Anthrone-Kolorimetrische Methode zur Quantifizierung von Glykogen in Rattenleber und Skelettmuskulatur

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine anthron-kolorimetrische Methode zur Quantifizierung von Glykogen in Rattenleber und Skelettmuskulatur über verschiedene Stoffwechselzustände hinweg.

Zusammenfassung

Glykogen ist eine wichtige intrazelluläre Glukosereserve in Leber- und Skelettmuskulatur und spielt eine grundlegende Rolle im Kohlenhydratstoffwechsel. Leberglykogen ist essenziell für die Erhaltung der systemischen glykämischen Homöostase, während das Skelettmuskelglykogen die körperliche Aktivität und die Leistungsfähigkeit des Trainings unterstützt. Eine genaue Quantifizierung des Gewebes ist daher entscheidend für Studien, in denen der Glykogenstoffwechsel dynamisch reguliert oder pathologisch verändert wird. Hier beschreiben wir eine zuverlässige und sensible kolorimetrische Methode des Anthrones zur Quantifizierung des Glykogengehalts in der Rattenleber- und Skelettmuskulatur. Das Protokoll besteht aus aufeinanderfolgenden Schritten, darunter alkalische Verdauung, Deproteinisierung, Glykogenausfällung, Alkoholwäsche und Farbentwicklung mittels Anthrone-Reagens. Die Anwendbarkeit dieser Methode zeigt sich bei Ratten, die drei physiologisch relevanten Bedingungen ausgesetzt sind: Ad-Libitum-Fütterung , nächtliches Fasten und kurzfristiges Nachfüttern. Diese experimentellen Paradigmen erfassen wichtige metabolische Zustände, die mit der Glykogenspeicherung, -erschöpfung und -resynthese verbunden sind. Die orthogonale Western-Blot-Analyse der wichtigsten Enzyme, der Glykogensynthase und der Glykogenphosphorylase, liefert mechanistische Unterstützung für die beobachteten Stoffwechselveränderungen. Die Anwendbarkeit dieser Methode zeigt sich zudem bei Tieren, die mit Adrenalin behandelt wurden, um den akuten stressbedingten Glykogenabbau zu modellieren. Zusammen bietet diese Methode einen großen dynamischen Bereich und ausreichende Empfindlichkeit, um Gewebeglykogen über deutlich unterschiedliche physiologische Zustände hinweg zu quantifizieren. Es bietet ein zuverlässiges Werkzeug zur Untersuchung des Glykogenstoffwechsels in vivo und kann auch auf In-vitro-Zellkulturmodelle angewendet werden.

Einleitung

Glykogen ist ein stark verzweigtes Polysaccharid, das als wichtiges Energiereservoir in Skelettmuskulatur und Leber von Säugetieren dient und in geringerem Maße auch in anderen Organen wie Gehirn, Niere, Herz und Fettgewebe¹. Während der Fütterung durchläuft überschüssige Glukose eine Polymerisation oder de-novo-Lipogenese und wird als Glykogen oder Lipide gespeichert. Während Fasten oder körperlicher Anstrengung wird Glykogen jedoch enzymatisch abgebaut, was eine konstante und schnelle Glukoseversorgung gewährleistet, um den Energiebedarf zu decken. Diese Pufferkapazität des Glykogens ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der glykämischen Homöostase während physiologischer Fasten-Wiederfütterungszyklen².

Die Glykogensynthese wird durch die Glykogensynthase (GYS) katalysiert, die in zwei säugetierischen Isoformen existiert: GYS1 und GYS2. GYS1 wird überwiegend in der Skelettmuskulatur exprimiert, während GYS2 die Leberisoform ist. Die katalytische Aktivität von GYS wird durch Phosphorylierung an mehreren Stellen, einschließlich Ser641, unter Fastenbedingungen unterdrückt, während ihre Aktivität bei der Dephosphorylierung unter Fütterungsbedingungen stimuliert wird. Der Glykogenabbau wird durch Glykogenphosphorylase katalysiert. Die Leberisoform ist PYGL, und die Muskelisoform ist PYGM. Im Gegensatz zu GYS wird ihre katalytische Aktivität bei der Phosphorylierung bei Ser15 während des Fastens stimuliert und nach der Dephosphorylierung nach der^{Ernährung 3} unterdrückt.

Die ordnungsgemäße Regulation des Glykogenstoffwechsels ist grundlegend für zahlreiche biologische Prozesse, und der dysregulierte Glykogenstoffwechsel wurde als ursächlicher Faktor bei vielen Krankheiten identifiziert. Konkret ist der veränderte Leberglykogenstoffwechsel mit verschiedenen Stoffwechselstörungen assoziiert, darunter Glykogenspeichererkrankungen⁴, Typ-2-Diabetes⁵, metabolische Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung ^6,7 und eine beeinträchtigte Gegenregulationsreaktion auf Hypoglykämie⁸. Darüber hinaus ist Gehirnglykogen für die Bildung des Langzeitgedächtnisses^{unerlässlich 9}, während das Skelettmuskelglykogen ein wichtiger Regulator der Ausdauerkapazität^ist. Daher ist eine genaue Quantifizierung des Gewebeglykogens entscheidend für Studien, bei denen der Glykogenstoffwechsel dynamisch reguliert oder pathologisch verändert wird, was die Untersuchung von Krankheitsmechanismen und die Bewertung glykogenmodulierender Interventionen ermöglicht.

Mehrere Methoden zur Glykogenquantifizierung wurden berichtet, darunter die Anthrone-Methode^11,12, die Amyloglucosidase-Methode¹³, die Phenol-Schwefelsäure-Methode¹⁴ und die nicht-invasive Kernspinresonanzspektroskopie (MRS)-Methode¹⁵, wobei jede Methode bestimmte Vorteile und Einschränkungen aufweist. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die kolorimetrische Anthrone-Methode zur Quantifizierung von Glykogen in Rattenleber- und Skelettmuskulatur (Abbildung 1). Dieses Protokoll umfasst aufeinanderfolgende Schritte der alkalischen Verdauung, Deproteinisierung, Glykogenfällung, Alkoholwäsche und Farbentwicklung mit Anthrone-Reagenz. Diese Methode ist einfach, wirtschaftlich und erfordert nur minimale spezialisierte Instrumentierung. Um ihre Sensitivität und Reproduzierbarkeit zu demonstrieren, berechneten wir den Nachweisgrenzwert (LOD), den Quantifizierungsgrenzwert (LOQ) sowie den Intraassay- und Interassay-Variationskoeffizienten (CV%) anhand einer Reihe von Glykogenstandards. Um ihre Anwendbarkeit zu demonstrieren, wurden die Glykogenwerte in Leber- und Skelettmuskulatur unter drei physiologisch relevanten Bedingungen bewertet: ad libitum-Ernährung, 16-stündiges Übernachtfasten und kurzfristiges Nachfüttern. Darüber hinaus wurde die Methode unter Verwendung von mit Adrenalin behandelten Tieren demonstriert, um den durch Stress verursachten Glykogenabbau zu modellieren. Eine orthogonale West-Blot-Analyse wichtiger Enzyme, die am Glykogenstoffwechsel beteiligt sind, wurde durchgeführt, um die beobachteten metabolischen Veränderungen zu bestätigen.

