Regionsspezifische Linseneinführungsstrategien für die in vivo Kalziumbildgebung bei Mäusen über kortikale und hippocampale Schaltkreise hinweg

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die regionsspezifische Linseneinführung und -stabilisierung, um eine zuverlässige In vivo Kalziumbildgebung bei Mäusen zu ermöglichen, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und Versuch-und-Irrtum bei der Kalziumbildgebung zu reduzieren.

Zusammenfassung

In vivo wird die Kalziumbildgebung neuronaler Populationen mit chirurgisch implantierten optischen Linsen weit verbreitet eingesetzt, um die neuronale Populationsaktivität während des Verhaltens zu überwachen. Allerdings hängen der chirurgische Erfolg und die Bildgebungsqualität entscheidend von anatomischen Einschränkungen ab, die zwischen den Hirnregionen variieren. Dieses Protokoll bietet regionsspezifische chirurgische Anleitungen für die Auswahl und Implantation von bildgebenden Linsen in häufig gezielten kortikalen und hippocampusalen Bereichen. Konkret beschreibt er einen chirurgischen Ablauf, der Ziellokalisierung und Schädelausgleich, regionsspezifische Kraniotomie und, wenn erforderlich, Dura-Entfernung oder Aspiration von überlagertem Gewebe sowie die Auswahl, Einführung und Fixierung geeigneter Linsen und Halter umfasst. Insbesondere beschreiben wir drei Implantationsstrategien: die konventionelle Linsenimplantation für den ventralen Hippocampus, die Linsenimplantation mit Gewebeaspiration für den dorsalen Hippocampus und die Prismalinsenimplantation für die kortikale Bildgebung. Wir geben zudem praktische Hinweise darauf, wie Unterschiede in Gewebetiefe, Gefäßarchitektur und Schaltkreisorganisation wichtige chirurgische Parameter beeinflussen, darunter Linsendurchmesser, Kraniotomiegröße, Ausmaß der Gewebeentfernung, Einsetzgeschwindigkeit, hämostatische Verfahren und Fixationsmethoden. Indem chirurgische Überlegungen explizit dokumentiert werden, die in schriftlichen Methoden oft unterberichtet werden, zielt dieses Protokoll darauf ab, Versuch und Irrtum während der Linsenimplantation zu reduzieren und die experimentelle Reproduzierbarkeit zu verbessern. Insgesamt bietet dieses Protokoll einen praktischen Leitfaden zur Auswahl und zuverlässigen Umsetzung regionsgeeigneter Linsenimplantationsstrategien in kortikalen und hippocampusalen Schaltkreisen.

Einleitung

In vivo ist die Kalziumbildgebung mit implantierten optischen Linsen zu einer zentralen Technik zur Überwachung der neuronalen Aktivität auf Populationsebene bei verhaltenden Tieren^geworden. 1,2,3,4,5,6. Durch die Ermöglichung von longitudinalen Aufzeichnungen aus genetisch definierten neuronalen Ensembles hat dieser Ansatz entscheidende Einblicke in die Schaltkreisdynamik geliefert, die Wahrnehmung, Lernen und Entscheidungsfindung^zugrunde liegen 2,6,7,8. Der Erfolg der linsenbasierten Bildgebung hängt jedoch nicht nur vom optischen Zugang ab, sondern auch von einer sorgfältigen Berücksichtigung regionsspezifischer anatomischer Einschränkungen. Kortikale Regionen wie der präfrontale Kortex (PFC), mittlere Tiefenstrukturen wie der dorsale Hippocampus und tiefe Ziele wie der ventrale Hippocampus unterscheiden sich erheblich in der Orientierung der Schaltkreise und der Toleranz gegenüber Gewebeverschiebungen, neben weiteren Faktoren. Diese anatomischen Unterschiede erfordern regionsspezifische chirurgische Strategien zur Linsenauswahl und Implantation. Frühere Studien haben zuverlässige Methoden zur Abbildung von dorsalen CA1-Neuronen in kopffixierten Mäusen mit vertikal implantierten Linsen 6,9,10,11 etabliert, und prismabasierte Linsen werden häufig für kortikale Bildgebung ^7,8 eingesetzt, wobei der laterale optische Zugang ganz- oder laminarspezifische Aufzeichnungen je nach Zielschaltungsorientierung ermöglicht. Obwohl diese Ansätze das gemeinsame Prinzip des optischen Zugangs über implantierte Linsen teilen, stellen sie unterschiedliche chirurgische Einschränkungen, die regionsspezifisch adressiert werden müssen.

