Eine Webplattform zur automatisierten bildbasierten Quantifizierung von menschlichen und nagetierenden isolierten Pankreasinseln

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt standardisierte Probenahmen, Färbungen, Bildaufnahme und automatisierte webbasierte Quantifizierung isolierter menschlicher und nagetierischer Pankreasinseln mittels Deep-Learning-unterstützter Bildanalyse und visueller Qualitätskontrolle.

Zusammenfassung

Zweck dieser Veröffentlichung ist es, ein schriftliches und Live-Action-Video-Schritt-für-Schritt-Protokoll für die standardisierte Nutzung von IsletNet bereitzustellen, einer webbasierten Plattform zur automatisierten Quantifizierung isolierter Bauchspeicheldrüseninselchen in Bildern, beginnend mit Stichproben und Bildaufnahmen bis hin zum Bildupload, visueller Validierung und automatischer Berichtserstellung. Die Plattform wurde für eine standardisierte, automatisierte Bewertung zweidimensionaler mikroskopischer Bilder isolierter Bauchspeicheldrüseninseln entwickelt, um klinische und experimentelle Isolationsabläufe zu unterstützen. Deep-Learning-basierte Bildsegmentierung wird verwendet, um Inselchen und exokrines Gewebe zu identifizieren, aus denen Konturen für die Bildanalyse extrahiert werden. Rechengestützte Algorithmen quantifizieren anschließend die Anzahl der Inselstücke, das Volumen und die Reinheit. Das visuelle Qualitätskontrolltool unterstützt die fachkundige Validierung automatischer Bildanalysen, indem es es den Nutzern ermöglicht, ungültige Bilder manuell zu korrigieren oder auszuschließen. Das Modul Clinical Islet Isolation unterstützt die Batch-Analyse der Reinheitsfraktion und erstellt automatische PDF-Berichte zusammen mit herunterladbaren Bild- und tabellarischen Datendateien zur Aufzeichnung und Analyse. Das Modul Simple Comparison vergleicht automatisierte Schätzungen mit lokal erhaltenen Referenzergebnissen, die mit den entsprechenden Musterbildern eingereicht werden, um die Eignung lokal standardisierter Bilder für die automatisierte Analyse zu bewerten. Das Protokoll enthält außerdem Empfehlungen zur Umschulung mit lokal generierten standardisierten Bildern, wenn dies erforderlich ist. Repräsentative Daten aus Nagetier- und menschlichen Inselisolationen, einschließlich herausfordernder Beispiele, zeigen eine verbesserte automatisierte Analyseleistung nach angemessenem Training.

Einleitung

Die Transplantation isolierter Bauchspeicheldrüseninseln bei diabetischen Empfängern reduziert oder eliminiert den Bedarf an externer Insulinverabreichung¹. Der Prozess der Isolierung von Leichen- oder lebenden Spendern unterliegt biologischer und prozeduraler Heterogenität, was sich in Unterschieden im Ertrag und in der Qualität widerspiegelt. Das gesamte Inselvolumen stellt den primären Input für die Dosisbestimmung und klinische Entscheidungsfindung hinsichtlich der Transplantationseignung^{dar 2}. Das Histogramm der Inselgröße und die Inselindexnummer erklären Unterschiede in der größenbezogenen Wirksamkeit³. Daher wird neben dem Gesamtvolumen auch auf einzelne Inselchen geachtet, das derzeit als Ersatzmarker für den Beta-Zellinhalt dient. Isolierte menschliche Inselchen sind weniger dicht als Nagetierinseln und oft nicht gut vom exokrinen Gewebe getrennt. Daher sind sie schwerer zu unterscheiden, wenn sie nicht beizt sind. Eine schnelle und einfache Zinkfärbungsmethode mit Dithizon wurde eingeführt, bei der intensives rotes Licht von zinkangereicherten Insulingranulen reflektiert wird. Aufgrund der Opazität des Gewebes wird nur von der Oberfläche reflektiertes Licht gesammelt, was den Einsatz einfacher stereo- oder invertierter Mikroskopieinstrumente mit Lichtquelle und Kamera ermöglicht.

Zahlreiche Versuche wurden unternommen, die Variation zwischen Laboren durch den Einsatz digitaler Bildanalysetools 5,6,7,8,9,10,11,12 zu verringern, jedoch haben diese Ansätze einige Einschränkungen. Bei diesen Methoden basiert die Segmentierung von Inselchen und exokrinem Gewebe entweder auf manueller Schwellenwertung, die zu subjektivem Fehler^{anfällig ist,} 5,6,7,8,9,10, oder verwendet vollautomatisierte Segmentierungsansätze^11,12. Zusätzlich ist eine lokale Softwareinstallation^{oft erforderlich} 5,6,7,8,9,10,11 und kann auf spezifische Hardware ^10,11 beschränkt sein, was die allgemeine Zugänglichkeit und Standardisierung einschränkt.

Das übergeordnete Ziel der vorliegenden Veröffentlichung ist es, einen standardisierten Workflow zur automatisierten Quantifizierung isolierter Bauchspeicheldrüseninselchen in Bildern mittels einer webbasierten Deep-Learning-Plattform unter menschlicher Expertenaufsicht bereitzustellen. IsletNet adressiert Einschränkungen, die sowohl mit der Verfügbarkeit als auch der Zuverlässigkeit der Islet-Bildanalyse zusammenhängen. In diesem Artikel stellen wir empfohlene Richtlinien für die Probenahme von Inseltransplantaten, die Erstellung geeigneter mikroskopischer Bilder und die ordnungsgemäße Nutzung der IsletNet-Tools vor. Das Protokoll führt das Konzept der menschlichen Überwachung automatisch generierter Ergebnisse ein und stellt Arbeitsabläufe für potenzielle und etablierte Nutzer vor (Abbildung 1). Das Simple Comparison Tool ermöglicht es potenziellen Nutzern, IsletNet-Ergebnisse direkt mit lokal erhaltenen Referenzmethoden zu vergleichen (Abbildung 1A). Da lokal generierte standardisierte Bilder zwischen den Zentren erheblich variieren können, muss IsletNet möglicherweise neu trainiert werden, bevor eine zuverlässige Analyse erzielt werden kann (Abbildung 1B). Um diesen Prozess zu erleichtern, werden Empfehlungen für standardisierte Färbung und Bildaufnahme gegeben. Für etablierte Nutzer ist das Clinical Islet Isolation-Tool entwickelt, um den menschlichen Isolations-Workflow für Menschen zu unterstützen (Abbildung 1C). Herunterladbare Berichte zusammen mit zusätzlichen Tabellen und Visualisierungen, die von IsletNet generiert wurden, werden in Tabelle 1 beschrieben, während die wichtigsten berechneten Parameter in Tabelle 2 zusammengefasst werden.

