Methodenartikel

Erkennung und Zuweisung von Ultraschalllautäußerungen an einzelne Mäuse während sozialer Interaktionen

196 Ansichten

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DOI:

10.3791/71121

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7. Juli 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychological and Brain Sciences, University of Delaware, 2Interdisciplinary Neuroscience Graduate Program, University of Delaware, 3Center for Bioinformatics and Computational Biology, Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Aufzeichnung synchronisierter Video- und Audiodaten während sozialer Interaktionen mit mehreren Maus. Die Methode verwendet ein Mikrofonarray und eine Lokalisierung der Schallquellen, um einzelnen Mäusen Ultraschallvokalisierungen (USVs) zuzuweisen, was eine quantitative Analyse des Stimmverhaltens zwischen Tieren und sozialen Kontexten ermöglicht.

Zusammenfassung

Mäuse (Mus musculus) kommunizieren während sozialer Interaktionen mit ultraschallartigen Lautäußerungen (USVs). Da Maus-USVs jedoch nicht mit klaren visuellen Indikatoren verbunden sind und in Frequenzen außerhalb des menschlichen Hörbereichs auftreten, bleibt es schwierig, einzelne vokalisierende Mäuse innerhalb einer Gruppe zu identifizieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Aufnahme synchronisierter Video- und Ultraschall-Audiodaten während sozialer Interaktionen zwischen mehreren Tieren, wodurch die gleichzeitige Erfassung von Verhalten und Stimmaktivität ermöglicht wird. Eine rechnergestützte Pipeline wird beschrieben, die Multi-Tier-Tracking, Vokalisationserkennung, Schallquellenlokalisierung und Zuweisung von Lautzuweisungen an einzelne Tiere integriert. Die Validierungsverfahren, die zur Bewertung der Verfolgungsgenauigkeit, der Vokalisations-Extraktion, der Lokalisierungspräzision und der Zuweisungssicherheit in jeder Phase der Pipeline verwendet werden, werden weiter beschrieben. Die Anwendung dieses Protokolls auf einen viertierigen Demonstrationsdatensatz ermöglicht individuell aufgelöste Vokalisationsverfolgung, räumlich präzise Schallquellenschätzungen und quantitative Messungen von Stimmausgabe und akustischen Merkmalen. Zusammen bieten diese Ansätze einen robusten Rahmen, um vokale Kommunikation mit individuellem Verhalten zu verknüpfen und ermöglichen nachgelagerte Analysen von Geschlechtsunterschieden, individueller Variabilität und sozialer Kommunikation bei frei interagierenden Mäusen.

Einleitung

Soziale Kommunikation im Tierreich ist ein wesentlicher Bestandteil der Verhaltensdynamik und unterstützt Prozesse wie Überleben und Fortpflanzung 1,2. Bei Säugetieren kommunizieren Mäuse akustisch über USVs, die Frequenzen von 35 bis 110 kHz3 abdecken. USVs zeigen komplexe Merkmale und vermitteln Informationen je nach Verhaltenskontext4. Weibliche Mäuse zeigen eine Präferenz für männliche Maus-USVs 5,6, und männliche und weibliche Mäuse interagieren während der Balzverhalten7 vokal, was darauf hindeutet, dass USVs als wichtige soziale Signale fungieren. Da spezifische USV-Merkmale mit unterschiedlichen Mausverhaltenszuständen8 verknüpft sind, ist es für das Verständnis sozialer Interaktionen unerlässlich, Individuen genau Lautäußerungen zuzuweisen.

Trotz umfangreicher Bemühungen, die Funktionen von USVs und ihre Beziehung zum sozialen Verhaltenaufzuklären, besteht eine anhaltende Herausforderung in diesem Bereich darin, USVs während Gruppeninteraktionen einzelnen Mäusen zuzuweisen. Schwierigkeiten entstehen sowohl durch fehlende sichtbare Mundbewegungen während der USV-Produktion4 als auch durch den Frequenzbereich der USVs für das menschliche Ohrunhörbar. Daher waren frühere Studien zur Beziehung zwischen USVs und sozialem Verhalten auf vereinfachte Tests oder eingeschränkte Umgebungen beschränkt, die die Bandbreite beobachtbarer Gruppenverhaltensweisen einschränken9 und nur teilweise Einblick darin geben, wie sich vokales Verhalten bei frei interagierenden Tieren entwickelt.

Um das Verständnis der Beziehung zwischen auditiver Kommunikation und sozialem Verhalten zu verfeinern, ist es notwendig, ein vollständiges Spektrum von Mausverhaltensweisen zu erfassen und Individuen innerhalb einer Gruppe Lautäußerungen zuzuweisen. Die Aufklärung von Vokalizer-Identitäten ist unerlässlich, um geschlechts- und kontextabhängige Stimmbereiche bei Individuenzu bestimmen 8, kausale Hypothesen darüber zu testen, wie bestimmte vokale Merkmale konspezifisches Verhalten antreiben 10,11,12, und – wo zutreffend – die Korrelation der Stimmausgabe mit gleichzeitig gemessenen Gehirnsignalen (z. B. Elektrophysiologie)13. Historisch glaubte man, dass männliche Mäuse die einzigen Vokalisatoren seien; allerdings zeigte die Lokalisierung der Schallquellen, dass weibliche Mäuse auch USVs in Gruppensettings7 oder wenn sie mit einem männlichen14 gepaart sind. Ohne zu bestimmen, welches Tier einen USV ausgestoßen hat, bleibt die Verbindung von stimmlichen Merkmalen mit individuellem Verhalten und sozialen Ergebnissen in frei interagierenden Gruppen begrenzt. Daher ist es unerlässlich, ein Lokalisationssystem zu verwenden, das die Zuweisung von Vokalisationen an einzelne Tiere ermöglicht und dabei die natürliche Interaktionsdynamik beibehält.