Trotz der zunehmenden Akzeptanz dieser Technik liegt eine häufige Ursache des experimentellen Scheiterns nicht im konzeptionellen Missverständnis, sondern im Mangel an ausreichend detaillierter, regionsspezifischer chirurgischer Führung. In der Praxis resultieren fehlgeschlagene Aufzeichnungen häufig aus ungenauer Kraniotomie, suboptimaler Gewebeentfernung oder unzureichender Berücksichtigung regionsspezifischer vaskulärer und struktureller Einschränkungen. Während allgemeine Linsenimplantationsverfahren in früheren Protokollen ^9,10,11,12 beschrieben wurden, sind die praktischen chirurgischen Feinheiten, die den Bildgebungserfolg bestimmen, insbesondere jene, die sich zwischen Zielregionen unterscheiden, noch unvollständig dokumentiert.

Dieses Videoprotokoll schließt diese Lücke, indem es explizite, regionsspezifische Orientierung für die Linsenauswahl und -implantation über kortikale und hippocampusale Ziele hinweg bietet, wobei das PFC sowie die dorsalen und ventralen CA1-Regionen des Hippocampus als repräsentative Beispiele verwendet werden. Konkret beschreiben wir drei Implantationsstrategien, die jeweils auf die anatomischen und chirurgischen Einschränkungen des Zielbereichs zugeschnitten sind, und heben wichtige Entscheidungspunkte sowie technische Fallstricke hervor, die mit jedem Ansatz verbunden sind.

Bei der darsalen Hippocampus-CA1-Bildgebung erfordert der relativ große Durchmesser herkömmlicher Linsen oft eine Gewebeaspiration, um ausreichend Platz für die Einnistung zu schaffen. Wenn die Gewebeentfernung unvollständig oder unsachgemäß durchgeführt wird, kann das umgebende Gewebe eher komprimiert als verdrängt werden, was zu einer Ansammlung von Neuronen in der Nähe der Linsenoberfläche und zur Bildung dicht gepackter Zellschichten führt, die die beabsichtigte Bildfläche verdecken. Für den ventralen Hippocampus, der tief im Gehirn liegt, erfordert eine präzise Zielerfassung eine präzise Kontrolle des Einstichwinkels, der Flugbahn und der Eindringgeschwindigkeit, um Gewebeschäden zu minimieren und eine korrekte Position sicherzustellen. Im Gegensatz dazu legt die Prismalinsenimplantation bei der PFC-Bildgebung mehr Wert auf die Minimierung von Blutungen und die Erhaltung der kortikalen Integrität durch eine präzise Kraniotomie und eine sorgfältige Linseneinführung zur Vermeidung von Gefäßschäden.

Dieses Protokoll richtet sich an Forscher, die eine GRIN-linsenbasierte Kalziumbildgebung bei kortikalen oder hippocampusalen Zielen bei Nagetieren durchführen wollen, insbesondere bei denen, die Schwierigkeiten bei der chirurgischen Reproduzierbarkeit oder Bildgebungsqualität hatten. Am anwendbarsten ist es, wenn man den dorsalen CA1, ventralen CA1 oder den präfrontalen Kortex anvisiert und Standard-GRIN- oder Prismenlinsen in Kombination mit einem Miniskop oder einem gleichwertigen kopfmontierten Bildgebungssystem verwendet. Forscher, die andere Hirnregionen ansprechen oder verschiedene Hardwarekonfigurationen verwenden, sollten die hier beschriebenen regionsspezifischen Prinzipien als anpassungsfähige Richtlinien und nicht als feste Verfahren betrachten. Indem diese praktischen Überlegungen explizit dokumentiert werden, zielt dieses Video darauf ab, Versuch und Irrtum zu reduzieren, die Reproduzierbarkeit in verschiedenen Laboren zu verbessern und einen prinzipiellen Rahmen für die Auswahl geeigneter Implantationsstrategien zu bieten.

Protokoll

Alle Tierpflege- und experimentellen Verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee des Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) unter der Genehmigungsnummer KA2025-060-V3 genehmigt. Alle Experimente entsprachen dem Leitfaden des National Institutes of Health zur Pflege und Nutzung von Labortieren. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um Tierleiden zu minimieren und die Anzahl der eingesetzten Tiere zu reduzieren.