Abbildung 1: Überblick über den Workflow zur Glykogenquantifizierung. Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs zur Glykogenquantifizierung in Leber- und Skelettmuskulatur. Das Verfahren umfasst Gewebesammlung, alkalische Verdauung, Proteinfällung, Glykogenisolierung und anthronbasierte kolorimetrische Erkennung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Protokoll

Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC; #1905019) der Nanjing Medical University genehmigt.

1. Herstellung von Reagenzien

1. Siehe die Materialtabelle für alle in dieser Studie verwendeten Reagenzien.
2. Bereiten Sie alle Lösungen vor Beginn der Experimente vor.
3. Skaliere das Lösungsvolumen nach Bedarf.
4. Bereite 1 M Natriumhydroxid (NaOH)-Lösung vor
   1. Wiege 40 g NaOH-Pellets.
   2. Fügen Sie die NaOH-Pellets zu 800 ml destilliertem Wasser hinzu.
   3. Rühren Sie die Lösung mit einem Glasstab um, bis am Boden des Gefäßes keine ungelösten Partikel mehr übrig sind.
   4. Übertragen Sie die Lösung in einen 1-Liter-Volumenkolben.
   5. Bringen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf genau 1 Liter.
   6. Die Lösung in einer fest geschlossenen Flasche bei Raumtemperatur (RT; 18°C–23°C) aufbewahren.
      VORSICHT: NaOH ist korrosiv. Tragen Sie eine Schutzbrille, Handschuhe und einen Laborkittel. Kommerzielle NaOH-Pellets sind nicht zu 100 % rein und nehmen Wasser auf. Vermeiden Sie längere Luftexposition von Pellets.
5. Bereite eine 20%ige Lösung aus Lithiumchlorid (LiCl) vor.
   1. Wiege 20 g wasserfreies LiCl-Pulver.
   2. Gib das LiCl-Pulver zu 80 ml destilliertem Wasser.
   3. Rühren Sie die Lösung um, bis am Boden des Gefäßes keine ungelösten Partikel mehr übrig sind.
   4. Übertragen Sie die Lösung in einen 100-mL Volumenkolben.
   5. Bring das Volumen mit destilliertem Wasser auf genau 100 mL.
   6. Lagere die Lösung in einer fest geschlossenen Flasche bei RT.
      HINWEIS: LiCl kann Haut, Augen und Atemwege reizen. Tragen Sie eine Schutzbrille, Handschuhe und einen Laborkittel. LiCl ist hoch hygroskopisch. Minimieren Sie die Luftexposition, um die Wasseraufnahme zu verhindern.
6. Anthrone-Reaktionslösung bereiten
   1. Geben Sie 28 ml destilliertes Wasser in einen 1-Liter-Becher.
   2. Fügen Sie dem Wasser 72 ml hochreine, konzentrierte (98 %) Schwefelsäure (H₂SO₄) hinzu.
   3. Lass die Mischung auf RT abkühlen.
   4. Gib 50 mg Anthron zur Lösung hinzu.
   5. Rühren, bis der Anthron aufgelöst ist.
   6. Geben Sie 3 g Thiourea zur Lösung.
   7. Rühren, bis die Thiourea aufgelassen ist.
   8. Übertragen Sie die Lösung in eine Bernstein- oder mit Folie umwickelte Glasflasche.
   9. Lagern Sie die Lösung maximal eine Woche lang im Kühlschrank (2°C–8°C).
      VORSICHT: Schwefelsäure ist hochgradig korrosiv, verursacht schwere chemische Verbrennungen und reagiert heftig mit Wasser. Trage einen Laborkittel, chemikalienresistente Handschuhe und ein Gesichtsschutz. Führen Sie alle Schritte in einer zertifizierten chemischen Abzughaube durch. Verdünnung erzeugt intensive Hitze. Füge immer Säure ins Wasser hinzu.
7. Bereiten Sie 95 % Ethanol mit 0,1 % LiCl vor.
   1. Gib 95 ml absolutes Ethanol in eine Glasflasche.
   2. Gib 4,5 ml destilliertes Wasser dazu.
   3. Gib 0,5 ml 20% LiCl-Stocklösung dazu.
   4. Gründlich mischen.
8. Bereiten Sie 80 % Methanol mit 0,1 % LiCl vor
   1. Geben Sie 80 ml absolutes Methanol in eine Glasflasche.
   2. Gib 19,5 ml destilliertes Wasser dazu.
   3. Gib 0,5 ml 20% LiCl-Stocklösung dazu.
   4. Gründlich mischen.
9. Bereite eine 100%ige (W/V) Trichloressigsäure (TCA) Lösung vor
   1. Gewicht 100 g TCA-Pulver.
   2. Fügen Sie das TCA-Pulver zu 80 ml destilliertem Wasser hinzu.
   3. Rühren, bis es sich aufgelöst hat.
   4. Übertragen Sie die Lösung in einen 100-mL Volumenkolben.
   5. Bring das Volumen mit destilliertem Wasser auf genau 100 mL.
   6. Die Lösung in einer fest verschlossenen Glasflasche bei RT aufbewahren.
10. Bereite gesättigte Benzoesäurelösung vor
    1. Gib 0,5 g Benzoesäurekristalle zu 100 ml destilliertem Wasser in einem 250 ml Glasbecher.
    2. Erhitze die Mischung auf 90°C auf einer heißen Platte mit kontinuierlichem magnetischem Rühren.
    3. Erhitze weiter, bis am Boden des Gefäßes keine ungelösten Partikel mehr übrig sind.
    4. Lass die Lösung auf RT abkühlen.
    5. Aspirieren Sie das klare Überstandsmittel, das frei von sichtbaren Partikeln ist.
    6. Lagere die Lösung in einer fest verschlossenen Glasflasche bei RT.
11. Glukosestandards erstellen
    1. Lösen Sie 50 mg Glukosepulver in 50 ml gesättigter Benzoesäurelösung, um eine 1 mg/mL Brühlösung herzustellen.
    2. Bereite Glukosestandards (0, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 und 1 mg/mL) in 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhren durch serielle Verdünnung mit gesättigter Benzoesäure wie folgt vor.
       1. Fügen Sie 500 μL 1 mg/mL Rohlösung in Tube 1 hinzu, um den 1 mg/mL Standard herzustellen.
       2. Fügen Sie 250 μL Grundlösung und 250 μL gesättigte Benzoesäure in Tube 2 hinzu, um den 0,5 mg/mL-Standard herzustellen.
       3. Fügen Sie 200 μL Tube 2-Lösung und 300 μL gesättigte Benzoesäure in Tube 3 hinzu, um den 0,2 mg/mL-Standard herzustellen.
       4. Fügen Sie 250 μL Tube 3-Lösung und 250 μL gesättigte Benzoesäure in Tube 4 hinzu, um den 0,1 mg/mL Standard herzustellen.
       5. Fügen Sie 250 μL Tube 4-Lösung und 250 μL gesättigte Benzoesäure zu Tube 5 hinzu, um den 0,05 mg/mL-Standard herzustellen.
       6. Fügen Sie 200 μL Tube 5-Lösung und 300 μL gesättigte Benzoesäure in Tube 6 hinzu, um den 0,02 mg/mL-Standard herzustellen.
       7. Fügen Sie 250 μL Tube 6-Lösung und 250 μL gesättigte Benzoesäure in Tube 7 hinzu, um den 0,01 mg/mL Standard herzustellen.
       8. Fügen Sie 500 μL gesättigte Benzoesäure in ein separates Rohr hinzu, um den Blank (0 mg/mL) herzustellen.
    3. Jede Tube verschließen und kurz für 10 Sekunden vortexen, um gründlich zu vermischen.

