Methodenartikel

Paralleles In vivo-Screening von Gen-Knockout und -Aktivierung in der Mammarisdrüse der Maus

DOI:

10.3791/71115

⸱

24. Juli 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt einen skalierbaren intraduktalen CRISPR-Screening-Ansatz, der parallele in vivo Gen-Knockout- und Aktivierungsstudien in der Mammarydrüse der Maus ermöglicht.

Zusammenfassung

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Vorwärtsgenetische Screenings werden routinemäßig eingesetzt, um Tausende von genetischen Elementen in einer geündigten Weise zu verändern, mit dem Ziel, groß angelegte Genotyp-zu-Phänotyp-Karten zu erstellen. Obwohl sie oft in Zellkultursystemen durchgeführt werden, belegen die gesammelten Belege, dass in vivo-Screens die Kraft haben, neue Biologie aufzudecken, die in vitro nicht wiederholt werden kann. Die weitverbreitete Anwendung dieses Ansatzes wurde jedoch durch zwei große Herausforderungen begrenzt: ein überwiegender Fokus auf Funktionsverluststörungen statt auf Genaktivierung und die erheblichen technischen Hürden bei der Bereitstellung komplexer genetischer Bibliotheken an spezifische Gewebe in vivo. Um diese Herausforderungen zu meistern, beschreiben wir eine einfache und vielseitige intraduktale Injektionsstrategie, die eine effiziente und schnelle funktionelle genomische Screening in der Mammarisdrüse der Maus ermöglicht, indem zehntausende diskrete Epithelklone erzeugt werden. Darüber hinaus stellen wir alle notwendigen Details zur Bibliotheksgenerierung, intraduktaler Injektion, Bildschirmdekonvolution und Analyse von CRISPR-Knockout- und Aktivierungsbibliotheken für umfassende In-vivo-Screens bereit. Mit diesen Werkzeugen, die wir CRISPR-KOALA (Knockout and Activation Linked Assay) genannt haben, haben wir neue Tumorsuppressoren und Onkogene im kodierenden und nicht-kodierenden Genom in zusammengefassten Bibliotheken identifiziert, die von 46 Loci bis zu einem Fünftel des Genoms reichen. Wichtig ist, dass dieser Ansatz und diese Analyse auf andere Organe angewendet werden kann, um die biologische Funktion eines beliebigen Gens während der Homöostase oder Erkrankung zu untersuchen.

Einleitung

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Funktionelle Genomik-Screens bieten einen leistungsstarken Rahmen, um Genfunktionen imMaßstab 1 zu untersuchen. Die Entwicklung von CRISPR-Cas-Gen-Editierungstechnologien hat die systematische Störung von Hunderten bis Tausenden von Genen parallel ermöglicht, und gebündelte CRISPR-basierte Screenings in Säugetierzelllinien sind zu einem Grundpfeiler der modernenKrebsbiologieforschung geworden. Diese in-vitro-Ansätze haben essentielle Gene3, Tumorsuppressoren4 und synthetische letale Interaktionen5 in verschiedenen Krebskontexten identifiziert. Eine zentrale Einschränkung ist jedoch die Unfähigkeit, die komplexen biologischen Merkmale von Tumoren in vivo zu erfassen, einschließlich Interaktionen mit Immunsystem und Stroma, Nährstoffgradienten und Gewebearchitektur innerhalb der Mikroumgebung2. Im Einklang mit dieser Einschränkung haben neuere Studien gezeigt, dass viele echte Krebstreiber-Gene in vitro keine messbaren Effekte zeigen, insbesondere wenn ihre Funktion von mikroökologischen Hinweisen abhängt, die in der Zellkultur 6,7,8,9,10 fehlen.

Die Mammarisdrüse der Maus bietet einen einzigartig vorteilhaften Gewebekontext für funktionelle Genomik-Screenings in vivo. Mammariatepithelzellen sind hochregenerativ, durchlaufen während des Östruszyklus klonale Expansionsrunden und sind in einem verzweigten Ductalnetzwerk organisiert, das leicht zugänglich und genetisch manipuliert werden kann 11,12,13. Diese Merkmale haben jahrzehntelange mosaikgenetische Analysen und Linienverfolgungsexperimente unterstützt und die Milchdrüse als handhabbares System zur Untersuchung der zellintrinsischen und mikroumweltabhängigen Genfunktion während der Gewebehomöostase und Krankheitetabliert 14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Wichtig ist, dass genetische Störungen auf das epitheliale Kompartiment beschränkt werden können, was eine direkte Untersuchung epithelspezifischer Treiber von Transformation, Zellkonkurrenz, Linientreue und Tumorprogression im intakten Gewebekontext ermöglicht.

Obwohl mehrere Strategien entwickelt wurden, um genetische Störungen direkt an die adulte Milchdrüse in situ zu bringen, bleiben erhebliche technische Hürden für Hochdurchsatzanwendungen bestehen. Die durch Adenovirus vermittelte Verabreichung von Cre-Rekombinase wurde weit verbreitet eingesetzt, um eine somatische Rekombination bedingter Allele in der adulten Mammaldrüsezu induzieren, was eine effiziente Möglichkeit bietet, die Genfunktion zu manipulieren, ohne die komplexe Keimbahnzucht, die für traditionelle genetisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) erforderlich ist. Obwohl das High-Titer-Adenovirus auch CRISPR-Cas9-Komponenten an geweberesidente Zellen liefern kann, integrieren sich diese Vektoren nicht in das Wirtsgenom 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Dies begrenzt den Umfang der Screens stark auf ~10–55 Gene, da jede gRNA-Zielstelle einzeln mit molekularen Inversionssonden 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 sequenziert werden muss . Darüber hinaus ermöglichen die derzeit vorhandenen intraduktalen Verabreichungsmethoden einen direkten Zugang zum Mammarduktalsystem, erfordern jedoch entweder eine invasive chirurgische Exposition der Brüstdrüse50 oder die Verwendung vergleichsweise großer Hamilton-Spritzen, die umständlich51 sind. Obwohl diese Ansätze für die lokale Verbreitung von Virusen effektiv sind, sind sie vergleichsweise invasiv, technisch anspruchsvoll und nicht für die skalierbare Bereitstellung gepoolter lentiviraler Bibliotheken optimiert. Zusammen zeigen diese Studien, dass in-situ-virale Störungen machbar sind, aber aktuelle Werkzeuge unterstützen nicht die stabilen, gepoolten, sequenzabrufbaren Störungen, die für das Hochdurchsatz-in-vivo-CRISPR-Screening erforderlich sind.

Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir und andere uns der Integration von lentiviralen Vektoren zugewandt, die stabile und erbliche genetische Modifikationen ermöglichen. Im Gegensatz zu Zellkultursystemen setzen in vivo Gewebe strenge Einschränkungen hinsichtlich der Anzahl der gestörten Zellen, die innerhalb eines einzelnen Organs erzeugt werden dürfen, was das genomweite Screening unpraktikabel macht. Folglich erfordern in vivo CRISPR-Bildschirme die Entwicklung biologisch informierter, gezielter Bibliotheken, die Abdeckung und Machbarkeit in Einklang bringen. Darüber hinaus konzentrierten sich die meisten in vivo CRISPR-Screens, die hier2 besprochen wurden, fast ausschließlich auf lentivirale Funktionsverluststörungen, obwohl zunehmende Hinweise darauf bestehen, dass Genaktivierung komplementäre und nicht überlappende biologische Erkenntnisse liefern kann 52,53,54,55. Wir und andere haben bereits gezeigt, dass die Integration lentiviraler CRISPR-Störungen in das adulte Mammarepithel stabile, erbliche genetische Modifikation in situ ermöglicht und dass sie aus genomischerDNA wiedergewonnen und quantifiziert werden können. Mit diesem Ansatz führten wir gepoolte in vivo CRISPR-Screens durch, die neue Treiber der onkogenen Transformationidentifizierten 36,55 und sowohl die Machbarkeit als auch die biologische Relevanz der lentiviralen Verabreichung und des CRISPR-Screenings feststellten. Diese Studien hoben jedoch auch den Bedarf an einem einfachen, standardisierten und skalierbaren Protokoll hervor, das breit übernommen und erweitert werden kann, um sowohl Modellverlust- als auch Leistungsgewinn-Screening innerhalb derselben Drüse einzubeziehen.

Hier beschreiben wir eine einfache und vielseitige intraduktale Injektionsstrategie, die eine parallele In-vivo-Screening der CRISPR-Knockout- und Aktivierungsbibliotheken, genannt CRISPR-KOALA, in der Mammariennüse55 der adulten Maus ermöglicht. CRISPR-KOALA verwendet entweder eine konventionelle 20-21 bp 'Single-Guide' (sg)RNA für CRISPR-KO-Fähigkeiten oder eine 14 bp 'dead-guide' (dg)RNA für CRISPR-A. Die dgRNA führt Cas9 effizient zu seinem Zielort, verhindert jedoch die Aktivität der Cas9-Endonuklease, 59,60,61, und ermöglicht somit die Nutzung einer einzelnen Maus, die aktives Cas9 sowohl für Knockout- als auch Aktivierungsmodalitäten exprimiert. Die Einführung von zwei PP7-Haarnadeln in das dgRNA trcr ermöglicht die Rekrutierung eines PP7-Mantelprotein:P65:HSF1-Transaktivators62 und führt zu einer effizienten Überexpression von Genen in vivo55 (Abbildung 1). Durch die Kombination von gezieltem gRNA-Bibliotheksdesign mit hochtitritriver lentiviraler Produktion und nicht-chirurgischer intraduktaler Abgabe mittels Glasmikrokapillaren erzeugt dieser Ansatz Zehntausende räumlich diskrete Epithelklone, während gleichzeitig Gewebearchitektur und mikroökologische Interaktionen erhalten bleiben. Wichtig ist, dass die lentivirale Integration in das Wirtsgenom die Rückgewinnung und Quantifizierung von gRNAs durch Hochdurchsatz-Sequenzierung ermöglicht, was gepoolte funktionelle genomische Screens in vivo ermöglicht. Zusammen ermöglicht dies parallele oder gleichzeitige (in derselben Zelle) CRISPR-KO- und CRISPR-A-Störungen innerhalb derselben Milchdrüse einer Cas9-exprimierenden Maus.

