Klinisch relevante transplantierbare Tumormodelle zur Untersuchung von metastasiertem Eierstockkrebs und der therapeutischen Reaktion bei Mausen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Etablierung der intraperitonealen und intrabursalen Tumormodelle, um das Fortschreiten von Eierstockkrebs, Metasättigung und therapeutische Wirkungswirkung zu untersuchen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie luciferasebasierte nicht-invasive in vivo-Bildgebung in diesen Modellen verwendet werden kann, um den Tumorverlauf bei Mausen zu überwachen.

Zusammenfassung

Metastasierter Eierstockkrebs ist eine äußerst tödliche gynäkologische Malignität, der es an wirksamen Behandlungsmöglichkeiten mangelt. Die Entwicklung klinisch übersetzbarer therapeutischer Ansätze für Eierstockkrebspatienten hängt davon ab, die Faktoren zu verstehen, die die Metastasen von Eierstockkrebs antreiben. Während die meisten soliden Tumore hämatogene Metastasen aufweisen, breiten sich Eierstockkrebszellen hauptsächlich über den intraperitonealen Weg aus. Dieser Prozess beinhaltet die Ablösung und Ablagerung von Krebszellen aus dem Primärtumor in die Bauchhöhle, die dann Eigenschaften annehmen, die es ihnen ermöglichen, Anoikis zu widerstehen und mehrzellige Aggregate zu bilden. Diese Zellaggregate haften sich dann an und betreten die mesotheliale Auskleidung des Peritoneums und bilden metastatische Läsionen. Klinisch relevante In-vivo-Modelle sind unerlässlich, um zu verstehen, wie zelluläre Faktoren und die Tumormikroumgebung die verschiedenen Schritte im metastasierten Prozess beeinflussen und um neuartige Therapiestrategien zu testen. Zwei transplantierbare Maustumor-Modelle, die weit verbreitet zur Untersuchung von Ovarialkrebsmetastasen und therapeutischer Wirkung eingesetzt werden, sind die intraperitonealen und intrabursalen Modelle. In diesem Bericht beschreiben wir die Schritt-für-Schritt-Methodik zur Etablierung dieser Modelle und heben ihre Vorteile und Einschränkungen hervor. Zusätzlich beschreiben wir, wie biolumineszente Bildgebung verwendet werden kann, um den Tumorverlauf mit diesen Modellen nicht-invasiv zu überwachen.

Einleitung

Trotz erheblicher Fortschritte im Verständnis der Faktoren, die das Fortschreiten von Eierstockkrebs vorantreiben, bleibt Eierstockkrebs die zweittödlichste gynäkologische Malignität in den Vereinigten Staaten¹. Aufgrund fehlender offensichtlicher Symptome und fehlender zuverlässiger früher diagnostischer Marker haben über 70 Prozent der Eierstockkrebspatienten bei der Diagnose ^2,3 eine fortgeschrittene metastasierte Erkrankung. Aktuelle Therapeutika sind bei der Behandlung von metastasiertem Eierstockkrebs nicht wirksam, weshalb die 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung weiterhin unter 30 Prozent^liegt. Eine Hauptursache für den mangelnden therapeutischen Erfolg ist das Auftreten von Chemoresistenz⁵. Daher besteht ein dringender Bedarf, Faktoren zu identifizieren, die Metastasen und Chemoresistenz an Eierstockkrebs antreiben. Die Schließung dieser Wissenslücke wird entscheidend sein, um wirksamere therapeutische Strategien zur Bekämpfung dieser Krankheit zu entwickeln. Um diese Ziele zu erreichen, benötigen wir In-vivo-Modelle, die die wichtigsten Schritte des Fortschritts von Eierstockkrebs genau nachahmen.

Während Eierstockkrebszelllinien und dreidimensionale In-vitro-Modelle maßgeblich zu unserem Verständnis der Faktoren beigetragen haben, die Metastasen und therapeutische Reaktionen beeinflussen, haben diese Modelle mehrere Einschränkungen ^6,7,8. Diese Modelle berücksichtigen beispielsweise nicht die verschiedenen nicht-krebsartigen Zellen, die Teil der Tumormikroumgebung sind, noch erfassen sie die komplexen Interaktionen, die innerhalb der Tumormikroumgebung^stattfinden. Darüber hinaus ist es äußerst schwierig, systemische Faktoren und deren Einfluss auf Tumorprogression und Wirkstoffantwort mit In-vitro-Modellen ^6,7,8 zu untersuchen. Diese Einschränkungen von In-vitro-Modellen verdeutlichen die Notwendigkeit von in vivo Modellen, die die verschiedenen Schritte der Metastasen von Eierstockkrebs genau nachahmen, einschließlich komplexer Interaktionen mit anderen Zelltypen und Faktoren innerhalb der Mikroumgebung.

Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) bieten eine In-vivo-Plattform, auf der Tumore spontan in einer natürlichen Mikroumgebung mit intaktem Immunsystem entstehen⁹. Allerdings sind sie zeitaufwendig, herausfordernd und teuer, um¹⁰ zu erstellen und zu warten. Die meisten GEMMs bei Eierstockkrebs haben zudem eine lange Latenzzeit für die Tumorentwicklung, was die Behandlung zeitaufwendig und kostspielig macht, selbst nachdem sie¹⁰ Jahre lang erzeugt wurden. Transplantierbare Modelle wie Xenograft- und Allograft-Modelle bieten ein gutes Gleichgewicht zwischen biologischer Relevanz und experimenteller Leichtigkeit und sind oft deutlich kostengünstiger zu erstellen als GEMMs¹¹. Neben der geringeren Latenz als GEMMs macht die Leichtigkeit, mit der Tumorzellen in vitro genetisch verändert werden können, diese Modelle praktisch und geeignet, um zu untersuchen, wie verschiedene genetische Faktoren den Tumorprogression beeinflussen¹⁰. Aufgrund dieser Vorteile haben sich transplantierbare Tumormodelle als wertvolle Werkzeuge sowohl für die Grundlagenforschung als auch für translationale Forschung am Eierstockkrebs etabliert.