Abbildung 1: Arbeitsablauf für potenzielle und etablierte Nutzer der Plattform. (A) Lokaler Validierungs-Workflow mit dem Modul Simple Comparison. (B) Retraining erfordert eine Menge, die lokal standardisierte Bilder repräsentiert. (C) Routine-Workflow mit dem Modul Clinical Islet Isolation. Wichtige Workflow-Schritte werden für das Hochladen, die Analyse, die visuelle Qualitätskontrolle (vQC) und die Berichtserstellung zusammengefasst. Skalenbalken sind nicht anwendbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Herunterladbare Ergebnisdateien, die von der Plattform generiert wurden. Liste herunterladbarer Ausgabedateien, die von den Tools Clinical Islet Isolation und Simple Comparison generiert wurden, gruppiert nach Dateiformat und Ausgabekategorie. Die Tabelle enthält Berichtsdateien, segmentierte Bildausgaben, Visualisierungsdateien und Tabellenkalkulationsexporte für Inselanzahl, Volumen, Reinheit und Histogrammanalysen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Schlüsselparameter, die in herunterladbaren Berichten und Tabellenkalkulationsausgaben enthalten sind. Detaillierte Liste von Metadaten, benutzerdefinierten Einstellungen und quantitativen Analyseparametern, enthalten in herunterladbaren XLSX- und CSV-Dateien, die von den Tools Clinical Islet Isolation und Simple Comparison generiert wurden. Zu den Parametern gehören Session-Metadaten, Bildaufnahmeeinstellungen und Islet-Quantifizierungsmetriken für Bilder und einzelne Islets. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Protokoll

Tierverfahren wurden vom Gesundheitsministerium der Tschechischen Republik (Genehmigungsnr. 49/2023) gemäß der Richtlinie 86/609/EWG des Rates der Europäischen Gemeinschaften genehmigt. Isolierungs- und Nutzungsverfahren für menschliche Inselchen wurden vom Staatlichen Institut für Arzneimittelkontrolle genehmigt (Zulassungsnummer sukls111286/2023). Standardisierte mikroskopische Bilder von Ratten- und menschlichen Inselzubereitungen wurden mit den Werkzeugen Simple Comparison und Clinical Islet Isolation analysiert, um automatisierte Analysen mit manuellem Zählen zu vergleichen. Die Standard-(kurze) Umrechnungstabelle¹³ wurde sowohl für manuelle als auch für automatisierte Inseläquivalentberechnungen verwendet.

1. Menschliche Aufsicht

1. Erster Überblick über die Primärergebnisse (Abbildung 2)
   1. Warte darauf, dass die automatisch generierten Werte für Inselanzahl, Volumen und Reinheit zusammen mit der grafischen Visualisierung der entsprechenden automatischen Annotationen (z. B. Konturen oder Segmentierungen) im Fenster Batch Results erscheinen.
   2. Sehen Sie sich zusammengefasste Ergebnisse für das aktuelle Beispielbild im linken Informationspanel (Abbildung 2A) an.
   3. Sehen Sie sich Replikationswerte (Abbildung 2B) und Batch-Durchschnitte (Abbildung 2C) in der rechten Tabelle an.
   4. Durchsuchen Sie die Bildvorschau (Abbildung 2D, E) mithilfe der Links (Abbildung 2F). Rechtsklick auf die Bildvorschau und folge dem Pop-up-Menü, um bei Bedarf ein einzelnes Bild herunterzuladen.
   5. Durchsuchen Sie Beispielbilder mit den Navigationspfeilen (Abbildung 2G) oder wählen Sie direkt aus der Tabelle aus.
   6. Öffnen Sie das Inspektionsfenster, indem Sie in die aktuelle Bildvorschau (Abbildung 2D) klicken, um die Qualität der automatisch generierten Konturen zu bewerten und die Ergebnisse zu validieren.
2. Visuelle Qualitätskontrolle
   1. Bewegen Sie das Bild und zoomen Sie (Abbildung 3A) hinein oder heraus, um die Konturen auf mögliche Fehler zu überprüfen.
   2. Wechsle zwischen Kontur (nur gezählte Inselchen haben sie), Originalbild und zusätzlichen Visualisierungsansichten.
      HINWEIS: Die verfügbaren Ansichten sind in der Legende auf der rechten Seite des Fensters (Abbildung 3B) aufgeführt und können über die Tastenkürzel oder die Links in der oberen Navigationsleiste (Abbildung 3C; Tabelle 3).
   3. Gehen Sie zum nächsten Bild, indem Sie die Pfeiltaste nach unten drücken, wenn die Konturen akzeptabel sind (Tabelle 3).
   4. Korrigieren Sie Konturierungsfehler, wenn möglich, manuell. Wenn unentdeckte, teilweise erkannte oder gefälschte Inselchen vorhanden sind, klassifizieren Sie das Bild als ungültig und schließen es aus der Analyse aus.
      HINWEIS: Ausgeschlossene Bilder sind im Fenster Batch Results (Abbildung 2J) und in allen heruntergeladenen Dateien markiert.
3. Korrigierbare Fehler: Ungetrennte benachbarte Inselchen
   1. Trennen Sie benachbarte Inselchen bei Bedarf manuell.
   2. Klicken Sie mit der linken Maustaste außerhalb der Inselchen, um eine Trennlinie zu initiieren (Abbildung 3D).
   3. Fügen Sie zwischengeschaltete Linksklicks hinzu, um die Trennlinie zwischen benachbarten Inselchen zu lenken (Abbildung 3E).
   4. Rechtsklick außerhalb der Inselchen, um die Trennlinie zu vervollständigen (Abbildung 3F).
   5. Reichen Sie die Trennungszeile ein, um das Ergebnis zu aktualisieren (Abbildung 3G).
      HINWEIS: Schalten Sie die Visualisierung der hinzugefügten Trennlinien je nach Bedarf ein oder aus (Abbildung 3H).
4. Korrigierbare Fehler: Falsche Inselchen
   1. Verwenden Sie das Trennwerkzeug, um eine Spurious Islet in mehrere Objekte zu unterteilen, die kleiner als die Islet-Größengrenze sind.
   2. Vermeiden Sie das Zählen kleiner Inselfragmente, indem Sie die vordefinierte Mindestgröße der Insel (konventionell 50 μm) festlegen. Passen Sie die Schwelle bei Bedarf entsprechend der lokalen Laborpraxis an.
   3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf einen beliebigen Punkt auf der Linie und wählen Sie im Pop-up-Menü die entsprechende Option aus, um eine oder alle manuell hinzugefügten Abstandslinien zu entfernen (Abbildung 3I).
5. Nicht korrigierbare Fehler: Fehlende, teilweise segmentierte oder verstaubte Inselchen
   1. Schalten Sie die Segmentierungsansicht um, um zu überprüfen, ob die Inselchen erkannt wurden.
   2. Schließen Sie aus der Batch-Durchschnittsberechnung jedes ungültige Bild aus, das unentdeckte, teilweise erkannte oder mehrere Spurious Islets enthält (Abbildung 3J).
6. Unkorrigierbare Fehler: Falschklassifizierte Objekte
   1. Das Bild wird von der Bewertung ausgeschlossen, wenn exokrines Gewebe, Hintergrundartefakte oder Blasen fälschlicherweise als Inselchen klassifiziert werden (Abbildung 3J).