1. Vorbereitungsschritte für die Operation

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde mit 8 Wochen alten erwachsenen C57BL/6J- und VIP-Cre-Knock-in-Mäusen entwickelt (RRID: IMSR_JAX:000664, IMSR_JAX:031628). Der gleiche allgemeine Ansatz kann auch auf andere Dehnungen angewendet werden; Allerdings können einige Anpassungen an bestimmten Details, wie Zielkoordinaten, erforderlich sein.

1. Betäuben Sie die Maus mit 3 % Isofluran, das durch Inhalation mit einer Durchflussrate von 1 L·^min-1 in einer Induktionskammer abgegeben wird.
2. Sichern Sie die Maus in einem stereotaxischen Rahmen mit Ohrstäben und legen Sie die Narkosemaske über die Schnauze.
   HINWEIS: Behalten Sie während des gesamten Eingriffs die gleiche Konzentration der Narkose bei.
3. Stellen Sie das homöotherme System auf 33,5 °C ein, um die Körpertemperatur während der Operation aufrechtzuerhalten.
4. Rasieren Sie den Operationsbereich ab und entfernen Sie die restlichen Haare mit einem Wattestäbchen, das in einer Chlorhexidinglukonatlösung eingeweicht ist.
5. Tragen Sie Augenschmiermittel auf die Augen der Maus auf und bedecken Sie sie mit kleinen Alufoliestücken, um sie während der Operation zu schützen.
6. Vor dem Schnitt wird ein Zehenkneifen durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt ist.
7. Injizieren Sie die 1 % Lidocain-Lösung (gemischt mit 0,5 % Bupivacain) lokal an der Schnittstelle und verabreichen Sie die 1 % Ketoprofen-Lösung per intramuskulärer Injektion.
8. Schneiden Sie die Haut in einer elliptischen Form ein, die ausreichend Platz für eine spätere Kopfbühnenimplantation bietet. Achte darauf, die Muskeln rund um den Schädel nicht zu schneiden.
   HINWEIS: Übermäßige Schnitte können umfangreiche Entzündungen auslösen, die langfristige Aufnahmen aus derselben Region beeinträchtigen können.
9. Mit sterilen Wattestäbchen zieht man den Schnitt vorsichtig seitlich zurück. Reinigen Sie die freiliegende Schädeloberfläche mit sterilen Wattestäbchen und kratzen Sie dann leicht mit einem Schaber ab.
   HINWEIS: Dieser Schritt entfernt Schmutz und raut die Oberfläche leicht, um die anschließende Fixierung von Linse und Kopfplatte zu erleichtern.
10. Zur Ausrichtung entlang der anteroposteriorenen (AP) Achse verwenden Sie Bregma und Lambda als Referenzmarken. Missen Sie die Höhenunterschiede zwischen den Referenzpunkten mit einer 26-Gauge-Nadel.
11. Wenn die AP-Achse nicht waagerecht ist, lockern Sie die Anästhesiemaske und stellen Sie die Höhe des Kieferadapters am stereotaxischen Rahmen ein, bis der Höhenunterschied zwischen Bregma und Lambda auf 0,02 mm liegt.
12. Für die Ausrichtung entlang der mittellateralen (ML) Achse verwenden Sie Punkte ± 3 mm von der Mittellinie als Referenzmarken.
13. Wenn die ML-Achse nicht waagerecht ist, positioniere die Ohrbügel richtig, bis der Höhenunterschied zwischen links und rechts innerhalb von 0,02 mm liegt.