Wir präsentieren ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll, das das Design von gRNA-Bibliotheken, lentivirale Produktion und Konzentration, intraduktale Abgabe, Bibliotheksdekonvolution und Datenanalyse umfasst (Abbildung 1). Zusammen bietet diese Methode einen praktischen und skalierbaren Rahmen für in vivo CRISPR-Knockout- und/oder Aktivierungsscreening in der Mammarisdrüse der Maus und kann angepasst werden, um die Genfunktion während der Gewebehomöostase, verschiedene Krankheitskontexte, andere Gewebe und andere Arten wie die Ratte zu untersuchen.

Protokoll

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Alle Tierverfahren wurden gemäß den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt und vom Animal Care Committee des Centre for Phenogenomics genehmigt (Protokoll 26-0272H).

1. CRISPR-Bibliotheksklonen

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt das pooled Klonen von CRISPR-Knockout- und CRISPR-Aktivierungsbibliotheken aus array-synthetisierten Oligonukleotiden in lentivirale Rückgrate. Wir generieren routinemäßig Bibliotheken mit bis zu 4.000 gRNAs, die bei 8-20 Mäusen mit einer 400-1.000-fachen Abdeckung gescreent werden können. Die Anzahl der gRNAs und die Abdeckung können nach Bedarf angepasst werden, was die Anzahl der Mäuse beeinflusst, die zur Aufrechterhaltung statistischer Stärke erforderlich ist. Wir empfehlen, eine Mindestabdeckung von 400X einzuhalten, was für starke Gain-of-Function-Phänotypen ausreichen kann.

  1. Design der Leit-RNA-Bibliothek
    1. Erstellen Sie eine Liste aller Mausgene, die innerhalb eines einzigen Experiments für das nachgelagerte CRISPR-Bibliotheksdesign gescreent werden, wobei getrennte Ziellisten für CRISPR-Knockout- (CRISPR-KO) und CRISPR-Aktivierungsbibliotheken (CRISPR-A) untergebracht werden.
      HINWEIS: CRISPR-KO- und CRISPR-A-Bibliotheken werden separat generiert und können im Stadium der lentiviralen Transduktion für gleichzeitige Screening kombiniert werden.
    2. Für CRISPR-KO-Bibliotheken wählen Sie pro Gen vier bis fünf Einzel-Guide-RNAs (sgRNAs) mit hochpunktenden Vorhersagealgorithmen wie CRISPick62,63, CHOPCHOP64 oder VBC Score65 aus.
      HINWEIS: Der VBC-Score zeigt eine sehr hohe Wirksamkeit und eine On-Target-Aktivitätvon 66. Unabhängig vom Tool priorisieren Sie Guides mit hoher prognostizierter On-Target-Aktivität, minimalem Off-Target-Potenzial und gezielter Codierung von Exons.
    3. Für CRISPR-A-Bibliotheken wählen Sie acht bis zehn Guides pro Gen mit CRISPick62,63 oder CHOPCHOP64 aus. Für Werkzeuge, die benutzerdefinierte Führungslängen erlauben (wie CHOPCHOP), stellen Sie die Führungslänge vor der Führungserstellung auf 14 bp ein. Wenn ein Werkzeug verwendet wird, das nur 20 bp-Guides erzeugt, werden diese Sequenzen in Dead-Guide-RNAs (dgRNAs) umgewandelt, indem die 14 bp-Sequenz unmittelbar 5 Fuß des Protospacer-angrenzenden Motivs erhalten bleibt, die Promoterregionen von Genen anvisieren.
      HINWEIS: dgRNAs sind abgeschnittene Guide-Sequenzen, die eine CRISPR-basierte transkriptionelle Aktivierung mit etwa 50–85 % der Wirksamkeit von vollwertigen sgRNAs55 ermöglichen, ohne DNA-Spaltung zu induzieren 59,60,61.
    4. Bündeln Sie alle sgRNAs oder dgRNAs, die einem einzelnen Experiment entsprechen, in separaten Listen, um einheitliches Klonen, Virusproduktion und In-vivo-Screening zu ermöglichen.
      HINWEIS: SgRNA und dgRNAs, die zusammen gescreent werden, werden in der postviralen Produktion zusammengelegt.
    5. Generiere gepoolte Negativkontrollbibliotheken für CRISPR-KO- und CRISPR-A-Screens, einschließlich nicht-zielgerichteter55,67 und nicht-genischer gRNA-Sequenzen68, wie zuvor beschrieben, um Hintergrundeffekte unabhängig von Genstörung oder -aktivierung zu kontrollieren.
      HINWEIS: Falls gewünscht, können separate Bibliotheken aus nicht-Ziel- und nicht-genischen gRNAs erstellt werden, um zwei unabhängige Negativkontrollbibliotheken zu schaffen.
  2. Design und Amplifikation des Oligonukleotidpools
    1. Entwickeln Sie poolierte Oligonukleotiden so, dass jede gRNA die Zielsequenz, Restriktionsenzym-Überhänge, die mit dem Ziellentiviral-Rückgrat kompatibel sind, und bibliotheksspezifische Primersequenzen enthält, um eine selektive Amplifikation aus einem komplexen Oligonukleotidpool zu ermöglichen (Abbildung 1, Tabelle 1).
    2. Jeder gRNA-Bibliothek wird ein einzigartiges Primerpaar zugewiesen, um eine unabhängige Amplifikation einzelner Bibliotheken aus einem gemeinsamen Oligonukleotidpool zu ermöglichen. Einzigartige Primer-Paare sind in Tabelle 1 aufgeführt.
    3. Bestellen Sie gepoolte Oligonukleotidbibliotheken von einer kommerziellen Array-Syntheseplattform, um eine äquimolare Darstellung aller gRNAs in jedem Pool sicherzustellen.
    4. Einzelne gRNA-Bibliotheken aus der gesammelten Oligonukleotid-Vorlage mit bibliotheksspezifischen Primern in der folgenden Reaktionsmischung amplifizieren. Die Reaktion kann modifiziert werden, um der empfohlenen Zusammensetzung der jeweiligen Polymerase zu entsprechen. Bereiten Sie drei Reaktionen mit einer gesammelten Oligonukleotid-Vorlage und einer negativen Kontrollreaktion ohne Vorlage vor.
      4 ng Pooled Oligonukleotid-Vorlage
      2,5 μL 10 μM Vorwärts-Bibliotheks-spezifischer Primer
      2,5 μL 10 μM Reverse library-spezifischer Primer
      10 μL 5x Reaktionspuffer
      0,5 μL High-Fidelity DNA-Polymerase
      X μL nukleasefreies Wasser
      50 μL Gesamtvolumen
    5. Durchführung der PCR-Verstärkung unter den folgenden Zyklusbedingungen, wobei die Annealing-Temperatur basierend auf der bibliotheksspezifischen Primer-Schmelztemperatur angepasst wird:
      1 Zyklus mit 98 °C für 30 Sekunden
      18 Zyklen mit 98 °C für 10 Sekunden, 62–65 °C für 20 Sekunden und 72 °C für 3 Sekunden
      1 Zyklus mit 72 °C für 5 Minuten
      HINWEIS: Überschreiten Sie 18–19 Amplifikationszyklen nicht, um eine gleichmäßige gRNA-Repräsentation innerhalb der Bibliothek zu erhalten.
    6. Lösen Sie PCR-Produkte auf einem 2,5%igen Agarosegel bei 120 V für etwa 45 Minuten auf und entfernen Sie das Band, das der erwarteten gRNA-Einsatzgröße entspricht (ca. 100 bp, je nach Primerdesign; Abbildung 2A).
    7. Reinigen Sie PCR-Produkte mit einem Gel-Extraktionsset und elutieren Sie während des letzten Eluationsschritts in 20 μL ultrareines Wasser.
      HINWEIS: (Pausenpunkt) Gereinigte gRNA-Einsätze können vor dem Klonen bei -20 °C gelagert werden.
  3. Vorbereitung und Verdauung der lentiviralen Rückgrate
    1. Bereite lentivirale Rückgratplasmide mit einer herausnehmbaren Stuffer-Sequenz für das Klonieren von gRNA-Einsätzen vor. Für in vivo CRISPR-KO und CRISPR-A Bibliotheken verwenden sie pLKO-Cre (Addgene Plasmid #158032 oder 256774) bzw. pXPR502-PPH-Cre (Addgene Plasmid #256776).
    2. Verdauen Sie 5–10 μg lentivirale Rückgrat-DNA in einem Gesamtreaktionsvolumen von 200 μL mit dem entsprechenden Restriktionsenzym und Puffer. Verwenden Sie Esp3I für das pLKO-Cre CRISPR-KO Backbone und SapI für das pXPR502-PPH-Cre CRISPR-A Backbone.
      5–10 μg Rückgratplasmid
      20 μL 10x Enzympuffer
      5 μL Restriktionsenzym
      X μL Nukleasefreies Wasser
      200 μL Gesamtvolumen
    3. Inkubieren Sie die Verdauungsreaktionen 2–3 Stunden bei 37 °C.
    4. Fügen Sie jeder Verdauungsreaktion 2 μL rekombinante alkalische Phosphatase hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde bei 37 °C, um das verdaute Rückgrat zu dephosphorylieren.
    5. Lösen Sie verdaute Produkte auf einem 1%igen Agarosegel auf und entfernen Sie das Band, das dem linearisierten Rückgrat entspricht (Abbildung 2B,C)
      HINWEIS: Für beide Rückgrate ist das Stuffer-Fragment als separates Band bei etwa 2000–2500 bp sichtbar, abhängig vom Vektor.
    6. Reinigen Sie die entfernte Rückgrat-DNA mit einem Gelextraktions-Set und elutieren Sie in einem minimalen Volumen ultrareinen Wassers, um eine hohe DNA-Konzentration (typischerweise 20 μL) zu erhalten.
      HINWEIS: (PAUSENPUNKT) Gereinigte verdaute Rückgrate können vor der Ligation bei -20 °C gelagert werden.
  4. Verdauung und Ligierung von gRNA-Bibliotheken
    1. Setzen Sie All-in-One-Verdauungs-Ligationsreaktionen mit 750 ng gereinigter lentiviraler Rückgrat-DNA, 43 ng gRNA-Bibliotheks-Insert-DNA, 3 μL Restriktionsenzym, 7,5 μL T4-DNA-Ligase, 15 μL 10 mM ATP und der passenden Menge Reaktionspuffer und sterilem destilliertem Wasser ein, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 150 μL zu erreichen.
      HINWEIS: Verwenden Sie dasselbe Restriktionsenzym, das ursprünglich im Verdauungsschritt des Plasmid-Rückgrats verwendet wurde. Ein Verhältnis von 750 ng gereinigtem lentiviralem Rückgrat zu 43 ng Library-Insert-DNA ergibt ein ungefähres Vektor-zu-Insert-Molarverhältnis von 1:7, wenn die empfohlenen Rückgrate verwendet werden.
    2. Teile jede Ligationsmischung in drei gleich große Aliquoten, um die Transformationseffizienz und die Bibliothekskomplexität zu erhöhen.
    3. Bereiten Sie eine einzelne negative Kontrollreaktion vor, die Backbone-DNA, aber keine gRNA-Einsätze enthält, um die Hintergrundligation zu bewerten.
    4. Inkubieren Sie Verdauungs-Ligationsreaktionen über Nacht bei 30 °C.
    5. Am folgenden Morgen geben Sie 1 μL des entsprechenden Restriktionsenzyms zu jeder Reaktion aliquot und inkubieren Sie 1 Stunde bei 37 °C, um den Abschluss der Rückgratverdauung zu ermöglichen.
    6. Fügen Sie jeder Reaktion 2 μL 10 mM ATP und 2 μL T4-DNA-Ligase hinzu und inkubieren Sie bei 25 °C für 2–3 Stunden, um die Ligation abzuschließen.
    7. Kombinieren Sie die drei einzelnen Verdauungs-Ligationsreaktionen pro Bibliothek, reinigen Sie die Reaktionen mit einer säulenbasierten Oligonukleotid-Reinigungsmethode und elutieren Sie jede in 21 μL ultrareines, steriles destilliertes Wasser. Elutieren Sie die einzelne gereinigte negative Kontrollreaktion in 7 μL ultrareines, steriles destilliertes Wasser.
      HINWEIS: Elutieren Sie keine Ligationsprodukte in Puffern mit Salz oder EDTA, da diese die Effizienz der bakteriellen Elektroporation erheblich verringern. (PAUSENPUNKT) Gereinigte Ligationsprodukte können vor der Elektroporation bei -20 °C gelagert werden.
  5. Bibliothekselektroporation und -erweiterung
    1. Vorkühle 0,1 cm Elektroporations-Cuvetten, Mikrozentrifugenröhren mit 2 μL Aliquot gereinigter Ligationsprodukte und 14 ml Polypropylen-Kulturröhren mit rundem Boden auf Eis für mindestens 20 Minuten vor der Elektroporation.
    2. Auftauen von elektrokompetenten Bakterienzellen auf Eis und vermischen Sie vorsichtig 25 μL Zellen mit 2 μL gereinigtem Ligationsprodukt im vorgekühlten Mikrozentrifugenrohr durch Pipetten.
    3. Übertragen Sie die Zell-DNA-Mischung auf eine vorgekühlte 0,1 cm Elektroporationscuvette und Elektroporat bei 1,8 kV, 25 μF und 200–600 Ω.
      HINWEIS: Eine erfolgreiche Elektroporation ergibt typischerweise eine Zeitkonstante zwischen 4,6 ms und 4,9 ms.
    4. Fügen Sie sofort 1 ml vorgewärmtes, 37 °C Rückgewinnungsmedium mit den elektrokompetenten Zellen zur Cuvette hinzu, setzen Sie die Zellen vorsichtig wieder auf und übertragen Sie die Federung auf ein 14-ml-Polypropylenrohr mit rundem Boden.
    5. Inkubieren Sie die wiedergewonnenen Zellen bei 30 °C und schütteln Sie bei 180 U/min 90 Minuten lang.
    6. Platte 10 μL der gewonnenen Zellen, verdünnt in 90 μL LB-Brühe auf LB-Agar-Platten mit Ampicillin und über Nacht bei 30 °C inkubiert, um die Transformationseffizienz und Hintergrundligierung zu bewerten.
      HINWEIS: Ein erfolgreiches Klonen sollte zu Hunderten von Kolonien auf der Platte mit Einsatz und wenigen (> 30) Kolonien auf der reinen Rückgrat-Negativkontrollplatte führen (Abbildung 3).
    7. Validieren Sie die Bibliothek weiter, indem Sie ~10 Kolonien für Miniprep und Sanger-Sequencing Forwards vom U6-Promoter auswählen. Erfolgreich geklonte Bibliotheken enthalten < 90 % der Minipreps, die eine klare Sequenzierung einer gRNA enthalten, ohne wiederholte Guides über die 10 Minipreps. Zusätzlich verdauen Sie das Restriktionsenzym die Minipreps und die gesammelte Plasmidbibliothek (Schritt 1.5.10) und führen sie mit einem Agarosegel aus, um die Bandgrößen zu überprüfen und sicherzustellen, dass die lentiviralen Konstrukte keine abweichende Rekombination durchlaufen haben.
      HINWEIS: Die Bibliotheksrepräsentation kann bewertet werden, indem Kolonienzahlen von Verdünnungsplatten mit der Gesamtzahl der gRNAs in der Bibliothek verglichen werden, wobei eine 1.000-fache Abdeckung angestrebt wird. Mehrere serielle Verdünnungen können bei dieser Berechnung verwendet werden.
    8. Wenn die Umwandlungseffizienz ausreichend ist, werden die verbleibenden geborgenen Zellen auf 15 cm LB-Agar-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum plattiert und über Nacht bei 30 °C inkubiert, um einen dichten Rasen aus Kolonien zu bilden.
      HINWEIS: Platte 100 μL geborgener Zellen auf jede der zehn 15 cm LB großen Agarplatten, um genügend Kolonien zu bergen.
    9. Am folgenden Tag wird mit einem Zellschaber Bakterienkolonien in 500 mL LB-Brühe mit Ampicillin abgekratzt, um eine einzelne Bakterienkultur zu erzeugen, die die geklonte gRNA-Bibliothek repräsentiert.
    10. Erweitern Sie die gesammelte Bakterienkultur bei 30 °C mit einem Schütteln für etwa 3 Stunden und isolieren Sie die Plasmid-DNA mit einem Maxiprep-Kit.

