekülen, ist als Abzweigung vor der Fixierung dargestellt. Weitere optionale Schritte, die der Übersichtlichkeit halber nicht gezeigt sind (z. B. Aldehyd-Quenching), werden im vollständigen Protokoll beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung von Antikörper-basierten Fluoreszenznachweisstrategien. Beim direkten Nachweis werden primäre Antikörper verwendet, die mit einem Fluorophor konjugiert sind, während beim indirekten Nachweis nicht konjugierte primäre Antikörper zusammen mit sekundären Antikörpern eingesetzt werden, die an ein Fluorophor gekoppelt sind; Letzteres ist die in diesem Protokoll verwendete Strategie. Für Multiplex-Anwendungen müssen beim indirekten Nachweis primäre Antikörper aus verschiedenen Wirtsarten stammen, sodass jeder sekundäre Antikörper gezielt den entsprechenden primären Antikörper erkennen kann, ohne Kreuzreaktivitäten zu zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Multiplex-Immunfluoreszenz von D17-kaninen Osteosarkomzellen. D17-Zellen (5 × 10⁴) wurden auf Deckgläsern in 24-Loch-Platten ausgesät und 10 min bei 25 °C mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Anschließend wurden die Zellen mittels Multiplex-Immunfluoreszenz mit den Primärantikörpern gegen p14ARF (1:200; grün emittierende Fluorophore), gegen Aktin (1:200; orange emittierende Fluorophore) und gegen Interferon-β (IFN-β) (1:200; weitrotemittierende Fluorophore) sowie den entsprechenden Sekundärantikörpern im Verdünnungsverhältnis 1:500 markiert. Die Kerne wurden kontragefärbt. Vor der Detektion von IFN-β wurden die Zellen mit BFA (5 µg/mL, 4 h) behandelt, um die Proteinausschüttung zu blockieren. (A) Die Zellen wurden 10 min bei 25 °C mit 0,3 % nichtionischem Detergens permeabilisiert. (B) Zellen, die ohne Permeabilisierung (0 % nichtionisches Detergens) verarbeitet wurden. Repräsentative Bilder aus zwei unabhängigen biologischen Wiederholungen, jeweils mit zwei technischen Wiederholungen. In dieser Abbildung werden nur die überlagerten Kanäle gezeigt; die einzelnen Kanäle sind in Ergänzende Abbildung 1 dargestellt. Unterschiede in der Färbung sind zwischen den Bedingungen erkennbar, insbesondere für p14ARF (A; Pfeile), ein intranukleäres Target, dessen Signal in der nichtpermeabilisierten Gruppe fehlte (B). Die Bilder A und B wurden unter identischen Einstellungen aufgenommen und verarbeitet (Ergänzende Tabelle 1). Negative Kontrollen sowie Einzelfärbungen, die zu diesem Panel gehören, sind in Ergänzende Abbildung 2 dargestellt. Maßstabsbalken: 100 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 1 (Zusatzmaterial): Einzelne Fluoreszenzkanäle entsprechend Abbildung 3, geordnet nach Markern mit permeabilisierten (linke Spalte) und nicht permeabilisierten (rechte Spalte) Proben. Dargestellte Bedingungen nebeneinander: Hoechst 33342 (A, B), p14ARF (C, D; grün emittierende Fluorophore), Aktin (E, F; orange emittierendes Fluorophor) und IFN-β (G, H; weit-rotes emittierende Fluorophore), zusammen mit den entsprechenden überlagerten Aufnahmen (I, J), die jeweils Abbildung 3A und 3B entsprechen. Pfeile zeigen repräsentative nukleäre Färbung von p14ARF; Ellipsen zeigen repräsentative Färbung von Aktin (E) bzw. IFN-β (G). Der Verlust des nukleären Signals von p14ARF sowie eine suboptimale Markierung von IFN-β und Aktin sind unter nicht permeabilisierten Bedingungen erkennbar. Das in (D; Sternchen) beobachtete Restsignal resultiert aus spektralem Übersprechen benachbarter Fluorophore, was durch dessen Abwesenheit in den entsprechenden Einzelfärbungs- und Sekundärantikörper-Kontrollen bestätigt wird (Abbildung 2 (Zusatzmaterial)). Maßstab: 100 µm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzabbildung 2: Kombinierte Immunfluoreszenz-Kontrollen entsprechend dem Multiplex-Panel in Abbildung 3. Für jede Kontrollgruppe werden einzelne Kanäle (Hoechst 33342, grün