Abbildung 2. Fenster für Batch-Ergebnisse. (A) Zusammenfassung aktueller Stichprobenergebnisse. (B) Ergebnisse für replizierte Probenbilder. (C) Batch-Durchschnittswerte nur aus akzeptierten Bildern. (D, E, F) Grafische Ergebnisvorschauen mit Links. (G) Beispiel-Navigationspfeile. (H, I, J) Veränderte, akzeptierte und ausgeschlossene Bilder. (K) IsletNet obere Navigationsleiste. (L, M) Batch-Results-Fensterkopf und -Fuß. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3. Inspektionsfenster für vQC und manuelle Konturkorrektur. (A) Bild-Zoom-Anzeige. (B) Legende und Navigationshinweise. (C) Obere Navigationsleiste des Inspektionsfensters. (D–G) Bau und Einreichung einer manuellen Trennleitung für benachbarte Inselchen. (H) Schalter zum Anzeigen oder Ausblenden manueller Trennleitungen. (I) Entfernung der manuellen Abtrennleitungen. (J) Schalter zum Ausschließen eines Bildes aus der Statistik. Skalenbalken werden in dieser Benutzeroberflächenansicht nicht angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 3: Ansichtsmodi, Tastenkombinationen und Navigationssteuerungen sind im Inspektionsfenster verfügbar. Zusammenfassung der Bildvisualisierungsmodi, Tastenkombinationen und Navigationsfunktionen, die während der vQC und manueller Überprüfung der Segmentierungsergebnisse im Inspektionsfenster verfügbar sind. Die Tabelle enthält Konturüberlagerungen, Segmentierungsanzeigen, Histogrammvisualisierung und Bildnavigationssteuerungen, die in den Tools Clinical Islet Isolation und Simple Comparison verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

2. Navigation auf der Plattform

1. Betrachtungsversion und technische Informationen
   1. Überprüfen Sie die aktuelle Softwareversion und das aktuellste Trainingsdatum, das in der oberen Navigationsleiste angezeigt wird (Abbildung 2K).
   2. Öffnen Sie den Bereich Home, um auf die technische Beschreibung und die zugehörigen Referenzinformationen zuzugreifen.
2. Vorläufige Bewertung lokaler Bilder
   1. Bestimmen Sie, ob lokal generierte standardisierte Bilder bereits korrekt von der Plattform analysiert werden können, basierend auf den in den Schritten 1.2.4 und 1.5.2 beschriebenen Fehlerkriterien, oder ob ein Nachtraining für lokale standardisierte Bilder erforderlich ist (Abbildung 1A und 1B).

3. Einfacher Vergleich und externes Training mit lokalen Bildern

Abbildung 4. Einfaches Vergleichstool, Dashboard und Workflow. (A) Obere Navigationsleiste. (B) Einfaches Vergleichs-Dashboard. (C) Hinweise und Anweisungen hochladen. (D, E) form.xlsx Vorlagen-Download und hochgeladene Parametervisualisierung. (F) Drag-and-Drop-Upload-Bereich für Bilder und Tabellenkalkulationen. (G) Auswahl der Umrechnung von Inselgröße zu Volumen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Stichprobe

HINWEIS: Inselchen sedimentieren schnell und unterschiedlich je nach Größe und Form, was die Probenahmeergebnisse verzerren kann.

VORSICHT: Führen Sie alle Verfahren zur Inselhandhabung in einer laminaren Flusshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durch.

1. Verwenden Sie 50 mL oder 250 mL Röhren für die Inselaufhängung.
2. Bestimmen Sie den erforderlichen Probeantragungsanteil entsprechend dem beobachteten Pelletvolumen und der Reinheit anhand lokaler Standardverfahren.
3. Mischen Sie die Inselsuspension gründlich, indem Sie das Rohr unmittelbar vor der Probenentnahme fünfmal sanft umdrehen.
4. Entnehmen Sie die Probe sofort mit einer Pipettenspitze mit großem Bohrrohr, um eine Verstopfung durch exokrines Gewebe zu verhindern und Inselschäden zu minimieren.