In diesem Bericht beschreiben wir das Protokoll zur Etablierung von zwei verschiedenen transplantierbaren Maustumormodellen, die weit verbreitet zur Untersuchung metastasierter Eierstockkrebs verwendet werden: (1) das intraperitoneale Modell und (2) das orthotopische oder intrabursale Modell. Beide Modelle können entweder als Xenograft- oder Allograft-Modelle etabliert werden. Im intraperitonealen Modell werden Krebszellen in die Peritonealhöhle der Mäuse injiziert. Das Einführen von Eierstockkrebszellen in den intraperitonealen Raum spiegelt das Stadium der Metastasen von Eierstockkrebs wider, bei dem metastasierende Eierstockkrebszellen vom primären Tumor in die Peritonealhöhle abgestoßen werden. Ähnlich wie beim metastatischen Prozess beim Menschen müssen diese transplantierten Eierstockkrebszellen sich an das feindliche peritoneale Mikroumfeld anpassen, sich an die mesotheliale Schicht festsetzen und die Peritonealhöhle befestigen und invadieren, und metastasierte Läsionen an intraperitonealen Organen und Geweben wie Omentum, Mesenterium, Leber und Zwerchfell bilden. Je nach Krebszelllinie, die zur Erstellung des intraperitonealen Modells verwendet wird, können metastasierte Tumore von Aszites begleitet werden, wie bei Krankheiten im Spätstadium beim Menschen beobachtet wird. Daher wurde das intraperitoneale Modell weit verbreitet verwendet, um Faktoren zu verstehen, die die Metastasierung von Eierstockkrebs und deren Fortschreitung in ein spätes Stadium^{der Erkrankung 12} antreiben. Diese Modelle sind auch nützlich, um die Wirksamkeit neuartiger therapeutischer Strategien bei metastasiertem Eierstockkrebs^zu bestimmen. Im intrabursalen oder orthotopischen Modell werden Krebszellen in die Bursa implantiert, eine membranöse Struktur, die den Maus-Eierstock umgibt. Dieses Modell ahmt frühe Stadien der ovarialen Tumorentstehung und Metastasen nach. In diesem Stadium sind Krebszellen noch auf Eileiter und Eierstock beschränkt. Von diesen Stellen aus werden Krebszellen in die Bauchhöhle abgestoßen und metastasieren schließlich in andere Organe. Daher ist das intrabursale Modell nützlich, um sowohl frühe Stadien der ovarialen Tumorentese als auch Ereignisse zu untersuchen, die zu ihrer anschließenden transcoelomischen Metastasierung durch die Peritonealhöhle¹² führen.

Daher sind sowohl die intraperitonealen als auch die intrabursalen Modelle ausgezeichnete Werkzeuge zur Untersuchung von Ovarialkrebsmetastasen und therapeutischer Wirkung, unterscheiden sich jedoch im spezifischen Stadium des metastatischen Prozesses, den sie nachahmen. Während die intrabursalen Modelle das Fortschreiten von Eierstockkrebs von frühen bis späteren Stadien des metastastischen Prozesses nachahmen können, werden sie aufgrund der mit diesem Prozess verbundenen Latenz üblicherweise verwendet, um frühe Ereignisse bei Metastasen von Eierstockkrebs zu untersuchen. Für Studien, die sich auf spätere Stadien der Metastasen von Eierstockkrebs konzentrieren, ist das intraperitoneale Modell geeigneter. Darüber hinaus ist das intrabursale Modell technisch auch schwieriger zu etablieren als das intraperitoneale Modell¹². Die Einrichtung des intrabursalen Modells erfordert Zugang zu einem Operationssaal, der mit mikrochirurgischer Ausrüstung ausgestattet ist und eine präzise Injektion von Krebszellen in die Ovarialbursa ermöglicht. Die Fähigkeit von Krebszellen, Tumore zu etablieren ("Take-Rate" oder "Engraftment-Rate"), ist in intrabursalen Modellen ebenfalls meist geringer als in intraperitonealen Modellen. Da Tumore nach orthotopischen oder intraperitonealen Injektionen nicht leicht beobachtbar sind, wird üblicherweise eine nicht-invasive biolumineszente Bildgebungstechnik eingesetzt, um den Tumorverlauf zu überwachen. Daher benötigen sowohl intraperitoneale als auch intrabursale Modelle zusätzliche Geräte, die eine nicht-invasive Bildgebung von^{Tumoren ermöglichen}. Letztlich bestimmen die experimentellen Ziele, die Verfügbarkeit von Ressourcen und der technische Kompetenzbereich die Wahl des Modells für jede Studie.

Dieser Bericht beschreibt das Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Etablierung intraperitonealer und intrabursaler Maus-Xenograft-Modelle unter Verwendung menschlicher Ovarialkrebszelllinien. Diese Modelle können durch Transplantation der Zellen in immungeschwächte Mausstämme wie NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ) oder Foxn1 nude (B6. Cg-Foxn1 nu/J). Die gleiche Methode kann angepasst werden, um Allograft-(syngene) Modelle zu erzeugen. Bei der Entwicklung von Allograft-Modellen werden Maus-Ovarialkrebszellen in immunkompetente Mäuse mit demselben genetischen Hintergrund implantiert. Da Allograft-Modelle mit immunkompetenten Mäusen entwickelt werden, sind sie nützlich, um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren das Mikroumfeld des Eierstocktumors, die Rolle des Immunsystems beim Fortschreiten von Eierstockkrebs und die Wirksamkeit der Immuntherapie regulieren. Neben der Etablierung der intraperitonealen und intrabursalen Xenograft-Mausmodelle beschreibt dieser Bericht auch, wie biolumineszente Bildgebung verwendet werden kann, um das Tumorverlauf in diesen Modellen nicht-invasiv zu überwachen.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Maryland, Baltimore County, genehmigt (Hauptverantwortlicher – Achuth Padmanabhan; Protokollnummer – 1947).  Die vollständige Liste der in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Ausrüstungen sowie deren Katalognummern sind in der Materialtabelle bereitgestellt.