Das hier beschriebene Mikrofonarray-Schallquellen-Lokalisierungssystem, das zuvor in 7,15 veröffentlicht wurde, schätzt den räumlichen Ursprung von USVs innerhalb einer Arena und verfolgt die Positionen aller zum Zeitpunkt der Lautäußerung anwesenden Tiere, sodass Lautäußerungen dem Emitter zugeordnet werden können. Schallquellen-Schätzungen und erfasste Tierpositionen werden anschließend mithilfe einer wahrscheinlichkeitsbasierten Kennzahl integriert, um die Zuweisung von USVs an einzelne Tiere zu unterstützen. Die Lautisationszuweisung wandelt zuvor mehrdeutige Gruppenvokalaufnahmen in markierte Tiervokaldatenum 7,15, was quantitative Analysen ermöglicht, die Vokalisationstyp und -timing mit Verhalten und anschließender konspezifischer Handlung verknüpfen. Zweck der vorliegenden Arbeit ist es, ein detailliertes Protokoll zur Umsetzung dieser Methode bereitzustellen, das zuvor quantifiziert und validiertwurde 15. Das folgende Protokoll beschreibt den Aufbau, die Kalibrierung und Implementierung dieses Systems, einschließlich Mikrofon-Array-Geometrie, Audio-Video-Synchronisation, automatisierter Schalldetektion und probabilistischer Quellschätzung, Mehrtier-Positionsverfolgung sowie das Zuweisungsverfahren zur Zuordnung von USVs an das emittierende Tier 7,15.

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Protokoll

Alle Protokolle, die Tiere betreffen, wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Delaware (Protokollnummer: 1275) genehmigt und gemäß den Richtlinien des National Institutes of Health durchgeführt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Konstruktion der Klangquellen-Lokalisierungsanlage

  1. Bereite die Aufnahmekammer vor.
    1. Man baut einen Würfelrahmen (76,2 cm × 76,2 cm × 61 cm; Breite × Länge × Höhe), der als Aufnahmearena dient, und platziert ihn in ein schalldämpfendes Gehäuse.
    2. Verwenden Sie Nylongitter, um die Wände zu bilden, und legen Sie die Außenseite des Gehäuses mit Akustikschaumstoff aus, um Schallreflexionen zu reduzieren.
    3. Stellen Sie ein Thermometer draußen, aber in der Nähe der Aufzeichnungskammer des Gehäuses, um die Umgebungstemperatur während der Aufnahmen zu überwachen.
    4. Führe alle Aufnahmen unter dunklen Bedingungen durch.
      HINWEIS: Stabile Umweltbedingungen während der gesamten Aufnahmesitzungen aufrechterhalten und Umweltparameter aufzeichnen.
  2. Konfigurieren Sie die Video- und Audioaufnahmesysteme.
    1. Installieren Sie Infrarotbeleuchtung über der Arena, um Videoaufnahmen im Dunkeln zu ermöglichen.
    2. Positionieren Sie eine Videokamera über der Arena und konfigurieren Sie sie so, dass sie kontinuierlich mit 30 Hz aufzeichnet.
    3. Konfigurieren Sie das Audioaufnahmesystem so, dass Ultraschallsignale von einem achtkanaligen Mikrofonarray mit einer Abtastrate von 250 kHz aufgenommen werden.
      HINWEIS: In diesem System wurden acht Mikrofone verwendet, aber die Anzahl der Mikrofone kann je nach experimentellen Bedürfnissen angepasst werden.
    4. Synchronisieren Sie die Video- und Audioaufnahmen mit einem gemeinsamen externen Trigger, um eine zeitliche Ausrichtung sicherzustellen.
    5. Bestätigen Sie, dass Video- und Audiodaten gleichzeitig aufgenommen und für jede Sitzung gespeichert werden.
      HINWEIS: Hardware und Beschaffungssoftware sind in der Materialtabelle bzw. Tabelle 1 aufgeführt.
  3. Ordne die Mikrofone und die Arena an.
    1. Verteilt die Mikrofone gleichmäßig entlang der Wände der Arena (zwei pro Wand).
    2. Positionieren Sie das Mikrofonzentrum 38,1 cm auseinander, 19,05 cm von jeder Ecke und 10,8 cm über dem Arenaboden.
    3. Markieren Sie die Mikrofonpositionen visuell, um die spätere Kalibrierung und Validierung zu erleichtern.
      HINWEIS: LEDs können zur Markierung der Mikrofonpositionen verwendet werden.