5. Optimierung der Bildaufnahme von Islet-Inseln

1. Dithizon-Vorbereitung
   HINWEIS: Eine konsequente Dithizonfärbung ist erforderlich, um einen ausreichenden Kontrast zwischen Inselchen und exokrinem Gewebe zu gewährleisten. Zwei häufig verwendete Zubereitungsmethoden werden im Folgenden beschrieben.
   VORSICHT: Dithizon ist ein vermutetes Fortpflanzungstoxin. Dimethylsulfoxid (DMSO) ist giftig und durchdringend in die Haut. Natriumhydroxid ist hochgradig korrosiv und kann schwere chemische Verbrennungen verursachen. Behandle alle Chemikalien mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung, vermeide Hautkontakt und entsorge Abfälle gemäß den institutionellen Verfahren für gefährliche Abfälle.
   1. Wiederaufhängung in DMSO¹³
      1. Wiege 50 mg Dithizonpulver.
      2. Lösen Sie die Dithizon in 5 mL DMSO auf.
      3. Die Lösung bei 37°C inkubieren und alle 5 Minuten kräftig vortexen, bis die Auflösung abgeschlossen ist.
      4. Verdünnen Sie 1 ml der Serienlösung mit 20 ml Hank's Balanced Salt Solution, das 2 % fetales Rinderserum enthält, um die Arbeitslösung herzustellen.
      5. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 μm Spritzenfilter.
      6. Wickle das Rohr in Alufolie, um die Lösung vor Licht zu schützen.
         HINWEIS: Verwenden Sie die Arbeitslösung innerhalb von etwa 12 Stunden.
   2. Resuspension in alkalischer alkoholischer Lösung (Alternative zu Ref. 8)
      1. Wiege 50 mg Dithizonpulver.
         HINWEIS: Bereiten Sie bei Bedarf Aliquots im Voraus vor.
      2. Fügen Sie 800 μL 70 % Ethanol zum Dithizon hinzu.
      3. Fügen Sie 400 μL 1 M Natriumhydroxidlösung hinzu und vorziehen Sie gründlich, bis die Auflösung abgeschlossen ist.
      4. Verdünnen Sie die Lösung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,2 mg/mL humanes Albumin enthält, auf ein Endvolumen von 20 mL.
      5. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 μm Spritzenfilter.
      6. Wickle das Rohr in Alufolie, um die Lösung vor Licht zu schützen.
         HINWEIS: Verwenden Sie die Arbeitslösung innerhalb von etwa 12 Stunden.
2. Inselflecken
   1. Fügen Sie 25 μL Dithizon-Arbeitslösung in die Mitte einer 35-mm-Schüssel hinzu.
   2. Fügen Sie 50 μL Inseln hinzu, die in Hanks Balanced Salt Solution mit Albumin, Complete Culture Medium oder Transplantationsmedium suspendiert sind.
      HINWEIS: Das tatsächliche Probenvolumen liegt je nach Reinheitsfraktionspellet zwischen 20 und 50 μL, mit einer Endkonzentration von 0,85 mg/mL bis 1,37 mg/mL.
   3. Pipettiere die Suspension dreimal ein- und aus, wobei der erste Stopp langsam verwendet wird, um die Lösungen sanft zu mischen und dabei Blasenbildung zu vermeiden.
   4. Inkubieren Sie die Probe bei 20°C–25°C für 1–2 Minuten, während Sie die Färbung unter dem Mikroskop visuell beobachten, bis die Inselchen leuchtend rot erscheinen. Einige Präparate können schlecht gefärbte Inselchen enthalten, für die auch IsletNet ausgebildet ist.
   5. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze, um schnell 4 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung, ergänzt mit 0,2 mg/mL Albumin, direkt in die gefärbte Probe zu injizieren, wobei sowohl Blasen als auch Spritzer vermieden werden.
   6. Rühren Sie das Gericht sofort kräftig in einer kreisenden Bewegung, um die Lösungen zu mischen, bewegen Sie die Inselchen zur Mitte, bevor Sie sich wieder beruhigen.
      OPTION 1: Fügen Sie vorsichtig 4 ml PBS/Albumin hinzu, sodass die Inselchen in Dithizone unberührt bleiben. Dann wirbeln Sie die Schale vorsichtig in einer kreisenden Bewegung, um die Lösungen zu vermischen und die Inselchen in der Mitte zu halten. Warte, bis Dithizone sich in der Schale verteilt hat.
      OPTION 2 (geeignet für das Stereomikroskop): Statt die Inselchen zu verdünnen, verteilen Sie den Dithizon-Inseltropfen mit einer Pipettenspitze oder Nadel in eine dünne Schicht, anstatt zu verdünnen, um Reflexionen zu reduzieren.
   7. Untersuchen Sie die Probe unter dem Mikroskop und bringen Sie alle verschobenen Inselchen sofort vorsichtig ins Kamerafeld zurück, indem Sie die umgebende Lösung mit einer Pipettenspitze umdrehen.
   8. Beginnen Sie sofort mit der Bildaufnahme, um Zytotoxizität und Veränderungen des Inselvolumens zu minimieren.
3. Bildaufnahme
   HINWEIS: Verwenden Sie ein Stereo- oder Invertiertenmikroskop mit einem Objektiv mit niedriger Vergrößerung und einer stabilen Lichtquelle. Schirmen Sie die Schüssel vor zusätzlichen Lichtquellen wie Raumbeleuchtung ab.
   1. Schalte die Lichtquelle ein und lass die Halogenlampe 5 Minuten lang aufwärmen.
   2. Stellen Sie eine standardisierte Lichtintensität ein, um Blendung und Unterbelichtung zu vermeiden. Der genaue Bereich hängt von der verwendeten Bildgerätehardware ab.
      HINWEIS: Die optimale Lichtintensität kann je nach Vergrößerung und Probenreinheit variieren.
   3. Wählen Sie die Ziel- und Zoomeinstellung, die es allen Inseln erlaubt, im Kamerasichtfeld zu bleiben.
   4. Halten Sie die gleiche Vergrößerung für alle Proben innerhalb eines Batches und vorzugsweise für alle Reinheitschargen aufrecht.
   5. Kalibrieren Sie den Weißabgleich bei Bedarf mit einem normalisierten Weißschieber. Wenn die Bildqualität aufgrund einzigartiger Eigenschaften der Islet-Vorbereitung unzureichend bleibt, passen Sie die RGB-Werte und/oder Gamma-Einstellungen an.
   6. Passen Sie die Belichtungszeit und gegebenenfalls die Beleuchtungsintensität oder -gewinnung mit dem Farbhistogramm an, um Überbelichtung zu vermeiden.
      HINWEIS: Proben, die reichlich exokrines Gewebe enthalten, können aufgrund reflektierter Lichtverhältnisse von nicht-inselbefindlichem Gewebe unterschiedliche Kamera- oder Beleuchtungseinstellungen benötigen. Um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen, speichern Sie diese Parameter als separate Konfigurationsdatei für die spätere Referenz.
   7. Erfassen Sie das Bild und speichern Sie die Datei in einem unterstützten Format, einschließlich JPG, PNG, TIFF oder BMP.
      HINWEIS: Beziehen Sie Datum, Reinheitsanteil, Vergrößerung oder Pixelgröße und Verdünnung im Dateinamen an, um eine zukünftige Neuanalyse zu erleichtern (z. B. iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg).
   8. Nehmen Sie ein Bild des Stufenmikrometers mit denselben Vergrößerungs- und Zoomeinstellungen auf, die für die Probenaufnahme verwendet werden.

6. Klinisches Insel-Isolationswerkzeug

HINWEIS: Die wichtigsten Workflow-Schritte sind in Abbildung 1C zusammengefasst. Analysieren Sie Bilder in Reinheitsfraktionschargen, sobald Proben verfügbar sind.