2. Lentivirale Produktion für das In-vivo-Screening

HINWEIS: Für intraduktale Verabreichung und in-vivo-Pooled Screening müssen lentivirale Präparate konzentriert werden, um hohe Titeren zu erreichen (idealerweise zwischen 1 x 108 pfu/mL und 1 x 109 pfu /mL), um eine effiziente Transduktion der Mammariapithelzellen sicherzustellen. Das folgende Protokoll beschreibt die Hochtiter-Lentiviralproduktion, die für den Einsatz in vivo optimiert ist.

  1. Herstellung lentiviraler produzierender Zellen
    1. Halten Sie HEK293TN Zellen im modifizierten Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin und Kulturzellen bei 37 °C mit 5 %CO2.
    2. Passage der Zellen alle 2–3 Tage, um das logarithmische Wachstum aufrechtzuerhalten und sicherzustellen, dass die Zellen die Konfluenz von 90 % nicht überschreiten. Verwenden Sie Zellen an Passagen <20 für eine optimale Virusproduktion.
    3. Einen Tag vor der Transfektion werden 15 cm große Gewebekulturplatten mit Poly-L-lysin (0,02 mg/mL) für 1 Stunde bei Zimmertemperatur beschichtet. Bereite neun Teller für eine Charge virale Zubereitung vor.
    4. Entfernen Sie die Poly-L-Lysin-Lösung und waschen Sie die Platten zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
    5. Säe 1,1 x 107 HEK293TN Zellen auf jeweils neun 15 cm Gewebekulturplatten mit Poly-L-Lysin beschichtet, um sicherzustellen, dass die Zellen zum Zeitpunkt der Transfektion ~90 % Konfluenz erreichen.
      HINWEIS: Für Anwendungen, die keine maximalen viralen Titer benötigen, kann die lentivirale Produktion auf weniger Platten (z. B. drei oder sechs Platten) mit proportional reduzierten Erträgen reduziert werden. Reduzieren Sie die Reagenzien (Plasmid-DNA, PEI und DMEM) entsprechend für die Transfektion.
  2. PEI-basierte lentivirale Transfektion
    1. Bereite Plasmid-DNA für die lentivirale Produktion mit einem Drei-Plasmid-System vor, bestehend aus 95 μg des gRNA-Bibliotheksplasmids, 95 μg des Verpackungsplasmids psPAX2 (Addgene Plasmid #12260) und 65 μg des VSV-G-Hüllplasmids pMD2.G (Addgene Plasmid #12259).
    2. Kombinieren Sie die drei Plasmide für die lentivirale Produktion in 10,8 ml serumfreiem DMEM und mischen Sie sie gründlich durch Vortex für etwa 10 Sekunden.
    3. Fügen Sie 366 μL 1 mg/mL Polyethylenimin (PEI) tropfenweise zur verdünnten DNA-Lösung hinzu, mischen Sie sie gründlich durch Vortex für etwa 10 Sekunden und inkubieren Sie die DNA-PEI-Komplexe bei Raumtemperatur für 10–30 Minuten.
    4. Während der Komplexbildung aspirieren Sie Kulturmedium aus den HEK293TN Platten und fügen Sie 14 ml serumfreies DMEM hinzu.
      HINWEIS: Fetales Rinderserum kann die Plasmidaufnahme durch die Zellen hemmen.
    5. Verteilt 1,2 ml des DNA-PEI-Komplexes tropfweise über die Platte und das Gestein, um eine gleichmäßige Verteilung sicherzustellen.
    6. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C mit 5 % CO2für 6 –8 Stunden.
    7. Ersetzen Sie das Medium auf jeder Platte durch 20 ml vorgewärmtes DMEM, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (ohne 1 % Penicillin-Streptomycin), und kultivieren Sie die Zellen weiterhin bei 37 °C mit 5 %CO2.
      HINWEIS: Eine Übernachttransfektion wird nicht empfohlen, da längere Exposition gegenüber PEI und ein Mangel an Serum die virale Ausbeute verringern.
  3. Virusernte und Ultrazentrifugation
    1. Bereiten Sie 200 ml einer Saccharose-Polsterlösung vor, indem Sie 40 g Saccharose, 11,7 g Natriumchlorid, 4 ml 1 M HEPES (pH 7,4) und 1 ml 0,5 M EDTA (pH 7,9) in einem geeigneten Volumen sterilen destillierten Wassers herstellen und filtersterilisieren Sie durch eine 0,45 μm niedrigproteinbindende Polyethersulfon-Filtrationseinheit. Diese Lösung kann mehrere Monate bei 4 °C gelagert werden.
    2. Sammeln Sie das lentivirale Supernatant 48–72 Stunden nach der Transfektion.
    3. Führen Sie 10 ml DMEM mit 10 % fetalem Rinderserum durch die 0,45 μm niedrig-proteinbindende Polyethersulfon-Filtrationseinheit. Verwerfen Sie den Durchfluss. Fülle das Überdachungsmittel auf den Filter und setze den Staubsauger an.
      HINWEIS: Wenn die Konzentration nicht sofort erfolgen kann, lagern Sie das klärende virale Supernatant über Nacht bei 4 °C.
    4. Geben Sie 30 ml klärendes virales Supernatant in ein Ultrazentrifugenrohr.
    5. Unterlagern Sie langsam das klarisierte virale Supernatant mit 4 ml Saccharose-Polsterlösung.
    6. Setzen Sie das Ultrazentrifugenrohr in einen kompatiblen Adapter für einen schwenkenden Eimerrotor und balancieren Sie die Röhren präzise.
    7. Zentrifugieren Sie die Röhren bei 104.000 × g für mindestens 2 Stunden bei 4 °C.
      HINWEIS: Ein schwingbarer Schaufelrotor, wie der Beckman JS24.38 Rotor, ist erforderlich, um das Virus richtig durch das Saccharosekissen zu pelletieren.
    8. Dekantieren Sie das Supernatant vorsichtig, ohne das virale Pellet zu stören, das am Boden des Röhrchens als schwacher weißer oder durchscheinender Film erscheinen kann.
    9. Lassen Sie die Schläuche mindestens 10 Minuten an der Luft trocknen und verwenden Sie ein Labortuch, um so viel Restflüssigkeit wie möglich aus dem Inneren des Röhrchens zu entfernen, ohne das Pellet zu stören.
      HINWEIS: Eine ordnungsgemäße Trocknung des Rohrs ist entscheidend für hohe Viruskonzentrationen, da dies das endgültige Erschütterungsvolumen reduziert.
    10. Viruspellets in 20 μL kalt-phosphatgepufferter Kochsalzlösung neu suspendieren und vorsichtig auf und ab pipetten, wobei Sie darauf achten, Luftblasen zu vermeiden.
    11. Inkubieren Sie die Röhrchen 2 Stunden lang auf Eis mit sanftem Rühren, um die viralen Pellets vollständig wieder aufzuhängen.
    12. Übertragen Sie das konzentrierte Virus in ein sauberes Mikrofugerohr und klären Sie die Lösung durch Zentrifugation bei 2.000 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
      HINWEIS: Dieser Spin entfernt Schmutz und Restpartikel, die während der Operation die Injektionsnadel verstopfen.
    13. Aliquot das konzentrierte Virus in Einmalvolumen, um wiederholte Auftauen zu vermeiden, und bei -80 °C zu lagern.
  4. Lentivirale Titration mit LSL-tdTomatenmaus embryonalen Fibroblasten (MEFs)
    1. Platte 100.000 LSL-tdTomaten-MEFs (abgeleitet von Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909]) in einer 6-Well-Platte einen Tag vor der Infektion in DMEM, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin, und die Zellen bei 37 °C mit 5 %CO2 kultiviert. Richte einen zusätzlichen Brunnen zum Zellzählen an.
      HINWEIS: LSL-tdTomato MEFs fungieren als Reporter für Cre im Lentivirus. Jedes geeignete Reporter-System zur viralen Titerung anderer Backbones kann verwendet werden.
    2. Am nächsten Tag zählen Sie die Anzahl der LSL-tdTomato MEFs aus einem zusätzlichen Brunnen, um die Anzahl der zum Zeitpunkt der Infektion vorhandenen Zellen zu quantifizieren.
    3. Serielle Verdünnungen von konzentriertem Lentivirus, das Cre-Rekombinase codiert, in insgesamt 2 ml des modifizierten Eagle-Mediums von Dulbecco, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum, vorbereiten. Im Allgemeinen ergeben 0,4 μL, 0,1 μL und 0,025 μL konzentriertes Virus einen sauberen dynamischen linearen Bereich (Abbildung 4A–D).
    4. Fügen Sie jedem LSL-tdTomato MEFs 2 ml virale Verdünnungen hinzu und geben Sie jedem 2 μL 10 mg/mL Polybren zu.
    5. Infiziere MEFs, indem du bei 400 × g 90 Minuten bei 37 °C spinnst.
    6. Ersetzen Sie virale Medien durch 2 ml DMEM, ergänzt durch 10 % fetales Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin, und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5 %CO für 48–72 Stunden.