2. Kraniotomie

1. Markiere die Zielpositionen (z. B. PFC, Hippocampus) auf dem Schädel mit einer mit Tinte getränkten Nadel. Beim Markieren des Zielorts markieren Sie auch die Bohrgrenzen in vorderen, hinteren, medialen und lateralen Richtungen.
   HINWEIS: Für das PFC, bei dem die Implantation durch vaskuläre Landmarken gesteuert wird, benötigt ein 1-mm-Objektiv eine 1,5-mm-Öffnung (Abbildung 1A). Für den ventralen Hippocampus, ein tiefes Ziel, benötigt ein 0,6-mm-Objektiv eine 0,8-mm-Öffnung (Abbildung 1B). Für den dorsalen Hippocampus, wo eine Gewebeaspiration erforderlich ist, benötigt eine 1-mm-Linse eine 1,2 mm große Öffnung (Abbildung 1C), um den nicht gestützten Raum um die Linse zu minimieren und die seitliche Verschiebung während der Positionierung vor der adhäsiven Fixierung zu verringern.
2. Erzeugen Sie eine abgerundete quadratische Öffnung mit einem Handbohrer, der von Markierungen geführt wird.
3. Während des ersten Schritts sollte das Bohren so vertikal wie möglich durchgeführt werden, um die Formen schräg geschlagener Kanten zu vermeiden.
4. Führen Sie das Bohren in mehreren kurzen Schritten durch, um das Risiko von Hirnschäden zu minimieren.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Dura während dieses Vorgangs zu reißen.
5. Wenn der verbleibende Schädel sehr dünn wird (wie durch sanften Druck mit der Pinzette bestätigt wird), heben Sie die Knochenlappe mit einer Pinzette ab und achten Sie darauf, die Gehirnoberfläche nicht zu schädigen.
6. Glätten Sie die Kanten mit reduzierter Bohrgeschwindigkeit (Abbildung 2A). Wenn scharfe Knochenfragmente entlang des Schädelrandes verbleiben (Abbildung 2B), können sie die Linse oder die Gehirnoberfläche schädigen.
7. Entfernen Sie vorsichtig alle während des Bohrvorgang entstandenen Knochenreste. Bewässern Sie die Stelle mit Kochsalzlösung, um verbliebene Knochenfragmente zu entfernen.

Abbildung 1. Repräsentative Beispiele für Schädelbohrungen für jede Zielregion Repräsentative Fotos von Mausschädeln nach einer Kraniotomie. (A) Kraniotomie auf den präfrontalen Kortex abzielt. (B) Kraniotomie mit Blick auf den ventralen Hippocampus. (C) Kraniotomie auf den dorsalen Hippocampus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2. Schädelbohrung und Kantenfertigstellung Schematische Darstellung von Schädelbohren und Kantenveredelung. (A) Querschnittsschema einer ordnungsgemäß fertigen Kraniotomie mit einer glatt polierten unteren Grenze. (B) Beispiel, das scharfe Knochenreste zeigt, die durch unzureichende Polierung der unteren Kante verursacht wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Präimplantationsgewebevorbereitung

Vor dem Einsetzen der Linse bereiten Sie das Gewebe so vor, dass ein stabiler Linseneinsatz möglich ist. Je nach Ziel verwenden Sie entweder Methode 3.1 oder 3.2.