2. Vorbereitungen zur Aufzeichnung sozialer Verhaltensweisen

  1. Richte die Versuchstiere ein.
    1. Wählen Sie die zu dokumentierenden Mäuse aus. Hier wurden Gruppen von 2 männlichen und 2 weiblichen C57BL/6J-Mäusen zwischen 8 und 12 Wochen zum Zeitpunkt der Aufnahme verwendet.
      HINWEIS: Der Stamm, das Geschlechterverhältnis, die Altersgruppe der Mäuse und die Anzahl der Aufnahmetage im aktuellen experimentellen Paradigma sind für verschiedene experimentelle Ziele anpassbar. Zur Demonstration dieser Methode wurde eine Teilmenge experimenteller Mäuse über zwei Aufnahmetage wiederverwendet. C57BL/6J-Mäuse ab 12 Wochen können eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber hochfrequenten Lautenzeigen 16.
  2. Huscht die Tiere.
    1. Jede Maus 14 Tage lang einzeln zu beherbergen, bevor die Aufnahme aufgenommen wird.
      HINWEIS: Einzelunterkünfte minimieren den Einfluss vorheriger sozialer Erfahrungen auf Gruppeninteraktionen.
    2. Stellen Sie jedem Käfig Einstreu, Beschäftigung und ad libitum-Zugang zu Futter und Wasser zur Verfügung.
  3. Markiere die Tiere zur visuellen Identifikation.
    1. Zwei Tage vor der Aufzeichnung betäuben Sie jede Maus mit 2,5 % Isofluran in Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 L/min über einen Präzisionsverdampfer in einer verschlossenen Kammer. Sobald jede Maus betäubt ist, werden sie aus der Kammer gebracht, flach mit freiem Rücken und während des Markierungsprozesses von einem Nasenkegel betäubt.
      HINWEIS: Das im aktuellen experimentelle Paradigma beschriebene Anästhesieprotokoll ist in unserem Tierprotokoll zugelassen und wurde auf jede Maus in der Serie angewendet, ist jedoch für verschiedene Tiere oder experimentelle Ziele anpassbar.
    2. Während jede Maus unter Narkose ist, tragen Sie ein einzigartiges Muster auf ihrem Rücken mit ungiftiger Haarfarbe an, um während der Verfolgung eine visuelle Identifikation zu ermöglichen.
    3. Überwachen Sie jedes Tier kontinuierlich, während der Farbstoff festsetzt, halten Sie etwa 15 Minuten lang Anästhesie aufrecht, und zeichnen Sie die Dauer der Anästhesie auf.
    4. Spülen Sie jede Maus aus und setzen Sie sie in einen erwärmten Erholungskäfig, bis sie vollständig gehfähig ist.
    5. Bringen Sie jede Maus in einen einzelnen, sauberen Käfig mit Einstreu, Beschäftigung sowie Zugang zu Futter und Wasser zurück.
      HINWEIS: Tragen Sie Markierungen auf weiblichen Mäusen an, bevor sie Männchen zeigen, um die Übertragung männlicher Dufthinweise zu minimieren, die das anschließende Verhalten beeinflussen könnten.
  4. Führen Sie eine Exposition mit unterschiedlichen Geschlechtern aus.
    1. Bereite einen Tag vor der Aufnahme saubere Käfige ohne Einstreu vor.
    2. Für jede experimentelle Maus wird das Tier in einen Käfig gelegt, gefolgt von einer neuen Maus des anderen Geschlechts.
    3. Lass die Tiere 10 Minuten lang interagieren.
    4. Beobachte Interaktionen und dokumentiere Verhaltensereignisse manuell.
    5. Nach der Exposition werden Versuchstiere nach der Exposition in Einzelunterkünfte zurückgebracht.
      HINWEIS: Die Exposition zwischen unterschiedlichen Geschlechtern ist spezifisch für das aktuelle experimentelle Paradigma, da sie die Wahrscheinlichkeit von vokalem Verhalten bei nachfolgenden Gruppenaufnahmenerhöht 17; es ist jedoch kein erforderlicher Bestandteil der beschriebenen Methoden. Trennen Sie Tiere, wenn Kopulationsverhalten beobachtet wird.
  5. Bestimmen Sie den östrusen Zustand weiblicher Mäuse.
    1. Etwa 2 Stunden vor der Aufnahme wird der östrusige Zustand jeder weiblichen Maus bewertet (wenn weibliche Probanden verwendet werden).
    2. Führen Sie eine Vaginalspülung mit 30 μL phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösungsmittel durch.
    3. Übertragen Sie die Lavageprobe auf einen sauberen Mikroskop-Objektträger und verteilen Sie sie gleichmäßig.
    4. Lassen Sie die Objektträger vollständig trocknen.
    5. Tragen Sie auf jeden Objektträger eine Kristallviolettbeizung auf und spülen Sie mit einer Pipette vorsichtig mit Wasser ab.
    6. Untersuchen Sie Objektträger unter einem Lichtmikroskop.
    7. Klassifizieren Sie den östrusen Zustand basierend auf den relativen Anteilen von nukleierten Epithelzellen, cornifizierten Epithelzellen und Leukozyten18.
    8. Zeichnen Sie den Östruszustand jeder Frau auf.
      HINWEIS: Da USVs die weibliche Empfänglichkeit währendÖstrus-19,20 beeinflussen können, ist die Bestimmung des östrusartigen Zustands spezifisch für das aktuelle experimentelle Paradigma.; es ist jedoch kein erforderlicher Bestandteil der beschriebenen Methoden.