    7. Quantifizieren Sie die tdTomato-positiven Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Flusszytometrie, um den Anteil der infizierten Zellen bei jeder Verdünnung zu bestimmen.
    8. Berechnen Sie den funktionellen Titer basierend auf dem Anteil infizierter Zellen und der Anzahl der zum Zeitpunkt der Infektion vorhandenen Zellen.
      HINWEIS: CRISPR-KO- und CRISPR-A-Viren werden separat produziert, konzentriert und getitriert. Funktional werden mit LSL-tdTomato MEFs bestimmte Titer verwendet, um CRISPR-KO- und CRISPR-A-Viren in einem definierten Verhältnis vor der intraduktalen Injektion zu mischen.
  5. Qualitätsbewertung von Plasmid- und Lentivirus-Bibliotheken
    1. Um sicherzustellen, dass die gRNA-Bibliotheken mit ausreichender Tiefe/Abdeckung geklont sind und alle gRNAs während des Klonens und der Virusproduktion erhalten bleiben, wird dringend empfohlen, sowohl den Plasmidpool als auch die transduzierten MEFs zu sequenzieren.
    2. Um die lentivirale Abdeckung zu bewerten, transfektieren Sie MEFs mit Lentivirus bei >1000× Abdeckung basierend auf berechnetem viralem Titer. Es ist nicht notwendig, während dieses Schritts eine einzelne Infektion der Zellen sicherzustellen.
    3. Nach 48–72 Stunden wird die Zellen mit Trypsin oder einem Zellschaber abgetrennt und die Zellen mit Pellets bearbeitet. Extrahiere die DNA mit einem kommerziellen GDNA-Extraktionskit.
    4. Sequenz 1 μg Plasmid und 3 μg extrahierte MEF-DNA nach dem in Abschnitt 5 beschriebenen Protokoll. Eine tiefe Sequenzierung von 5 Millionen Lesevorgängen ist für die meisten benutzerdefinierten Bibliotheken mit <5000 gRNAs ausreichend.
      HINWEIS: Eine starke Korrelation (R2> 0,6) zwischen den Reads des Plasmidpools und einer relativ gleichmäßigen Repräsentation der Guides (>70 % der Guides innerhalb von 1 logitarem Jahrzehnt), bei der keine einzelnen Guides die Bibliothekszahlen dominieren, deutet auf gute Qualität hin (Abbildung 4E).

3. Intraduktale lentivirale Injektion in die Mammarisdrüse der Maus

  1. Nadel- und Virusverdünnung
    1. Ziehen Sie Glas-Mikrokapillarnadeln mit einem Mikropipetten-Nadelzieher, um fein gespitzte Kapillaren zu erzeugen, die für die intraduktale Injektion von 9–10 μL geeignet sind. Benutze eine feine Pinzette, um die Spitze der Nadel abzubrechen.
      HINWEIS: Die optimale Lage schafft eine Nadelgröße, die groß genug ist, um mit Flüssigkeit gefüllt zu werden, aber dünn genug, um problemlos in die Nippelöffnung zu passen.
    2. Verdünnen Sie lentivirale Präparate auf eine Endkonzentration von 1 × 107 pfu /ml in steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung, ergänzt mit 0,05 % (w/v) Fast Green FCF-Farbstoff.
    3. Wenn CRISPR-KO- und CRISPR-A-Viren gemischt werden, um sie innerhalb desselben komplexen Pools zu screenen, passen Sie die beiden Bibliotheken auf einen gleichwertigen viralen Titer mit steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung an und mischen sie in einem Verhältnis, um eine gleichmäßige Repräsentation der gRNAs in beiden Bibliotheken sicherzustellen.
  2. Vorbereitung von Mäusen für die intraduktale Injektion
    1. Betäube eine erwachsene weibliche Maus (8–20 Wochen alt) unter 4 % Isofluran mit 1 L/min Sauerstoff und trage steriles Augenschmiermittel auf beide Augen auf, um das Hornhauttrocknen während des Eingriffs zu verhindern.
      HINWEIS: Die intraduktale Injektion ist ein nicht-invasives Verfahren und erfordert keine Analgesie. Verwenden Sie Rosa26-LSL-Cas9, H11-Cas9 oder Rosa-LSL-tdTomaten-Mäuse für diese Experimente.
    2. Sichern Sie die Maus in Rückenlage auf einem abgedeckten Heizkissen, das auf niedrig eingestellt ist, um die Körpertemperatur zu halten und die Anästhesie zu erhalten, wobei Sie während des gesamten Eingriffs 2 % Isofluran mit 1 L/min Sauerstoff über den Nasenkegel verwenden.
    3. Entfernen Sie das Fell um die dritte Thorax- und die vierte Bauchbrustwarze mit Enthaarungscreme, die mit einem sterilen Wattestäbchen in einem kreisförmigen Bereich von etwa 0,5 cm Radius für 10–15 Sekunden aufgetragen wird. Entfernen Sie die Creme sofort mit steriler Mullbinde und sterilem Wasser, um Hautreizungen zu verhindern.
      HINWEIS: Die dritte und vierte Milchdrüse sind routinemäßig am einfachsten zu injizieren. Alternativ können die zweite und fünfte Drüse auf die gleiche Weise für die Injektion vorbereitet werden.
    4. Desinfizieren Sie die Haut um jede Brustwarze herum, indem Sie sequentiell mit 70 % Isopropylalkohol und Jod mit steriler Mullbinde abstreichen.
    5. Stellen Sie die Maus unter ein Seziermikroskop in einem Biosicherheitsschrank, um eine klare Sichtbarkeit der Brustwarzen zu ermöglichen.
    6. Entfernen Sie mit feiner Pinzette, gereinigt mit 70 % Ethanol, vorsichtig abgestorbene Haut, die den Sauger überlagert, um die Kanalöffnung freizulegen.
      HINWEIS: Diese abgestorbene keratinisierte Schicht ist locker angesetzt und kann den Nadeleintritt blockieren. Die Entfernung sollte keine lebensfähige Haut oder darunterliegendes Gewebe schädigen.
  3. Intraduktale Injektion
    1. Laden Sie 8 μL des verdünnten Virus in eine herausgezogene Glas-Mikrokapillare.
    2. Halten Sie den Brustwarzenbereich mit einer feinen Pinzette und führen Sie die Nadelspitze vorsichtig in die Brustwarzenöffnung (Abbildung 5A). Eine richtig platzierte Nadel dringt mit minimalem Widerstand in den Kanal ein. Geben Sie die virale Suspension langsam über 5–10 Sekunden in den Milchgang ab.
      HINWEIS: 8 μL eines 1 × 107 pfu /mL Lentivirus ergibt etwa 30 % Infektivität der luminalen Mammariatepithelzellen und eine 5 % Infektivität der basalen Mammariatepithelzellen, mit vernachlässigbarer Infektion (< 0,5 %) des Stroma36. Der virale Titer kann angepasst werden, um eine höhere oder niedrigere Infektivitität zu erreichen.
    3. Überwachen Sie die Verbreitung des Fast Green-Farbstoffs während der Injektion mit dem Seziermikroskop. Bestätigen Sie eine erfolgreiche intraduktale Lieferung, indem Sie die Farbstoffverteilung im gesamten Duktalnetzwerk unter der Haut beobachten (Abbildung 5B).
    4. Identifizieren Sie fehlgeschlagene Injektionen durch Ansammlung von Farbstoff im Fettpolster der Milch neben der Brustwarze statt entlang des Ductalbaums (Abbildung 5C).
    5. Wiederholen Sie das Injektionsverfahren für die dritte thorakale und vierte bauchbauchige Brustdrüse auf beiden Seiten, wobei insgesamt vier Drüsen pro Maus injiziert werden.
      HINWEIS: Mit Erfahrung wird eine erfolgreiche intraduktale Verabreichung in >95 % der Injektionen erreicht. Fehlgeschlagene Injektionen, die auf das Fettpad beschränkt sind, sind nicht mit Nebenwirkungen verbunden, und die übrigen Drüsen können weiterhin verwendet werden. Eine weitere Validierung der Injektionen kann durch Immunhistochemie und Durchflusszytometrie erfolgen (Abbildung 5D, E).
    6. Beenden Sie die Anästhesie und bringen Sie die Maus in einen sauberen Erholkäfig.
    7. Überwachen Sie die Maus, bis sie vollständig gehfähig ist, und bringen Sie sie zurück in das vorgesehene Biosicherheitsgehäuse, sobald normales Verhalten eingehalten ist.
    8. Drei Tage nach der Injektion wird ein vollständiger Käfigwechsel durchgeführt, wobei jegliches Gehäuse und Einstreu als virale Abfälle entsorgt werden, und die Maus in einen sauberen Käfig gebracht werden kann, der wieder in das Standardgehäuse zurückgebracht werden kann.