2. Tierbehandlung

1. Allgemeine Haltung
   1. Männliche Sprague–Dawley-Ratten (230–270 g) in einer Tiereinrichtung unter spezifischen krankheitserregerfreien Bedingungen (VAF/Plus-Gesundheitsstatus, Charles River Laboratories) zu betreuen, zertifiziert frei von häufigen Nagetiererregern wie dem Sendai-Virus, Mycoplasma pulmonis und Rattenparvoviren.
   2. Bieten Sie eine Standard-Essensdiät an und ermöglichen Sie freien Zugang zu Wasser.
   3. Halten Sie die Tiere auf einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Zyklus (Licht an um 08:00 Uhr und Licht aus um 20:00 Uhr).
   4. RT bei 22°C–23°C halten.
   5. Halten Sie die relative Luftfeuchtigkeit bei 30–70%.
2. Übernachtfasten
   1. Bringen Sie die Ratten in normale Futterkäfige.
   2. Entferne Nahrung und gewähre freien Zugang zu Wasser.
   3. Fasten Sie 16 Stunden lang von 16:30 bis 08:30 Uhr am nächsten Morgen.
3. Nachnahrung
   1. Geben Sie regelmäßig Futter (200 g) für über Nacht fastende Ratten.
   2. Lassen Sie die Tiere 2 Stunden lang ad libitum füttern.
4. Epinephrin-Herausforderung
   1. Bereite eine Epinephrin-Hydrochloridlösung vor.
      1. Wäge 5 mg Epinephrin-Hydrochloridpulver mit einer kalibrierten Analysewaage.
      2. Das Pulver in ein 15-ml-Zentrifugenrohr umgeben und 10 ml Kochsalzlösung hinzufügen.
      3. Verschließen Sie den Tubus und wenden Sie sich 10 Mal um, um eine 0,5 mg/mL Brühlösung herzustellen.
   2. Injizieren Sie nicht-nüchtern Ratten intraperitoneal Epinephrin-Hydrochloridlösung mit einem Volumen von 1 ml/kg Körpergewicht (0,5 mg/kg Körpergewicht)³.
      1. Halten Sie das Tier kopfgesenkt, damit sich der Bauchinhalt kranial verschieben kann.
      2. Führen Sie eine 25-Gauge-Nadel in den unteren rechten Quadranten des Bauches in einem Winkel von 45° ein.
      3. Aspirieren Sie, um das Fehlen von Blut oder enterischem Inhalt vor der Injektion zu bestätigen.
   3. Kontrolltiere intraperitoneal mit Kochsalzlösung mit einem Volumen von 1 ml/kg injizieren.
   4. Sammeln Sie Blutproben der Schwanzvene.
      1. Halte die Ratte fest, um den Schwanz freizulegen.
      2. Kompressiere und erwärme den Schwanz für 10 Sekunden, um den Blutfluss zu erleichtern.
      3. Stiche die laterale Schwanzvene 3 cm von der Spitze mit einer sterilen 25-Gauge-Nadel ab.
      4. Entsorgen Sie den ersten Blutstropfen mit sauberem Gaze, um eine Kontamination mit Gewebeflüssigkeit zu vermeiden.
      5. Sammeln Sie den zweiten Bluttropfen zur Glukosemessung.
   5. Messen Sie den Blutzucker alle 15 Minuten mit einem Blutzuckermessgerät für 60 Minuten.
      1. Kalibriere das Blutzuckermessgerät gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      2. Überprüfen Sie die Genauigkeit des Blutzuckermessers monatlich mit Kontrolllösungen.
      3. Bewahren Sie die Teststreifen im Originalbehälter auf, um Feuchtigkeitsexposition zu vermeiden.
      4. Verwenden Sie Teststreifen direkt nach dem Entfernen aus dem Behälter.
      5. Stecken Sie einen Teststreifen in das Blutzuckermessgerät, um das Messgerät automatisch zu aktivieren.
      6. Lassen Sie die Blutprobe durch Kapillarwirkung in den Streifen eindringen.
      7. Zeichnen Sie den angezeigten Blutzuckerwert auf.

