Hochpräzise Detektion von RNA-Editierstellen mit kalibriertem Differential-RNA-Editierscanner

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Nutzung des Calibrated Differential RNA Editing Scanner (CADRES), eines rechnergestützten Workflows, der DNA–RNA-Gelenkvariantenaufrufe, signaloptimierte Rekalibrierung und replikationsbewusste statistische Modellierung integriert, um differenzielle RNA-Editierungsstellen mit hoher Präzision zu identifizieren.

Zusammenfassung

Eine genaue Abgrenzung der RNA-Editierung bleibt technisch herausfordernd, da echte posttranskriptionelle Veränderungen von genomischen Varianten und Sequenzierungsartefakten unterschieden werden müssen. Diese Schwierigkeit ist besonders ausgeprägt bei der Cytidin-zu-Uridin-Editierung, die durch APOBEC-Enzyme katalysiert wird, wobei vermischte DNA- und RNA-Änderungen das eigentliche Editierungssignal verdecken. Der Calibrated Differential RNA Editing Scanner (CADRES) bietet einen strukturierten rechnergestützten Rahmen, um diese Einschränkungen durch integrierte DNA–RNA-Varianten-Abfrage und gezielte Bewahrung authentischer Editierungssignaturen zu adressieren. Dieses Protokoll präsentiert den CADRES-Workflow, einschließlich Datenvorbereitung, gemeinsamer RNA-Variantenaufrufe, signalerhaltender Rekalibrierung der Basisqualität, Artefaktfilterung und differenzierter Bewertung der RNA-Editierung zwischen experimentellen Bedingungen. CADRES unterstützt gepaarte RNA-Seq- und Ganzgenom- oder Ganz-Exom-Sequenzierung mit biologischer Replikation.  Eine mehrstufige Filterstrategie, einschließlich Homopolymer-Entfernung und PBLAT-basierter Paralog-Screening, reduziert systematisch Fehlalarme und erhält gleichzeitig Niederfrequenz-Bearbeitungsereignisse. Durch die Kombination von Kalibrierung mit replikationsbewusster Modellierung erhöht CADRES die Präzision und Reproduzierbarkeit der RNA-Editierungsanalyse und ermöglicht so die Untersuchung der Editierungsdynamik über verschiedene biologische Kontexte hinweg. Im Vergleich zu etablierten Methoden ist CADRES darauf ausgelegt, die Präzision bei der RNA-Editierung zu verbessern, insbesondere bei APOBEC-vermittelten C-zu-U-Ereignissen.

Einleitung

Die RNA-Bearbeitung bildet eine dynamische Schicht posttranskriptionaler Regulation, die standortspezifische Nukleotidsubstitutionen innerhalb von RNA-Transkripten ermöglicht, ohne die zugrundeliegende DNA-Sequenz zu verändern. Bei Metazoen ist die Deaminierung von Adenosin-zu-Inosin (A>I), vermittelt durch ADAR-Enzyme, die vorherrschende Form und trägt zur Transkriptdiversifizierung, mRNA-Stabilität, angeborener Immunmodulation und neuronaler Funktion^bei. Cytidin-zu-Uridin (C>U) (im Folgenden im biologischen Kontext "C>U"; "C>T" im Sequenzierungskontext) Deamination, katalysiert von Mitgliedern der APOBEREC-Familie, wirkt parallel zu diesen Signalwegen und ist beteiligt an Lipidstoffwechsel, viraler Restriktion, Mutagenese und aufkommenden regulatorischen Rollen in der Immun- und Krebsbiologie ^3,4,5,6,7. Jüngste Arbeiten haben gezeigt, dass mehrere APOBEC-Enzyme, darunter APOBEC1, APOBEC3A und APOBEC3B (A3B), RNA-Editierung in physiologischen und pathologischen Kontexten katalysieren 3,4,7,8,9,10. APOBEC3 Enzyme induzieren außerdem DNA-Editierung, wodurch überlappende mutationale Signaturen entstehen, die die Unterscheidung zwischen RNA-Editierung und genomischer Variation erschweren 8,10,11,12.