1. Vorbereitung von Eierstockkrebszelllinien für die Transplantation bei der Maus

Hinweis: Für alle in vivo beschriebenen Modelle in diesem Protokoll sollten Eierstockkrebszellen für die Maustransplantation vorbereitet werden. Eierstockkrebszellen sollten in einer laminaren Gewebekulturhaube wie unten beschrieben bei Raumtemperatur vorbereitet werden, sofern nicht angegeben:

1. Eierstockkrebszellen bei 37 ^°C in einem wasserummantelten CO-2-Inkubator mit 5 % _CO-2 und Standardmedium wie in der Literatur empfohlen zu verwenden. Wenn eine nicht-invasive in-vivo-Bildgebung des Tumors gewünscht ist, müssen die Eierstockkrebszellen so konstruiert werden, dass sie vor der Transplantation Luciferase stabil ausdrücken.
2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80–85 % erreichen, entnehmen Sie sie unter sterilen Bedingungen, wie unten beschrieben:
   1. Aspiratiere das Medium von der Gewebekulturplatte.
   2. Waschen Sie die haftenden Zellen zweimal mit steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Kalzium und Magnesium. Das Vorhandensein von Kalzium und Magnesium in PBS kann die Trypsinaktivität beeinträchtigen und die Zelladhäsion fördern. Aspiratiere das PBS von der Gewebekulturplatte.
   3. Gib 0,05 % Trypsin-EDTA zur Gewebekulturplatte hinzu. Die Menge des verwendeten Trypsins hängt von der Größe der Gewebekulturplatte und der untersuchten Zelllinie ab. Für die meisten Zelllinien, die auf einer 100-mm-Platte wachsen, verwenden Sie 1 ml 0,05 % Trypsin-EDTA. Für stark adhärente Eierstockkrebszelllinien wie OVCA420 wird 1 ml 0,25 % Trypsin-EDTA empfohlen.
   4. Die Platte mit den Zellen wird zurück in den 37 ^°C Wassermantel CO2-Inkubator für die Gewebekultur umgeleitet und 1–5 Minuten inkubiert. Die genaue benötigte Inkubationszeit hängt von der Zelllinie ab. Einige Zelllinien, wie TYK-Nu und HEYA8, lösen sich sehr schnell (1–2 Min), während andere, wie OVCA420, länger benötigen (4–5 Min).
   5. Sobald die Zellen getrennt sind, fügen Sie FBS-haltiges Medium hinzu, um die Trypsinwirkung zu stoppen. Fügen Sie 6 ml FBS-haltiges Medium pro 1 ml Trypsin hinzu. Pipette vorsichtig auf und ab, um Zellen von der Gewebekulturplatte zu lösen und sie in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren.
      Hinweis: Wenn man sie unter einem Bright-Field-Inverted-Mikroskop betrachtet, erscheinen abgetrennte Zellen abgerundet (statt flach/verlängert) und schweben frei, anstatt am Boden der Platte zu kleben.
   6. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen Rohr und zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
   7. Entfernen Sie das trypsinhaltige Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in frischem, FBS-haltigem Zellkulturmedium.
3. Zähle die Zellen mit einem Zelllebensfähigkeitsfarbstoff wie Trypanblau und einem Hämozytometer. Alternativ kann ein automatischer Zellzähler verwendet werden, um Zellen zu zählen.
4. Rekonstituieren Sie die Zellen in einem definierten Volumen sterilen 1X PBS (pH 7,4), sodass die gewünschte Zellkonzentration pro Volumeneinheit erreicht wird. Die empfohlene Anzahl von Zellen, die für häufig verwendete humane Eierstockkrebszelllinien injiziert werden sollten, ist in Tabelle 1¹³ dargestellt.
   Hinweis: Das maximale Volumen, das sicher in Mäuse injiziert werden kann, hängt vom Modell ab. Für das intraperitoneale Modell beträgt das maximal empfohlene Volumen 500 μL (siehe Abschnitt 2.1). Für das intrabursale Modell beträgt das maximal empfohlene Volumen 5 μL (siehe Abschnitt 2.2).
5. Lassen Sie die Zellsuspension auf Eis, bis es Zeit ist, sie in Mäuse zu injizieren. Injizieren Sie Zellen so schnell wie möglich in Mäuse, vorzugsweise innerhalb von 30–45 Minuten nach der Vorbereitung der Zellen.