3. Gewebeentnahme

1. Euthanasie und Vorbereitung
   1. Tiere durch eine Isofluran-Überdosis einschläfern. Setze die Tiere in eine Induktionskammer und setze sie 5 % Isofluran aus, das in 100 % Sauerstoff bei 2 L/min für mindestens 3 Minuten abgegeben wird.
   2. Verifizieren Sie den Tod durch Bestätigung des Atmungsstopps.
   3. Bestätigen Sie den Verlust des Hornhautreflexes und des Zehenkneifreflexes.
      1. Berühren Sie die Hornhaut vorsichtig mit einem sterilen Applikator mit Baumwollspitzen, um das Fehlen einer Blinzelreaktion zu bestätigen.
      2. Verlege einen festen Druck auf das Schwimmhäutchen zwischen den Zehen einer Hinterpfote mit einer stumpfen Zange, um das Fehlen einer motorischen Reaktion zu bestätigen.
   4. Lege die Rattenseite mit der Ventralseite nach oben auf ein Dissektionstablett.
   5. Befeuchte die Bauchhaut mit 75 % Ethanol und einer Sprühflasche.
      HINWEIS: Minimieren Sie die Zeit zwischen Euthanasie und Gewebekonservierung, um den Glykogenabbau durch postmortale Ischämie zu reduzieren.
2. Leberdissektion
   1. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut etwa 1 cm kaudal zum Xiphoid-Prozess.
   2. Verlängern Sie den Schnitt zum Brustbein.
   3. Trenne die Haut vom darunterliegenden Muskel.
   4. Führen Sie eine beidseitige transversale Laparotomie durch, indem Sie einen 4 cm langen horizontalen Schnitt etwa 1 cm kaudal zum Xiphoideusfortsatz machen und seitlich zu den linken und rechten subkostalen Rändern führen, um die Bauchhöhle vollständig freizulegen.
   5. Identifizieren Sie die Leber.
   6. Entfernen Sie den rechten Mittellappen (Abbildung 2A).
   7. Wiegen Sie das Taschentuch innerhalb von 1 Minute.
   8. Geben Sie das Gewebe in einen Polypropylen-Kunststoffbehälter.
   9. Das Gewebe mit Trockeneis einfrieren.
3. Skelettmuskeldissektion
   1. Verwenden Sie den Gastrocnemius-Musculus als repräsentatives Exemplar, da er eine gemischte Population von schnellen und langsam zuckenden Fasern enthält, die die metabolischen und kontraktilen Eigenschaften der Hintergliedzelle¹⁶ widerspiegeln.
   2. Leg die Ratte auf ihren Bauch.
   3. Machen Sie einen längsverlaufenden Hautschnitt entlang der hinteren Seite des Hintergliedmaßes von der Fossa poplitealis bis zur Tuberositus calcaneal.
   4. Trenne die Haut.
   5. Identifizieren und spiegeln Sie die Muskeln Bizeps, Femoris und Semitendinosus wider.
      1. Identifizieren Sie den Bizeps femoris als den großen, seitlich positionierten Muskel, der die obere Hälfte des hinteren Oberschenkels bedeckt.
      2. Identifizieren Sie den Semitendinosus als den schmalen, riemenartigen Muskel, der medial entlang des hinteren Oberschenkels verläuft und in der Nähe des Knies einsetzt.
   6. Legen Sie den Muskel Gastrocnemius frei.
   7. Schneiden Sie die Achillessehne an ihrer distalen Ansetzung am Kalk mit einer feinen chirurgischen Schere durch.
   8. Trenne den Soleusmuskel.
   9. Befreit die proximale Ansatzung des Musculus gastrocnemius an den medialen und lateralen Epikondylen des Oberschenkelknochens.
   10. Entfernen Sie den gesamten Muskel gastrocnemius (Abbildung 2B).
   11. Wiegen Sie das Taschentuch innerhalb von 1 Minute.
   12. Geben Sie das Gewebe in einen Polypropylen-Kunststoffbehälter.
   13. Das Gewebe mit Trockeneis einfrieren.

Abbildung 2: Gewebedissektionsverfahren für Leber- und Skelettmuskulatur. (A) Fortlaufende Schritte zur Freilegung der Bauchhöhle und zur Entnahme von Lebergewebe, einschließlich Hautschnitt, Erweiterung des Schnitts, Trennung der Haut vom darunterliegenden Muskel und transversale Laparatomie. (B) Fortlaufende Schritte zur Isolierung des Muskels gastrocnemius, einschließlich Längschnitt, Reflexion der darüberliegenden Muskeln, Identifikation anatomischer Strukturen und Exzision des Muskels. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Glykogen-Kolorimetrische Analyse

1. Tag 1: Alkalische Verdauung
   1. Gib 0,4 g Gewebe in ein 50-mL Zentrifugenrohr. Eine Toleranz von ± 0,1 g ist erlaubt, um eine schnelle Verarbeitung zu gewährleisten und den Gewebeabbau zu minimieren.
   2. Gib 10 ml 1 M NaOH-Lösung in das Rohr.
   3. Zerkleinern Sie das Gewebe mit sterilen Klingen oder Scheren, bis die Gewebefragmente etwa 1–2 mm groß sind.
   4. Stellen Sie den Schlauch bei 95 °C ± 5 °C in ein Wasserbad.
   5. Inkubiere 30 Minuten.
   6. Wirbeln Sie die Probe während der Inkubation alle 10 Minuten mit 2.500 U/min für 10 Sekunden.
   7. Nehmen Sie den Schlauch aus dem Wasserbad.
   8. Lass die Probe auf RT abkühlen.
2. Herstellung von Lysat für den Proteintest
   1. Übertragen Sie 1 ml alkalisches Lysat mit einem kalibrierten P1000-Pipettor in ein Mikrozentrifugenrohr.
   2. Zentrifugiere bei 8.000 × g für 10 Minuten.
   3. Sammle das Supernatant.
   4. Reservieren Sie das Supernatant für den BCA-Protein-Test.
3. TCA-vermittelte Deproteinisierung
   1. Übertragen Sie 3 ml alkalines Lysat in ein 15-mL Zentrifugenrohr.
   2. Gib 1 ml 100% (mit /v) TCA-Lösung dazu.
   3. Fügen Sie 6 ml destilliertes Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 ml zu bringen.
   4. Wirbeln Sie das Gemisch bei 2.500 U/min für 10 Sekunden.
   5. Legen Sie das Rohr auf Eis (0°C–4°C).
   6. Inkubieren Sie 1 Stunde, um Proteine auszufällen.
4. Sammlung von deproteinisiertem Supernatant
   1. Übertragen Sie 1 ml der Mischung in ein Mikrozentrifugenrohr.
   2. Zentrifugiere mit 8.000 × g für 10 Minuten bei RT.
   3. Reservieren Sie das Supernatantant.
5. Glykogenpräzipitation
   1. Übertragen Sie 0,4 ml des Überstandsmittels in ein neues Mikrozentrifugenrohr.
   2. Fügen Sie 0,8 ml 95 % Ethanol mit 0,1 % LiCl hinzu.
   3. Wirbeln Sie die Mischung gründlich vor.
   4. Inkubiere 16 Stunden im RT.
6. Tag 2: Glykogenpelleting
   1. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.000 × g für 15 Minuten bei RT, um ein festes, halbtransparentes weißes Glykogenpellet zu erhalten (Abbildung 3A und Abbildung 3B).
   2. Entsorge das Supernatant.
7. Erste Glykogen-Waschung
   1. Fügen Sie dem Pellet 1,5 ml 80 % Methanol mit 0,1 % LiCl hinzu.
   2. Vortex die Probe bei 2.500 U/min für 10 Sekunden.
8. Zentrifugation nach dem Waschen
   1. Zentrifugiere mit 1.000 × g für 5 Minuten bei RT.
   2. Entsorge das Supernatant.
9. Zweiter Glykogen-Wash
   1. Wiederhole den Waschschritt einmal.
   2. Entfernen Sie eventuelle Restflüssigkeiten, indem Sie vorsichtig mit einem P200-Pipettor mit feiner Spitze aspirieren, damit das Glykogenpellet unberührt bleibt.
10. Glykogenauflösung
    1. Gib 0,8 ml destilliertes Wasser zum Pellet.
    2. Vortex bei 2.500 U/min, bis eine klare, homogene Lösung ohne sichtbare Partikel erreicht ist.
11. Vorbereitung von Standards und Proben
    1. Bereiten Sie 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für Glukosestandards vor, Blank- und unbekannte Proben in dreifachem Exemplar.
       HINWEIS: Fügen Sie gemäß Tabelle 1 jedem Rohr Reagenzien hinzu.
    2. Fügen Sie 50 μL jedes Glukosestandards zu den vorgesehenen Röhrchen hinzu.
    3. Gib 50 μL destilliertes Wasser in das Leerrohr.
    4. Fügen Sie 50 μL Glykogenprobe zu jedem unbekannten Probenröhrchen hinzu.
    5. Fügen Sie jedem Rohr eine Anthronreaktionslösung von 200 μL hinzu.
12. Messung der Farbentwicklung und Absorption von Anthrone
    1. Vortex alle Röhren gründlich.
    2. Stellen Sie die Schläuche in ein Wasserbad bei 95 °C ± 5 °C.
    3. 15 Minuten inkubieren.
    4. Entferne die Schläuche und lass sie bis RT abkühlen.
    5. Übertragen Sie 200 μL von jedem Rohr auf eine 96-Well-Platte.
    6. Messen Sie die Absorption bei 620 nm mit einem Mikroplatten-Leser (Endpunktmodus, 25 °C) mit automatischer Pfadlängenkorrektur bis 1 cm.
    7. Die Standardkurve sollte einen Bestimmungskoeffizienten (R²) von ≥0,995 haben, bestimmt durch lineare Regression, um als akzeptabel zu gelten.
    8. Jede einzelne Standard- oder Stichprobenreplikation mit einem CV%-Wert von >20 % bei dreifachen Messungen sollte als unzuverlässig angesehen und erneut durchgeführt werden.