Die Next-Generation-Sequenzierung hat die transskriptomweite Identifikation potenzieller RNA-Editierungsstellen ermöglicht, doch die Unterscheidung echter Bearbeitungen von genomischen SNVs oder technischem Rauschen bleibt schwierig. A>I- und C>U-Ereignisse treten als A>G- und C>T-Substitutionen in cDNA-Bibliotheken auf und können durch Fehlpriming, Polymerasefehler, Kartierungsartefakte und kontextspezifische Expressionsänderungen gestört werden. Öffentliche Ressourcen wie REDIportal¹³ katalogisieren Millionen von A>I-Standorten, während C>U-Annotationen spärlich bleiben und sowohl biologische als auch analytische Einschränkungen widerspiegeln. Eine zuverlässige Identifizierung der C>U-Bearbeitung – insbesondere Veränderungen zwischen den Bedingungen – bleibt daher ein unerfüllter analytischer Bedarf.

Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methode, des Calibrated Differential RNA Editing Scanner (CADRES), ist die präzise Identifizierung von Differential Variants on RNA (DVRs): Bearbeitungsstellen, die statistisch signifikante Änderungen der Schnitttiefe zwischen zwei oder mehr definierten Bedingungen^{durchlaufen 14}. Bei der Entwicklung dieses Protokolls haben wir versucht, zwei anhaltende Hindernisse anzugehen. Erstens müssen echte RNA-Bearbeitungen von DNA-codierten Varianten unterschieden werden. Zweitens müssen Editierunterschiede statistisch robust über biologisch replizierte RNA-Seq-Datensätze quantifiziert werden. Die zentrale Innovation von CADRES liegt in der Integration des gemeinsamen DNA/RNA-Variantencalls mit einer kalibrierten Behandlung der RNA-Varianten während der Base-Quality Score Recalibration (BQSR). Diese "Boost Recalibration"-Strategie bewahrt neu entdeckte RNA-Editierstellen während BQSR und verhindert so systematische Qualitätsabstufungen, die häufig die Sensitivität für niedrigfrequente Bearbeitungen 15,16,17 verringern. Dieser Ansatz reduziert falsch negative Ergebnisse und verbessert die Spezifität im Vergleich zu Pipelines, die ausschließlich auf unvollständige RNA-Editierungsdatenbanken angewiesen sind.

CADRES befindet sich in einer Landschaft von Methoden, die jeweils unterschiedliche Aspekte der RNA-Editierungsanalyse behandeln. SNPiR¹⁸- und RVboost-19-Filterartefakte aus RNA-reinen Variantensätzen; VaDiR²⁰ integriert DNA–RNA-Vergleiche, modelliert jedoch keine Replikationsstruktur; rMATS-DVR²¹ führt GLMM-basierte Differentialtests durch, stützt sich jedoch ausschließlich auf RNA-seq; und JACUSA/JACUSA2^22,23 unterstützen replicate-bewusste Detektion, integrieren jedoch keine gemeinsamen DNA–RNA-Abfrage- oder Rekalibrierungsstrategien. CADRES vereint replicate-bewusste statistische Modellierung, gemeinsames DNA/RNA-Variantenaufruf und Rekalibrierung, angereichert für de novo-Editierungsstellen, und bietet so einen einheitlichen Workflow, der zur Erkennung bedingungsabhängiger RNA-Editierung optimiert ist – einschließlich C>U-Ereignisse, die mit APOBEREC-Aktivität 10,11,12 verknüpft sind.

In diesem Zusammenhang können Nutzer CADRES als angemessen ansehen, wenn ihr experimentelles System die folgenden Kriterien erfüllt. Zunächst ist eine gepaarte RNA-Seq- und Ganzgenom- oder Whole-Exome-Sequenzierung aus denselben Proben verfügbar, was eine rigorose Partitionierung von RNA-abgeleiteten Ereignissen aus DNA-codierten Varianten ermöglicht. Zweitens betrifft die biologische Frage Veränderungen in der RNA-Editierung über Bedingungen hinweg – wie Enzyminduktion, Umweltstress, Entwicklungsstadien oder Krankheitszustände –, bei denen eine statistische Modellierung allelspezifischer Tiefe über Replikate hinweg unerlässlich ist. Drittens strebt der Forscher eine erhöhte Spezifität bei der Detektion der C>U-Editierung an, bei der die Unterscheidung von RNA-Ereignissen von APOBEC-getriebener DNA-Mutagenese unerlässlich ist. CADRES ist besonders wertvoll in Systemen, in denen die APOBEC-Aktivität sowohl RNA- als auch DNA-Bearbeitungen induziert, wie in induzierbaren A3B-Modellen 10,11,12 gezeigt wird und bei konventionellen RNA-Only-Methoden überhöhte falsch-positiven Raten aufgrund von Stör-SNVs oder repetitiven Sequenzartefakten zeigen.