1. Entfernung der Dura mater (bei ventralem Hippocampus, präfrontaler Kortex): Wenn eine Aspiration des Gehirngewebes durchgeführt wird, ist die Entfernung der Dura nicht notwendig. Wird die Linse jedoch ohne Gewebeaspiration implantiert, muss die Dura entfernt werden.
   1. Um die Dura zu entfernen, biegen Sie die Spitze einer Insulinspritze leicht und verwenden Sie sie als Schneidwerkzeug.
   2. Schneide die Dura vorsichtig in kleinen Schritten ein. Falls nötig, halten Sie das eingeschnittene Gewebe mit einer feinen Pinzette fest, während Sie die restlichen Teile durchschneiden. Achten Sie darauf, das Gehirn während dieses Vorgangs nicht zu schädigen.
2. Aspiration des oberen Gewebes (bei dorsalem Hippocampus): Bei diesem Ansatz ist ein Mindestabstand von zwei Wochen zwischen der Virusinjektion und der Linsenimplantation erforderlich, um den Verlust oder die Verringerung der viralen Expression durch Aspiration zu verhindern.
   HINWEIS: Eine Gewebeaspiration vor der viralen Injektion wird nicht empfohlen, da die Injektion in kürzlich beschädigtes Gewebe die stabile Expression beeinträchtigen kann. Umgekehrt ist eine verlängerte Erholungszeit nach der Aspiration ebenfalls suboptimal, da das Gewebewachstum die nachfolgende Linsenimplantation behindern kann.
   1. Schließen Sie die Pumpe an einen 8 mm großen Schlauch an, der dann an das Ende einer 1-ml-Spritze angeschlossen wird. Alle Verbindungen werden mit Klebeband fest abgedichtet, um Luftlecks zu verhindern.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine Aspirationspumpe, die einen maximalen Unterdruck von mindestens 50 kPa erzeugen kann. Da die Pumpe erhebliche Vibrationen erzeugen kann, positionieren Sie sie abseits des OP-Tisches.
   2. Verbinden Sie die geglättete 24-Gauge-Nadel mit dem Ende der angeschlossenen 1-ml-Spritze (Abbildung 3).
   3. Erhöhen Sie den Druck der Aspirationspumpe auf mindestens 50 kPa.
   4. Führen Sie die Nadelspitze vorsichtig nah ans Gewebe, damit das Gewebe zusammen mit Kochsalzlösung eingesaugt wird. Während dieses Schrittes benutzen Sie eine Hand, um die Aspirationsnadel zu bedienen, während mit der anderen Hand die Kochsalzlösung kontinuierlich mit einer Spritze aufträgt. Dies verhindert, dass das Blut die Sicht behindert, und erleichtert eine sanfte Aspiration.
      HINWEIS: Obwohl während des Aspirationsprozesses eine Blutung erwartet wird, erfordert dies keine wiederholten Aspirations-Hämostase-Zyklen. Wichtig ist, dass übermäßige Aspiration an den Stellen mit aktiver Blutung vermieden werden sollte, da dies durch zusätzliche mechanische Störungen die Blutung verschlimmern kann.
   5. Führen Sie die Gewebeaspiration in kleinen Schritten durch. Spülen Sie das Operationsfeld in Abständen mit Kochsalzlösung, um das Ausmaß und die Lage der Gewebeentfernung zu beurteilen.
   6. Entfernen Sie Hirngewebe über dem Ziel in einem trichterförmigen Volumen, das auf das Ziel zentriert ist, anstatt Gewebe über die gesamte Öffnung zu entfernen. Eine schematische Darstellung dieses Verfahrens ist in Abbildung 4 dargestellt.
      HINWEIS: Um dies zu erreichen, nähern Sie sich dem Gewebe nicht nur aus einem einzigen Winkel; Stattdessen stellen Sie die Nadel während der Aspiration auf mehrere Winkel ein.
   7. Die Gewebeentfernung sollte etwas oberhalb des Zielbereichs enden, sodass eine dünne Schicht erhalten bleibt. Für den dorsalen Hippocampus ist die Aspiration bis zum Corpus callosum-Niveau vorgeschoben; Die Aspiration wird gestoppt, sobald die weiße Substanz unter dem Kortex sichtbar wird (Corpus callosum wird nicht entfernt).
3. Wenn nach der Entfernung der Dura oder der Gewebeaspiration eine Blutung auftritt, tragen Sie einen Gelatineschwamm (z. B. Cutanplast) auf, der in gekühlter Kochsalzlösung (4 °C) eingeweicht ist, um die Blutung vor der Gerinnung zu kontrollieren. Achten Sie darauf, dass kein Blut im Operationsfeld verbleibt.
   HINWEIS: Anstatt das Blut wegzuwischen, üben Sie sanften Druck mit dem Schwamm aus.
4. Sobald das Gehirn freigelegt ist, legen Sie den mit Kochsalzlösung getränkten Gelatine-Schwamm über den Bereich, um das Gewebe während des gesamten Eingriffs bis zur Linsenimplantation feucht zu halten.

Abbildung 3. Aufbau des Aspirationsgeräts Fotografie der fertigen Montage des Aspirationsgeräts. Das distale Ende des Rohrs ist mit einer Aspirationspumpe verbunden, und alle Verbindungen sind sicher abgedichtet, um eine stabile Saugwirkung zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4. Gewebeaspiration während der Kraniotomievorbereitung Eine schematische Darstellung, die die ungefähre Tiefe und Ausmaß der Gewebeaspiration darstellt, die für die Linsenimplantation auf dCA1 erforderlich ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Linsenimplantation

Hier werden zwei Methoden der Linsenimplantation beschrieben. Beide beinhalten das Einführen der Linse, indem sie ins Gewebe eingeführt wird, unterscheiden sich jedoch darin, wie die Linse angewendet wird. Wählen Sie die geeignete Methode aus den Abschnitten 4.1 und 4.2 aus.