emittierende Fluorochrome, orange emittierendes Fluorochrom und weit-rotes emittierende Fluorochrome) zusammen mit der Überlagerung (fünfte Spalte) dargestellt.A–E) Kontrolle ohne Antikörper: Zellen, die ohne primäre oder sekundäre Antikörper verarbeitet wurden. (F–J) Sekundärkontrolle: Zellen, die mit dem Sekundärantikörper-Cocktail in Abwesenheit von Primärantikörpern inkubiert wurden. (K–O) p14ARF-Einzelanfärbungs-Kontrolle (grün emittierende Fluorophore). (P–T) Aktin-Einzelanfärbungskontrolle (orange-emittierender Fluorophor). (U–Y) IFN-β Einzel-Färbungs-Kontrolle (fluoreszierende Farbstoffe mit Emission im fernroten Bereich). Die Einstellungen für Erfassung und Verarbeitung waren identisch mit denen, die in Abbildung 3 verwendet wurden (Zusatz-Tabelle 1). Maßstabsleiste: 100 µm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatz-Tabelle 1: Spezifikationen der Fluoreszenzfilterwürfel und Aufnahmereihenfolge. Die Bilder wurden sequenziell an einem umgekehrten Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop (40×/0,80 Objektiv) unter Verwendung der unten aufgeführten Filterwürfel in der angezeigten Reihenfolge für jedes abgebildete Feld in Abbildung 3, Zusatz-Abbildung 1 und Zusatz-Abbildung 2 aufgenommen. Die Aufnahmen erfolgten als einzelne optische Ebenen (kein Z-Stacking).Die Anregungsintensität wurde mithilfe der Fluoreszenzintensitätsregelung auf den angegebenen Stufen eingestellt, wobei die Einfalllicht-Felddiaphragma-Position für alle Kanäle bei Stufe 6 blieb. Die Kameraeinstellungen (8-Bit-Digitalisierung, 3072×2048 Format, Gamma 1,0) sowie eine feste digitale Schärfungseinstellung waren für alle Kanäle und Darstellungen identisch, einschließlich der Kontrollbilder in Zusatz-Abbildung 2. Eine einheitliche lineare Helligkeits-/Kontrastanpassung wurde für alle Kanäle und Darstellungen zur Visualisierung identisch angewendet. Die Bilder wurden als TIFF exportiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Erweiterte Tabelle 2: Fehlerbehebungshandbuch für häufige technische Probleme im Immunfluoreszenz-Protokoll. Häufige Probleme, wahrscheinliche Ursachen und korrigierende Maßnahmen entlang des Protokolls.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Mehrere Schritte sind entscheidend für die zuverlässige Durchführung dieses auf Deckgläsern basierenden Immunfluoreszenzverfahrens. Alle Arbeitsschritte werden innerhalb des begrenzten Raums einer 24-Loch-Kulturmulde durchgeführt, was die Handhabung vereinfacht, die Probenvorbereitung begrenzt und eine vollständige Benetzung der Deckgläser mit geringen Reagenzvolumina ermöglicht, wodurch der Antikörpereinsatz pro Experiment reduziert wird. Da diese geringen Volumina anfällig für Verdunstung sind, sollten Inkubationen am besten in einer befeuchteten Kammer erfolgen, und die Proben dürfen niemals austrocknen: selbst kurze Austrocknungsphasen erhöhen die Hintergrundfluoreszenz und schädigen die zelluläre Morphologie. Beim Absaugen bleibt ein dünner Pufferfilm auf dem Deckglas zurück, und die nächste Lösung wird unmittelbar hinzugegeben.

Eine geeignete Zellansaatdichte und eine kontrollierte Konfluenz zum Zeitpunkt der Fixierung sind entscheidend, um die Hintergrundfärbung zu minimieren und die Zellmorphologie zu erhalten, da eine Überwucherung die Hintergrundfärbung erhöht und die zelluläre Architektur beeinträchtigt. Ebenso ist eine genaue Kontrolle von Inkubationszeit und -temperatur während des gesamten Verfahrens erforderlich, da beide Faktoren die Fixierungseffizienz, die Antikörperbindung und das Hintergrundsignal beeinflussen^5,13. Wenn sich die Umgebungsbedingungen schwanken, verbessert sich die Reproduzierbarkeit durch die Verwendung eines temperaturgeregelten Inkubators oder Trockenofens, der auf 25 °C eingestellt ist, kombiniert mit einheitlichen Inkubationszeiten über alle Ansätze hinweg.