2. Etablierung transplantierbarer Eierstockkrebsmodelle bei der Maus

1. Etablierung des intraperitonealen Modells von Eierstockkrebs
   Hinweis: Bei diesem Prozess werden Eierstockkrebszellen, die Luciferase stabil exprimieren, in die Peritonealhöhle einer erwachsenen weiblichen Maus injiziert. Die Verwendung von Zellen, die Luciferase stabil exprimieren, ermöglicht eine longitudinale, nicht-invasive Überwachung des Tumorfortschritts mit dem In Vivo Imaging System (IVIS).
   1. Bereiten Sie die Zellen wie in Abschnitt 1 beschrieben vor. Lassen Sie die Zellen vorsichtig mit einer 1000-μL-Mikropipette wieder aufhängen und sorgen Sie dafür, dass die Zellen dissoziiert bleiben.
      Hinweis: Wenn die Klumpen nicht gelöst werden, verstopfen die Nadeln.
   2. Ziehe 500 μL Zellsuspension in eine 1-mL Spritze und befestige eine 21G x 1 Zoll große Nadel. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze befinden.
      Hinweis: Das maximale Volumen, das intraperitoneal in eine adulte weibliche Maus (25–30 g) injiziert werden kann, beträgt 500 μL. Daher werden Zellen in einem Volumen neu suspendiert, sodass die erforderliche Anzahl von Zellen in einem maximalen Volumen von 500 μL enthalten ist. Die empfohlene Anzahl von Zellen, die für häufig verwendete humane Eierstockkrebszelllinien injiziert werden sollten, ist in Tabelle 1¹³ dargestellt.
      Hinweis: Wenn die Maus zwischen 20–25 g wiegt, wird empfohlen, ein kleineres Volumen (weniger als 400 μL) zu injizieren.
   3. Nehmen Sie das Tier aus dem Käfig und legen Sie es auf eine raue oder mit Draht versehene Oberfläche, um es festzuhalten.
   4. Fesseln Sie die Maus, indem Sie die lose Haut an der Basis des Halses sanft mit der nicht-dominanten Hand berühren, wie in Abbildung 1A gezeigt.
   5. Heben Sie die Maus vorsichtig auf und drehen Sie sie so, dass ihre Bauchseite nach oben zeigt. Sichern Sie den Schwanz des Tieres mit den Fingern, wie in Abbildung 1B gezeigt.
   6. Zeichne eine imaginäre Linie quer durch die Mitte des Bauches. Um die Injektionsstelle zu lokalisieren, stellen Sie sich ein Dreieck zwischen der Mittellinie und den beiden Brustwarzen im unteren rechten Quadranten vor. Stellen Sie sicher, dass die Injektionsstelle in der Mitte dieses imaginären Dreiecks liegt. Siehe Abbildung 1B.
   7. Neigen Sie den Kopf der Maus leicht zum Boden, sodass er tiefer als das Hinterteil liegt. Das Festhalten der Maus in dieser Position hilft, dass sich der Bauchinhalt kranial verlagert. Dies verringert das Risiko, während der Injektion innere Organe zu durchstochen.
   8. Verwenden Sie einen sterilen Alkoholabstrich, um den Injektionsbereich zu reinigen.
   9. Mit der dominanten Hand wird die Nadel in die Einstichstelle in einem Winkel von 45° oder weniger eingeführt. Schieben Sie nur 0,5 Zoll und nicht mehr als die Hälfte der Nadellänge vor. Stellen Sie sicher, dass die Nadel stabil bleibt, da Bewegungen in der Bauchhöhle innere Organe verletzen können.
   10. Geben Sie die Zellen langsam und gleichmäßig in die Bauchhöhle der Maus ab.
   11. Ziehen Sie die Nadel aus der Maus im gleichen Einführungswinkel. Setzen Sie sofort eine sterilisierte Anzeige über die Einstichstelle, um ein Auslaufen zu verhindern.
   12. Entsorgen Sie die Nadel und die Spritze im passenden Behälter für scharfe Gegenstände.
   13. Bevor Sie die Maus in den Käfig setzen, sollten Sie sie mit einer bevorzugten Methode mit Ohrmarkierungen markieren. Das Ohren-Tagging ermöglicht die spätere Identifikation der injizierten Maus.
2. Etablierung des intrabursalen Modells von Eierstockkrebs
   Hinweis: Im intrabursalen Modell werden Eierstockkrebszellen, die Luciferase stabil exprimieren, direkt in die Ovarialbursa einer erwachsenen weiblichen Maus injiziert. Bursa ist ein membranöser Sack, der die Maus-Eierstöcke umgibt. Eine stabile Luciferase-Expression in Eierstockkrebszellen ermöglicht eine nicht-invasive longitudinale Überwachung des Tumorverlaufs mittels IVIS.
   1. Tag 1 – Ausrüstung und Maus für die intrabursale Transplantation vorbereiten
      1. Autoklaven – die für die Operation benötigten Instrumente. Die Liste der Instrumente lautet (Abbildung 2A):
         Feinspitze Schere, 5 Zoll lange gebogene feinspitze Pinzette, Mayo-Heger-Nadelhalter, Sezierende Juwelier-Mikrozange, Feinspitze, Instrumente zur Zerschneiden von Zangen mit feinen Spitzen
      2. Verabreichen Sie alle 24 Stunden eine präoperative Analgesie von Carprofen (15 mg/kg) durch subkutane Injektion in die Maus.
         Hinweis: Geben Sie das Analgetikum Carprofen alle 24 Stunden subkutan, beginnend 1 Tag vor der Operation und 3 Tage nach der Operation.
   2. Tag 2 – Intrabursale Transplantation von Eierstockkrebszellen bei einer Maus
      1. Vorbereitung der Eierstockkrebszellen für die Injektion, wie in Abschnitt I beschrieben. Das maximale Volumen, das sicher intrabursal in einer Maus injiziert werden kann, beträgt 5 μL. Daher ist es vorzuziehen, Zellen mit einer Konzentration von 10⁴ Zellen/μL zu haben. Dies ermöglicht die Transplantation von 5 x 10^{4 Zellen} .
         Hinweis: Die empfohlene Anzahl an Zellen für häufig verwendete menschliche Eierstockkrebszelllinien ist in Tabelle 1¹³ aufgeführt.
      2. Lass die Zellen bis zur Nutzung auf Eis. Nach der Entnahme wird empfohlen, die Zellen so schnell wie möglich zu injizieren, vorzugsweise innerhalb von 30–45 Minuten.
      3. Anästhesie wird induziert, indem die Maus in eine Isoflurankammer mit einer Isofluran-Flussrate von 4 Prozent und einer Sauerstoffflussrate von 3,5 L/min platziert wird. Bestätigen Sie, dass die Maus betäubt ist, indem Sie auf Immobilisierung und das Fehlen des Zehenkneifreflexes prüfen.
      4. Übertragen Sie die betäubte Maus auf einen sterilen chirurgischen Vorhang, der auf ein Nagetier-Heizpad gelegt wird, das bei 37 °C gehalten wird. Setzen Sie schnell einen Nasenkegel ein und halten Sie eine Anästhesie mit 1,5 % Isofluran und 98,5 % Sauerstoff. Stellen Sie sicher, dass die Maus betäubt wird, indem Sie das Fehlen des Zehenkneifreflexs bestätigen.