Abbildung 3: Glykogenisolierung und Quantifizierung unter verschiedenen Ernährungszuständen. (A) Repräsentatives Bild von ausgefällten Glykogenpellets aus Leberproben unter gefütterten, nüchternden und reservierten Bedingungen. (B) Repräsentatives Bild von ausgefällten Glykogenpellets aus Skelettmuskelproben unter gefütterten, nütternden und refierten Bedingungen. (C) Standardkurve, die aus Glukosestandards generiert wird und die lineare Beziehung zwischen Absorption bei 620 nm und Glukosekonzentration zeigt. (D) Blutzuckerwerte unter gefütterten, nüchternden und refedierten Bedingungen. (E) Leberglykogengehalt unter gefütterten, nütternden und refedierten Bedingungen. (F) Glykogengehalt der Skelettmuskulatur unter gefütterten, nütternden und refedierten Bedingungen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM präsentiert (n = 6 pro Gruppe). Die statistische Analyse wurde mittels gewöhnlicher Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, wobei mehrere Vergleiche mit der Benjamini–Hochberg-Methode korrigiert wurden. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns: nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Reagenzien	0 mg/mL	0,01 mg/mL	0,02 mg/mL	0,05 mg/mL	0,1 mg/mL	0,2 mg/mL	0,5 mg/mL	1 mg/mL	Blank	Unbekannte Probe
Glukosestandardlösung	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	50 μL	–	–
Destilliertes Wasser (H₂O)	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL	–
Glykogenprobe	–	–	–	–	–	–	–	–	–	50 μL
Anthronreaktionslösung	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL

Tabelle 1: Reaktionsaufbau für den glykogenkolorimetrischen Test. Reaktionsaufbau für Glukosestandards, Blank- und unbekannte Glykogenproben, die im kolorimetrischen Anthrone-Test verwendet werden. Definierte Volumina von Glukosestandards, destilliertem Wasser oder Glykogenproben wurden vor Inkubation und Absorptionsmessung mit einer Anthronreaktionslösung kombiniert.

5. Berechnung des Gewebeglykogengehalts

HINWEIS: Normalisiere das gemessene Glykogen entweder auf das Gewebefeuchtgewicht oder die Gesamtproteinmasse.

1. Bestimmung der Standardkurve und Konzentration
   1. Verwenden Sie Absorptionsmessungen aus den acht Standard-Glukoseröhrchen.
   2. Subtrahieren Sie leere Werte von den Absorptionswerten, bevor Sie sie mit den Glukosekonzentrationen abrechnen.
   3. Passen Sie eine lineare Regressionskurve mit der gewöhnlichen Kleinste-Quadrat-Regression in Excel an (Abbildung 3C).
   4. Berechnen Sie die Glukosekonzentration in jeder unbekannten Glykogenprobe (C_unbekannt), indem Sie deren blanksubtrahierte Absorption auf die lineare Standardkurve mit der in Schritt 5.1.3 erhaltenen Regressionsgleichung interpolieren.
2. Normalisierung zum feuchten Gewebegewicht
   1. Berechnen Sie den Glykogengehalt mit folgender Gleichung:
      
   2. Definieren Sie C_unbekannt als die Glukosekonzentration (mg/mL) in der unbekannten Glykogenprobe, die in Schritt 5.1.4 bestimmt wurde.
   3. Definieren Sie 0,8 als das Volumen der gelösten Glykogenprobe (mL) in Schritt 4.10.1.
   4. Definieren Sie 0,9 als den Faktor, der verwendet wird, um den Glukosewert in den Glykogenwert umzuwandeln.
   5. Definieren Sie 2.5 als den während der Glykogenausfällung eingebrachten Verdünnungsfaktor in Schritt 4.5.
   6. Definieren Sie 10 als den Verdünnungsfaktor, der den 1 mL Aliquot aus dem in Schritt 4.3.3 hergestellten 10 mL Gemisch berücksichtigt.
   7. Definieren Sie 10/3 als den Verdünnungsfaktor, der die 3 mL Aliquot aus dem in Schritt 4.1.2 hergestellten 10 mL alkalischen Verdauungsgehalt berücksichtigt.
3. Normalisierung zur Gesamtproteinmasse
   1. Berechnen Sie den Glykogengehalt mit folgender Gleichung:
      
   2. Definieren Sie C_unbekannt als die Glukosekonzentration (mg/mL) in der unbekannten Glykogenprobe, die in Schritt 5.1.4 bestimmt wurde.
   3. Definieren Sie 0,8 als das Volumen der gelösten Glykogenprobe (mL) in Schritt 4.10.1.
   4. Definieren Sie 0,9 als den Faktor, der verwendet wird, um den Glukosewert in den Glykogenwert umzuwandeln.
   5. Definieren Sie 2.5 als den während der Glykogenausfällung eingebrachten Verdünnungsfaktor in Schritt 4.5.
   6. Definieren Sie 10 als den Verdünnungsfaktor, der den 1 mL Aliquot aus dem in Schritt 4.3.3 hergestellten 10 mL Gemisch berücksichtigt.
   7. Definieren Sie 1/3 als Korrekturfaktor, der den verwendeten 3 mL Aliquot aus der alkalischen Verdauung in Schritt 4.3.1 berücksichtigt.
   8. Definieren Sie die Proteinkonzentration als die Konzentration des Gesamtproteins (mg/mL) in der alkalischen Verdauung, die durch den BCA-Test in Schritt 4.2.4 bestimmt wurde.