Die Fixierung ist der erste entscheidende Schritt, da sie die Antigenpräser­vation und die zelluläre Architektur bestimmt⁵. Das Fixativ wird je nach Ziellokalisation und Empfindlichkeit des Epitops ausgewählt. PFA wird für die meisten membranassoziierten, zytoplasmatischen, nukleären und zytoskelettalen Zielstrukturen empfohlen, da es die Architektur erhält, die Antigenverteilung bewahrt und mit der auf Phalloidin basierenden F-Aktin-Färbung verträglich ist. Methanol kann für bestimmte nukleäre Antigene bevorzugt werden, die nach Vernetzungsfixierung schlecht nachweisbar sind, insbesondere Phospho-Epitope oder aldehydempfindliche Epitope; es beeinträchtigt jedoch die Membranintegrität, extrahiert lösliche Proteine und stört die Phalloidin/F-Aktin-Färbung. Die Verträglichkeit sollte für jedes Zielantigen validiert werden^13,14,15,16. Für lösliche Zytokine und andere schnell sekretierte Proteine bewahrt die PFA-Fixierung in Kombination mit einer BFA-Vorbehandlung das intrazelluläre Signal vor der Fixierung: BFA blockiert den Proteinentransport vom endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat und fördert so die intrazelluläre Anreicherung sekretierter Proteine, wodurch ihr Nachweis mittels Immunfluoreszenz ermöglicht wird. Wenn Zielstrukturen mit widersprüchlichen Fixierungsanforderungen gleichzeitig detektiert werden müssen, ist eine empirische Optimierung erforderlich. Glyoxal, ein kleines Dialdehyd, wurde als Alternative zu PFA beschrieben, das eine schnellere Vernetzung, verbesserte Antigenpräser­vation sowie Verträglichkeit mit Immunfluoreszenz und Super-Resolution-Mikroskopie bietet; wir haben keine direkte Erfahrung mit der Glyoxal-Fixierung und stellen sie hier als literaturbasierte Option vor^17,18.

Nach der Fixierung ermöglicht eine geeignete Permeabilisierung den Antikörpern den Zugang zu intrazellulären und nukleären Epitopen, während die strukturelle Integrität erhalten bleibt⁵. Unzureichende Permeabilisierung führt typischerweise zu einem schwachen oder fehlenden Signal, trotz intakter Morphologie, was auf einen eingeschränkten Antikörperzugang hinweist; dagegen extrahiert eine übermäßige Permeabilisierung lösliche Proteine, stört die Membranen, führt zum Verlust der Zytoskelett-Färbung und erhöht die Hintergrundfärbung. Die Art, Konzentration und Inkubationszeit des Detergens müssen daher an das jeweilige Zielmolekül angepasst werden. Eine ausreichende Permeabilisierung kann anhand von vier Kriterien beurteilt werden: (i) spezifisches Signal im erwarteten subzellulären Kompartiment; (ii) erhaltene Morphologie mit intakten nukleären und zytoplasmatischen Grenzen, sichtbar durch Färbung mit Hoechst 33342 bzw. Phalloidin; (iii) gut definierte F-Aktin-Färbung, da unscharfe oder fehlende Zytoskelett-Signale auf eine Überpermeabilisierung hindeuten; und (iv) geringer Hintergrund in den negativen Kontrollen. Werden diese Kriterien nicht erfüllt, werden Konzentration und/oder Inkubationszeit des nichtionischen Detergens Octylphenol-Ethoxylat empirisch angepasst. Wenn membranassoziierte und intrazelluläre Antigene in einem einzigen Panel kombiniert werden, bewahren mildere Bedingungen (niedrigere Detergenskonzentration, kürzere Inkubation) die Membranepitope, während gleichzeitig ein intrazellulärer Zugang ermöglicht wird; hier ist eine Zeitreihe, beginnend bei 5 min und schrittweise erhöht, hilfreich. Falls stattdessen Saponin verwendet wird, muss es in allen nachfolgenden Antikörper- und Waschpuffern beibehalten werden, da seine permeabilisierende Wirkung umkehrbar ist.