4. Genomische DNA-Isolierung aus Milchdrüsen und Tumoren

HINWEIS: Euthanasierung von Mäusen durch CO2-Exposition oder Überdosis von Anästhetika gefolgt von zervikaler Verrenkung gemäß den Tierpflegerichtlinien. Ernten Sie Milchdrüsen oder Milchtumoren zu den gewünschten Zeitpunkten oder zum humanen Endpunkt gemäß den regulatorischen Richtlinien. Infizierte Zellen wurden bereits 48 Stunden nach der lentiviralen Infektion,36,55 oder so spät wie 5+ Monate nach der Injektion bei Wildtyp-Mäusen36 oder >24 Monate in onkogenen Hintergründen55 entnommen. Die folgenden Schritte sollten in einem mit DNA-Erase gereinigten Raum und mit Geräten durchgeführt werden, die frei von Plasmiden mit sgRNA/dgRNA-Kassetten sind. Sogar Spuren von Plasmid-DNA reichen aus, um eine Kontamination der Gewebeproben zu verursachen, und anschließende Tiefensequenzierungs-PCRs sowie negative (ohne Gewebe) Kontrollen sollten durchgeführt werden, um saubere Präparate zu gewährleisten.

  1. Gewebedissoziation
    1. Bei den Milchdrüsen sollte jede Milchdrüse in 2 ml vollständigem Epicult-B-Medium (Maus) verdauen, ergänzt mit 0,2 ml sanfter Kollagenase/Hyaluronidase in einem 15 ml konischen Rohr, und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
    2. Pellet dissoziierte Zellen bei 450 × g für 5 Minuten bei Zimmertemperatur.
    3. Übertragen Sie vorsichtig die obere Fettschicht mit einer mit Rinderserum beschichteten Pipettenspitze auf eine neue 15-ml-Kegelröhre und entsorgen Sie den verbleibenden Supernatanten.
      HINWEIS: Die obere Fettschicht in diesem Schritt enthält oft Restepithelorganoide, die nicht getrennt wurden und weiterhin mit dem Fettgewebe assoziiert sind. Die Verarbeitung dieses Anteils in einem separaten Röhrchen erhöht die Erholung der Epithelzellen erheblich.
    4. Waschen Sie sowohl die Fettfraktion als auch das Zellpellet einmal mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung, zentrifugieren Sie bei 450 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie die Supernatanten.
    5. Kombinieren Sie die gewaschene Fettfraktion und das Zellpellet aus derselben Milchdrüse zu einem einzigen 15-mL konischen Röhrchen mit 5 mL phosphatgepuffertem Kochsalzlösung.
    6. Pellet das kombinierte Material bei 450 × g für 5 Minuten und das Supernatant entsorgen.
    7. Bei Milchtumoren wird das Gewebe mit steriler Schere oder einem Skalpell in kleine Stücke zerkleinert und direkt in ein 2-ml-Mikrofugerohr übertragen.
  2. Genomische DNA-Isolation
    HINWEIS: Die genomische DNA-Extraktion kann mit dem Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit gemäß den Herstelleranweisungen oder mit dem folgenden Phenol-Chloroform-Protokoll durchgeführt werden.
    1. Bereiten Sie einen DNA-Lysepuffer vor, indem Sie 5 mL 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 mL EDTA (pH 8,0), 25 mL 5 M NaCl und 50 mL 10% SDS kombinieren und das Endvolumen mit sterilem destilliertem Wasser auf 500 mL bringen.
    2. Fügen Sie jeder Probe 1 ml DNA-Lysepuffer und 10 μL Proteinase K (20 mg/mL) hinzu und mischen Sie gründlich durch Inversion.
    3. Inkubieren Sie Proben über Nacht bei 56 °C, um eine vollständige Lyse zu ermöglichen.
    4. Zentrifugieren Sie Lysate mit 16.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um unlösliche Trümmer zu pelletieren.
    5. Übertragen Sie das geklärte Überbeutungsmittel in ein neues 2-mL-Mikrozentrifugenrohr.
      VORSICHT: Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol ist giftig und korrosiv. Führen Sie alle Schritte, die organische Lösungsmittel in einer chemischen Abzugsdübe betreffen, während Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen.
    6. Fügen Sie ein gleiches Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol hinzu und mischen Sie kräftig durch Vortexen etwa 15 Sekunden, bis eine homogene Mischung entsteht.
    7. Zentrifugieren Sie bei 16.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um organische und anorganische Phasen zu trennen.
    8. Übertragen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase auf ein neues Rohr, ohne die Interphase zu stören.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das Aspiratieren von Material aus der weißen Interphase, um eine Kontamination von Proteinen und RNA zu minimieren.
    9. Fügen Sie 0,7 Volumen Isopropanol zur wiedergewonnenen wässrigen Phase hinzu und mischen Sie kräftig durch Vortexen für etwa 15 Sekunden.
    10. Zentrifugiere bei 16.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C.
    11. Entsorge vorsichtig den Überstandsstoff und spüle das DNA-Pellet mit 500 μL 70% Ethanol ab.
    12. Zentrifugiere bei 16.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C und entferne das Ethanol vollständig.
    13. Das DNA-Pellet 10 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
    14. Das DNA-Pellet in 50 μL sterilem destilliertem Wasser wieder suspendieren.
    15. Proben werden bei 37 °C für 1 Stunde oder über Nacht bei 4 °C inkubiert, um die vollständige Resuspension der genomischen DNA zu ermöglichen.
    16. Messen Sie die DNA-Konzentration und -Reinheit mittels Nanodrop- oder fluorometrischer Quantifizierung.

5. Next-Generation-Sequenzierung von CRISPR-Bibliotheken


HINWEIS: Erstellen Sie eine Referenzprobe, um die Berechnung der gRNA-Faltenänderungen im Zeitverlauf zu ermöglichen. Transduzierte MEFs (Abschnitt 2) oder Milchdrüsen (Abschnitt 4), die 3 Tage nach der Infektion entnommen wurden, sowie das ursprüngliche Plasmid Maxiprep, können verwendet werden, um die Leitrepräsentation in der Startbibliothek und im viralen Bestand zu bestimmen.