6. Westlicher Blot wichtiger Enzyme, die den Glykogenstoffwechsel katalysieren

1. Allgemeine Überlegungen
   1. Siehe die zuvor beschriebenen Protokolle für Standard-Western-Blot-Verfahren^17,18.
2. Proteinextraktion
   1. Ich wiege 75 mg gefrorenes Gewebe. Eine Toleranz von ± 25 mg ist erlaubt, um eine schnelle Verarbeitung zu gewährleisten und das Auftauen des Gewebes zu minimieren.
   2. Fügen Sie 1 ml eiskalte RIPA-Lysepuffer hinzu (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 1% Triton X-100; 0,5% Natriumdeoxycholat; 0,1% SDS; und 1 mM EDTA), ergänzt mit Protease- und Phosphataseinhibitoren.
   3. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem handgehaltenen Rotor-Stator-Homogenisator.
3. Lysatzubereitung
   1. Homogenate 30 Minuten lang auf Eis brüten.
   2. Die Proben während der Inkubation mit 2.500 U/min alle 10 Sekunden vorversetzen.
   3. Zentrifugiere bei 10.000 × g mit einem festen Winkelrotor für 5 Minuten bei 4°C.
4. Proteinquantifizierung
   1. Sammeln Sie das Supernatant als vollständiges Proteinlysat.
   2. Führen Sie einen BCA-Test durch, um die Proteinkonzentration zu bestimmen.
   3. Bereiten Sie BSA-Standards von 0, 0,025, 0,125, 0,25, 0,5, 0,75 und 1 mg/ml vor, verdünnt im RIPA-Lysepuffer.
   4. In einer 96-Well-Mikroplatte werden 20 μL jeder Standard- oder unbekannten Probe in einzelne Bohrungen geladen.
   5. Fügen Sie jedem Bohrloch 200 μL BCA-Arbeitsreagenz hinzu (hergestellt durch Mische von 50 Teilen Reagenz A mit 1 Teil Reagenz B).
   6. Inkubieren Sie die Reaktionsplatte bei 37°C für 30 Minuten.
   7. Nach dem Abkühlen auf RT (18°C–23°C) wird die Absorption bei 562 nm mit einem Mikroplatten-Leser (Endpunktsmodus, 25°C) mit automatischer Pfadlängenkorrektur bis 1 cm gemessen.
5. SDS-PAGE
   1. Mische 15 μg Protein mit SDS-PAGE Ladepuffer.
   2. Erhitze die Proben bei 95°C für 5 Minuten.
   3. Kühlen Sie die Proben auf Eis.
   4. Laden Sie die Proben auf ein 10%iges SDS-PAGE-Gel.
   5. Proteine werden durch Elektrophose im laufenden Puffer aufgelöst (25 mM Tris, 192 mM Glycin und 0,1 % SDS).
   6. Führe das Gel bei konstanten 100 V, bis die Front des Bromphenol-Blau-Farbstoffs den Boden des Gels erreicht.
6. Proteintransfer und Blockierung
   1. Proteine werden auf eine Nitrocellulose- oder PVDF-Membran übertragen.
   2. Bei Nitrocellulosemembranen wird die Membran im Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20 % Methanol, pH 8,3) für 10 Minuten ausgeglichen.
   3. Bei PVDF-Membranen wird die Membran durch Immersion in 100 % Methanol für 30 Sekunden aktiviert und anschließend 10 Minuten im Transferpuffer ausgegleicht.
   4. Setze das Transfersandwich in folgender Reihenfolge zusammen: Schwamm, Filterpapier, Gel, Membran, Filterpapier, Schwamm.
   5. Führen Sie den Proteintransfer bei einem konstanten Strom von 200 mA für 90 Minuten bei 4°C durch.
   6. Bereiten Sie 3 % (w/v) BSA in TBST vor (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; und 0,1% Tween-20).
   7. Blockiere die Membran bei RT für 1 Stunde mit ständigem Schaukeln.
      HINWEIS: Verwenden Sie BSA anstelle von fettfreier Milch, wenn phosphorylierte Proteine festgestellt werden.
7. Primäre Antikörperinkubation
   1. Primäre Antikörperlösung im Blockpuffer mit einer Verdünnung von 1:1.000 vorbereiten.
   2. Inkubieren Sie die Membran über Nacht mit einem primären Antikörper bei 4 °C und ständigem Schaukeln.
8. Waschen
   1. Wasche die Membran mit TBST.
   2. Wiederhole das Waschen dreimal für jeweils 10 Minuten.
9. Sekundäre Antikörperinkubation
   1. Bereiten Sie HRP-konjugierte Sekundärantikörper im Blockpuffer mit einer Verdünnung von 1:10.000 vor.
   2. Inkubiere die Membran bei RT für 1 Stunde mit ständigem Schaukeln.
10. Waschen
    1. Wasche die Membran mit TBST.
    2. Wiederhole das Waschen dreimal für jeweils 10 Minuten.
11. Chemilumineszente Detektion
    1. Bereiten Sie chemilumineszierende Substrat vor, indem Sie gleiche Mengen von Luminol/Enhancer und stabilen Peroxidlösungen mischen.
    2. Tragen Sie das Substrat mit einem Volumen von 0,1 mL/cm² Membranfläche auf und inkubieren Sie 2 Minuten bei RT auf einem Orbitalshaker (100 U/min).
    3. Signale werden mit einem chemilumineszenten Bildgerät erfasst.
    4. Testen Sie Belichtungszeiten von 10 bis 300 Sekunden und wählen Sie für jeden Fleck eine Belichtung innerhalb des linearen Detektionsbereichs aus.
    5. Überprüfen Sie die Signallinearität, indem Sie das Fehlen von Pixelsättigung mit der integrierten Software des Instruments überprüfen.
12. Bildanalyse
    1. Analysieren Sie die Bandintensität mit der ImageJ-Software (Version 1.51, NIH).
    2. Konvertiere Bilder in 8-Bit-Graustufen und wende Rolling-Ball-Hintergrundsubtraktion mit einem Radius von 50 Pixeln an.
    3. Definieren Sie jedes Band anhand eines rechteckigen Interessensbereichs identischer Abmessungen und subtrahieren Sie den lokalen Hintergrund von einem benachbarten leeren Bereich, um rohe integrierte Dichtewerte zu erhalten.
13. Totale Proteinfärbung
    1. Inkubieren Sie die Membran in 0,1 % India-Tintenlösung in TBST bei RT für 1 Stunde mit ständigem Schaukeln.
    2. Wasche die Membran dreimal für jeweils 10 Minuten mit TBST.
    3. Quantifizieren Sie mehrere gefärbte Bänder als Belastungskontrollen, um Immunoblotting-Signale zu normalisieren.
       HINWEIS: Verwenden Sie Totalproteinfärbung anstelle von Housekeeping-Genen (HKGs), da die HKG-Expression unter verschiedenen experimentellen Bedingungen variieren kann¹⁹.