      5. Stellen Sie sicher, dass die Maus während des gesamten Eingriffs betäubt bleibt, indem Sie alle 15 Minuten das Fehlen des Zehenkneifreflexes überprüfen. Überwachen Sie die Atemfrequenz der Maus während der Anästhesie, um sicherzustellen, dass sie langsam und sanft verläuft. Wenn sich die Atemfrequenz ändert, passen Sie die Isofluran-Dosierung an. Wenn die Maus schwere Atmung oder Keuchen zeigt, sollten Sie die Dosis reduzieren. Umgekehrt, wenn die Maus eine erhöhte Atemfrequenz zeigt, sollte die Isofluran-Dosis leicht erhöht werden.
         Hinweis: Vermeiden Sie es, die Maus länger als 40 Minuten unter Narkose zu halten. Um dies zu erreichen, ist es wichtig, während des chirurgischen Eingriffs effizient und zügig zu sein.
      6. Positioniere die Maus auf der Seite, auf der die Eierstockkrebszellen intrabursal transplantiert werden sollen, nach oben, wie in Abbildung 2B gezeigt.
      7. Tragen Sie auf beide Augen der Maus eine Augensalbe auf, um sie vor dem Austrocknen (Hornhauttrocknung) zu schützen.
      8. Wenn die Maus Fell hat, rasiere die Haare auf der unteren Hälfte der Maus auf der nach oben gerichteten Seite. Reinige die rasierte Stelle richtig und lege die Maus auf eine neue sterile Matte. Wenn du mit dem Foxn1 nackt (B6. Cg-Foxn1 nu/J) Mausstamm, diesen Schritt überspringen.
      9. Verwenden Sie ein steriles chirurgisches Vorhang, um die Maus so zu bedecken, dass nur die untere Körperhälfte sichtbar wird.
      10. Waschen Sie vor Beginn der Operation die Hände gründlich mit Seife und ziehen Sie frische sterile OP-Handschuhe an. Vermeiden Sie es, nicht sterile Bereiche oder Gegenstände nach dem Anziehen von OP-Handschuhen zu berühren.
      11. Verwenden Sie einen sterilen Baumwolltip-Applikator, um die Betadine-Flüssigkeit in einer im Uhrzeigersinn kreisenden Bewegung von innen nach außen an der Operationsstelle aufzutragen. Als Nächstes verwenden Sie einen sterilen Alkoholabstrich, um denselben Bereich auf ähnliche Weise zu reinigen. Wiederholen Sie dieses Verfahren noch zweimal.
          Hinweis: Berühren Sie während des Eingriffs keine nicht sterilen Gegenstände oder Bereiche. Ersetzen Sie sofort die Handschuhe, wenn Kontakt mit einer nicht sterilen Oberfläche auftritt. Es wird dringend empfohlen, eine weitere Person zu haben, die während der intrabursalen Injektion hilft. Diese Person kann während der Operation helfen, nicht sterile Gegenstände zu handhaben.
      12. Warte 1 Minute, bis der Alkohol getrocknet ist.
      13. Lokalisieren Sie die Stelle, die etwa 1,5 cm über dem Hinterbein und 5 mm vom Brustkorb der Maus entfernt ist, wie in Abbildung 2B dargestellt. Heben Sie die Haut an dieser Stelle mit der gebogenen Zange an und machen Sie dann mit einer feinspitzigen Schere einen 5 mm breiten vertikalen Schnitt.
          Hinweis: Stellen Sie vor dem Schnitt sicher, dass die Maus vollständig unter dem Einfluss der Narkose steht, indem Sie das Fehlen des Zehenkneifreflexes bestätigen.
      14. Halten Sie die Haut auf einer Seite mit einer feinen Mikropinzette fest und machen Sie an derselben Stelle einen Schnitt im subkutanen Gewebe.
      15. An diesem Punkt wird die Peritonealschicht unter dem subkutanen Gewebe sichtbar. Verwenden Sie eine feinspitzige, gebogene, gezackte Pinzette, um die Peritonealschicht zu halten, und machen Sie mit einer fein gespitzten Schere einen etwa 2,5 mm langen Schnitt.
      16. Halten Sie mit der gezackten Zange die Seite des Peritonealschnitts fest und lokalisieren Sie das Fettpolster des Eierstocks mit feiner Pinzette. Der Eierstock befindet sich unter dem Fettpolster.
      17. Ziehe vorsichtig ein Stück vom Fettpolster des Eierstocks zusammen mit dem Eierstock durch den Schnitt heraus.
      18. Verwenden Sie die Dissektionszange, um das Fettpad so zu halten, dass der Eierstock nach oben zeigt und unbeweglich ist.
          Hinweis: Halten Sie den Eierstock nicht mit der Pinzette fest. Verwenden Sie immer gezackte Pinzette, um das Fettpad zu halten, da das Gewebe rutschig ist.
      19. Bitten Sie die Person, die hilft, die Spritze mit der Zellsuspension vorzubereiten. Es wird empfohlen, eine 0,3 ml Insulinspritze zu verwenden.
      20. Führen Sie die Nadel vorsichtig mit dem Abschrägen nach oben in die Ovarialbursa vom Übergang von Eileiter und Eierstock ein. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Fasen in die Bursa geht, bevor Sie auf den Pümpel drücken.
          Hinweis: Seien Sie vorsichtig, die Bursa am gegenüberliegenden Ende der Einstichstelle nicht zu durchstochen.
      21. Drücken Sie vorsichtig den Kolben und übertragen Sie den Inhalt der Spritze in die Ovarialbursa. Entfernen Sie die Nadel schnell.
      22. Eine Schwellung der Bursa rund um den Eierstock deutet auf eine erfolgreiche Inokulation der Zellen hin.
      23. Warte 5 Sekunden und führe den Eierstock vorsichtig zurück in die Bauchhöhle.
      24. Schließen Sie das Peritoneum mit einer 6-0 absorbierbaren Monofilamentnaht und ein oder zwei einfachen, unterbrochenen chirurgischen Nähten.
      25. Schließen Sie den Hautschnitt mit der 6-0 resorbierbaren Monofilamentnaht und einer einfachen, laufenden chirurgischen Naht. Stellen Sie sicher, dass keine Blutung an der Schnittstelle vorhanden ist.
      26. Tragen Sie nach dem Schließen eine dreifache antibiotische Salbe (Bacitracin, Neomycin und Polymyxin B) an der Schnittstelle auf.
      27. Geben Sie der Maus Carprofen 15 mg/kg subkutan zur Schmerzlinderung.
      28. Nutze die Maus mit einer bevorzugten Methode. Das Ohren-Tagging ermöglicht die spätere Identifikation der injizierten Maus.
      29. Bring die Maus in einen frischen Käfig. Stelle diesen Käfig mit einer Hälfte auf eine Wärmematte für mindestens 60 Minuten. Stellen Sie sicher, dass die Wirkung der Anästhesie zu diesem Zeitpunkt vollständig abgeklungen ist und die Maus wach und aktiv ist.
          Hinweis: Mäuse neigen unter Narkose zu Unterkühlung. Daher ist es wichtig, externe Wärme bereitzustellen, um die Körpertemperatur zu regulieren.
      30. Untersuchen Sie die Mäuse 4-5 Stunden nach der Operation auf Anzeichen von Blutungen an der Schnittstelle oder andere Beschwerden.
      31. Geben Sie Mäusen 15 mg/kg subkutan alle 24 Stunden für die nächsten 3 Tage.
      32. Wenn die geimpften Zellen genetisch so verändert werden, dass sie Luciferase stabil exprimieren, kann die Tumorlast mit IVIS ab Tag 1 nach der Injektion gemessen werden, wie in Abschnitt 3 beschrieben.