3. Aufzeichnungen sozialer Interaktion

  1. Bereite die Aufnahmearena vor.
    1. Fügen Sie dem Arenaboden eine gleichmäßige Tiefe von etwa 1,25 cm auf den Arenaboden auf weißes Papier hinzu.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Einstreu alle Ecken gleichmäßig bedeckt.
    3. Überprüfen Sie, dass alle Mikrofone ausgerichtet, ungehindert und zur Arena ausgerichtet sind.
    4. Vor den experimentellen Aufnahmen wird ein Lineal und ein hochkontrastiges Objekt in die Mitte der Arena gelegt, um den Kamerafokus zu überprüfen und räumliche Skalierung herzustellen.
    5. Entfernen Sie die Kalibrierungsobjekte, bevor die Verhaltensaufzeichnungen beginnen.
      HINWEIS: Die auf weißem Papier basierende Einstreu sorgt für Kontrast für dunkelbehaarte Tiere und erleichtert das Verfolgen. Wenn hellere Tiere verwendet werden, hilft eine schwarze papierbasierte Bettwäsche beim Verfolgen. Wenn die Aufzeichnungsdauer verlängert wird, fügen Sie Futter und Wasser in die Arena hinzu. Das Hinzufügen von Nord/Süd- und Ost/West-Richtungsmarkern am Lineal erleichtert die Identifikation der acht Mikrofone.
  2. Führen Sie Systemaufzeichnungen vor dem Verhalten durch.
    1. Unmittelbar vor Verhaltensaufnahmen werden 15 Sekunden Hintergrundgeräusche mit eingeschaltetem Infrarotlicht aufgenommen.
    2. Nehmen Sie 15 Sekunden eines Mikrofonlokalisierungstests mit ausgeschaltetem Infrarotlicht und eingeschalteten Mikrofonindikatoren auf.
    3. Speichern Sie alle Pre-Behavior-Aufzeichnungen für die spätere Überprüfung der Systemleistung.
      HINWEIS: Diese Aufnahmen werden verwendet, um die Funktion des Mikrofons und die Basisrauschpegel zu überprüfen. Für die Aufzeichnung verwendete Skripte sind im zugehörigen Code-Repository verfügbar.
  3. Nehmen Sie das soziale Verhalten der Gruppe auf.
    1. Bereiten Sie alle Aufzeichnungseinstellungen im Voraus vor, um die Tierinteraktion vor der Datenerhebung zu minimieren.
    2. Setze die weiblichen Mäuse in die Arena.
    3. Setze die männlichen Mäuse in die Arena.
      HINWEIS: Wenn Sie mehrere Tiere desselben Geschlechts aufnehmen, platzieren Sie beide Tiere gleichzeitig.
    4. Schließe das Gehäuse und beginne mit der Aufnahme.
    5. Nehmen Sie das soziale Verhalten der Gruppe 10 Minuten lang kontinuierlich auf.
      HINWEIS: Die Aufnahmedauer ist einstellbar.
    6. Überprüfen Sie vor der Vorverarbeitung, dass Video- und Audiodateien lesbar und frei von Beschädigungen sind.
    7. Am Ende der Aufnahme entfernen Sie alle Tiere bis auf eines.
  4. Nehmen Sie einzelne Tiere auf.
    1. Nehmen Sie die verbleibende Maus 10 Minuten lang allein in der Arena auf.
    2. Wiederholen Sie einzelne Aufnahmen für jede der verbleibenden Mäuse.
    3. Wiegen Sie jede Maus sofort nach den einzelnen Aufnahmen.
      HINWEIS: Einzelne Aufnahmen werden verwendet, um das Tracking mit mehreren Tieren zu trainieren und zu validieren. Dokumentiere die Temperatur im Rig vor jeder Aufnahmesitzung, da die Temperatur die Schallausbreitung beeinflusst. Wiederholen Sie die Aufnahmesitzung, wenn Video- oder Audiodateien beschädigt oder unvollständig sind.