Antikörperkonzentrationen werden empirisch durch Titration bestimmt, anstatt allgemeine Empfehlungen zu übernehmen. Ein praktischer Ansatz besteht aus einer seriellen Verdünnungsreihe, die mindestens 3–4 Konzentrationen oberhalb und unterhalb der vom Hersteller empfohlenen Verdünnung umfasst (z. B. 1:50, 1:100, 1:200 und 1:400 bei einer empfohlenen Verdünnung von 1:200), angewendet auf replizierte Deckgläser unter identischen Bedingungen. Jede Verdünnung wird hinsichtlich der spezifischen Signalintensität im erwarteten Kompartiment bewertet; des Verhältnisses von Signal zu Hintergrund, das durch Vergleich der gefärbten Proben mit der entsprechenden Kontrolle ohne Primärantikörper und des sekundären Hintergrunds mit der Kontrolle ohne Antikörper ermittelt wird; sowie der Erhaltung der Morphologie. Die niedrigste Konzentration, die ein starkes, spezifisches Signal mit minimalem Hintergrund liefert, wird ausgewählt. Ein anhaltend hoher Hintergrund kann häufig durch weitere Titration, verlängertes Blockieren oder strengere Waschbedingungen verringert werden, während ein schwaches Signal auf übermäßige Fixierung, suboptimale Antikörperkonzentration, das Versagen des Primärantikörpers, sein Ziel-Epitop zu erkennen, eine Inkongruenz zwischen dem sekundären Antikörper und der Wirtsart des Primärantikörpers (z. B. ein Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, angewendet auf einen mausstämmigen Primärantikörper) oder einen Verlust des Fluorophorsignals durch Zerfall des sekundären Antikörpers infolge von Ablauf des Verfallsdatums oder unsachgemäßer Lagerung – insbesondere wiederholte Lichteinwirkung – zurückzuführen sein. Falls kein Signal bei allen Verdünnungen nachweisbar ist, empfiehlt es sich, die Inkubationszeit des Primärantikörpers zu verlängern oder auf eine Übernachtkultur bei 4 °C umzusteigen, den Antigenausdruck in der Zelllinie zu bestätigen, die Verträglichkeit des Antikörpers mit den Fixierungs- und Permeabilisierungsbedingungen zu überprüfen, die Charge sowie Lagerung und Verfallsdaten der primären und sekundären Antikörper zu kontrollieren, sicherzustellen, dass das Mikroskop über geeignete Anregungs- und Emissionsfilter für das verwendete Fluorophor verfügt, und, falls das Problem weiterhin besteht, einen alternativen Klon zu testen. Bei der Herstellung der Arbeitslösungen ergibt sich das benötigte Cocktailvolumen aus der Anzahl der Vertiefungen multipliziert mit 150 µL zuzüglich etwa 10 % Überschuss, um Pipettierverluste auszugleichen; das erforderliche Volumen an jedem Antikörper beträgt dieses Gesamtvolumen geteilt durch den jeweiligen Verdünnungsfaktor (z. B. 825 µL ÷ 200 = 4,13 µL bei einer 1:200-Verdünnung), der Rest wird mit TBST–BSA 1 % aufgefüllt. Dieselbe Berechnung gilt für den sekundären Cocktail, wobei der entsprechende Verdünnungsfaktor eingesetzt wird.

Die Leistungsfähigkeit der Multiplexing-Analyse hängt letztlich von der Gestaltung des Fluorophor-Panels ab. Die Fluorophore, die den primären Zielstrukturen, der nukleären Gegenfärbung und dem Zytoskelett-Marker zugewiesen sind, müssen so abgestimmt werden, dass spektrale Überlappungen oder Signalverdopplungen vermieden werden, und das Bildgebungssystem muss die Anregung und Detektion jedes ausgewählten Fluorophors unterstützen^9,10; die Anregungs- und Emissionsbereiche für jeden Filterblock sind in Ergänzende Tabelle 1 angegeben, wodurch ein direkter Vergleich der spektralen Verträglichkeit innerhalb des Panels ermöglicht wird. Anwender, die dieses Panel an andere Fluorophore anpassen, sollten nach Möglichkeit Kombinationen wählen, die eine minimale Überlappung benachbarter Kanäle aufweisen, und vor der Kombination der Zielstrukturen die Abwesenheit von Übersprechen in Einzelfärbungs-Kontrollen überprüfen, wie hier durchgeführt. Restsignal, das auf koexistierende Fluorophore zurückzuführen ist, wurde in allen erfassten Kanälen des Multiplex-Panels beobachtet (Ergänzende Abbildung 1), fehlte jedoch in den entsprechenden Einzelfärbungs- und nur mit Sekundärantikörpern behandelten Kontrollen (Ergänzende Abbildung 2), was auf spektrales Übersprechen durch die breitbandigen Filter-Sets hinweist, die bei der Weitfeld-Aufnahme verwendet wurden (das potenziell durch konfokale, laserbasierte Anregung reduziert werden könnte). Aufgrund der räumlichen Trennung zwischen der nukleolaren Lokalisation von p14ARF und der filamentösen/zytoplasmatischen Verteilung von Aktin und IFN-β beeinträchtigt dieses Übersprechen nicht die Interpretation der p14ARF-Lokalisation im Multiplex-Panel. Dieser Arbeitsablauf basiert auf herkömmlichem, fluorophorbasiertem Multiplexing, bei dem die Anzahl gleichzeitig auflösbarer Zielstrukturen durch die verfügbaren Wirtsarten für Antikörper und spektral unterscheidbare Fluorophore begrenzt ist. Multiplexing höherer Ordnung kann durch zyklische Immunfluoreszenz oder spektrale Bildgebung erreicht werden, die eine wiederholte Färbung/Ausbleichen beziehungsweise lineare Entmischung überlappender Fluorophore ermöglichen, erfordern jedoch spezielle Geräte und Software, die hier nicht behandelt werden^19,20.