  1. PCR-Amplifikation von gRNA-Kassetten aus genomischer DNA
    1. Verwenden Sie in Tabelle 2 aufgeführte Primerpaare, um Proben eindeutig zu indexieren und so das Multiplexen und Demultiplexieren von bis zu 306 Proben nach der Sequenzierung zu ermöglichen.
    2. Bereite PCR-Reaktionen mit 1 μg genomischer DNA als Vorlage in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μL vor, das 25 μL 2x Q5 Master Mix, 2,5 μL 10 μM Forward Primer und 2,5 μL 10 μM Reverse Primer enthält.
    3. Fügen Sie eine Kontrollreaktion ohne Vorlage parallel ein, um auf Verunreinigungen zu achten.
    4. Durchführung der PCR-Verstärkung unter den folgenden Zyklusbedingungen, wobei die Annealing-Temperatur basierend auf der bibliotheksspezifischen Primer-Schmelztemperatur angepasst wird:
      1 Zyklus mit 98 °C für 30 Sekunden
      5 Zyklen mit 98 °C für 10 s, 68 °C (-1 °C/Zyklus) für 10 s und 72 °C für 15 s
      20 Zyklen mit 98 °C für 10 Sekunden, 63 °C für 30 S. und 72 °C für 15 Sekunden
      1 Zyklus mit 72 °C für 2 Minuten
    5. Verwenden Sie PCR-Produkte mit einem 2,5%igen Agarosegel, um die korrekte Amplicongröße zu überprüfen.
    6. Bestätigen Sie das Vorhandensein von Bändern bei etwa 306 bp für pLKO-basierte sgRNA-Bibliotheken und 430 bp für pXPR502-basierte dgRNA-Bibliotheken (Abbildung 6).
      HINWEIS: Eine klare Kontrolle ohne Schablone gewährleistet die Reinheit der Reagenzien und bestätigt, dass der Test frei von Kreuzkontamination ist.
    7. Reinigen Sie PCR-Produkte mit einer geeigneten DNA-Reinigungsmethode und quantifizieren Sie die DNA-Konzentration mittels fluorometrischer Quantifizierung.
  2. Next-Generation-Sequenzierung
    1. Bestimme die erforderliche Sequenztiefe basierend auf der erwarteten Bibliothekskomplexität und der Klonalität der Samples.
      HINWEIS: Für Tumore, die als klonal vermutet werden, reichen etwa 1 Million Reads pro Probe aus, um die Leitrepräsentation genau zu quantifizieren. Um die Sequenzierungstiefe von Milchdrüsen zu berechnen, multiplizieren Sie die Anzahl der Guides in der Bibliothek mit einer 1.000-fachen Abdeckung und dann mit 6 pg genomischer DNA/Zelle, um die Gesamtmasse der genomischen DNA pro Probe zu berechnen, die PCR-amplifiziert werden sollte. Die Gesamtzahl der für die Sequenzierung benötigten Lesearten entspricht der Anzahl der Guides in der Bibliothek mal 1.000.
    2. Poole gereinigte Bibliotheken aus verschiedenen Proben bei gleichmolaren Konzentrationen.
    3. Sequenzpool-Bibliotheken mit einer kurz gelesenen Illumina-Sequenzierungsplattform.
  3. Datenanalyse
    1. Demultiplexing von rohen FASTQ-Dateien mit beispielspezifischen Indizes.
    2. Trim liest die gRNA-Protospacer-Sequenz mit Trimmomatic69 aus. Für CRISPR-A-Proben zeigt der Trimm 14 bp an, und bei CRISPR-KO zeigt der Trimm 20 bp vom Ende des vorderen Primers aus.
    3. Align Trimmed liest mit Bowtie70 in die entsprechende gRNA-Referenzbibliothek. Verwenden Sie die Ausrichtungsparameter -v 2 und -m 1 für CRISPR-KO sowie -v 2 und -m 2 für CRISPR-A und gemischte Pools.
      HINWEIS: In der Regel sind über 90 % der Lesungen erfolgreich ausgerichtet. Niedrige Ausrichtung resultiert typischerweise aus Trimmfehlern, falscher Formatierung der Eingabedateien oder Probenkontamination während der PCR.
    4. Quantifizieren Sie abgeleitete Lesungen für jede gRNA mit der Zählfunktion in MAGeCK72 , um endgültige gRNA-Zähltabellen für die nachgelagerte Analyse zu erstellen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll für das gepoolte in vivo CRISPR-Screening in der Mammarisdrüse der Maus bereit. Diese Pipeline kann End-to-End-Anwendungen nutzen, um gepoolte gRNA-Bibliotheken aus Oligonukleotid-Arrays zu entwerfen und zu amplifizieren, die gRNA-Bibliotheken in lentivirale Rückgrate zu klonen, High-Titer Lentivirviren zu produzieren, intraduktale Abgabe gepoolter lentiviraler Bibliotheken in die adulte Mammariendrüse durchzuführen und gRNAs für sequenzierungsbasierte Dekonvolution der Bibliotheksrepräsentation wiederherzustellen (Abbildung 1).

Die erfolgreiche Amplifikation und das Klonieren gepoolter gRNA-Bibliotheken werden zunächst mittels Agarose-Gel-Elektrophorese bewertet. Die PCR-Amplifikation von gRNA-Bibliotheken liefert diskrete Bänder, die eine einheitliche Amplifikation aus gepoolten Oligonukleotid-Chip-Arrays anzeigen (Abbildung 2A). Die Restriktionsverdauung der pXPR502 PPH-Cre- und pLKO-Cre-Rückgrate führt zu einer klaren Trennung des linearisierten Rückgrats vom Füllerfragment (Abbildung 2B,C). Eine effiziente Verdauung und eine saubere Rückgewinnung des Rückgrats sind entscheidend, um die Hintergrundligierung zu minimieren und eine hohe Bibliothekskomplexität beim Klonen zu erreichen.

Ein wichtiger Aspekt bei der Verwendung von CRISPR-KOALA ist die Effizienz von dgRNAs in Kombination mit lebendem Cas9 im Vergleich zu anderen konventionellen Ansätzen, die vollwertige sgRNAs und totes Cas9 verwenden. Wir haben bereits gezeigt, dass dgRNAs mit lebendem Cas9 ausreichen, um Genaktivierung mit etwa 50–85 % der Effizienz von vollwertigen sgRNAs55 zu induzieren. Um diese Verringerung der Aktivierung auszugleichen und das Potenzial ineffizienterer dgRNAs im Vergleich zu sgRNAs zu überwinden, wollen wir in unser Bibliotheksdesign doppelt so viele dgRNAs pro Gen aufnehmen. Da diese Methodik auf die Verwendung von lebendem Cas9 zur Gen-Knockout beschränkt ist, schlossen wir an, dass dieses Aktivierungsniveau für das CRISPR-Screening ausreichend ist. Um dies zu testen, führten wir eine dgRNA-vermittelte Genaktivierung mehrerer endogener Gene, darunter Erbb2, Esr1 und Plgrkt, durch und erreichten eine robuste Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinniveau55. Wichtig ist, dass wir regelmäßig eine 3- bis 10-fache Steigerung der Zielgenexpression erreichten, was oft physiologisch relevanter ist als die 100- bis 1.000-fachen Steigerungen, die bei mehreren herkömmlichen CRISPR-A-Systemen beobachtet wurden.

Die Bibliothekskomplexität nach Ligation und Elektroporation wird durch die Beschichtung serieller Verdünnungen transformierter Bakterien bewertet. Ein erfolgreiches Bibliotheksklonen zeigt sich durch dichte und gleichmäßig verteilte Kolonien in Ligationsreaktionen im Vergleich zu wenigen Kolonien auf den nur Rückgrat-negativen Kontrollplatten (Abbildung 3). Kolonienzahlen auf Verdünnungsplatten werden verwendet, um die Bibliotheksrepräsentation zu schätzen und eine Abdeckung von mehr als 1.000 Mal anzustreben (z. B. 1.000 bakterielle Kolonien pro gRNA in der Bibliothek). Unzureichende Abdeckung oder hoher Hintergrund auf den negativen Kontrollplatten deutet auf suboptimale Ligation und/oder Elektroporation hin. In diesem Fall sollten diese Schritte vor der großflächigen Expansion der Bakterienkulturen wiederholt werden.

Für intraduktale Milchdrüseninjektionen und gesammelte In-vivo-Screenings müssen lentivirale Präparate konzentriert werden, um ausreichend hohe funktionelle Titer zu erreichen. Hochtiter-Virusproduktion kann durch funktionelle Titration mit LSL-tdTomaten-Maus-embryonalen Fibroblasten (MEFs, JAX# 007909) validiert werden, da sowohl die in diesem Protokoll hervorgehobenen pLKO- als auch pXPR502-Rückgrate Cre ausdrücken. Alternative Methoden für andere Rückgrate können jedoch bei Bedarf verwendet werden (z. B. Verwendung eines anderen fluoreszierenden Reporters oder Antibiotikaselektion innerhalb des lentiviralen Rückgrats). Effiziente lentivirale Präparate zeigen eine klare, dosisabhängige Induktion der tdTomato-Expression mit linearem Bereich, was die Berechnung funktioneller Titer ermöglicht (Abbildung 4A–D). Für gepoolte und multiplexierte CRISPR-KO- und CRISPR-A-Screens werden Lentiviren separat produziert, konzentriert und titeriert, und funktionelle Titer werden verwendet, um die beiden lentiviralen Bibliotheken vor der Infektion in definierten Verhältnissen zu normalisieren und zu mischen.

Eine korrekte und effiziente Abgabe der gesammelten lentiviralen Bibliotheken in die adulte Milchdrüse ist erforderlich, um das Milchepithel optimal zu infizieren. Die richtige Platzierung der Glas-Mikrokapillare mit der Brustwarze, um Zugang zum Milchgang zu ermöglichen (Abbildung 5A), ist entscheidend, um das Lentivirus über den Ductalbaum zu verbreiten. Eine geeignete Nadelspitze ermöglicht eine Ladung des Lentivirus in die Nadel selbst und ermöglicht mit minimalem Widerstand den Eintritt in den Milchgang. Erfolgreiche Injektionen zeigen sich durch gleichmäßige Ausbreitung des Fast Green-Farbstoffs im gesamten Milchgangbaum, der unmittelbar nach der Injektion extern in den Drüsen sichtbar ist (Abbildung 5B). Im Gegensatz dazu sind fehlgeschlagene Injektionen durch eine Ansammlung von Farbstoff unter der Brustwarze gekennzeichnet, wodurch die Abgabe in die Fettpolster der Milch und nicht in den Milchgang gespiegelt wird (Abbildung 5C). Die immunhistochemische Färbung von Milchgewebeschnitten kann verwendet werden, um eine Infektion von Epithelzellen zu bestätigen (Abbildung 5D), und die Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um den Anteil der luminalen und basalen Epithelzellinfektionen zu quantifizieren (Abbildung 5E), beide bestätigen die erfolgreiche Zielsetzung von Mammatepithelzellen nach der intraduktalen Verabreichung.

Sobald genomische DNA gefunden wurde, wird sie mit PCR für eine Tiefensequenzierung der nächsten Generation amplifiziert, um zu quantifizieren, welche gRNAs in einer bestimmten Probe angereichert wurden. Nach der PCR werden die Produkte durch Gelelektrophorese getrennt, was zu lentiviral-spezifischen Produkten führen sollte (Abbildung 1 und Abbildung 6). Gelegentlich kann eine unspezifische Amplifikation beobachtet werden, insbesondere in CRISPR-A-Proben (Abbildung 6B), obwohl dieses Produkt üblicherweise größer als 1.000 bp ist und gut vom gewünschten Produkt getrennt ist; Das Vorhandensein eines starken Bands in der erwarteten Größe deutet jedoch auf eine erfolgreiche Bibliothekswiederherstellung hin. Kontrollreaktionen ohne Vorlage sollten kein nachweisbares Band liefern, und das Vorhandensein einer Amplifikation in diesen Kontrollen deutet auf eine Kontamination hin, die die nachgeschaltete Bibliotheksquantifizierung beeinträchtigt (Abbildung 7A). Wenn diese Verunreinigung festgestellt wird, sollte jeder Grundmaterial mit Wasser als Vorlage getestet werden, um die Quelle der Verunreinigung zu identifizieren, wobei diese Grundierung(en) sofort ersetzt werden. Gereinigte Amplikone werden bei äquimolaren Verhältnissen zusammengefasst und auf einer kurz lesbaren Illumina-Sequenzierungsplattform zur Quantifizierung der nachgelagerten Guides sequenziert.