4. Video-Vorverarbeitung

  1. Bereite die Videodateien vor.
    1. Überprüfen Sie, dass alle Videoaufnahmen in einem einzigen Verzeichnis gespeichert sind, das dem Experiment zugeordnet ist.
  2. Passen Sie die Videointensität für das Tracking an.
    1. Falls erforderlich, wenden Sie eine gleichmäßige Helligkeitsanpassung auf alle Videobilder an, indem Sie jedem Pixel einen konstanten Wert (brightness_adjustment x 255) hinzufügen, wobei brightness_adjustment ein Skalar ist, der typischerweise zwischen 0,1 und 0,6 liegt, abhängig von den Beleuchtungsbedingungen.
    2. Bei Bedarf wird eine globale Kontrastanpassung mittels Intensitätsremapping (z. B. MATLABS Imadjusting-Funktion) mit einem definierten Eingangsbereich (z. B. [0,2, 0,8]) angewendet, die Pixelintensitäten von 20 % des Maximums auf Schwarz und 80 % der maximalen auf Weiß sowie linear skalierende Zwischenwerte abbildet. Dieser Schritt dient dazu, die Trennung zwischen hellen Identifikationsmarkierungen und dem Hintergrund zu erhöhen.
    3. Clippixelintensitäten bis zum gültigen Bereich für die Videobittiefe (d. h. 0 bis 255 für 8-Bit-Video).
      HINWEIS: Identische Vorverarbeitungsparameter müssen auf alle Frames innerhalb einer Aufnahme und über Aufnahmen hinweg angewendet werden, um Konsistenz zu gewährleisten. Diese Anpassungen sind optional und hängen von den Aufzeichnungsbedingungen ab. Für die hier präsentierten repräsentativen Daten wurden keine Helligkeits- oder Kontrastanpassungen vorgenommen. Wenn Anpassungen nötig sind, sollten Nutzer das bearbeitete erste Bild vorschauen, um einen ausreichenden Kontrast zwischen Tieren und Arena zu bestätigen, bevor das gesamte Video verarbeitet wird.
  3. Exportiere die vorverarbeiteten Videos.
    1. Speichere die vorverarbeiteten Videodateien mit derselben Bildrate und zeitlichen Ausrichtung wie die Originalaufnahmen.
    2. Bewahre die Originalvideodateien zur Referenz und Überprüfung auf.
      HINWEIS: Skripte, die für die Videovorverarbeitung verwendet werden, und die spezifischen Parameterwerte sind im zugehörigen Code-Repository verfügbar.

5. Mehrtier-Verfolgung

  1. Bereiten Sie die Tracking-Software und die Daten vor.
    1. Installiere eine Mehrtier-Tracking-Software und alle erforderlichen Abhängigkeiten. Diese Studie verwendete MOuse TRacker (MoTR; Tabelle 1) weil das Ausgabeformat mit Muse kompatibel ist (Tabelle 1), einer weiteren Software in unserer Pipeline, die für die Berechnungen der Klangquellenlokalisierung21 verwendet wird.
      HINWEIS: Andere automatisierte Tracking-Software, wie Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP)22 oder DeepLabCut23, könnten zur Verfolgung von Tieren verwendet werden, sofern die Position des Tieres, die Kursrichtung und die Position der Nase generiert werden.
    2. Organisieren Sie vorverarbeitete Videodateien so, dass Einzel- und Mehrtieraufnahmen klar getrennt sind.
    3. Überprüfen Sie, dass alle Videodateien konstante Bildraten und räumliche Auflösungen haben.
      HINWEIS: Softwareinstallationsanweisungen und Abhängigkeitsanforderungen werden im zugehörigen Code-Repository bereitgestellt.
  2. Trainiere die Ein-Tier-Modelle.
    1. Wählen Sie Einzeltieraufnahmen aus, die zu jedem Versuchssubjekt passen.
    2. Trainieren Sie für jedes Tier einen separaten Identitätsklassifikator anhand von Merkmalen, die aus der einzelnen Tieraufnahme dieses Tieres extrahiert sind. Während der Gruppenaufnahmen werden diese Tier-Klassifikationsausgaben mit Trajektorieninformationen über verschiedene Frames hinweg kombiniert, um die Tieridentität aufrechtzuerhalten.
    3. Überprüfen Sie, ob die Ausbildung erfolgreich abgeschlossen ist, bevor Sie fortfahren.
      HINWEIS: Einzel-Tier-Aufnahmen werden verwendet, um identitätsspezifische Nachverfolgung in Mehr-Tier-Sitzungen zu initiieren.
  3. Tracke Aufnahmen mit mehreren Tieren.
    1. Wenden Sie das trainierte Tracking-Modell auf Aufnahmen von sozialen Interaktionen mehrerer Tiere an.
    2. Erstellen Sie Bild-für-Bild-Schätzungen der Tierposition, -orientierung und Körperform für jedes Subjekt.
    3. Speichere die Tracking-Ausgaben für nachgelagerte Analysen.

6. Akustische Segmentierung

  1. Bereite die Audiodaten vor.
    1. Überprüfen Sie, dass alle Audioaufnahmen von einzelnen Mikrofonkanälen vorhanden und zugänglich sind.
  2. Erkennen Sie Lautäußerungen.
    1. Führen Sie die akustische Segmentierungssoftware Ax (Tabelle 1) bei jeder Aufnahme aus, um USVs zu erkennen.
    2. Konfigurieren Sie Zeit-Frequenz-Parameter, die in einer von Ax betrachteten Eingabedatei definiert werden. Die Mikrofon-Abtastfrequenz war auf 250 kHz eingestellt.
      HINWEIS: Drei Fenstergrößen für nicht-uniforme schnelle Fourier-Transformationen wurden betrachtet, darunter 64, 128 und 256 Proben. Ein Multi-Taper-Zeit-Bandbreitenprodukt von 3 mit 5 Tapern wurde angewendet, zusammen mit einer Signifikanzschwelle von 0,05. Es wurde eine Mindestdauer von 0 Samples verwendet, mit einem Niederfrequenz-Cutoff von 30 kHz und einem High-Frequency-Cutoff von 110 kHz. Die Faltungsgröße wurde so eingestellt, dass sie 1001 Hz mit 0,001 s abdeckt. Eine Flagge wurde eingebaut, um harmonisch verwandte Signale zu verschmelzen. Für spezifische Details siehe Neunuebel et al.7.
    3. Extraktion von Kandidaten-USVs basierend auf diesen Zeit-Frequenz-Merkmalen.
    4. Speichere die Segmentierungsausgaben als Tabelle für jede Aufnahme.
      HINWEIS: Softwareinstallationsanweisungen, Skripte und Parametereinstellungen werden im zugehörigen Code-Repository7 bereitgestellt.
  3. Kompiliere die Segmentierungsausgaben.
    1. Generiere eine konsolidierte Liste der erkannten Vokalisationsereignisse mit Eintrittszeiten, Versatzzeiten und Frequenzbegrenzungen.
    2. Speichere konsolidierte Vokalisationsdateien für nachgelagerte Lokalisierungsanalysen.