Das Eindeckmedium beeinflusst sowohl die Bildqualität als auch die Signalstabilität. Ein handelsübliches selbsthärtendes Antifade-Medium oder alternativ als selbst hergestellte Variante 80 % Glycerin in PBS (ohne Antifade, ohne Selbsthärtung) kann verwendet werden; selbst hergestellte Glycerin-basierte Präparate werden mit klarem Nagellack versiegelt, um Austrocknung und Bewegung des Deckglases zu verhindern. Nach einer nuklearen Kontrastfärbung werden Medien ohne nukleare Farbstoffe gewählt. Die Bildaufnahme sollte idealerweise unmittelbar nach der Aushärtung erfolgen. Falls eine sofortige Bildgebung nicht möglich ist, können die ausgehärteten Objektträger bis zu 2–4 Wochen bei 4 °C oder bis zu 6 Monate bei −20 °C im Dunkeln aufbewahrt werden. Dabei ist zu beachten, dass hochphotolabile Fluorophore (z. B. grün emittierende Fluorophore) mit der Zeit auch unter optimalen Lagerbedingungen an Signalintensität verlieren. Handelsübliche Antifade-Medien erhöhen die Stabilität der Fluorophore deutlich im Vergleich zu selbst hergestellten Glycerin-basierten Medien; bei Verwendung letzterer wird dringend empfohlen, die Aufnahme innerhalb von 24–48 Stunden durchzuführen. Klarer Nagellack ist mit den meisten Fluorophoren verträglich und beeinträchtigt die Signalstabilität nicht wesentlich, sofern vor der Lagerung mindestens 30 Minuten Dunkelhärtung zugelassen werden.

Ab dem Fixierungsschritt ist sterile Technik nicht mehr erforderlich, und die Färbung kann am Laborplatz durchgeführt werden, wobei ein zertifizierter chemischer Abzug für alle Reagenzien, die mit VORSICHT gekennzeichnet sind, vorbehalten bleibt. D17 und andere tumorassoziierte Zelllinien werden gemäß den institutionellen Biosicherheitsrichtlinien für Risikogruppe 1 oder 2 behandelt, je nach Anwendbarkeit. Alle Materialien, die mit kultivierten Zellen, Deckgläsern, Spitzen, Medium und flüssigen Abfällen in Kontakt kommen, werden vor der Entsorgung dekontaminiert: Flüssige Abfälle werden mit Bleichmittel inaktiviert, um eine Endkonzentration von 10 % für mindestens 30 Minuten zu erreichen, und feste Abfälle werden in geeigneten Behältern für biologische Abfälle entsorgt. Chemische Abfälle, die PFA, Methanol oder den nichtionischen Tensid Octylphenolethoxylat enthalten, werden getrennt gesammelt und gemäß den institutionellen chemischen Sicherheitsvorschriften entsorgt.