3. Nicht-invasive Bildgebung eines Maustumors mit dem In Vivo Imaging System (IVIS)

Ein wichtiges Ziel mehrerer Studien, die die in diesem Bericht beschriebenen transplantierbaren Tumormodelle verwenden, ist es, longitudinale Daten zum Tumorverlauf zu erhalten. Obwohl das Volumen der subkutanen Tumoren mit einem Vernier-Kaliper geschätzt werden kann, ist dies keine praktikable Option für Tumore, die mit den intraperitonealen und intrabursalen Modellen gebildet wurden. Um diese Herausforderung zu meistern und die intraperitoneale Tumorbelastung zu bestimmen, verwenden die meisten Labore luciferasebasierte, nicht-invasive Biolumineszenzbildgebung. Um dies zu ermöglichen, werden transplantierte Krebszellen so konstruiert, dass sie Luciferase stabil exprimieren, die bei der Verabreichung des Substrats D-Luziferin Biolumineszenz erzeugt. Biolumineszenz wird nicht-invasiv mit einem In Vivo Imaging System (IVIS) nachgewiesen. Dieses Signal wird dann quantifiziert, um die Tumorlast zu verfolgen und Informationen über Metastasen sowie die therapeutische Wirksamkeit des Medikaments zu liefern. Im Folgenden beschreiben wir das Protokoll zur Verfolgung der Tumorlast mittels luciferasebasierter, nicht-invasiver Biolumineszenzbildgebung mit IVIS bei Mäusen.