7. Sensibilität und Reproduzierbarkeit der Methode

1. Herstellung von Glykogenstandards
   1. Bereiten Sie eine 20 mg/mL Glykogenbrühlösung in 1 M NaOH vor.
   2. Bereiten Sie eine Reihe von Glykogenstandards (0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 und 1 mg/mL) in 15-mL-Zentrifugenröhren durch stufenweise Verdünnung mit 1 M NaOH wie unten beschrieben vor.
      1. Bereiten Sie Tube 1 (1 mg/mL) vor, indem Sie 500 μL Glykogen-Fondlösung mit 9,5 mL 1 M NaOH mischen.
      2. Bereiten Sie Tube 2 (0,5 mg/mL) vor, indem Sie 250 μL Glykogen-Fondlösung mit 9,75 mL 1 M NaOH mischen.
      3. Bereiten Sie Tube 3 (0,2 mg/mL) vor, indem Sie 100 μL Glykogen-Fondlösung mit 9,9 mL 1 M NaOH mischen.
      4. Bereiten Sie Tube 4 (0,1 mg/mL) vor, indem Sie 50 μL Glykogen-Stocklösung mit 9,95 mL 1 M NaOH mischen.
      5. Bereiten Sie Tube 5 (0,05 mg/mL) vor, indem Sie 25 μL Glykogen-Lagerlösung mit 9,975 mL 1 M NaOH mischen.
      6. Bereiten Sie Tube 6 (0,02 mg/mL) vor, indem Sie 10 μL Glykogen-Fondlösung mit 9,99 mL 1 M NaOH mischen.
      7. Bereite Tube 7 (0,01 mg/mL) vor, indem du 100 μL Tube 1-Lösung mit 9,9 mL 1 NaOH mischst.
      8. Bereiten Sie Tube 8 (0,005 mg/mL) vor, indem Sie 50 μL Tube 1-Lösung mit 9,95 mL 1 M NaOH mischen.
      9. Bereiten Sie den Blank (0 mg/mL) vor, indem Sie 10 mL 1 M NaOH in ein 15 mL Zentrifugenrohr geben.
   3. Jede Röhre abdecken und vortexen auf 2.500 U/min für 10 Sekunden, um zu mischen.
2. Anthrone-Kolorimetrische Analyse
   1. Glykogen extrahieren und den kolorimetrischen Anthrone-Test gemäß den Schritten 4.1.4–4.12.6 durchführen.
   2. Rekordabsorptionswerte bei 620 nm (A₆₂₀).
3. Berechnung der Glykogenkonzentration
   1. Erzeugen Sie die Glukosestandardkurve und berechnen Sie die Glukosekonzentration in jeder Standardprobe (_C-Standard) gemäß Schritt 5.1.
   2. Berechnen Sie die Glykogenkonzentration in jedem Standardrohr mit folgender Gleichung:
      
   3. Definieren Sie den_C-Standard als die Glukosekonzentration (mg/mL), die in jeder Standardprobe bestimmt wird.
   4. Definieren Sie 0,8 als das Volumen der Glykogenprobe (mL).
   5. Definieren Sie 0,9 als Faktor zur Umwandlung des Glukosewerts in den Glykogenwert.
   6. Definieren Sie 2,5 als Verdünnungsfaktor.
   7. Definieren Sie 10 als den Verdünnungsfaktor, der den 1 mL Aliquot aus dem in Schritt 4.3.3 hergestellten 10 mL Gemisch berücksichtigt.
   8. Definieren Sie 1/3 als Korrekturfaktor, der den verwendeten 3 mL Aliquot aus der alkalischen Verdauung in Schritt 4.3.1 berücksichtigt.
   9. Wiederholen Sie das vollständige Verfahren dreimal an einem Tag, also insgesamt vier Durchläufe.
   10. Wiederholen Sie die vier Läufe über vier Tage hinweg, insgesamt 16 Läufe.
4. Berechnung von LOD und LOQ
   1. Zeichnen Sie alle 16 Absorptionswerte auf der y-Achse gegen jede Glykogen-Standardkonzentration auf der x-Achse aus.
   2. Berechnen Sie die lineare Regressionskurve und R². Eine lineare Regression mit R² von ≥0,995 gilt als akzeptabel.
   3. Berechnen Sie LOD und LOQ mit den folgenden Gleichungen:
      
      
   4. Definieren Sie σ als den Standardfehler der Antwort (y-Intercept).
   5. Definiere S als die Steigung der linearen Regressionskurve.
5. Berechnung des intra-assay- und inter-assay-CV%
   1. Für jeden Glykogenstandard berechnen Sie den intra-assay CV% der berechneten Werte aus den vier Durchläufen am ersten Tag mit folgender Gleichung:
      
   2. Definiere s₁ als Standardabweichung der Werte von den vier Durchläufen am ersten Tag.
   3. Definieren Sie den Mittelwert der vier Runs am ersten Tag.
   4. Wiederholen Sie diese Berechnung für Tag 2, Tag 3 und Tag 4, um CV₂, CV₃ und CV₄ zu erhalten.
   5. Berechnen Sie den endgültigen intra-assay CV% mit folgender Gleichung:
      
   6. Berechnen Sie den Inter-Assay CV% mit folgender Gleichung:
      
   7. Definiert s_inter als Standardabweichung von CV₁, CV₂, CV₃ und CV₄.
   8. Definieren Sie als den Mittelwert von CV₁, CV₂, CV₃ und CV₄.