1. Linsenimplantation mit Aluminium-Linsenhalter (für PFC und ventrales CA1)
   1. Vor der Operation sollten Sie sicherstellen, dass die GRIN- (oder Prisma-) Linse dauerhaft im Aluminium-Linsenhalter⁹ mit Sekundenkleber fixiert ist.
   2. Unmittelbar vor der Einpflanzung sterilisieren Sie die hervorstehende Linse und den Linsenhalter durch Eintauchen in eine 0,5 % Chlorhexidinglukonatlösung. Vor dem Einsetzen der Linse sollten Sie sicherstellen, dass die Lösung vollständig getrocknet ist.
   3. Montiere die vormontierte Linsenhalter-Stangeneinheit am stereotaxischen Rahmenmanipulator und stelle sicher, dass die Muttern fest angezogen sind, um Verschiebungen beim Einsetzen zu verhindern.
   4. Da die Linse möglicherweise nicht perfekt orthogonal zum Halter ist, richten Sie die Gewindestange zunächst manuell mit dem Auge aus, um sicherzustellen, dass sie horizontal zum stereotaxischen Rahmen oder den umliegenden Orientierungspunkten ausgerichtet ist.
   5. Sobald die visuelle Ausrichtung erreicht ist, verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Nullpunktreferenz bei Bregma einzustellen.
   6. Senken Sie das Objektiv mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,5 mm·^min-1 (für PFC). Für tiefe Hirnbereiche wie den ventralen Hippocampus verwenden Sie eine langsamere Einführungsrate, um Gewebeschäden zu minimieren und eine genaue Zielerfassung sicherzustellen.
   7. Während der Linsenimplantation in den ventralen Hippocampus wird die Linse alle 2 Minuten um 0,2 mm vorgeschoben, bis eine Tiefe von 2,0 mm erreicht ist. Senken Sie das Objektiv weiterhin langsam von 2,0 mm auf 3,0 mm.
   8. Der Fortschrittsschritt wird auf 0,1 mm alle 2 Minuten reduziert, über eine Tiefe von 3,0 mm hinaus.
   9. Senken Sie das Objektiv in Schritten von 0,05 mm alle 2 Minuten, bis die endgültige Zieltiefe erreicht ist.
   10. Da dieser Prozess oft starke Blutungen verursacht, sollten Sie kleine Stücke Gelatineschwamm, die in steriler Kochsalzlösung getränkt sind, auf die Kraniotomiestelle auftragen, um ein freies Feld zu erhalten und die Blutung während des Linsenvorrückens zu kontrollieren.
   11. Nachdem die Linse die Zieltiefe erreicht hat, warten Sie mindestens 10 Minuten, bis die Operationsstelle vollständig getrocknet ist. Restfeuchtigkeit kann die Haftung des Zahnklements beeinträchtigen.
   12. Sobald der Behälter trocken ist, tragen Sie den Kleber auf, bis die gesamte Baugruppe bedeckt ist, sodass nur die Oberseite des Objektivhalters freiliegt.
   13. Nachdem der Klebstoff vollständig ausgehärtet ist, um den mechanischen Stoß beim Ablösen des Halters zu minimieren, lockern Sie die Ohrstangen teilweise.
   14. Schneide den Brückenkopf des Halters mit Zwickeln durch. Nachdem der Schnitt abgeschlossen ist, ziehen Sie die Ohrstangen wieder fest, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren.
2. 4.2. Linsenimplantation mit Aspirationspumpe (für dorsale CA1)
   1. Vorbereitung des Objektivhalters: Verbinden Sie das schmale Ende einer P1000-Spitze mit einem 4-mm-Durchmesser Gummischlauch, und das gegenüberliegende Ende des Schlauchs ist mit einer 1-mL-Spritze verbunden. Alle Verbindungen werden mit Teflonband abgedichtet, um luftdichte Verbindungen zu gewährleisten.
   2. Die mit dem Schlauch verbundene 1-mL-Spritze waagerecht auf dem stereotaxischen Halter montieren.
   3. Spitzenmontage: Schneiden Sie die P1000-Spitze auf 2 und 27 mm vom schmalen Ende ab und behalten Sie das 2–27 mm lange Segment. Schneiden Sie die P200-Spitze bei 24,5, 27 und 45 mm vom schmalen Ende ab und behalten Sie die 0–24,5 mm und 27–45 mm Segmente (Abbildung 5A).
   4. Setzen Sie das 0–24,5 mm Segment der P200-Spitze in das 27–45 mm Segment ein und fixieren Sie es mit Sekundenkleber (z. B. Loctite, Abbildung 5B). Setzen Sie die zusammengesetzten P200-Segmente in das P1000-Spitzensegment ein und fixieren Sie es mit Sekundenkleber. Richten Sie die Mittelachsen aller Spitzensegmente aus. Stellen Sie den Abstand zwischen dem Ende der P1000-Spitze und dem schmalen Ende der inneren P200-Spitze auf 1 mm ein (Abbildung 5C).
   5. Entfernen Sie die Aspirationsnadel, die an der Spritze befestigt ist, und ersetzen Sie sie durch einen Linsenhalter, der am stereotaxischen Halter befestigt ist (oben beschrieben).
   6. Sterilisieren Sie die Linse, indem Sie sie vor dem Einlegen in den Halter in eine 0,5%ige Chlorhexidinglukonatlösung eintauchen.
   7. Montiere den Objektivhalter am stereotaxischen System und stelle die Vakuumpumpe auf ≥ 50 kPa. Befestigen Sie die oben beschriebene Spitzeneinheit per Press-Fit am Halter und laden Sie die Linse mit einer Pinzette in die Spitzenmontage.
   8. Linsenplatzierung: Nach sicherer Bestätigung der stabilen Befestigung der Linse an der Spitze positionieren Sie die untere Kante der Linse am Bregma als Bezugspunkt und bewegen Sie sich dann zur Zielposition. Verschieben Sie das Objektiv um einen zusätzlichen Abstand in Höhe seines Radius (in diesem Fall 0,5 mm) entlang der anteroposterioren (AP) Achse, um das Zentrum des Objektivs mit dem Ziel auszurichten.
   9. Richte die Spitze der Linse an der medialen Kante der Kraniotomie aus.
   10. Senken Sie das Objektiv um 1,7 mm entlang der dorsoventralen (DV) Achse (für dorsale CA1). Wenn während des Vordervorlaufs Blutungen auftreten, ziehen Sie die Linse langsam zurück, stoppen Sie die Blutung, entfernen Sie das Blut aus der Linse und setzen Sie das Einsetzen erneut.
       HINWEIS: Die ersten 0,7 mm werden mit einer Geschwindigkeit von 0,1 mm pro 10 Sekunden vorgeschoben und die verbleibenden 1 mm langsam mit einer Geschwindigkeit von 0,2 mm pro Minute vorgerückt.
   11. Sobald die Linse das Ziel erreicht, fixiert man die Linse (unten beschrieben) mit Superbond und Zahnzement, nachdem die Schädeloberfläche vollständig getrocknet ist. In diesem Stadium sollten Sie darauf achten, dass der Klebstoff nicht die Schnittstelle zwischen Linse und Halter berührt.
   12. Um den Halter nach der Fixierung zu entfernen, schalten Sie den Staubsauger aus und lösen Sie dann Halter und Schlauch ab.
       HINWEIS: Diese Abfolge stellt sicher, dass nach der Deaktivierung der Pumpe kein Restunterdruck im System verbleibt.
   13. Heben Sie den Halter vorsichtig an, um zu vermeiden, dass die Spitze herunterfällt.