CADRES bietet mehrere praktische Vorteile. Sein gemeinsames DNA/RNA-Varianten-Ruf reduziert SNV-bedingte Fehlalarme. Die Boost-Rekalibrierung bewahrt echte Bearbeitungssignale, einschließlich neuartiger Ereignisse, die in Referenzdatenbanken fehlen. Das rMATS-abgeleitete GLMM bietet einen statistisch prinzipiellen Rahmen für differenzielle Bearbeitungsanalysen über Replikate hinweg. Zusammen ergeben diese Merkmale eine kalibrierte, hochpräzise Plattform zur Untersuchung dynamischer RNA-Editierung in experimentellen und krankheitsbezogenen Kontexten. In unserer vorherigen Studie¹⁴ wurde CADRES rigoros mit etablierten RNA-Editier-Detektionsmethoden verglichen und sowohl in silico simulierte Datensätze als auch realweltnahe induzierbare A3B-Zellmodelle. In der in silico-Bewertung erzielte CADRES konstant Präzisionswerte von 0,85–0,95 und Genauigkeitswerte von 0,92–0,98 über Replikationszahlen hinweg. Der gesamte CADRES-Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt.

Protokoll

Dieses Protokoll beschreibt einen rein computergestützten Bioinformatik-Workflow zur Identifikation von C>U-RNA-Editierungsereignissen mit dem CADRES-Framework. Alle Schritte werden in einer Linux-Umgebung über die Kommandozeile durchgeführt. Es werden nur öffentlich zugängliche Sequenzierungsdatensätze verwendet, und es sind weder Menschen noch Wirbeltiere beteiligt.

1. Umgebungsaufbau und Softwareinstallation

HINWEIS: Die Mindestrechenanforderungen für den CADRES-Workflow sind wie folgt: CPU ≥ 8 Kerne (empfohlen werden 16 Kerne), RAM ≥ 32 GB (64 GB empfohlen für Gesamtgenomdatensätze) und Festplattenspeicher ≥ 100 GB.

1. Bestätigen Sie, dass ein Linux-Betriebssystem verfügbar ist. Öffnen Sie ein Terminalfenster und stellen Sie sicher, dass die Berechtigung zur Installation in der aktuellen Benutzerumgebung verfügbar ist.
2. Installiere einen Conda-Paketmanager, falls dieser nicht bereits auf dem System vorhanden ist. Laden Sie einen Installer für eine minimale Conda-Distribution von der offiziellen Website herunter. Führe das Installationsskript gemäß den Bildschirmanweisungen aus.
3. Überprüfen Sie, ob Conda aktiv ist, indem Sie den folgenden Befehl eingeben und sicherstellen, dass der Befehl eine gültige Versionsnummer ausgibt.
   $ Conda --Version
4. Erstelle ein Arbeitsverzeichnis für den CADRES-Workflow. Navigieren Sie in dieses Verzeichnis mit:
   $ cd /pfad/zu/working_directory
5. Laden Sie den CADRES-Quellcode herunter, indem Sie folgendes ausführen:
   $ git-Klon --Branch v1.0.0 https://github.com/junsun-hash/CADRES
6. Geben Sie das geklonte Verzeichnis ein, indem Sie folgendes ausführen:
   $ cd KADER
7. Erstellen Sie eine dedizierte Conda-Umgebung mit der environment.yml-Datei, die im CADRES-Repository bereitgestellt wird. Führe den folgenden Befehl aus und lass den Installationsprozess ohne Unterbrechung abgeschlossen werden.
   $ conda env create -f environment.yml
8. Aktivieren Sie die neu erstellte Umgebung, indem Sie den folgenden Befehl eingeben. Bestätigen Sie, dass die Umgebung aktiviert wurde, indem Sie prüfen, dass die Terminal-Eingabeaufforderung jetzt ihren Namen anzeigt.
   $ conda activate CADRES
9. Überprüfen Sie, dass die erforderlichen Kommandozeilen-Tools korrekt installiert wurden. Führe jeden untenstehenden Befehl aus und stelle sicher, dass sie eine Versionsnummer und keine Fehlermeldung zurückgeben:
   $ Python --Version
   $ samtools --Version
   $ gatk --Hilfe
   $ Bettwerkzeuge --Version
   $ pblat
   HINWEIS: Der genaue Satz der Werkzeuge, die in der CADRES-Umgebung enthalten sind, kann je nach Aktualisierung der environment.yml-Datei leicht abweichen. Wenn ein Werkzeug fehlt, erstellen Sie die Umgebung neu oder aktualisieren Sie die Abhängigkeitsliste bei Bedarf.
10. Stellen Sie sicher, dass genügend Speicherplatz zur Verfügung steht. Bestätigen Sie, dass mindestens 100 GB freier Speicherplatz für Referenzgenome, Ausrichtungsindizes und zwischenliegende BAM-Dateien vorhanden sind, indem Sie folgendes eingeben:
    $ df -h
11. Bestätigen Sie, dass Schreibberechtigungen in allen Arbeits-, Ausgabe- und temporären Verzeichnissen verfügbar sind, indem Sie eine Testdatei erstellen:
    $ Touch test_file.txt
12. Löschen Sie die Datei danach, indem Sie Folgendes eingeben:
    $ rm test_file.txt