Obwohl dieser Arbeitsablauf allgemein anwendbar konzipiert ist, sollte er besser als anpassungsfähig an zielabhängige Gegebenheiten und nicht als starres, universelles Verfahren betrachtet werden; eine erfolgreiche Anwendung hängt vom Verständnis des Forschers für die Lokalisation, Löslichkeit, Epitop-Zugänglichkeit und Empfindlichkeit des jeweiligen Antigens gegenüber Fixierung und Permeabilisierung ab. Zwei Einschränkungen sollten betont werden. Erstens basiert die hier vorgenommene Beurteilung der Färbung auf einer qualitativen Einschätzung, die sich an negativen Kontrollen und der erwarteten subzellulären Lokalisation orientiert, und nicht an einer formalen Quantifizierung des Signal-Rausch-Verhältnisses; dementsprechend spiegelt die hier berichtete Konsistenz eine reproduzierbare qualitative Färbung über mehrere Wiederholungen und Kontrollbedingungen wider und nicht eine quantitativ validierte Leistung. Ein zusammenfassender Leitfaden zur Fehlerbehebung, der häufige Probleme, wahrscheinliche Ursachen und korrigierende Maßnahmen auflistet, ist in Zusätzliche Tabelle 2 enthalten. Labore, die quantitative Auswertungen benötigen, können Open-Source-Software zur Bildanalyse verwenden, um Mittelwert-Messungen, Hintergrundsubtraktion, die quantitativen Analysen basierend auf definierten Regionen von Interesse (Region of Interest, ROI) sowie Intensitätsprofile zu erstellen²¹. Zweitens stammen die repräsentativen Daten von einer einzigen adhärenten Hunde-Tumorzelllinie (D17), sodass eine Übertragung auf andere Zelltypen, Arten oder Antigenkombinationen eine zielgruppenspezifische Neuparametrierung der Bedingungen für Fixierung, Permeabilisierung und Antikörper erfordert.

Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen flexiblen und kostengünstigen Arbeitsablauf für mono- und multiplex Immunfluoreszenz in adhärenten zweidimensionalen Kulturen, der einen geringen Reagenzverbrauch mit einer gleichmäßigen Färbungsleistung auf Standard-Laborgeräten kombiniert und gleichzeitig gezielte, zielmolekülabhängige Anpassungen ermöglicht.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
24-Loch-Zellkulturplatten	Corning	3524	Besiedlung und Färbung von Deckgläsern
Antibiotikum-Antimykotikum	Gibco	15240062	Verhindert bakterielle und pilzliche Kontaminationen in der Zellkultur.
Antikörperverdünnungslösung (TBST-BSA 1 %)	Eigenherstellung	—	Für 10 mL: 2 mL der 5 %igen BSA-Blockierungslösung + 5 µL Tween-20 + 7,995 mL TBS 1x (Arbeitslösung) auf ein Endvolumen von 10 mL (endgültig: 1 % BSA, 0,05 % Tween-20 in TBS; pH 7,6). Frisch herstellen; bei Lagerung bei 4 °C vor Kontamination schützen und innerhalb einer Woche verwenden.
Blockierungslösung	Eigenherstellung	—	Für 10 mL: 0,5 g BSA in 10 mL TBS 1x (1 mL TBS 10x-Stammlösung + 9 mL destilliertes Wasser) lösen; pH 7,6. 30-minütige Inkubation bei 25 °C; frisch herstellen.
(5 % BSA in TBS)
Brefeldin A	Sigma-Aldrich	B7651	5 µg/mL; 4-stündige Vorbehandlung zur Hemmung der Proteinausschüttung vor der Zytokindetektion.
BSA (Rinderserumalbumin)	Sigma-Aldrich	A7906	5 % in TBS zur Blockierung; 1 % in TBS + 0,05 % Tween-20 als Antikörperverdünnung.
Kollagenbasiertes Reagenz (Beschichtung von Deckgläsern, optional)	Corning	354231	Typ-I-Kollagen aus Rinderhaut; auf 50 µg/mL in 0,01 N HCl verdünnt; appliziert mit 5–10 µg/cm² (≈100 µL/Loch); 1 h bei Raumtemperatur (≈25°C) inkubieren; vor der Zellbesiedlung mit PBS abspülen.
Deckgläser, Glas, rund, 12 mm	Knittel Glass	100013	Untergrund für adhärente Zellkultur und Färbung.
D17-Canine Osteosarkomzelllinie	Banco de células do Rio de Janeiro	276	Repräsentatives Zellmodell; wird in DMEM mit 10 % FBS und Antibiotikum-Antimykotikum kultiviert; bei 37 °C, 5 % CO2 gehalten.
(BCRJ)
Deionisiertes/destilliertes Wasser	Eigenherstellung	—	Pufferherstellung.
DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eaglesches Medium)	Gibco	12100-046	Vollständiges Medium für die Zellkultur.