7. Klangquellenlokalisierung

  1. Bereiten Sie die Eingaben für die Lokalisierung vor.
    1. Bestätigen Sie, dass für jede Aufnahme akustische Segmentierungen und Mehrtier-Tracking-Ergebnisse verfügbar sind.
    2. Organisieren Sie Lokalisierungseingaben so, dass Audiodaten, Tracking-Daten und Informationen zur Arenageometrie für die Lokalisierungssoftware zugänglich sind.
      HINWEIS: Skripte, die zum Ordnen von Eingabedateien, zur Definition erforderlicher Verzeichnisstrukturen und zur Sammlung von Arena-Geometrieinformationen verwendet werden, werden im zugehörigen Code-Repository bereitgestellt.
  2. Schätzen Sie die Standorte der Schallquellen.
    1. Wenden Sie den Klangquellenlokalisierungsalgorithmus MUSE (Tabelle 1) auf jede detektierte Vokalisation7 an.
    2. Mit Hilfe von Mikrofonarray-Aufnahmen schätzen Sie den räumlichen Ursprung jeder Lautäußerung innerhalb der Arena.
    3. Für jede Vokalisation schätzen Sie den Standort der Schallquelle mittels Jackknife-Resampling, indem Sie das Lokalisierungsverfahren achtmal wiederholen, wobei jedes Mal ein Mikrofon weggelassen wird, sodass jede Schätzung auf den verbleibenden sieben Mikrofonen basiert. Dies ergibt acht Schätzungen pro Lautäußerung.
      HINWEIS: Unterschiede in der Ankunftszeit zwischen Mikrofonen sind entscheidend für die Schätzung des Schallquellenstandorts. Jackknife-Resampling wird verwendet, um die Zuverlässigkeit der Lokalisation zu bewerten und die Empfindlichkeit einzelner Mikrofonkanäle zu verringern. Skripte, die zur Schätzung des Klangquellenstandorts verwendet werden, werden im zugehörigen Code-Repository7 bereitgestellt.
  3. Berechnen Sie die Wahrscheinlichkeitsverteilungen zwischen Schall und Quelle.
    1. Für jede Lautäußerung berechnen Sie eine Kovarianzmatrix24 und verwenden Sie diese sowie die durchschnittlichen Jackknife-Punkt-Schätzungen, um die Wahrscheinlichkeitsdichte über den Arenaboden zu berechnen.
  4. Integrieren Sie Lokalisierung mit Tierpositionen.
    1. Entnehmen Sie erfasste Kopf- oder Nasenpositionen aller Tiere zum Zeitpunkt jeder Lautäußerung.
    2. Für jede Lautäußerung wird die Lokalisationswahrscheinlichkeit an der Stelle der Nase jedes Tieres bewertet.
    3. Für jede Lautäußerung berechnen Sie eine Zuweisungskonfidenzmetrik für jedes Tier anhand der Wahrscheinlichkeitswerte. Die Zuweisungskonfidenzmetrik wird für jedes Tier als Dichtewert an der Nase dieses Tieres geteilt durch die Summe der Dichtewerte aller Tiere berechnet. Wir bezeichnen diese Metrik als Mauswahrscheinlichkeitsindex (MPI)15.
  5. Ordne Lautäußerungen zu.
    1. Wenn die Zuweisungskonfidenzmetrik für eine einzelne Maus 0,95 übersteigt, wird das Signal dieser Maus 7,15 zugewiesen.
    2. Beschrifte Vokalisationen, die die Zuweisungskriterien nicht erfüllen, als nicht zugewiesen.
    3. Speichere Lokalisierungs- und Zuweisungsausgaben für nachgelagerte Validierung und Analyse.
      HINWEIS: Zuweisungsschwellen, Konfidenzkriterien und Code werden in den zugehörigen Analyseskripten bereitgestellt.