1. Einstellung der Pixelgröße
   HINWEIS: Die berechnete Pixelgröße bleibt nur gültig, wenn das Stufenmikrometerbild mit denselben Vergrößerungs- und Zoomeinstellungen wie die analysierten Proben aufgenommen wird.
   1. Öffnen Sie das Dashboard "Clinical Islet Isolation ".
   2. Klicken Sie auf Stage Micrometer hochladen und wählen Sie das Bild des Stage-Mikrometers aus.
   3. Zeichne die Endpunkte der roten Messlinie über einen bekannten Abstand auf dem digitalen Lineal.
      HINWEIS: Verwenden Sie möglichst einen längeren Kalibrierungsabstand, um die Messgenauigkeit zu verbessern.
   4. Geben Sie die bekannte Entfernung in Mikrometern (μm) ein.
   5. Reichen Sie die berechnete Pixelgröße ein.
      HINWEIS: Die Plattform behält die berechnete Pixelgröße, bis sie manuell modifiziert wird.
2. Batch-Upload von Reinheitsfraktionsbildern
   HINWEIS: Verwenden Sie 3–4 Replikationsproben, um eine zuverlässige Berechnung des Chargenmittelwerts und der Standardabweichungswerte sicherzustellen. Verwenden Sie dieselbe Verdünnung für alle Proben innerhalb eines Batches.
   1. Drag-and-Drop-Bilder replizieren Proben mit derselben Reinheitsfraktion in den Upload-Bereich.
      HINWEIS: Die Plattform verhindert die wiederholte Verwendung desselben Bildes basierend auf Dateinamenerkennung.
   2. Ändere die Pixelgröße, falls nötig.
   3. Hier kommt die Schwelle für die minimale Inselgröße ins Spiel.
   4. Hier kommt der Probenverdünnungswert ein (z. B. 1000).
   5. Geben Sie das Pelletvolumen in Millilitern ein, die aus der ursprünglichen Flasche aufgezeichnet wurden.
   6. Hier kommen die Operator-Initialen ins Spiel.
      HINWEIS: Die Operatorinitialen erscheinen im generierten Bericht.
   7. Geben Sie die Session-ID ein, die das aktuelle Isolationsverfahren repräsentiert.
   8. Geben Sie die Batch-ID ein (z. B. 1 High Purity).
      HINWEIS: Die Plattform ordnet Brüche alphanumerisch nach Batch-ID.
   9. Klicken Sie auf Batch absenden , um die Analyse zu starten.
3. Überprüfen und finalisieren Sie die Batch-Ergebnisse
   HINWEIS: Schließen Sie das vorherige Batch-Ergebnis-Fenster, indem Sie bei Bedarf auf die Kopfzeile klicken (Abbildung 2L).
   1. Warte darauf, dass die numerischen und grafischen Ergebnisse im Fenster Batch Results angezeigt werden.
   2. Öffnen Sie das Inspektionsfenster, indem Sie die Bildvorschau im Batch-Ergebnisfenster doppelklicken.
   3. Überprüfen und korrigieren Sie gegebenenfalls die Konturen wie in Schritt 1 beschrieben.
   4. Wenn die Konturen akzeptabel sind, gehe mit der Pfeiltaste nach unten zum nächsten Bild über.
   5. Fügen Sie eine weitere Charge hinzu oder fahren Sie mit den Schaltflächen am unteren Fensterrand (Abbildung 2M) zur Sitzungszusammenfassung fort.
4. Batch-Bearbeitung
   HINWEIS: Die Plattform speichert die Dateinamen der Bilder während der gesamten Sitzung, um eine unbeabsichtigte wiederholte Nutzung desselben Bildes zu verhindern. Dazu gehören auch entfernte Bilder. Benennen Sie Bilder vor der Wiederverwendung gegebenenfalls um.
   1. Klicken Sie auf Batch bearbeiten , um Bilder hinzuzufügen oder zu entfernen, Beispielspezifikationen zu korrigieren oder die Charge umzubenennen (Abbildung 2L).
      HINWEIS: Zeichnen Sie die Dateinamen des Bildes auf, bevor Sie den Batch ändern, falls eine Wiederverwendung des Bildes erwartet wird.
   2. Klicken Sie auf Batch entfernen , um die Charge vollständig zu löschen (Abbildung 2L).
5. Die Zusammenfassung ansehen und Berichte erstellen
   1. Klicken Sie auf Zusammenfassung anzeigen , um die Sitzungsübersicht anzuzeigen (Abbildung 2M).
      HINWEIS: Gehen Sie zu früheren Chargen zurück und bearbeiten Sie sie bei Bedarf.
   2. Sehen Sie sich die gesamten Inselanzahl, das Volumen und das Pelletvolumen der Sitzung zusammen mit den entsprechenden mittleren Chargenwerten an.
6. Laden Sie den Bericht herunter.
   HINWEIS: Der kurze Bericht enthält die Gesamtanzahl der Inseln, das Volumen, die Reinheit, die Pelletwerte, Histogramme und Reinheits-Fraktionszusammenfassungen. Der vollständige Bericht enthält zusätzlich grafische Informationen zu jedem Musterbild, wobei akzeptierte Werte in Rot und ausgeschlossene Werte in Schwarz angezeigt werden.

Ergebnisse

Reine Ratteninselchen

Im ersten Experiment wurden 36 Bilder von 12 Proben mit insgesamt 249 gereinigten Ratteninseln während vier unabhängigen Bildgebungssitzungen aufgenommen. Die Bilder wurden mit einem Stereomikroskop unter drei standardisierten, aber unterschiedlichen Beleuchtungsbedingungen erzeugt, wobei Halogen- und LED-Lichtquellen sowie unterschiedliche Kameraeinstellungen verwendet wurden. Ground-Truth-(GT)-Segmentierungen wurden manuell für drei repräsentative Bilder vom IsletNet-Trainingsexperten generiert.

Als die Bilder mit der öffentlich verfügbaren Version des Simple Comparison-Tools analysiert wurden, bestand keine der automatisch generierten Konturen die visuelle Qualitätskontrolle (vQC, Abbildung 5F). Die Plattform wurde anschließend mit repräsentativen lokalen Bildern neu trainiert, und alle von der neu trainierten experimentellen Version erzeugten Konturen bestanden die vQC (Abbildung 5C).