2. Datenaufbereitung

HINWEIS: Der repräsentative Datensatz, der in diesem Protokoll verwendet wird, besteht aus: HEK293T Zellen mit doxycyclin-induzierbarem A3B–GFP; WGS bei 33×; strängspezifischer gepaarter RNA-seq (2×150 bp, ≥60 M Lesungen/Probe); n = 3 biologische Replikate pro Bedingung (DMSO vs. Doxycyclin 72 H). Vollständige Daten: SRA PRJNA1211186. Eine chr22-Demonstrations-Teilmenge wird im CADRES-Repository bereitgestellt.

CADRES benötigt: (i) WGS (≥33×) oder WES (≥33×); (ii) strängspezifische, paarende-RNA-seq (≥60 Millionen Reads pro Probe); (iii) zwei experimentelle Bedingungen mit jeweils ≥2 biologischen Replikaten.

1. Bereite das Referenzgenom und die Annotation vor.
   1. Laden Sie die Referenzgenom- (FASTA)- und GTF-Annotationsdatei aus Ensembl oder einem vergleichbaren Repository herunter. Das empfohlene Referenzgenom ist Ensembl GRCh38 Primary Assembly: https://ftp.ensembl.org/pub/release-111/fasta/homo_sapiens/dna/ und die empfohlene GTF-Annotation ist GENCODE Release 45:
      https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_45/.
   2. Indexiere die Referenz FASTA:
      $ samtools faidx FASTA_FILE.fa
      Stellen Sie sicher, dass die Chromosomenbenennungskonventionen (zum Beispiel "chr1" versus "1") über alle Referenzmaterialien hinweg konsistent sind.
2. Holen Sie sich die Sequenzierungsdaten.
   1. Erhalten Sie DNA-seq FASTQ-Dateien (WGS oder WES) mit ≥33× Tiefe.
   2. Erhalten Sie strängspezifische, gepaarte RNA-seq FASTQ-Dateien mit ≥60 Millionen Lesearten pro Probe, über zwei biologische Bedingungen und mindestens zwei biologische Replikate pro Gruppe hinweg.
3. Richten Sie die DNA-Sequenzierungswerte mit BWA-MEM aus.
   1. Erstellen Sie einen BWA-Index:
      $ BWA Index Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa -p bwaindex -a bwtsw
   2. Ausrichten und in BAM umwandeln:
      $ bwa mem -R '@RG\tID:ID\tPL:platform\tLB:library\tSM:sample_name' bwaindex wgs_R1.fq.gz wgs_R2.fq.gz | samtools view -b > wgs.bam
4. Richten Sie die RNA-Sequenzierungswerte mit STAR aus.
   1. Erstellen Sie den STAR-Genomindex:
      $ STAR --runMode genomeGenerate \
      --genomeFastaFiles Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      --genomeDir STAR_index \
      --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.gtf
   2. Align-RNA-Lesungen
      $ STAR \
      --genomeDir STAR_index \
      --readFilesCommand zcat \
      --readFilesIn rna_sample1.fq.gz rna_sample2.fq.gz \
      --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --outSAMtype BAM Unsorted \
      --outSAMmapqUnique 60 \
      --outFileNamePrefix pass1_
      HINWEIS: Dies erzeugt eine Splice-Junction-Datei (pass1_SJ.out.tab), die sowohl annotierte als auch neuartige Junctions enthält.
   3. Regenerieren Sie den STAR-Genomindex mit neuartigen Übergängen:
      $ Cat pass1_SJ.out.tab > SJ_all.tab
      $ STAR --runMode genomeGenerate \
      --genomeFastaFiles Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      --genomeDir STAR_index_2pass \
      --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --sjdbFileChrStartEnd SJ_all.tab
   4. Führen Sie die zweite Durchgangsausrichtung mit dem aktualisierten Index durch:
      $ STAR \
      --genomeDir STAR_index_2pass \
      --readFilesCommand zcat \