Die Sequenzierung von Bibliotheken liefert ein klares Maß für den Erfolg des Bibliotheksklonens und der viralen Produktion. Optimal produzierte und qualitätskontrollierte Bibliotheken zeigen eine gleichmäßige Repräsentation über gRNAs hinweg, ohne (oder nur sehr wenige) Leitfäden, die in transduzierten Zellen fehlen (Abbildung 7B). Bei großen Bibliotheken hat der Ausfall einer kleinen Anzahl von gRNAs keinen starken Einfluss auf die Leistung der Bibliothek, wenn die verbleibenden gRNAs für jedes Gen gut vertreten sind.

Bisher wurde dieser Screening-Ansatz überwiegend verwendet, um die Neigung einzelner klonaler genetischer Störungen zur Steuerung der Umwandlung von Mammaria-Epithelzellen und des Tumorwachstums in tumorsensibilisierten genetischen Hintergründenzu bewerten 36,55. Die Dissektion und Sequenzierung eines einzelnen klonalen Tumors zeigt oft eine klonale Anreicherung einer einzelnen gRNA, die als Screen Hit klassifiziert werden kann (Abbildung 7C). In manchen Fällen sind bei Tumoren zwei oder mehr gRNAs in etwa gleichem Anteil vorhanden. Diese können entweder das Ergebnis einer doppelten Infektion sein oder zwei Klone, die zusammen zu einer einzigen Tumormasse wachsen. Manchmal ist es möglich, diese beiden Möglichkeiten durch das Probenentnehmen mehrerer Bereiche desselben Tumors zu entwirren, jedoch ist dieses Maß an Granularität meist nicht erforderlich. Echte Treffer lassen sich leicht von mehreren Infektionen durch ihre Prävalenz über viele Tumore im Screening unterscheiden, während zufällige Beobachter nicht bei mehreren Tumoren wiederauftreten. Unser Standardansatz für das Aufrufen von Treffern auf einem Bildschirm besteht darin, eine Lesezählungsgrenze von 80 % festzulegen, wobei jede gRNA, die mindestens 80 % der Lesezählungen innerhalb einer gegebenen Probe besitzt, als Treffer bezeichnet wird. Die Quantifizierung der Anzahl dieser Treffer über alle sequenzierten Tumoren hinweg identifiziert, welche Gene die stärksten phänotypischen Effekte haben.

Diese Methode kann auch an Milchdrüsen vor der Tumorbildung angewendet werden, indem die gRNA-Häufigkeit mit Werkzeugen wie MAGeCK71 bewertet wird. In diesem Kontext funktioniert dieser Ansatz gut im Kontext des Anreicherungsscreenings. Obwohl ein Test auf Depletion möglich ist, erfordert dies eine deutlich höhere Abdeckung, und die resultierenden Daten können weniger zuverlässig sein, da es statistisch schwierig ist festzustellen, ob eine gRNA zu Beginn des Screenings erschöpft war oder einfach nicht vorhanden war. CRISPR-StAR bietet in dieser Hinsicht eine wertvolle alternative Technologie: 9,10, muss aber für das In-vivo-Screening in GEMMs optimiert werden.

Zusammen liefern diese repräsentativen Ergebnisse Qualitätskontroll-Benchmarks für jeden wichtigen Schritt des gebündelten in vivo CRISPR-Screening-Workflows, von der Bibliotheksklonierung und Virusproduktion bis hin zur intraduktalen Abgabe und sequenzierungsbasierter Dekonvolution.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der in-vivo-Screening-Pipeline für die Mammariendrüse der Maus. Dieses Protokoll umfasst das Design von gRNA-Bibliotheksolikotid-Chips, Bibliotheks-PCR und Klonierung, lentivirale Präparate, intraduktale Milchdrüseninjektionen und anschließende nachgelagerte Analysen zu dekonfaltenden Treffern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Amplifikation und Klonierung der gRNA-Bibliothek. Repräsentative Agarose-Gel-Bilder für (A) PCR-Reaktionen der gRNA-Bibliothek, (B) verdautes pXPR502 PPH Cre-Rückgrat und (C) verdautes pLKO-Cre-Rückgrat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Repräsentative Bilder der seriellen Verdünnung des Bakterienpools, transduziert mit der gRNA-Bibliothek nach der Elektroporation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 4: Lentivirale Titerung. (A–D) Repräsentative Flusszytometrie zur Berechnung viraler Titer aus einem Beispiel (A und B) niedriger Titer und (C und D) hoher Titer viraler Vorbereitung. In beiden Fällen wurden LSL-tdTomato MEFs mit Cre-exprimierenden Viren transduziert, wie in Abschnitt 2.5 angegeben. (E) Repräsentative Ergebnisse des Zählvergleichs zwischen tief sequenzierten Plasmiden und transfectierten Zellen, die eine schlecht repräsentierte Bibliothek (links) zeigen, mit großer Variation in den Zählungen und vielen niedrigzähligen gRNAs, im Vergleich zu einer gut repräsentierten Bibliothek mit enger Verteilung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-5
Abbildung 5: Intraduktale Injektion der Milchdrüse. (A) Blick auf die Glasnadel, die in die Brustwarze eingeführt wird. (B) Erfolgreiche Injektion, angezeigt durch das Durchdringen des Baumes durch den Baum durchdringenden Farbstoff, gesehen von außen an der Maus (links) oder in einer unmittelbar nach der Injektion dissektionierten Brustdrüse (rechts). (C) Fehlgeschlagene Milchinjektion, angezeigt durch das Ansammeln von Farbstoff unter der Brustwarze. (D) Mit Anti-GFP gefärbte Milchschnitte zeigen infizierte Zellen. (E) Repräsentative Flowzytometriediagramme, die GFP+-infizierte luminale und basale Zellen zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-6
Abbildung 6: Sequenzierungsbasierte Dekonvolution von Proben. Repräsentative tiefe Sequenzierungsgele aus (A) MEF-Proben sowie Plasmid- und (B)-Tumorproben. Beachten Sie, dass das 1-KB-Band für einige CRISPR-A-Samples ein unspezifisches Band ist und außer Acht gelassen werden sollte. Die Konstrukte, die zur Probe beitragen, sind oberhalb der Bohrungen angegeben (KO für pLKO und A für pXPR502). Variationen in der Bandintensität sind normal, aber ein vollständiges Fehlen eines Bandes weist auf eine fehlgeschlagene Reaktion hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 7: Bibliotheksrepräsentation und repräsentative Ergebnisse der Tumor-Deep-Sequenzierung. (A) Mapping liefert für einen erfolgreich sequenzierten Tumor im Vergleich zu einer kontaminierten Tiefsequenzierungsreaktion, bei der viele Reads nicht auf die Bibliothek abgebildet werden können. (B) Repräsentative Ergebnisse zeigen eine Sequenzierung von einem Plasmid, einem klonalen Tumor und einem Bereich der Milchdrüse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Bibliotheksdesign und Einführungen.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Tabelle 2: Liste der Tiefsequenzierungsprimer.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein wichtiger Aspekt bei der Pooled in vivo CRISPR-Screening ist die Erreichung einer ausreichenden Bibliotheksabdeckung bei gleichzeitiger sparsamer, einzelzelliger Transduktion zur Erhaltung klonaler Auflösung2. In der Maus-Milchdrüse besteht das epitheliale Kompartiment konservativ aus etwa 3,5 × 105 Zellen proDrüse 36. Bei einer durchschnittlichen lentiviralen Transduktionsrate von 15 %, was die Häufigkeit mehrerer Infektionen pro Zelle minimiert, führt die intraduktale Abgabe zu etwa 5 × 104 transducierten Epithelzellen proDrüse 36,55. Die beidseitige Injektion sowohl der dritten thorakalen als auch der vierten Bauchbauchdrüse ergibt daher ~2 × 105 transduzierte Epithelzellen pro Maus36,55. Basierend auf diesen Parametern benötigt eine Bibliothek mit 4.000 gRNAs (entsprechend ~1.000 Genen für CRISPR-KO oder ~500 Gene für CRISPR-A) etwa 4 × 106 transduzierte Zellen, um eine robuste Repräsentation von 1.000-facher Menge pro gRNA zu erreichen, was einer Kohortengröße von etwa 20 Mäusen entspricht. Wenn ein starker Gain-of-Function-Phänotyp erwartet wird, könnte eine geringere Abdeckung (z. B. 400× oder 8 Mäuse) ausreichen. Alternativ könnte eine höhere Infektionsrate von z. B. 30–35 % auch machbar sein, insbesondere für größere Bibliotheken. Andererseits erfordern Experimente mit basalen Mammariatepithelzellen möglicherweise höhere lentivirale Titer oder größere Tierzahlen, um eine ausreichende Abdeckung zu gewährleisten, während dieser lentiviral-vermittelte Ansatz aufgrund der extrem geringen Infektionsfähigkeit dieser Zellenwahrscheinlich nicht für stromale Störungen geeignet ist. Dieses quantitative Rahmenwerk bietet eine praktische Grundlage für das experimentelle Design, indem es Bibliothekskomplexität, Tiernutzung und klonale Auflösung ausbalanciert, und kann an andere Screening-Kontexte angepasst werden, indem geschätzte Zielzellzahlen und gewebespezifische Transduktionseffizienz angepasst werden.

Obwohl dieses Protokoll skalierbares, in vivo pooltes CRISPR-Screening ermöglicht, sollten bei der Gestaltung von Experimenten mehrere Einschränkungen berücksichtigt werden. Erstens ist die effektive Bibliotheksabdeckung von Natur aus durch Gewebegröße und erreichbare Transduktionseffizienz eingeschränkt, was gezielte statt genomweite Bibliotheken für die meisten in vivo-Anwendungen erforderlich macht2. Die Variabilität der intraduktalen Injektionseffizienz zwischen Drüsen und/oder Tieren kann die effiziente Abdeckung weiter verringern und sollte durch sorgfältige Injektionstechniken, konsequente virale Titerung und Pilotexperimente zur Schätzung der Infektionsraten bei verschiedenen viralen Titern gemindert werden. Trotz dieser potenziellen Variabilitätsquellen haben wir kürzlich gezeigt, dass CRISPR-Screens mit einer Bibliothek von 4.000 gRNAs bei 20 Mäusen nach Bibliotheksdekonvolution55 nahezu die Sättigung erreichen.