Das Verhältnis von automatisierten zu manuellen Inselvolumen-Schätzungen zeigte eine konsistente Leistung über die drei Bildgebungsbedingungen nach dem Nachtrainieren, mit Medianwerten von 1,03, 0,98 und 0,94 für die Beleuchtungsbedingungen A, B und C (Abbildung 5A). Diese Ergebnisse stellten eine erhebliche Verbesserung im Vergleich zum ursprünglichen Trainingsmodell dar (Abbildung 5B).

Der pixelweise Vergleich mit GT-Segmentierungen zeigte eine enge Übereinstimmung zwischen automatisierten und manuell generierten Konturen nach dem Retraining (Abbildung 5D), was einer genauen Konturplatzierung in repräsentativen Bildern entspricht (Abbildung 5C). Im Gegensatz dazu zeigte das ursprüngliche Trainingsmodell einen erhöhten Anteil an falsch-negativen Pixeln (Abbildung 5G) und Konturfehlpositionen (Abbildung 5F), was zu einer Verschiebung hin zu kleineren Inselkategorien in den entsprechenden Inselgrößenhistogrammen führte (Abbildung 5E vs. 5H).

Abbildung 5. Bewertung der Plattform-Umschulung mittels drei Bildaufnahmen und Vorbereitungen für Ratteninseln. (A) Vergleich von IsletNet- und manuellen Inseläquivalenten (IEQ) Schätzungen nach Umschulung mit drei bildgebenden Setups. (B) Vergleich von IsletNet- und manuellen IEQ-Schätzungen mit dem ursprünglichen öffentlichen Trainingsmodell. (C, F) Repräsentative Konturplatzierung mit dem vQC-Werkzeug nach bzw. vor dem Nachtrainieren des Modells. Weiße Pfeilspitzen zeigen die korrekte Konturplatzierung an und magentafarbene Pfeilspitzen die falsche Konturplatzierung. (D, G) Pixelweise Vergleich mit der Bodenwahrheit nach dem Retraining und mit dem ursprünglichen Trainingsmodell. In der Legende sind True Positive, False Positive, False Negative und True Negative Regionen angegeben. (E, H) Repräsentative Histogramme der Inselgröße nach dem Retraining bzw. mit dem ursprünglichen Trainingsmodell im Vergleich zum manuellen Zählen. Bildaufbau 1 = LED-Beleuchtung; Bildgebungsanlage 2 = Halogenbeleuchtung; Bildaufbau 3 = LED-Dunkelfeldbeleuchtung. Skalenbalken = 100 μm. Boxplots werden nach Tukey-Konvention dargestellt; Schnurrhaare erstrecken sich bis zu Datenpunkten innerhalb von 1,5 × Interquartilbereich vom ersten und dritten Quartil. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Klinische menschliche Inselvorbereitungen

Im zweiten Experiment wurden 17 Bilder, die ein einzelnes menschliches Insel-Isolationsverfahren mit drei Reinheits-Fraktions-Paaren darstellen, mit der öffentlich verfügbaren Version der Plattform analysiert. Eine Probe ging verloren. Nach der vQC wurden alle Bilder, die mittlere und niedrige Reinheitsfraktionen darstellen, wegen fehlerhafter Inselerkennung (Daten nicht gezeigt) ausgeschlossen. Die Plattform wurde anschließend mit repräsentativen lokalen Bildern umgeschult.

Nach dem Nachtraining bestanden alle Bilder die vQC, nachdem drei manuelle Trennleitungen hinzugefügt wurden. Der batchweise Vergleich mit manueller Zählung zeigte eine Gesamtunterschätzung von ≤5 % für die Gesamtzahl der Inselchen und das Volumen. Proben, die zwischen 2.000- und 4.000-fach verdünnt wurden, enthielten je nach Reinheitsanteil zwischen 80 und 4 Inselchen. Der relative Beitrag der einzelnen Reinheitsfraktionen zur Endpräparation ist in Abbildung 6A dargestellt. Die hochreine Fraktion 1VC2 trug im Vergleich zur mittelreinen Fraktion 2SC1 überwiegend kleinere Inselchen bei. Das Gesamthistogramm der Inselgröße, das automatisch von der Plattform generiert wird, ist in Abbildung 6B dargestellt.

Abbildung 6. Quantifizierung und Analyse menschlicher Inselisolationsproben. (A) Inselzählung und äquivalente Insel-Volumenschätzungen mittels IsletNet und manueller Zählmethoden über Reinheitsfraktionen des vollständigen Transplantats. (B) Endgültiges Histogramm der Inselgröße, das von IsletNet unter Verwendung von Batch-Mittelwerten generiert wird. (C) Vergleich von IsletNet- und manuellen Schätzungen für Anzahl und Volumen über 17 einzelne Bilder hinweg. (D) Repräsentatives Bilddetail aus Beispiel 3NC1, das das Originalbild und die Konturplatzierung zeigt, die von neu trainiertem IsletNet generiert wurde. (E) Pixelweiser Vergleich der IsletNet-Segmentierung mit der Bodenwahrheit, die vom manuell zählenden Experten vs. IsletNet-Trainingsexperten (GT1 vs. GT2) erzeugt wurde. In der Legende sind True Positive, False Positive, False Negative und True Negative Regionen angegeben. (F) Repräsentatives Inselgrößen-Histogramm für dasselbe Bild, vergleicht IsletNet- und manuelle Ergebnisse. Magenta-Pfeilspitzen zeigen eine Verschiebung der Kontur- und Inselgrößenkategorie an. Skalenbalken = 100 μm. Boxplots werden nach Tukey-Konvention dargestellt; Schnurrhaare erstrecken sich bis zu Datenpunkten innerhalb von 1,5 × Interquartilbereich vom ersten und dritten Quartil. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Automatisierte und manuelle Schätzungen wurden anschließend für alle einzelnen Bilder verglichen (Abbildung 6C). Die Medianverhältnisse zwischen automatisierten und manuellen Schätzungen betrugen 1,00 für die Anzahl der Inseln und 0,93 für das Inselvolumen, wobei mehrere Ausreißer beobachtet wurden. In einer repräsentativen Stichprobe mit niedriger Reinheit (3NC1) identifizierte die Plattform die gleiche Anzahl von Inselchen wie bei manueller Zählung (fünf Insel), schätzte jedoch ein um 29 % geringeres Inselvolumen. Diese Datenpunkte sind durch Pfeilspitzen in Abbildung 6C angezeigt.