      --readFilesIn rna_sample1.fq.gz rna_sample2.fq.gz \
      --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
      --outSAMmapqUnique 60 \
      --outFileNamePrefix output_name
5. Bereiten Sie Hilfsreferenzressourcen vor.
   1. (Empfohlen) Erhalten Sie dbSNP VCF
      Laden Sie das menschliche GRCh38 dbSNP VCF (zum Beispiel dbSNP Build 150) vom NCBI FTP-Server herunter:
      https://ftp.ncbi.nih.gov/snp/latest_release/VCF/ Legt die heruntergeladene Datei (zum Beispiel dbsnp_150.vcf.gz) in das Arbeitsverzeichnis.
      HINWEIS: RNA-abgeleitete Einträge (molType="cDNA") in dbSNP können echte RNA-Editierstellen verbergen. Schließen Sie sie aus:
      $ bcftools view -i 'INFO/molType!="cDNA"' dbsnp.vcf.gz -Oz -o dbsnp_no_cDNA.vcf.gz
   2. (Empfohlen) Sortiere das dbSNP VCF
      Sortiere das VCF so, dass es mit dem Referenzgenom und GATK kompatibel ist:
      $ gatk SortVcf \
      -Ich dbsnp_150.vcf.gz \
      -O dbsnp_150.sorted.vcf.gz \
      --Sequenzwörterbuch Homo_sapiens. GRCh38.dict
   3. (Empfohlen) Indexiere das sortierte dbSNP VCF
      Erstellen Sie einen Index für das sortierte dbSNP VCF:
      $ gatk IndexFeatureFile -I dbsnp_150.sorted.vcf.gz
      HINWEIS: Ein passendes Referenzwörterbuch ist erforderlich. Wenn die Akte Homo_sapiens. GRCh38.dict fehlt, generiere es wie folgt:
      $ gatk CreateSequenceDictionary \
      -R Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      -O Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.dict
   4. (Empfohlen) Erhalten Sie GnomAD-Keimlinien-VCF
      Laden Sie die GRCh38 gnomAD Keimlinien-Variantenstellen VCF herunter von: https://gnomad.broadinstitute.org/downloads Verwenden Sie das für die Pipeline geeignete Genom-VCF (zum Beispiel gnomad.genomes.vX.X.sites.vcf.gz).
   5. (Empfohlen) Sortiere das gnomAD VCF
      Sortiere das gnomAD VCF mit demselben Referenzwörterbuch, um die Kompatibilität sicherzustellen:
      $ gatk SortVcf \
      -Ich gnomad.vcf.gz \
      -O gnomad.sorted.vcf.gz \
      --Sequenzwörterbuch Homo_sapiens. GRCh38.dict
   6. (Empfohlen) Indexiere den sortierten GnomAD VCF
      Erstellen Sie einen Index für das sortierte gnomAD VCF:
      $ gatk IndexFeatureFile -I gnomad.sorted.vcf.gz
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Chromosomenbenennung (zum Beispiel "chr1" vs. "1") mit der Referenz-FASTA übereinstimmt, bevor Sie SortVcf ausführen.
6. Erhalten Sie eine bekannte RNA-Editierungsreferenz.
   HINWEIS: Eine kompatible REDIportal-Referenzdatei (rediportal.txt), die für CADRES geeignet ist, wird im CADRES-Repository kuratiert und kann direkt aus folgenden Teilen heruntergeladen werden:
   https://github.com/junsun-hash/CADRES/releases/tag/v1.0.0. Diese Datei wird für die Annotation bekannter Bearbeitungsereignisse in Schritt 3 verwendet.
7. Bereite Gen-Annotationen im RefGene-Format vor. Laden Sie die RefGene-Annotation herunter (zum Beispiel refGene.txt.gz von UCSC). Dekomprimieren Sie bei Bedarf und stellen Sie sicher, dass die Chromosomennamen mit denen im Referenzgenom übereinstimmen.
   HINWEIS: Ein geeignetes Beispiel für CADRES ist im CADRES-Repository kuratiert und kann direkt aus folgenden Teilen heruntergeladen werden:
   https://github.com/junsun-hash/CADRES/releases/tag/v1.0.0