8. Validierung der Ergebnisse

  1. Überprüfen Sie die Mehrtierverfolgung.
    1. Laden Sie die finalisierten Tracking-Ausgaben für jede Aufnahme.
    2. Er verfolgte Tierpositionen und Körperform auf entsprechende Videoframes.
    3. Überprüfen Sie die Tracking-Ergebnisse visuell, um die genaue Mausposition und die konsistente Identitätszuweisung über die Frames hinweg zu bestätigen.
      HINWEIS: Die Nachverfolgungsergebnisse umfassen farbcodierte Ellipsen, die die Kopfrichtung anzeigen, die auf jeder Maus in jedem Videobild überlagert werden. Ellipsengröße und Körperausrichtung sollten in jedem Bild mit Mausgröße und -orientierung übereinstimmen. Die Ellipsenfarbe sollte für jede Maus während einer gesamten Aufnahme einheitlich sein.
    4. Identifizieren und korrigieren Sie Tracking-Fehler.
      Speichere korrigierte Tracking-Ausgaben für nachgelagerte Analysen.
      HINWEIS: Häufige Tracking-Fehler treten bei engen sozialen Interaktionen oder nahe Arenagrenzen auf. Korrigiere alle Fälle von Head-Tail-Flips, Identitätswechseln sowie Ellipsensprüngen und -driften.
      HINWEIS: Programme zum Anzeigen von Tracking-Ausgaben und zur Korrektur von Fehlern werden im Code-Repository bereitgestellt.
  2. Validiere die Vokalisationsextraktion.
    1. Lade akustische Segmentausgänge für jede Aufnahme.
    2. Erzeugen Sie Spektrogramme aus rohen Audiodaten für repräsentative Zeitfenster.
    3. Über die Spektrogramme wurden die Vokalisationsereignisse, einschließlich individueller Vokalisationszeit und -frequenzbereiche, überlagert.
    4. Visuelle Bestätigung der Entsprechung zwischen den detektierten Ereignissen und den in den Spektrogrammen beobachteten Lautäußerungen.
    5. Wenn systematische Fehler festgestellt werden, passen Sie die Segmentierungsparameter vor erneuten Extraktions- und Lokalisierungsschritten an oder passen Sie manuell alle Segmentierungsfehler an (z. B. Fehlidentifikation der Vokalisationszeit oder des Frequenzbereichs).
  3. Validiere die Lautzuweisung.
    1. Lade, Lokalisierung und Zuweisungsausgaben für die Klangquelle.
    2. Für jede Lautäußerung visualisieren Sie Lokalisierungsschätzungen, räumliche Wahrscheinlichkeitsverteilungen und Tierpositionen, die auf Videoframes überlagert sind.
    3. Bestätigen Sie, dass die Dichte der Lokalisierungswahrscheinlichkeit nahe dem Kopf des zugewiesenen Tieres zentriert ist und klar von anderen Tieren getrennt ist.
    4. Überprüfen Sie, dass Lautisationen, die die Zuweisungskriterien nicht erfüllen, als nicht zugewiesen gekennzeichnet sind.
      HINWEIS: Prüfungen der Zuweisungsausgabe umfassen die Kontrolle, dass alle erwarteten Ausgaben generiert wurden und dass die Wahrscheinlichkeitskarte für jede Lautäußerung innerhalb der Arenagrenzen liegt und die Maus umgibt, die der Lautisation zugewiesen ist.
    5. Speichere die validierten Zuweisungsergebnisse für nachgelagerte Analysen.
      HINWEIS: Zuweisungskonfidenzschwellenwerte und Validierungskriterien sind in den zugehörigen Analyseskripten definiert.