Die größte Insel, teilweise in exokrinem Gewebe eingeschlossen, ist in Abbildung 6D dargestellt, einschließlich des Originalbildes und der automatisch generierten Konturüberlagerung. Der pixelweise Vergleich mit GT-Segmentierungen, die unabhängig voneinander von zwei Experten erstellt wurden, ist in Abbildung 6E dargestellt. Die entsprechenden Histogramme der Inselgröße zeigten eine Verschiebung der Größenverteilung zwischen manuellen und automatisierten Segmentierungen (Abbildung 6F).

Betriebsleistung der automatisierten Analyse

Die Betriebsleistung der Tools Simple Comparison und Clinical Islet Isolation wurde unter Standardinternetbedingungen mit durchschnittlichen Download- und Upload-Geschwindigkeiten von 50 Mbit/s bzw. 30 Mbit/s bewertet. Fünf Bildchargen mit jeweils 12 Bildern wurden mit Bildgrößen von 0,5 MB JPEG-Dateien bis zu 20 MB TIFF-Dateien analysiert. Die Downloaddauer wurde für vollständige ZIP-Ergebnispakete gemessen.

Die Visualisierungszeiten und Downloadzeiten der Analyse nahmen mit der Bildgröße beider Werkzeuge schrittweise zu (Tabelle 4). Das Clinical Islet Isolation-Tool erforderte längere Verarbeitungszeiten als das Simple Comparison Tool für gleichwertige Bildsätze. Diese Ergebnisse zeigen den praktischen Zusammenhang zwischen Bildauflösung, Dateiformat und Analysedurchsatz während des Routinebetriebs.

Tabelle 4: Analyse-Visualisierungszeiten und Download-Dauern für die Tools Clinical Islet Isolation und Simple Comparison. Vergleich der Verarbeitungszeiten, die für die Ergebnisvisualisierung und den Dateidownload erforderlich sind, mit Bildchargen unterschiedlicher Dateigrößen und Formate. Die Messungen wurden mit Chargen mit 12 Bildern erzielt und als vergangener Zeitraum von der Chargenabgabe bis zur Ergebnisvisualisierung oder Abschluss des Downloads angegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt den praktischen Arbeitsablauf für potenzielle und etablierte Nutzer von IsletNet, mit Schwerpunkt auf zwei kritischen Funktionen der Plattform: Experten-vQC und Neutraining von neuronalen Netzen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass eine genaue automatisierte Quantifizierung nicht nur von der Bildsegmentierungsleistung abhängt, sondern auch von der Fähigkeit des Nutzers, die Konturplatzierung und Bildeignung kritisch zu bewerten, bevor die Ergebnisse akzeptiert werden. Zwei weitere fortschrittliche Werkzeuge, Pixel-zu-Pixel Comparison und My Segmentations, wurden verwendet, um ausgewählte Validierungsergebnisse zu erzeugen; Diese Werkzeuge sind jedoch hauptsächlich für die Unterstützung des Trainings von neuronalen Netzwerken gedacht und sind daher nicht im Protokoll-Workflow enthalten.

IsletNet wurde als kollaboratives und breit zugängliches Referenzwerkzeug für standardisierte Inselbildanalysen in verschiedenen Laboren entwickelt. Das neuronale Netzwerk wurde mit manuell annotierten GT-Segmentierungen von originalen zweidimensionalen mikroskopischen Bildern isolierter menschlicher und Ratteninseln^trainiert und validiert ^14,15,16. Es wurden zwei separate Modelle für Dithizon-gefärbte Präparate und ein weiteres Forschungsmodell für ungefärbte Ratteninseln erstellt, wobei auf Anfrage der Zugang möglich ist. Die Plattformversion und das Trainingsdatum werden in der Benutzeroberfläche angezeigt. IsletNet segmentiert automatisch Inselchen und exokrines Gewebe und berechnet anschließend die Anzahl der Inseln, das Volumen und die Reinheit anhand der benutzerdefinierten Pixelgröße und der minimalen Inselgrößenschwelle. Die Wahl des Inselgrößenschwellenwerts hängt von der Bildqualität und dem Zweck der Analyse ab (Seiten-an-Seite-Vergleich mit manueller Zählung vs. Untersuchung kleiner Insel) und nicht von der Art. Angesichts der Auflösung der herkömmlichen Mikroskopie beträgt die bedeutungsvolle minimale Inselgröße 50 μm 7,8,9,12, aber sie kann für Bilder mit einem geeigneten^{Instrument 10} auf bis zu 10 μm reduziert werden. Inselvolumen-Schätzungen werden mit der standardmäßigen kugelbasierten Umrechnungstabelle¹³ sowie alternativen Umrechnungstabellen ^7,18,19 erstellt, einschließlich angepasster Ellipsenannäherungen ^5,6 und konturbasierten Spinacle- und Sphiracle-Modellen¹⁷. Die resultierenden Werte werden in Inseläquivalenten und Nanolitern angegeben, während die Reinheit entweder aus der Gewebefläche oder dem geschätzten Gewebevolumen berechnet wird. Ein entscheidender Schritt im Protokoll ist die Erfassung standardisierter mikroskopischer Bilder, die für die automatisierte Segmentierung geeignet sind. IsletNet wurde mit Bildern trainiert, die mit Stereo- und Invertiertmikroskopen aufgenommen wurden, die mit einer Reihe komplementärer Metalloxid-Halbleiterkameras und Beleuchtungssysteme ausgestattet waren. Objektive mit niedriger Vergrößerung (1–2×) sind vorteilhaft, da sie erlauben, die gesamte Probe im Sichtfeld zu halten und gleichzeitig eine Pixelgröße beizubehalten, die mit der zuverlässigen Detektion kleiner Inselchen kompatibel ist. Gleichmäßige Beleuchtung, stabiler Weißabgleich und das Vermeiden von Bildüberbelichtung sind für eine zuverlässige Konturgenerierung unerlässlich. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass das Umschulen mit repräsentativen lokalen Bildern die Segmentierungsleistung über heterogene Bildgebungsbedingungen hinweg erheblich verbessern kann. Als praktische Richtlinie eignen sich Bilder im Allgemeinen für das IsletNet-Training, wenn die Grenzen von Insel- und exokrinem Gewebe für erfahrene Beobachter klar erkennbar sind. Bilder mit gruppierten oder stark überlappenden Inselchen sollten wann immer möglich vermieden werden.