3. Ausführung des CADRES-Analyse-Workflows

HINWEIS: Abschnitt 3 wird im Linux-Terminal mit aktivierter CADRES Conda-Umgebung ausgeführt.

1. Kalibrierung und Boost-Rekalibrierung
   HINWEIS: Schritt 1 standardisiert BAM-Dateien und führt die Boost-Rekalibrierung durch – ein verbessertes BQSR, das dbSNP, gnomAD und eine vorläufige Reihe von RNA-Bearbeitungskandidaten integriert, um echte Bearbeitungssignale zu erhalten. Listen Sie alle RNA-BAM-Dateien nach Abzeichen auf. Ausgabe: neu kalibrierte BAMs (Suffix: _recalibration.bam) und Boost-Kandidatenseiten.
   1. Um Schritt 3.1 auszuführen:
      $ python pipeline_step1_calibration.py \
      --rna_bams /path/to/rna_sample1.bam /path/to/rna_sample2.bam ... \
      --dna_bam /path/to/wgs_normal.bam \
      --Genom /path/to/hg38.fa \
      --known_snv /path/to/dbsnp.sorted.vcf.gz \
      --output_dir ./output/step1_calibration \
      --Präfix project_demo
      HINWEIS: Boost-Kandidaten werden aus einem vorläufigen gemeinsamen DNA-RNA-Mutect2-Aufruf aufgebaut (--max-events-in-Region 4, nur PASS-Filter; keine zusätzlichen AF/Qualitätsschwellen). Homopolymer- und Wiederholungsfilterung werden in Schritt 3.2 behandelt.
2. Variantenruf, Kontaminationsschätzung und Filterung
   HINWEIS: Schritt 3.2 führt einen gemeinsamen DNA-RNA-Variantenaufruf mit Kontaminationsschätzung (über gnomAD) durch und filtert dann die Kandidaten nach Homopolymer-Kontext und PBLAT-Neuausrichtung. Ausgabe: {Präfix}.final.vcf.
   1. Um Schritt 3.2 auszuführen:
      $ python pipeline_step2_variant_calling.py \
      --rna_bams ./output/step1_calibration/rna_sample1_split_recalibration.bam ... \
      --dna_bam ./output/step1_calibration/DNA_processed_recalibration.bam \
      --Genom /path/to/hg38.fa \
      --gnomad /pfad/zu/gnomad.sorted.vcf.gz \
      --output_dir ./output/step2_variant_calling \
      --Präfix project_demo
      HINWEIS: Dieser Schritt erzeugt das endgültige, streng gefilterte Variantenrufset (project_demo.final.vcf), das hochsichere RNA-DNA-Unterschiede über alle Proben repräsentiert. Schlüsselparameter: Mutect2 --min-median-basisqualität 12, --max-Events-in-Region 4; PBLAT minbasequal 5; Alle sind im Pipeline-Skript vorkonfiguriert.
3. Statistische Tests und funktionale Annotation
   HINWEIS: Schritt 3.3 quantifiziert die differenzielle RNA-Editierung mit einem GLMM, das aus rMATS adaptiert ist (Benjamini-Hochberg FDR-Korrektur), und annotiert jede Stelle mit Genregion, Gensymbol und bekanntem Bearbeitungsstatus. Ausgabe: {Präfix}_Result.txt (DVRs mit P-Werten und FDR).
   Der PBLAT-Realignment-Filter entfernt Kandidaten, die auf mehrere genomische Loci zugeordnet werden, was die Spezifität in repetitiven Regionen erhöht. Seine interne THREAD_COUNT wird durch das --threads-Flag in pipeline_step2_variant_calling.py gesteuert.
   1. Um Schritt 3.3 auszuführen:
      $ python pipeline_step3_statistical_test.py \
      --group1_rna_bams ./output/step1_calibration/control_rep1.bam ... \
      --group2_rna_bams ./output/step1_calibration/treated_rep1.bam ... \
      --final_vcf ./output/step2_variant_calling/project_demo.final.vcf \
      --Genom /path/to/hg38.fa \
      --known_snv /path/to/dbsnp.sorted.vcf.gz \
      --known_editing /path/to/rediportal.txt \
      --gene_anno /path/to/refGene.txt \
      --output_dir ./output/step3_statistical_test \
      --bezeichnet Kontrolliert behandelt
      HINWEIS: Wichtige Parameter: samtools mpileup -q 30 (minimale Mapping-Qualität), -Q 17 (minimale Basisqualität); rMATS-GLMM-Likelihood-Ratio-Test mit Δψ-Cutoff = 0,0001, binomialer Logit-Link mit replikat-bewusster multivariater Normalstrafe (rho = 0,9); Benjamini-Hochberg FDR-Korrektur; Alle sind im Pipeline-Skript vorkonfiguriert
      Alle drei Pipeline-Schritte unterstützen Multithread-Ausführung über das --threads-Flag (Standard: 4 pro Schritt). Schritt 2 akzeptiert zusätzlich --contamination_threads (Standard: 2).