Äthanol	Supelco	1.00983	Desinfektion von Deckgläsern und Pinzetten.
Fötales Rinderserum	Sigma-Aldrich	F7524	Zusatz im Zellkulturmedium.
(FBS)
Fibronectin	Gibco	33016015	Glykoprotein der extrazellulären Matrix; auf 0,0125 mg/mL im Zellkulturmedium verdünnt; appliziert mit 100 µL/Loch und 1 h bei Raumtemperatur (≈25°C) vor der Zellbesiedlung inkubiert.
Feinspitzen-Metallpinzette	Verschiedene	—	Handhabung von Deckgläsern.
Fluoreszenzmikroskop	Leica Microsystems	DMi8	Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop DMi8 (Leica Microsystems), Objektiv HC PL FLUOTAR 40×/0,80 DRY; kompatibel mit den Fluorophoren im Panel (AF488, AF555, AF647, Hoechst).
Glasobjektträger	Bioslide	—	Montage gefärbter Deckgläser zur Bildgebung.
Glas-Petrischale oder Deckglasbehälter	Verschiedene	—	Autoklavieren/Lagern von Deckgläsern.
Glycin	Sigma-Aldrich	8.16E+09	Für 10 mL einer 50 mM-Lösung: 37,5 mg Glycin in 10 mL TBS 1x lösen; pH 7,6. 5 min bei 25 °C; optionaler Schritt zur Aldehyd-Quenchung nach der Fixierung, vor der Permeabilisierung; frisch herstellen.
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Für 10 mL Arbeitslösung: Stammlösung 1:5000 in TBS verdünnen. Kerngegenfärbung; lichtgeschützt inkubieren; frisch herstellen.
Befeuchtete Kammer	Verschiedene/Eigenherstellung	—	Für die Inkubation mit Antikörpern; alternativ aus einer verschließbaren Kunststoffbox mit angefeuchtetem absorbierendem Papier hergestellt.
ImageJ	Open source (NIH)	—	Wird für die Bildanalyse nach der Aufnahme verwendet.
Software zur Bildaufnahme	Leica Microsystems	LAS X 3.7.3	Wird zur Bildaufnahme am Leica DMi8 verwendet.
Methanol	Merck	1.06009	Alternative Fixierung (für nukleäre Antigene/Phospho-Epitope); auf −20 °C vorgekühlt, 5-minütige Inkubation; kann die Phalloidin/F-Aktin-Färbung beeinträchtigen.
Einbettmedium	Sigma-Aldrich	G2289	Für 10 mL: 8 mL Glycerin + 2 mL PBS, pH 7,6, gründlich mischen. Keine Antifade-Eigenschaften und härtet nicht selbstständig aus. Deckglasränder mit Nagellack versiegeln, um Austrocknung und Verschiebung zu verhindern; Objektträger bei 4 °C lichtgeschützt lagern und zeitnah abbilden, um Photobleaching zu minimieren.
(Glycerinbasiert)
Einbettmedium (ProLongTM Glass)	Invitrogen	P36984	Enthält Antifade-Reagenzien und härtet innerhalb von ca. 24 h bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, zu einer dauerhaften Einbettung aus (keine Versiegelung mit Nagellack erforderlich). Objektträger bei 2–8 °C lichtgeschützt lagern, bis zur Bildgebung.
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Ionenbestandteil des TBS-Puffers; erhält die physiologische Osmolarität zur Erhaltung der Zell- und Gewebemorphologie während der Wasch- und Antikörperinkubationsschritte.
Kanüle (feine Nadel, z. B. 25–27G)	Verschiedene	—	Wird als Hebel verwendet, um das Deckglas vorsichtig vom Boden des Lochs zu lösen, ohne die Zellschicht zu beschädigen.
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	Für 10 mL: 0,4 g Paraformaldehydpulver in 8 mL PBS lösen, mit einigen Tropfen 1N NaOH auf 60–65 °C erhitzen, bis die Lösung klar ist, abkühlen lassen, pH auf 7,4 einstellen und mit PBS auf 10 mL auffüllen; vor der Verwendung durch einen 0,2 µm-Filter filtrieren. Frisch herstellen oder portionieren und bei −20 °C lagern, wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen vermeiden.