Ergebnisse

Leber- und Skelettmuskel-Glykogenwerte unter unterschiedlichen Nährzuständen

Nächtliches Fasten senkte signifikant den Blutzuckerspiegel (mittlerer ± Standardfehler des mittleren [SEM]) von 7,9 ± 0,4 mM bei ad libitum gefütterten Ratten auf 5,4 ± 0,3 mM. Der Blutzuckerspiegel wurde nach 2 Stunden Wiederernährung auf 8,3 ± 0,1 mM wiederhergestellt (Abbildung 3D). Im Einklang mit diesen Veränderungen lagen die Leberglykogenwerte (mittlerer ...

Diskussion

In diesem Artikel beschreiben wir eine modifizierte anthrone-kolorimetrische Methode zur Quantifizierung von Glykogen in tierischen Geweben. Zusätzlich zu den konventionellen sequentiellen Schritten wie Gewebeernte, alkalischer Verdauung, Glykogenfällung, Alkoholwäsche und anthronbasierter Farbentwicklung haben wir einen Deproteinisierungsschritt integriert, um Hintergrundinterferenz zu reduzieren (Abbildung 1). Anschließend wandten wir diese Methode an, um ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1.5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	LABGIC	BS-15-M	Verwendet für Probenverarbeitung und Reaktionseinrichtung
15 mL Mikrozentrifugenröhrchen	LABGIC	BS-150-M-S	Verwendet für Lysathandhabung und Präzipitationsschritte
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	Puffer für Membranwäsche im Western Blot
37 oC Inkubator	Shanghai Jinghong Instrument	HWS-150	BCA-Assay-Platteninkubation
50 mL Zentrifugenrohre	LABGIC	CT-112-50A	Verwendet für Gewebeverdauung und Extraktion
96-Well-Platte	LABGIC	BS-MP-96W-CL	Plattenbasierte Absorptionsmessung
Analytische Waage	Changzhou Xingyun	FA2204N	Chemische Pulver wiegen
Anthrone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	A108571	Reagenz für die kolorimetrische Glykogen-Erkennung
Anti-GYS1-Antikörper	Proteintech	10566-1-AP	Erkennung von Glykogensynthase 1
Anti-GYS2-Antikörper	Proteintech	22371-1-AP	Erkennung von Glykogensynthase 2
Anti-phospho-GYS1/2 (Ser641)-Antikörper	Cell Signaling Technology	47043S	Erkennung von phosphoryliertem GYS
Anti-phospho-PYGL (Ser15)-Antikörper	Abcam	ab227043	Erkennung von phosphorylierter Glykogen-Phosphorylase
Anti-PYGL-Antikörper	Proteintech	15851-1-AP	Erkennung von leber-Glykogen-Phosphorylase
Anti-PYGM-Antikörper	Novus Biologicals	NBP2-16689	Erkennung von Muskel-Glykogen-Phosphorylase
BCA-Assay-Kit	Beyotime	P0012	Proteinquantifizierung
Benzoesäure	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	B116255	Zubereitung der gesättigten Lösung für Standards
Gummizangenzangen	Shanghai Jinzhong	J42010	Zehenquetsch; Gewebesektion
BSA Fraktion V	Beyotime	ST023	Blockierungsmittel im Western Blot
Chemilumineszenz-Imager	Tanon	Tanon 5200 Multi	Erkennung von Western-Blot-Signalen
Chemilumineszenz-Substrat (ECL)	Beyotime	P0018S	Signalentwicklung im Western Blot
Destilliertes Wasser	Beyotime	ST872	Lösungsmittel für Reagenzienzubereitung
Epinephrinhydrochlorid	Sigma-Aldrich	E4642	Induktion des Glykogenabbaus in vivo
Ethanol	Macklin	E809065	Glykogenpräzipitation und -wäsche
Feinschneidescheren	Shanghai Jinzhong	JA2601	Gewebesektion
Fresco 17 Zentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Probenzentrifugation
Glukosimeter	i-SENS	CareSens N	Messung des Blutzuckers
Glukosimeter	i-SENS	CareSens N	Messung des Blutzuckerspiegels in der Schwanzvene
Glukosimeter-Streifen	i-SENS	CareSens N Streifen	Messung des Blutzuckerspiegels in der Schwanzvene
Glukose	Macklin	G6172	Zubereitung der Standardkurve
Glykogenvorrat	Beyotime	D0812	Zubereitung einer Reihe von Glykogenstandards
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper	Thermo Fisher Scientific	31462	Erkennung von Primärantikörpern
Handhomogenisator	GreenPrima	PB100	Gewebehomogenisierung
Tusche	Sigma-Aldrich	198285	Totalprotein-Färbung zur Normalisierung
Isofluran	RWD Life Science	R510-22-10	Euthanasie von Tieren
Laborheizblock	Changzhou Guowang	GWJ300-1	Probenheizung während der Assays
Lithiumchlorid	Macklin	767397	Verbesserung der Glykogenpräzipitation
Methanol	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	M116115	Glykogen-Wäscheschritt
Mikroplatten-Reader	BioTek	ELx800	Messung der Absorption bei 620 nm
Nitrocellulose-Membran	Millipore	HATF04700	Proteintransfermembran
Orbitalschüttler	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	Inkubation des Chemilumineszenz-Substrats
P1000 Pipettierer	Thermo Fisher Scientific	4641100N	Übertragungslösung
P200 Pipettierer	Thermo Fisher Scientific	4641080N	Entfernung von Restflüssigkeit
Phosphatasehemmer (PhosSTOP)	Roche	4906845001	Erhaltung der Proteinphosphorylierung
Kunststoffbehälter (zur Gewebelagerung)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	Lagerung von geernteten Geweben
Proteasehemmer-Cocktail	MCE	HY-K0011	Verhinderung der Proteindegradation
RIPA-Lysispuffer	Beyotime	P0013B	Proteinextraktion
SDS-PAGE-Gelkit	Beyotime	P0012A	Proteintrennung
SDS-PAGE-Laufpuffer (6X)	Beyotime	P0015F	Mischen mit Proteinproben vor dem Einlegen in die SDS-PAGE-Gel-Kugeln
SDS-PAGE-Laufpuffer (5x)	Beyotime	P0014D	SDS-PAGE-Elektrophorese
Kleintier-Narkosemaschine	RWD Life Science	R500	Euthanasie von Tieren
Natriumhydroxid	Macklin	S817977	Gewebeverdauung und Glykogenextraktion
Sprague-Dawley-Ratten	Charles River Laboratories	Crl: CD(SD)	Experimentelles Tiermodell
Sprühflasche	Beyotime	TB6310	Auftragen von 75% Ethanol auf Tierfell zum Benetzen und Desinfizieren
Standardfutter	Jiangsu-Xietong, Inc.	XTI01ZJ-009	Nahrung für Nagetiere
Chirurgische Scheren	Shanghai Jinzhong	J22010	Gewebesektion
Sp