4. Ergebnisprüfung und Visualisierung

1. Nachdem der CADRES-Workflow abgeschlossen ist, navigieren Sie zum Ausgabeverzeichnis. Die Hauptdatei für Ergebnisse, {prefix}_Result.txt, listet alle detektierten Differentialvarianten auf RNA (DVRs) auf, einschließlich genomischer Koordinaten, Allele, Replizierniveau-Allelzählungen, Bearbeitungsfraktionen, Unterschieden zwischen den Gruppen und zugehörigen statistischen Metriken (P-Wert und FDR). Genebene Annotationen (Gensymbol, Region, Strang, Variantentyp, bekannter SNP-/Editierungsstatus) sind ebenfalls enthalten. Die beigefügte Zusammenfassungsdatei, {prefix}_Result_summary.txt, liefert Zählungen jedes Substitutionstyps und deren Klassifikation in SNP-DVRs, bekannte RNA-editierende DVRs und neuartige DVRs.
2. (Optional) Generiere Standardvisualisierungen, indem du das Postanalyse-Skript ausführst. Öffne eine R-Sitzung und gib ein:
   R-Konsole:
   Quelle("Post-Analysis.R")
   Das Skript Post-analysis.R ist in https://github.com/junsun-hash/CADRES/ enthalten.
3. Ein Dateiauswahl-Dialog erscheint; Wähle {Präfix}_Result.txt. Das Drehbuch produziert sechs PNG-Figuren.
   HINWEIS: Der Dateiauswahl-Dialog erfordert eine Desktop-R-Sitzung. Auf headless-Servern bearbeiten Sie die input_file-Variable direkt (Zeile 10 von Post-analysis.R) und führen Sie Rscript Post-analysis.R aus.

Ergebnisse

Um CADRES unter realistischen experimentellen Bedingungen zu evaluieren, verwendeten wir ein induzierbares APOBEC3B (A3B)-System in 293T-Zellen. Ein doxycyclin-responsives lentivirales Konstrukt, das A3B-GFP exprimiert, wurde in 293T-Zellen eingeführt, und stabile Integranten wurden mit Puromycin ausgewählt. Die Induktion mit Doxycyclin über 72 Stunden ergab eine robuste A3B-GFP-Expression, bestätigt durch GFP-Fluoreszenz und erhöhte A3B-mRNA-Spiegel. Abgeglichene induzierte und nicht-in...