Phalloidin, mit Fluorophor konjugiert	Invitrogen	Abhängig von der gewählten Fluoreszenz	Für 10 mL Arbeitslösung: Stammlösung gemäß Herstellerangaben 1:400 in TBS, pH 7,6, verdünnen. Alternative Markierung des Cytoskeletts/F-Aktin; frisch herstellen, lichtgeschützt.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich	P4474-1L	Isotonischer Phosphatpuffer (pH 7,4); erhält die physiologische Osmolarität zur Erhaltung der Zellmorphologie während der Fixierungs- und Waschschritte.
(PBS)
Poly-L-Lysin (Deckglasbeschichtung, optional)	Sigma-Aldrich	P8920	Synthetisches polykationisches Beschichtungsreagenz, das die elektrostatische Zelladhäsion verbessert; verwendet mit 0,1 mg/mL in destilliertem Wasser; ausreichende Menge, um die Oberfläche des Deckglases zu bedecken; 30 min bei 25 °C vor der Zellbesiedlung inkubieren.
Erster Antikörper, anti-Aktin (Ziegen-Wirt)	Santa Cruz Biotechnology	SC-1615	Anti-Aktin-Antikörper; polyklonal, nicht konjugiert, nachgewiesen mit sekundärem Anti-Ziegen-Antikörper. Verwendet in einer Arbeitsverdünnung von 1:200.
Erster Antikörper, anti-IFN-β (Maus-Wirt)	Aviva Systems Biology	OAPB00536	Anti-IFN-β-Antikörper; polyklonal, nicht konjugiert, nachgewiesen mit sekundärem Anti-Maus-Antikörper. Verwendet in einer Arbeitsverdünnung von 1:200.
Erster Antikörper, anti-p14ARF (Kaninchen-Wirt)	Calbiochem	PC409	Anti-p14ARF-Antikörper; polyklonal, nicht konjugiert, nachgewiesen mit sekundärem Anti-Kaninchen-Antikörper. Dieses Produkt wurde eingestellt; bei geplanter Arbeit an diesem Ziel muss ein neuer Antikörper validiert werden. Verwendet in einer Arbeitsverdünnung von 1:200.
Sekundärer Antikörper, anti-Kaninchen, mit Alexa Fluor 488 konjugiert	Thermo Fischer Scientific	A32731TR	Anti-Kaninchen-AF488-konjugierter Antikörper. Verwendet in einer Arbeitsverdünnung von 1:500.
Sekundärer Antikörper, anti-Ziege, mit Alexa Fluor 555 konjugiert	Thermo Fischer Scientific	A-21432	Anti-Ziege-AF555-konjugierter Antikörper. Verwendet in einer Arbeitsverdünnung von 1:500.
Sekundärer Antikörper, anti-Maus, mit Alexa Fluor 647 konjugiert	Thermo Fischer Scientific	A-21235	Anti-Maus-AF647-konjugierter Antikörper. Verwendet in einer Arbeitsverdünnung von 1:500.
Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS), 10x-Stammlösung	Eigenherstellung	—	Für 100 mL: 6,06 g Tris-Basis und 8,77 g NaCl in 80 mL destilliertem Wasser lösen; pH mit konzentrierter HCl auf 7,6 einstellen; auf Endvolumen von 100 mL auffüllen; autoklavieren. Zur Arbeitslösung (TBS 1x) 1:10 in destilliertem Wasser verdünnen (endgültig: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6); bei Raumtemperatur oder 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
TBST (TBS + 0,05 % Tween-20)	Eigenherstellung	—	Für 10 mL: 1 mL TBS 10x-Stammlösung + 8,995 mL destilliertes Wasser + 5 µL Tween-20 (0,05 % v/v); pH 7,6. Waschpuffer zwischen den Färbungsschritten; frisch herstellen, innerhalb von ca. 1 Woche bei 4 °C verwenden.
Tris-Basis	Sigma-Aldrich	252859	Pufferstoff zur Herstellung der TBS-Stammlösung; gewährleistet die pH-Stabilität im physiologischen Bereich (pH 7,6) für Wasch- und Verdünnungspuffer in der Immunfluoreszenz.
Triton X-100 (nichtionisches Octylphenol-Ethoxylat-Detergens)	Sigma-Aldrich	X100	Für 10 mL: 10 µL Triton X-100 in 9,99 mL TBS 1x für TX100 0,1 %; 30 µL in 9,97 mL TBS 1x für TX100 0,3 % (zielabhängig; für nukleäre Ziele sind höhere Konzentrationen erforderlich).
Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Wird zur Zellablösung verwendet.
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	Wird in TBS als Waschpuffer (TBST) und als Antikörperverdünnung (TBST-BSA 1 %) verwendet.