Abbildung 5. Spitzenbaugruppe (A) Segmente von P1000- und P200-Pipettenspitzen, die für den Bau der Spitzenbaugruppe verwendet werden. (B) Schaltplan der zusammengesetzten Konfiguration. Setzen Sie das kleinere P200-Spitzensegment in das größere P200-Spitzensegment ein und setzen Sie dann das P1000-Spitzensegment außen an. (C) Vollständig montierte Spitzenmontage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

5. Zementierung

1. Tragen Sie Zahnharzklement (z. B. Super-Bond C&B) auf, um die Schädeloberfläche und die seitliche Oberfläche der Linse zu bedecken.
2. Nachdem der Klebstoff vollständig ausgehärtet ist, entfernen Sie den Linsenhalter wie oben beschrieben.
3. Verwenden Sie den Zahnkleber, um den freiliegenden Schädel mit einer kuppelförmigen Schicht zu bedecken. Stellen Sie sicher, dass die Linse nicht über das Niveau des Zahnklements hinausragt.
4. Tragen Sie schwarzen Zement oder schwarzen Nagellack um die Linse auf, um Störungen durch Umgebungslicht zu vermeiden.
5. Zum Schutz der Linse wird die Linsenoberfläche mit Silikondichtmittel (z. B. Kwik-Cast) bedeckt. Nachdem das Silikondichtmittel ausgehärtet ist, wird Silikonkleber (z. B. Kwik-sil) auf den Zahnkleber aufgetragen (Abbildung 6).
   HINWEIS: Dieses Protokoll basiert auf der Implantation einer Standard-GRIN-Linse. Nach der Genesung ist daher eine sekundäre Grundplattenoperation erforderlich. Nach der Injektion lassen Sie 4–8 Wochen für eine ausreichende virale Expression ein, identifizieren Sie dann die optimale Fokalebene, bevor Sie die Grundplatte dauerhaft fixieren.