1. Herstellung des D-Luziferin-Substrats
   1. Bereite unter sterilen Bedingungen 15 mg/mL D-Luciferin-Lösung in 1X PBS (pH 7,4) her.
   2. Filtersterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter.
   3. Wickle die Lösung in Alufolie, um sie vor dem Licht zu schützen, bis du sie benutzt.
2. Initialisierung des IVIS-Imagers zur Bildaufnahme
   1. Öffnen Sie die "Living Image"-Software auf dem Computer, der mit dem IVIS-Imager verbunden ist, und melden Sie sich an.
   2. Der Imager muss für die Bildaufnahme initialisiert werden. Dies geschieht wie folgt:
      1. Beim Einloggen öffnet sich ein Fenster im IVIS-Bedienfeld, wie in Abbildung 3A gezeigt.
      2. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Initialisieren" auf der rechten unteren Seite des Fensters (Abbildung 3A). Es dauert ein paar Minuten, bis das System initialisiert ist.
         Hinweis: Anfangs wird der Temperaturbalken am unteren Rand des Fensters rot, was darauf hinweist, dass die Bildkamera gerade dabei ist, ihre Zieltemperatur von -90 °C zu erreichen (Abbildung 3B).
      3. Wenn die Bildkamera die Zieltemperatur (-90 °C) erreicht, wird der Temperaturbalken grün und der Systemstatus zeigt "Bereit zur Verwendung" (Abbildung 3C). Jetzt ist der Imager bereit, die Maus zu fotografieren.
         Hinweis: Die Belichtungszeit, das Binning und die Blende können je nach Nutzerbedarf angepasst werden.
3. Vorbereitung der Maus auf IVIS-Bildgebung
   Vor der Bildgebung der Maus muss D-Luciferin intraperitoneal injiziert werden.
   1. Nimm die Maus aus dem Käfig und stelle sie auf eine raue oder verdrahtete Oberfläche. Ziehe die Mäuse vorsichtig in den Nacken, um sie richtig zu fixieren, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.
   2. Heben Sie die Maus auf und drehen Sie sie so, dass ihre Bauchseite nach oben zeigt.
      Hinweis: Wenn die Maus richtig befestigt ist, werden beim Aufheben alle vier Beine nach außen gestreckt, wie in Abbildung 1B gezeigt. Halte während des Eingriffs den Schwanz zwischen den Fingern als zusätzliche Maßnahme zur Kontrolle.
   3. Verwenden Sie einen sterilen Alkoholabstrich, um die Injektionsstelle zu reinigen, wie im intraperitonealen Injektionsprotokoll in Abschnitt 2.1.
   4. Verwenden Sie eine 1-ml-TB-Spritze und eine 30G, 1/2 Zoll große Nadel, um intraperitoneal ein angemessenes Volumen D-Luciferin aus der Standardlösung zu injizieren, um eine Enddosis von 150 mg/kg D-Luciferin zu erreichen.
      Hinweis: Siehe das intraperitoneale Injektionsprotokoll in Abschnitt 2.1 für Anweisungen zur Durchführung der intraperitonealen Injektion. Bei Verwendung von C57BL/6-Mäusen (für syngene Allograft-Modelle) wird dringend empfohlen, das Fell vor der Biolumineszenzbildgebung mit IVIS zu entfernen. Schwarzes Fell und pigmentierte Haut dämpfen das Licht erheblich und verringern die Signalintensität.
   5. Setzen Sie die Maus vorsichtig zurück in den Käfig. Die genaue Wartezeit und Belichtungszeit müssen empirisch bestimmt werden. Dies lässt sich wie folgt bestimmen.
      1. Betäube die Maus unmittelbar nach der D-Luciferin-Injektion und bilde sie wie in Abschnitt 3.4 beschrieben alle 2 Minuten für 20 Minuten ab.
         Hinweis: Bei der ersten Durchführung dieses Experiments wird empfohlen, zu bestimmen, wie sich das Luciferase-Signal nach der Verabreichung von D-Luciferin im Laufe der Zeit verändert. Dies hilft, den am besten geeigneten Zeitpunkt für die Mausabbildung nach der Verabreichung von D-Luziferin in späteren Experimenten zu bestimmen. Das biolumineszente Signal kann je nach verschiedenen Faktoren variieren, darunter die Zelllinie, das Maus-Xenograft-Modell, das Grad der Luciferase-Expression usw.
      2. In jedem Intervall nehmen Sie Ausgaben von 5, 10 und 15 Sekunden.
      3. Verwenden Sie diese Daten, um eine Standardkurve zu zeichnen. Basierend auf der Kurve wählen Sie die Warte- und Belichtungszeit, zu der das Signal ein Plateau erreicht, während die höchste Intensität erhalten bleibt.
         Hinweis: In der Regel beträgt diese Zeit zwischen 5 und 10 Minuten, kann aber je nach Modell variieren.
4. Nicht-invasive Bildgebung von Maustumoren mit IVIS
   1. Nach der Wartezeit wird die Maus in eine Isoflurankammer mit einer Isofluran-Rate von 4 % und einer Sauerstoffdurchflussrate von 3,5 % gesetzt.
   2. Bestätigen Sie, dass die Maus betäubt ist, indem Sie prüfen, ob der Zehenkniffreflex fehlt.
   3. Stellen Sie die Maus auf die Bühne im IVIS-Imager und schieben Sie ihre Nase während der Bildabbildung zur Anästhesie-Erhaltung in den Nasenkegel. Achte darauf, dass sie innerhalb der markierten Linien des Kamerafokus bleiben und schließe die Klappe zum Imager.
      Hinweis: Im Imager befinden sich fünf Positionen auf der Bühne. Jede Position hat außerdem ihre jeweiligen Anästhesie-Nasenkegel. Dies ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung von fünf Mäusen. Je nach Anzahl der zu fotografierenden Mäuse kannst du das Kamerafeld im Kontrollfeld von "D" (breiteres Feld) auf "A" (schmaler Fokus) anpassen. Die Maus kann überall auf der Bühne platziert werden, vorausgesetzt, ihre Nase bleibt während der gesamten Bildgebenszeit in den Nasenkegeln der Anästhesie. Es wird empfohlen, die Mäuse nacheinander zuerst auf der Rückenseite und dann auf der Bauchseite zu fotografieren.
   4. Passen Sie die Belichtungszeit an und klicken Sie auf "Aufnehmen" im Bedienfeld (Abbildung 3C).
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Lumineszenz, Foto und Overlay im Bedienfeld "EIN" sind.
      Sobald das Bild aufgenommen wurde, erscheint das Bild der Maus mit Luciferase-Signal auf dem Bildschirm.
   5. Öffne den Imager und drehe die Maus so, dass die Bauchseite nach oben zeigt, und klicke nach dem Schließen der Imager-Tür auf "Acquire".
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Nase der Maus im Nasenkegel liegt, um die Anästhesieaufrechterhaltung während der Bildgebenden zu gewährleisten.
   6. Sobald sowohl dorsale als auch ventrale Bilder gemacht sind, öffnen Sie die Klappe des Imagers und setzen Sie die Maus zurück in ihren Käfig.
   7. Warte 5–10 Minuten, um sicherzugehen, dass die Maus wieder zu Bewusstsein kommt.
5. Analyse des IVIS-Bildes zur Bestimmung der Tumorlast bei der Maus
   1. Anpassung der Farbskala von Bildern
      1. Speichere die RAW-Bilder im entsprechenden Ordner, indem du auf "Datei" klickst, gefolgt von "Speichern unter".
         Hinweis: Der Imager passt die Farbskala automatisch basierend auf der Signalintensität an. Es ist ratsam, die Farbskala über alle im Verlauf des Experiments aufgenommenen Bilder konstant zu halten. Die Farbskala kann später auch durch das Öffnen des RAW-Bildes mit dieser Software angepasst werden.
      2. Für die manuelle Einstellung erscheint ein weiteres Fenster der Werkzeugpalette oben rechts auf dem Bildschirm (Abbildung 3D), gehe zu "Bildanpassung" und wähle dann "manuell" für die Skalierung. Geben Sie die gewünschte Mindest- und Maximalzahl für den Skalenwert ein und klicken Sie auf "Enter" (Abbildung 3E).
         Hinweis: Wenn Sie die Farbskala eines zuvor aufgenommenen Bildes anpassen, öffnen Sie zunächst die gespeicherte RAW-infoclick.txt Bilddatei aus dem jeweiligen Ordner mit "file" gefolgt von "open".
         3.5.1.3. Speichere dieses Bild separat vom RAW-Bild im entsprechenden Ordner.
   2. Analyse der Tumorlast bei der Maus
      Hinweis: Zur quantitativen Messung der Tumorbelastung können Sie die Signalintensität jeder Maus über Bilder aus dem gesamten Zeitraum messen. Sie können diese Werte in Excel oder GraphPad Prism für statistische Analysen und zur Erstellung von Liniendiagrammen des Tumorfortschritts eingeben.
      1. Öffne die gespeicherte RAW-infoclick.txt Datei aus dem jeweiligen Ordner.
      2. Gehe zum Bereich ROI (Region of Interest) im Werkzeugpalettenfenster, der oben rechts (Abbildung 3F) erscheint.
      3. Zeichne den ROI-Bereich auf jeder Maus manuell oder automatisch mit Hilfe der "Zeichen"-Funktion in jeder Form, die am besten zu dir passt. Um dies manuell zu tun, halten Sie den Bereich für alle Bilder aller verglichenen Mäuse konsistent.
         Hinweis: Bei der intraperitonealen Impfung funktioniert die manuelle Auswahl des ROI für die gesamte Brust und den Bauch auf dem ventralen Bild der Maus am besten. Für die intrabursale Impfung funktioniert die manuelle Auswahl des ROI im dorsalen Bildbereich mit Signal am besten.
         Hinweis: Die automatische ROI-Auswahl wählt nur Bereiche mit höherer Bildsignalintensität aus.
      4. Klicken Sie auf "ROI messen" (Abbildung 3F). Dies öffnet ein weiteres Fenster mit Daten zu den Gesamt- und Durchschnittszahlen für jede ausgewählte ROI.
      5. Speichere diese Datei im entsprechenden Ordner, damit sie später abgerufen werden kann. Verwenden Sie diese Daten, um den Graphen entweder in MS Excel oder GraphPad Prism zu zeichnen.