9. Datenanalysen

  1. Visualisieren Sie die Lokalisierung der Schallquelle.
    1. Für Einzel- oder Mehrtieraufnahmen werden Videoframes ausgewählt, während der Lautäußerungen erkannt wurden.
    2. Erzeugen Sie schematisierte Darstellungen der ausgewählten Videoframes.
    3. Erstellen Sie ein räumliches Schema aus dem MUSE-Ausgang, indem Sie die Positionen aller Mikrofone, die einzelnen Schallquellen-Punktschätzungen, den geschätzten Schallquellenstandort, die räumliche Wahrscheinlichkeitsverteilung, die Mausposition(en), die abgeleitete Vokalisier-Identität und eine Skalaleiste darstellen.
    4. Erzeugen Sie Spektrogramme der entsprechenden Vokalisation, wie sie von jedem Mikrofonkanal aufgezeichnet werden.
      HINWEIS: Diese Visualisierungen sind hilfreich, um die Lokalisierungsleistung sowohl im Einzel- als auch in Gruppenkontexten qualitativ zu bewerten.
  2. Quantifizieren Sie den Lokalisierungsfehler und die Präzision.
    1. Berechnen Sie den Abstand zwischen dem geschätzten Ort der Schallquelle und der Position des aufgezeichneten Tieres, um den Lokalisierungsfehler zu quantifizieren. Verwenden Sie für diese Berechnungen Einzelmausaufnahmen, da es nur einen einzigen Emitter gibt und die Quelle bekannt ist.
    2. Um die Zuweisungsgenauigkeit zu bewerten, transformieren Sie Schallquellen-Schätzungen und die entsprechenden Tierpositionen in einen Bezugsrahmen, der auf das vokalisierende Tier zentriert ist.
    3. Visualisieren Sie die räumliche Verteilung der Schallquellen-Schätzungen relativ zur zentrierten Tierposition.
  3. Erzeugen Sie Spektrogramme, um Lautbildungen zu visualisieren.
    1. Identifizieren Sie interessante Vokalisierungsphasen anhand von Vocal Extraction-Outputs, die die Identität des Vokalisierers, die Beginn- und Offset-Zeiten der Vokalisation sowie hohe und niedrige Frequenzbeschränkungen enthalten.
    2. Wählen Sie Zeitfenster aus, die von vor dem Beginn der ersten Lautäußerung bis nach dem Offset der letzten Lautäußerung in jeder Runde reichen.
    3. Extrahiere Spannungsleiterbahnen aus den Audiokanaldateien für die ausgewählten Zeitfenster.
    4. Erzeugen Sie Spektrogramme, indem Sie die extrahierten Spannungsspuren vom Zeitbereich in den Frequenzbereich transformieren.
    5. Markiere Zeitpunkte, die den zugewiesenen und nicht zugewiesenen Lautäußerungen entsprechen, mit unterschiedlichen Farben auf dem Spektrogramm.
    6. Für soziale Interaktionssitzungen identifizieren Sie Lautäußerungen, die von verschiedenen Personen erzeugt werden, und erstellen Sie Spektrogramme, bei denen Vokalisationsidentitäten mit identitätsspezifischen Farben angezeigt werden.
  4. Quantifizieren Sie die stimmliche Leistung individuell.
    1. Verwenden Sie die Ausgabe des Klangquellen-Lokalisierungscodes, um jeder Vokalisation ein Identitätslabel zuzuweisen, sodass unlokalisierte, lokalisierte, aber nicht zugewiesene und einzelne Tieridentitäten numerisch codiert werden.
    2. Summiere die Anzahl der Lautäußerungen, die jedes einzelne Tier erzeugt.
    3. Vergleichen Sie die Lautstärke zwischen Individuen und zwischen den Geschlechtern.
  5. Analysieren Sie die stimmlichen Merkmale.
    1. Für jede Vokalisation werden Frequenzkonturen extrahiert.
    2. Quantifizieren Sie vokale Parameter wie maximale Frequenz, Minimalfrequenz, mittlere Frequenz, Bandbreite und Vokalisationsdauer.
    3. Vergleichen Sie die stimmlichen Parameter zwischen den Geschlechtern.
    4. Führen Sie angemessene statistische Analysen auf Basis der Verteilungseigenschaften der Daten durch.
      HINWEIS: Wählen Sie statistische Methoden aus, um die parametrischen Eigenschaften der gemessenen Variablen abzustimmen. Hier ist die Anzahl der Probanden für statistische Vergleiche zu gering.

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Ergebnisse

Die in diesem Artikel präsentierten Ergebnisse stammen aus Aufnahmen, die über zwei Tage durchgeführt wurden, und sollen das Ergebnis des ursprünglich in Warren et al.15 veröffentlichten Protokolls veranschaulichen. Diese Daten sind nicht dazu gedacht, statistische Inferenzen oder verallgemeinerte Schlussfolgerungen zu unterstützen.

Bergung und Zuweisung von USVs
USVs wurden sowohl während individueller als auch in G...

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Diskussion

Die zuverlässige Zuordnung von USVs an einzelne Tiere während Gruppeninteraktionen war eine wesentliche technische Einschränkung in der Untersuchung der Mundvokalkommunikation. Obwohl Mäuse weit verbreitet zur Untersuchung sozialer Kommunikation verwendet werden, hat die Unfähigkeit, bestimmten Individuen Lautäußerungen zuzuweisen, die quantitative Analyse des stimmlichen Verhaltens in naturalistischen sozialen Kontexten begrenzt. Eine Methode, die tierspezifische Lautaufnahme während so...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken dem Personal der University of Delaware Life and Science Research Facility für die Tierpflege, Jim Farmer und Jamie Quesenberry für die Unterstützung beim Bau der Laborausrüstung sowie der University of Delaware High-Performance Computing Group für die Unterstützung bei der Pflege des Rechenclusters. Wir danken André Yichong Ma für die Unterstützung bei der Datenerhebung. Die Arbeit wurde vom NIH finanziert, Fördergeldnummern R01MH122752 und T32GM142603.

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Materialien

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Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alpha-Dri BeddingShepherd Specialty PapersALPHA-driBenötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
Aluminium-Extrusion8020Kundenspezifisch für Aufnahmearena gebautBenötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
BNC-2110National Instruments777643-01Benötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
Klares AcrylglasHome DepotMC-24Benötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
CM16/CMPA40-5VAvisoft40014Benötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
ComputerHewlett–PackardZ620Benötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
Grasshopper 3FLIRGS3-U3-41C6M-CBenötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
IR-LichterGANZIR-LT30Benötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
NI PXIe-1073National Instruments781161-01Benötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
NI PXIe-6356National Instruments781053-01Benötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
Nice ‘N Easy, Born Blonde MaxiClairol2523721Benötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
Nylon-Netz für KäfigwändeMcMaster-Carr9318T25Benötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
NetzkabelNational Instruments763000-01Benötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
SCHC68-68-EPMNational Instruments192061-02Benötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
Sonex-SchaumPinta AcousticVLW-35Benötigt für Schallquellen-Lokalisierungssystem
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Referenzen

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