Abbildung 6. Zementierungs- und Versiegelungspläne für die Linsenfixierung Schaltpläne der Linsenfixierung nach der Implantation. Superbindung wird auf die laterale Oberfläche der Linse und den umgebenden Schädel (grau) aufgetragen. Nach vollständiger Aushärtung der Superbindung wird Zahnklement in einer Kuppelform aufgebaut, die der Höhe der Linse entspricht (rosa). Sobald der Zement ausgehärtet ist, wird ein Silikondichtmittel aufgetragen, um die Linsenoberfläche zu bedecken (grün). Abschließend wird Silikonkleber aufgetragen, um die Zementkuppel zu bedecken und zu umgeben (hellblau). (A) Linsenfixierung auf den dorsalen Hippocampus. (B) Linsenfixierung auf den PFC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergebnisse

Die histologische Analyse nach der Linsenimplantation mit dem oben genannten Protokoll bestätigte die genaue Platzierung sowohl der GRIN-Linse als auch der prismagekoppelten GRIN-Linse. In beiden Fällen waren die Linsen korrekt positioniert, um die neuronale Aktivität des medialen präfrontalen Kortex (Abbildung 7A) bzw. der CA1-Region des dorsalen Hippocampus (Abbildung 7B) zu erfassen.

Diskussion

Der Erfolg der linsenbasierten In-vivo-Kalziumbildgebung hängt von mehreren chirurgischen Schritten ab, die sich zwischen Gehirnregionen und Linsengeometrien unterscheiden und jeweils direkt die Qualität und Zuverlässigkeit der aufgezeichneten Signale bestimmen. Abbildung 10 fasst den gesamten chirurgischen Arbeitsablauf für jede Implantationsstrategie zusammen. Eine genaue Skalierung der Kraniotomie ist ein grundlegender Schritt: Eine Öffnung, die...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
8  mm (Außendurchmesser) Schlauch	Tygon	E-3603
Aspirationspumpe	Cliq	VC-701
Schwarzer Zement (zeitgenössische Ortho-Jet-Flüssigkeit)	Lang Dental Mfg. Co.	1506, schwarz
Schwarzer Zement (zeitgenössisches Ortho-Jet-Pulver)	Lang Dental Mfg. Co.	1530, schwarz
Bupivacain HCl schwere Injektion	Myungmoon	649801341
Chlorhexidinglukonatlösung 5 %	Sungkwang	657400190
Cutanplast (Zahn)	Mascia Brunelli	5610101
Zahnbeton	Scheitelpunkt	Typ 2, Baureihe 2
Bohrer (Spitzendurchmesser: 0,5 lb; Mm)	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	19007-05
Augenschmiermittel (Optixcare Pet Eye Lube Plus)	Aventix Tiergesundheit	OPX-4242
Pinzette	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	11254-20, 11051-10
GRIN-Objektiv (0,6  & Times;   7.3  Mm)	Inscopix	1050-004597
GRIN-Objektiv (1.0  & Times;   4.0  Mm)	Inscopix	1050-004595
Homöothermes System zur Kontrolle der Körpertemperatur bei kleinen Tieren	Harvard-Apparat	Modell: HB101
Isofluran (Terrell)	Piramal	NDC 66794-011-25
Ketoprofen-Injektion 100  MG/2  mL	Bukwang	642201001
Kwik-Cast	Weltpräzisionsinstrumente	KWIK-CAST
Kwik-Sil	Weltpräzisionsinstrumente	KWIK-SIL
Lidocain HClhydrat-Injektion 2 %	Daihan	645104361
Nagellack (Schwarz)	Wakemake	11
Prisma-GRIN-Objektiv (1,0 x 4,3 mm)	Inscopix	1050-004601
Kochsalzlösung	JW Pharmaceutical Corporation	201703175
Stereo-Mikroskop	Olympus	SZ61
Stereotaxischer Halter (Standard-Elektrodenhalter)	KOPF	Modell 1770
Super bond C& B (Katalysator)	Sun Medical	0334-0010
Super bond C& B (L-Typ Radiopaque)	Sun Medical	0334-0020
Super bond C& B (Monomer)	Sun Medical	0334-0013
Chirurgische Schere	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	14060-10
UV-Kleber (Norland Optical Adhesive)	Norland-Produkte	NOA 63