Ergebnisse

Repräsentative Daten aus einem intraperitonealen Eierstockkrebsmodell mit luciferase-markierten OVCAR8-Zellen bei immungeschwächten Foxn1-Nacktmäusen sind in Abbildung 4 dargestellt. Eine stabile Luciferase-Expression in diesen Zellen ermöglichte die longitudinale Überwachung des Tumorverlaufs durch nicht-invasive biolumineszente Bildgebung mit dem IVIS-Imager, wie in Abschnitt III beschrieben. Die intraperitoneale Injektion von 5 Millionen OVCAR8-Luciferase...

Diskussion

Die Fähigkeit, komplexe Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen, Mikroumgebung und systemischen Faktoren nachzuahmen, macht Mausmodelle zu einer hervorragenden Ressource zur Untersuchung des Fortschreitens von Eierstockkrebs¹². Neben der Verbesserung unseres Verständnisses der Faktoren, die das Fortschreiten und die Metastasen von Eierstockkrebs antreiben, spielen in vivo Mausmodelle auch eine wichtige Rolle bei der präklinischen Bewertung kleiner Moleküle und bei B...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,22 μm Spritzensterilfilter, 33 mm	Fisher Scientific	09-720-004
1 ml TB-Spritze	BD	309659
21G, 1-Zoll-Nadel	BD	305167
30G, ½ Zoll-Nadel	BD	305106
5 Zoll gebogene Feinspitz-Pinzetten	Fisher Scientific	1631
6-0 Absorbierbare Monofilamentnähte	MaxonTM	6532-11
Alkoholabstrich (70 % Isoprolylalkohol)	Dukal Corp	80003156
Betadin (1 % Jodlösung)	Purdue-Produkte	367618150085
Carprofen Inj, 50 mg/ml	Levafen	RXLEVA50-20INJ
Zentrifuge	Eppendorf	5702
D-Luziferin	Syd Labs	MB000102-R70170
Sezierende Juwelier-Mikropinzette, feine Spitze	Fisher Scientific	08-953E
Augensalbe	Medvet	11897
Schere mit feiner Spitze	Fisher Scientific	8940
Wärmekisse	Sonnenstrahl	731-500
Instrumente, die Zangen mit feinen Spitzen sezieren	Fisher Scientific	S08096
Insulinspritze 3/10 ml	BD	328438
Isofuran	Fluriso	Fluriso250
IVIS	Perkin Elmer	IVISLMIII
Mayo – Heger Halter für gerade Nadel	Fisher Scientific	08-966
Sterile 1-fache PBS, ohne Kalzium und Magnesium	Corning	21-040-CV
Sterile Baumwollspitzenapplikatoren	Mckeesson	24-106-1S
Sterile Anzeige	Kendall	3033
Sterile Unterlage/Handtuch/Draperung, nicht mit Fenstern versehen	Henry-Schein	100-9687
Dreifache Antibiotikasalbe	Kugel	4006-4SL
Trypsin-EDTA (0,25 %), Phenolrot	Gibco	25200-056