Um die effektive Anzahl der Mäuse zu reduzieren, die für eine so robuste Abdeckung erforderlich ist, ist es in der Praxis möglich, zusätzlich zur dritten thorakalen und vierten Bauchbrustdrüse, wie in diesem Protokoll hervorgehoben, die zweite thorakale und fünfte leistende leistende Milchdrüse zu injizieren. Während die Brustwarzen dieser zusätzlichen Drüsen während des Eingriffs beim Dissektionsmikroskop gut beobachtet werden, wird die erste Halsmutterdrüse oft von den Vorderglieden, die an der Nasenkegel befestigt sind, bedeckt und verdeckt. Da sich jede Milchdrüse sowohl innerhalb als auch zwischenPaaren 72 voneinander unterscheidet, müsste die Anzahl der Milchepithelzellen in diesen zusätzlichen Drüsen empirisch bestimmt werden, um die effektive Abdeckung zu berechnen. Ein wichtiger Aspekt ist jedoch, dass die Induktion von Mammartumoren über acht Mammardrüsen einer einzelnen Maus zu einem totalen kumulativen Tumorlastendpunkt vor der offenen Anreicherung aller gRNA-haltigen Klone führen kann. Alternativ können spannende neue Ansätze zur Reduzierung der Abdeckungen für das in vivo CRISPR-Screening erforderlich sind, wie CRISPR-StAR (Stochastic Activation by Recombination)9,10, mit unserer CRISPR-KOALA-Technologie kombiniert werden. CRISPR-StAR führt sowohl eine einzigartige Linienspur für jede gRNA als auch eine intern gesteuerte negative Kontrolle ein, die nachweislich die Anforderungen an die Screening-Abdeckung in Xenograft-Settings um mehr als zwei Größenordnungen9 senkt. Ob diese Prinzipien auf unsere CRISPR-KOALA-Technologie angewendet werden können, muss noch getestet werden, bietet aber eine spannende Gelegenheit, die Anzahl der pro Screening benötigten Tiere weiter zu reduzieren.

Neben der Ermöglichung eines gepoolten in vivo CRISPR-Screenings vereinfacht dieses Protokoll die intraduktale Abgabe im Vergleich zu bestehenden Ansätzen. Frühere Methoden zum direkten Zugang zum Mammarduktalsystem basierten auf chirurgischer Exposition der Drüse50 oder auf Hamilton-Spritzen zur Injektion51, die invasiv und technisch umständlicher sein können. Im Gegensatz dazu verwendet die hier beschriebene nicht-chirurgische intraduktale Injektionsstrategie feine Glas-Mikrokapillarnadeln, die eine schnelle, reproduzierbare Abgabe von konzentriertem Lentivirus mit minimaler Gewebestörungermöglicht. Dieser stromlinienförmige Ansatz ermöglicht die effiziente Erzeugung großer Mengen unabhängig gestörter Epithelklone und eignet sich besonders gut für die gesammelte lentivirale Verabreichung in Screening-Anwendungen, bei denen maximale Virusausbreitung wichtig ist.

Eine große Stärke dieser Pipeline ist, dass das Framework hoch anpassungsfähig über Zelllinien und Gewebekontextehinweg ist. Die Prinzipien des gezielten gRNA-Bibliotheksdesigns, der sparsen lentiviralen Transduktion und der sequenzierungsbasierten Dekonvolution entsprechen denen, die in herkömmlichen in vitro CRISPR-Screensverwendet werden 2. Hier bieten wir jedoch eine zusätzliche Plattform zur multiplexierten CRISPR-KO und CRISPR-A innerhalb desselben Screenings, die in vitro im genomweiten Maßstab genutzt werden können, wobei höhere Zellzahlen eine höhere Bibliothekskomplexität und eine tiefere Abdeckung ermöglichen. Die Verwendung der toten Leit-RNAs für CRISPR-A ermöglicht die Nutzung derselben Cre-induzierbaren oder konstitutiven Cas9-Maus, um CRISPR-A und CRISPR-KO durchzuführen. Zusätzlich können diese Experimente innerhalb derselben Milchdrüse durchgeführt oder in derselben Zelle multiplexiert werden, wobei Konstrukte verwendet werden, die sowohl eine sgRNA als auch eine dgRNA55 exprimieren. Da das CRISPR-Screening-Protokoll auf stabiler lentiviraler Integration und Barcode-Wiederherstellung basiert, ist es auch kompatibel mit und kann für alternative Störungsmodalitäten wie CRISPR-Inhibition62, Cas12 73,74 und ORF-basierte Screens75 angepasst werden. Zusätzlich zum Screening kann dieselbe Pipeline genutzt werden, um einzelne Gene zu stören, indem einzelne gRNAs, siRNAs oder ORFs geklont und als einzelne Perturbationen auf die gleiche Weise bereitgestellt werden: 36,55,67,76,77,78,79.

Außerdem wird es von großem Interesse sein, diese Technologie auf andere Arten, insbesondere auf die Ratte80, anzupassen. Die größere Größe der Rattenmilchdrüse würde die Nutzung deutlich erweiterter Bibliotheken ermöglichen, während eine hohe Abdeckung und Infektionseffizienz von80 % erhalten bleiben. Darüber hinaus wiederholt die Mammarienbiologie der Ratten bestimmte Merkmale der menschlichen Drüse genauer als die der Maus 80,81,82,83,84,85; Zum Beispiel sind Maus-Mammarientumoren überwiegend hormon-unabhängige83, während Ratten-Mammarientumoren häufig hormonabhängig 81,82,85 sind.

Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen praktischen und reproduzierbaren Ansatz für das pooled in vivo CRISPR-Knockout- und Aktivierungsscreening in der erwachsenen Maus-Milchdrüse. Durch die Integration gezielter Bibliotheksgestaltung mit hochtitritriver lentiviraler Produktion, vereinfachter nicht-chirurgischer intraduktaler Abgabe und sequenzierungsbasierter Dekonvolution senkt es die technischen Hürden für die funktionelle Genomik in vivo und ermöglicht eine direkte Untersuchung der Genfunktion in nativen Gewebeumgebungen. Dieser Rahmen sollte eine breitere Einführung von gebündelten In-vivo-Screening-Ansätzen erleichtern und eine systematische Untersuchung kontextabhängiger genetischer Regulatoren von Gewebehomöostase und -erkrankungen unterstützen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S. ist Berater und Gründer von ViVerita Therapeutics, und sein Labor hat Forschungs- und Serviceverträge mit ViVerita Therapeutics gesponsert.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken allen Mitgliedern unserer Labore für hilfreiche Kommentare und Diskussionen zu dieser Arbeit. Wir danken und würdigen außerdem das Centre for Phenogenomics für alle Hilfe und Expertise bei der Mausarbeit am Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute (LTRI) in Toronto, Kanada. Diese Studie wurde durch einen Projektzuschuss der Canadian Institutes of Health Research (PJT462506) sowie ein Terry Fox Research Institute Program Projects Grant für D.S. (TFRI Project #1107), für D.S. und von der Nicol Family Foundation unterstützt. E.R.L. wurde durch den Canadian Cancer Society Research Training Award und den Frank Fletcher Memorial Fund unterstützt. K.N.A. wurde durch einen H.L. Holmes Postdoctoral Award sowie Fördermittel 1318698 und 26089 der Cancer Research Society unterstützt. J.N. wurde durch ein Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship – Master und einen Canadian Institutes of Health Research Doctoral Research Award (#193389) unterstützt. Y.L. wurde vom Research Excellence, Diversity, and Independence Fellowship des Canadian Institutes of Health Research (#ED6-190718) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,45-Mikron-FilterSigmaS2HVU02RE
12k oder 92k Oligo ChipCustomarray Inc. (Genscript)
15 cm ZellkulturplattenCorningCLS353004
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
Alkaline PhosphataseNEBM0290L
AmpicillinFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
Cutsmart-PufferNEBB6004S
Deep Sequencing (Next-Seq oder Hi-Seq)Illumina
DNAesy Blood and Tissue DNA ExtraktionskitQiagen69506
Dulbecco’s modifiziertes Eagle-MediumWisent319-015-CL
Endura Elektrokompetente ZellenLucigen60242-1
EpiCult-B Mouse Medium KitStemcell Technologies05610
Esp3INEBR0734L
Fetal Bovine SerumWisent090-150
Gel DNA-Cleanup-KitZymo ResearchD4008
Gene Pulser/MicroPulser ElektroporationsküvettenBioRad1652089
Gentle Collagenase/HyaluronidaseStemcell Technologies7919
H11-Cas9Jackson LabratoriesJAX#028239
HochgeschwindigkeitszentrifugeBeckman CoulterMLS-50
Kim-wipeKimberly-Clark34155
LB-AgarWisent Technologies800-011-LG
Mikropipetten-ZieherSutter InstrumentP97
Mini-Prep-Plasmid-KitFrogga BioPDH300
NEBuffer 3.1 (Puffer für BsmBI)NEBR0580L
Oligo Clean and ConcentratorZymo ResearchD4061
Oligo Cleanup-KitZymo ResearchD4060
PAGE gereinigter Illumina-SequenzierungsprimerIDT DNA
PCR-MikropipettenDrummond5-000-1001-X10
PEI (Polyethylenimin)Sigma408727-100ML
Penicillin und StreptinomycinWisent450-201-EL
pLKO-CreAddgene158032
pMD2.GAddgene12259
Poly-L-LysinSigmaP2636-100MG
psPAX2Addgene12260
pXPR502-PPH-CreAddgene256776
Q5 Polymerase 2x Master MixNEBM0494L
Qubit Fluorometrische QuantifizierungInvitrogenQ33327
R26-LSL-Cas9-EGFPJackson LabratoriesJAX#024857
R26-LSL-TdTomato MäuseJackson LabratoriesJAX#007909
SapINEBR0569L
T4 DNA LigaseNEBM0202L
UltrazentrifugenrohreBeckman Coulter344058
Vakuum-Filter-EinheitenFisher ScientificSCHVU02RE

Referenzen

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