Diskussion

Der hier vorgestellte CADRES-Workflow bietet eine kalibrierte, intern konsistente Strategie zur Erkennung differenzierender RNA-Editierungsereignisse mit hoher Spezifität, insbesondere C>U-Deaminierung, die durch APOBEREC-Enzyme katalysiert wird. Mehrere Schritte im Protokoll sind entscheidend für seine Genauigkeit. Abgestimmte genomische und transkriptomische Sequenzierung ist entscheidend, um echte RNA-Bearbeitungen von zugrundeliegenden DNA-Polymorphismen zu unterscheiden, während das...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BCFtools	Samtools project	N/A	Version 1.21. Variantenaufruf und VCF-Manipulation. URL: https://github.com/samtools/bcftools
Bedtools	Quinlan Lab	N/A	Version 2.31.1. Genome arithmetische Operationen. URL: https://github.com/arq5x/bedtools2
Biopython	Biopython project	N/A	Version 1.85. Python-Tools für Molekularbiologie. URL: https://www.biopython.org
BWA-MEM	GitHub (lh3/bwa)	N/A	Version 0.7.18. DNA-Seq-Alignment. URL: https://github.com/lh3/bwa
CADRES Quellcode	GitHub (junsun-hash/CADRES)	N/A	Version 1.0.0. CADRES-Pipeline-Skripte. URL: https://github.com/junsun-hash/CADRES
Conda oder Miniconda	Anaconda Inc.	N/A	Version 23.1. Paket- und Umgebungsmanager. URL: https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
dbSNP GRCh38 VCF	NCBI	N/A	Build 155. Datenbank für häufige Keimbahnvarianten. URL: https://ftp.ncbi.nih.gov/snp/
GATK4	Broad Institute	N/A	Version 4.3.0.0. Genome-Analyse-Toolkit. URL: https://github.com/broadinstitute/gatk
Git	Software Freedom Conservancy	N/A	Version 2.39. Versionskontrollsystem. URL: https://git-scm.com
gnomAD GRCh38 VCF	Broad Institute	N/A	Version 3.1. Populationsallelfrequenzen. URL: https://gnomad.broadinstitute.org
GTF-Annotationsdatei	Ensembl	N/A	Release 109. Gen-Annotation für GRCh38. URL: https://www.ensembl.org
Humanes Referenzgenom GRCh38	Ensembl/UCSC	N/A	Release 109. Referenzgenom-Assembly. URL: https://www.ensembl.org oder https://hgdownload.soe.ucsc.edu
Linux-Workstation oder Server	Verschiedene	N/A	Ubuntu 20.04. x86_64 Architektur erforderlich. URL: https://ubuntu.com
pblat	UCSC Genome Browser	N/A	Version 2.5.1. Parallele BLAT-Neuausrichtung. URL: https://github.com/ucscGenomeBrowser/kent
Picard	Broad Institute	N/A	Version 2.20.8. NGS-Datenmanipulation. URL: https://github.com/broadinstitute/picard
Python	Python Software Foundation	N/A	Version 3.9.19. Programmiersprache. URL: https://www.python.org
R	R Foundation	N/A	Version 4.5.2. Statistisches Rechnen. URL: https://www.r-project.org
R-Paket: forcats	CRAN	N/A	Version 1.0.0. Faktorenmanipulation. URL: https://cran.r-project.org/package=forcats
R-Paket: ggplot2	CRAN	N/A	Version 4.0.1. Datenvisualisierung. URL: https://cran.r-project.org/package=ggplot2
R-Paket: ggrepel	CRAN	N/A	Version 0.9.5. Textlabel-Repulsion. URL: https://cran.r-project.org/package=ggrepel
R-Paket: lme4	CRAN	N/A	Version 1.1.35. Lineare gemischte Effekte-Modelle. URL: https://cran.r-project.org/package=lme4
R-Paket: readr	CRAN	N/A	Version 2.1.5. Schnelles Dateilesen. URL: https://cran.r-project.org/package=readr
R-Paket: stringr	CRAN	N/A	Version 1.6.0. String-Manipulation. URL: https://cran.r-project.org/package=stringr
REDIportal Referenz	Universität Bologna	N/A	Version 2.0. A-zu-I RNA-Editing-Stellen-Datenbank. URL: http://srv00.recas.ba.infn.it/atlas/
RefGene-Annotation	UCSC Table Browser	N/A	Release 109. Genstruktur-Annotation. URL: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables
Samtools	Samtools project	N/A	Version 1.21. BAM-Datei-Manipulation. URL: https://github.com/samtools/samtools
STAR-Aligner	GitHub (alexdobin/STAR)	N/A	Version 2.7.11b. RNA-Seq-Alignment. URL: https://github.com/alexdobin/STAR