Das Protokoll hebt zudem mehrere Einschränkungen und Fehlerbehebungsaspekte im Zusammenhang mit der automatisierten Bildanalyse hervor. Obwohl IsletNet den Durchsatz, die Objektivität und die Reproduzierbarkeit im Vergleich zum vollständig manuellen Zählen deutlich erhöht, bleibt die Methode sensibel gegenüber der Bildqualität. Falsche Konturplatzierung (falsche Inselerkennung und Versäumnis, benachbarte Inselchen zu sepa-raten) kann gelegentlich auftreten und die nachgelagerte Quantifizierung beeinflussen. Eine routinemäßige vQC bleibt unerlässlich, bevor automatisierte Ergebnisse akzeptiert werden. Die sofortige Anwendung vor Ort auf IsletNet ist vorteilhaft, da ungeeignete Bilder mit angepassten Bildparametern wiederaufgenommen werden können. Eine manuelle Korrektur automatischer Konturen ist innerhalb des Inspektionsfensters möglich, außer bei fehlenden Inselchen oder mehreren unregelmäßigen Inselchen. Darüber hinaus basiert der automatisierte Trennalgorithmus auf Konturgeometrie und Statistiken zur Inselgrößenverteilung und kann daher von der ursprünglichen Interpretation eines einzelnen Experten abweichen, bleibt aber analytisch akzeptable.

Die Zuverlässigkeit von IsletNet wird in erster Linie durch die Konsistenz zwischen lokaler Bildqualität und dem Trainingsdatensatz bestimmt, nicht nur durch Arten. Obwohl das aktuelle Trainingsset menschliche Inselchen unterschiedlicher Reinheit und hochreine Ratteninselchen enthält, kann die Plattform auf andere Arten ausgeweitet werden, sofern die Bildeigenschaften mit den Trainingsdaten konsistent bleiben. Zum Beispiel können von Kultur gereinigte Schweineinselchen eingebetteten menschlichen Inselchen im Trainingsdatensatz ähneln. Im Gegensatz dazu waren umfangreich kultivierte Inselchen mit schwacher Dithizonfärbung während des Trainings nicht vertreten und erfordern möglicherweise zusätzliches Training. Das Simple Comparison Tool unterstützt daher einen wichtigen Validierungsschritt für neue Nutzer oder neue Bildkonfigurationen. Die hier präsentierten Ergebnisse unterstreichen, wie unterschiedliche Experteninterpretationen eingebetteter Inselchen die GT-Generierung und die nachgelagerte Volumenschätzung beeinflussen können. Um dem Fehlen eines breiten Expertenkonsenses in zukünftigen Multicenter-Studien entgegenzuwirken, wurde die IsletSwipe-Anwendung²⁰ entwickelt, um konsensbasierte Bildannotationen zu erleichtern.

Im Vergleich zur herkömmlichen manuellen Zählung unter dem Mikroskop bietet IsletNet deutlich einen höheren Durchsatz, dauerhafte digitale Dokumentation und standardisierte quantitative Ausgaben, während die bedienerabhängige Variabilität reduziert wird. Manuelles Zählen kann in Borderline-Fällen weiterhin mehr Vertrauen in die Gewebeidentifikation bieten, ist jedoch durch subjektive Größenschätzung, geringere Skalierbarkeit und umfangreiche Anforderungen an Personalschulungen begrenzt. Als webbasierter Dienst ermöglicht IsletNet den Vergleich zwischen Laboren durch zentralisierte, aber anonyme Analyse. Die Analysegeschwindigkeit bleibt abhängig von der lokalen Internetbandbreite, der Bilddateigröße und der Bildkomplexität. Größere TIFF-Dateien können die Bildqualität verbessern, erfordern jedoch längere Upload- und Downloadzeiten als komprimierte JPEG-Bilder.

Insgesamt zeigen die hier präsentierten Ergebnisse, dass eine zuverlässige automatisierte Quantifizierung erreicht werden kann, wenn die lokale Bildaufnahme reproduzierbar und mit dem Trainingssatz konsistent bleibt. Nutzer werden ermutigt, vQC in ihre Routine zu integrieren und eine Neuschulung in Erwägung zu ziehen, sobald wesentliche Veränderungen der lokalen Bildgebungsbedingungen auftreten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
35 mm Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5481	Unsteril
200 µL Pipettenspitzen, breit	Sigma-Aldrich	AXYT205WBCRS	Zum Dosieren der Inselsuspension vor dem Färben
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	GC-Qualität oder Zellkulturqualität
Dithizone (DTZ)	Sigma-Aldrich	D5130	Pulver
Ethanol, 70%	Lokaler Lieferant	N/A	(v/v) in H2O; für die DTZ-Zubereitung
Fetal bovines Serum (FBS)	Gibco	10270106	Hitzeinaktiviert, qualifiziert
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	Mit oder ohne Phenolrot (basierend auf dem Assay angeben)
Humanes Albumin	Grifols	61953-0001-2	Hochkonzentrierte Lösung (200 g/L)
Infinity 1-3C	Lumenera	3-1URC	CMOS, 3 MP
Infinity Capture	Lumenera	N/A	Standard Bilderfassungssoftware
Invertiertes Mikroskop CKX41	Olympus	N/A	1,25x und 2x Objektive
LED-High-Power-Spots (2-arm)	Photonics	10068	LED-Lichtquelle; doppelte Schwanenhalsführung
Lichtquelle Highlight 2000	Olympus	5-HL2000	Halogenlichtquelle (14,5 V, 90 W); manuelle Intensitätssteuerung; doppelte Schwanenhalsführung
Laborbedarf	Verschiedene	N/A	Pipetten, Röhrchen, Nadeln, Spritzen, Laborzeitmesser, Standard-PSA
MicroCam-Software	Bresser	N/A	Standard Bilderfassungssoftware
MikroCam 3.0M	Bresser	86000180	CMOS, 3,1 MP Kamera
Millex-MP-Filtereinheit	MilliporeSigma	SLMP025SS	0,22 µm Porengröße, PES-Membran
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	10010023	pH 7,4
Promicam Pro 3-5 CP	Promicam	E61MPR937	CMOS, 5 MP, hochdynamische Reichweitenkamera
QuickPHOTO	Promicra	N/A	Standard Bilderfassungssoftware
Natriumhydroxid (1 M NaOH)	Lokaler Lieferant	N/A	Zur pH-Anpassung und Solubilisierung während der DTZ-Zubereitung
Objekttisch-Mikrometer	Thorlabs	R1L3S1P	10 mm Länge; 50 µm Teilungen zur Kalibrierung
Stereomikroskop SZH10	Olympus	N/A	1x Apochromat-Objektiv