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Forschungsartikel
* These authors contributed equally
Mit einem fettreichen, von der Ernährung induzierten Mausmodell der mit metabolischen Dysfunktion assoziierten steatotischen Lebererkrankungen bewertet diese Studie die Auswirkungen der docosahexaensäurereichen (DHA)-reichen Mikroalgenöl-Supplementierung und zeigt, dass die Intervention die Leberlipidprofile verbessert und mit Veränderungen der Zusammensetzung der Darmmikrobiota assoziiert ist.
Metabolisch ist die dysfunktionale steatotische Lebererkrankung eine häufige Stoffwechselstörung, die mit einer Dysbiose der Darmmikrobiota und einem Leberlipidungleichgewicht assoziiert ist. In dieser Studie wurde ein fettreiches, auf Diät induziertes Mausmodell entwickelt, um die Auswirkungen der Supplementierung mit DHA-reichem Mikroalgenöl zu bewerten. Mäuse (n = 4 pro Gruppe) erhielten 8 Wochen lang eine fettreiche Ernährung und erhielten täglich orale Verabreichung von Mikroalgenöl, Probiotika oder einer Kombination aus DHA-reichem Mikroalgenöl und Probiotika. Metabolische Parameter, Darmmikrobiota-Zusammensetzung (16S rRNA-Sequenzierung), mikrobielle funktionelle Signalwege und hepatische metabolomische Profile wurden bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass DHA-reiches Mikroalgenöl die Lipidhomöostase verbesserte, was durch reduzierte Serum-LDL-c- und hepatische Triglyzeridwerte sowie erhöhte High-Density-Lipoprotein (HDL-c) angezeigt wurde und mit der Linderung von Leberschäden und oxidativem Stress verbunden war. Die Mikrobiomanalyse zeigte selektive Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobien, einschließlich der Anreicherung von Lactobacillus und Bifidobacterium sowie der Reduzierung fettreicher, fettassoziierter Taxa wie Clostridium und Ruminococcus. Funktionelle Profilierungen zeigten Veränderungen der mikrobiellen Stoffwechselwege, einschließlich des L-Methionin-Rettungszyklus und des Abbaus von Phenylethylamin. Die integrierte Mikrobiom-Metabolom-Analyse identifizierte zudem Zusammenhänge zwischen mikrobiellen Taxa und Lebermetaboliten, die am Fettsäurestoffwechsel, dem Gallensäureumsatz und den Aminosäurewegen beteiligt sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Supplementierung mit DHA-reichem Mikroalgenöl mit Verbesserungen des Leberlipidstoffwechsels und der Zusammensetzung der Darmmikrobiota in diesem Modell verbunden ist, ohne einen direkten kausalen Mechanismus zu implizieren.
Die mit Stoffwechselstörungen assoziierte steatotische Lebererkrankung (MASLD) ist eine weltweit sehr verbreitete Erkrankung, die etwa 32,4 % der Weltbevölkerung betrifft1. MASLD ist definiert durch übermäßiges Fett in der Leber, das zu verschiedenen damit verbundenen Gesundheitsproblemen beiträgt. Der menschliche Verdauungstrakt enthält eine ausgefeilte und ausgewogene mikrobielle Gemeinschaft, darunter Bakterien, Viren, Pilzeund Parasiten. Aufgrund der Wechselwirkung zwischen dieser mikrobiellen Gemeinschaft und der Leber gelten Probiotika als vielversprechende Methode zur Vorbeugung und Behandlung von MASLD, indem diese kritische Verbindung moduliertwird. Neue Forschungsergebnisse zeigen, dass Probiotika MASLD positiv beeinflussen können, indem sie das Darmmikrobiom modulieren und Entzündungen reduzieren. Konkret wurde gezeigt, dass die Verabreichung von Probiotika das Gleichgewicht der Darmmikrobiota wiederherstellt und Leberentzündungen reduziert4. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass bestimmte Probiotika, insbesondere solche, die den Gallensäurestoffwechsel fördern können, die hepatische Steatose (Fettleber) lindern und die allgemeine metabolische Gesundheit bei Personen mit MASLD 5,6 unterstützen. Darüber hinaus zeigten starke Belege, dass Patienten mit MASLD signifikante Veränderungen im Darmumfeld zeigen, eine Erkrankung, die als Dysbiose 7,8 bekannt ist. Eine entscheidende Erkenntnis war die Reduktion der Alpha-Diversität, was bedeutet, dass die Gesamtzahl und Vielfalt mikrobieller Arten reduziert ist. Darüber hinaus ist die Darmmikrobiota von MASLD-Patienten oft durch eine Dominanz des bakteriellen Phylums Firmicutes 9,10,11 gekennzeichnet. Personen mit MASLD konsumieren häufig eine schlechte Ernährung, die typischerweise eine hohe Aufnahme gesättigter Fette und eine geringe Aufnahme essentieller Mikronährstoffe12,13 beinhaltet. Diese ungesunden Essgewohnheiten, die häufig in städtischen Bevölkerungen beobachtet werden, korrelieren mit einem erhöhten Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes im Vergleich zu Menschen in ländlichen Gebieten14. Darüber hinaus waren fettreiche Diäten direkt an der Ursache eines tiefgreifenderen Darmungleichgewichts beteiligt. Insbesondere zeigten sowohl Studien in Tiermodellen als auch Studien an Patienten mit fortgeschrittener Lebererkrankung, MASLD, dass eine hohe Fettaufnahme mit einer Veränderung des Darmviroms in Verbindung steht. Diese Veränderungen beinhalteten eine Erhöhung der lytischen Phagenaktivität, die letztlich die bestehende Darmdysbioseverschlimmerte.
Omega-3-Mehrfachungesättigte Fettsäuren (PUFAs), die häufig in Fischöl vorkommen, könnten den Lipidstoffwechsel verbessern und das Darmmikrobiota regulieren. Mikroalgenöl hat sich als vielversprechende und nachhaltige Quelle für Omega-3-PUFAs etabliert. Insbesondere ist Schizochytrium-Mikroalgenöl eine vielversprechende kommerzielle Quelle, da es eine hohe Konzentration reiner Docosahexaensäure (DHA) enthält. Frühere Studien aus dieser Gruppe berichteten, dass in einem fettreichen (HFD)-induzierten Fettleibigkeits-Mausmodell die Wirksamkeit von Mikroalgenöl zur Förderung des Gewichtsverlusts vergleichbar mit der von Fischöl und dem Gewichtsverlustmedikament Orlistat war. Entscheidend ist, dass Mikroalgenöl diese Gewichtsverlusteffekte früher aufwies als Fischöl oder Orlistat17. Frühere Ergebnisse zeigten auch, dass Mikroalgenöl im Vergleich zu kommerziellem Fischöl und Orlistat deutliche und vorteilhafte Effekte auf die Darmmikrobiota hatte. Obwohl Mikroalgenöl die gesamte bakterielle Vielfalt nicht signifikant veränderte, war es mit einer erhöhten Häufigkeit nützlicher, kurzkettiger Fettsäuren (SCFA) produzierender Bakterien und einer Reduktion pathogener Taxa, einschließlich der fettleibigkeitsassoziierten Gattung Desulfovibrio, verbunden. Darüber hinaus stellte Mikroalgenöl die Stoffwechselkapazität der Darmmikrobiota bemerkenswert wieder her, verbesserte die mit Aminosäuren, SCFAs und dem Gallensäurestoffwechsel verbundenen Signale und verringerte gleichzeitig die Biosynthese von Lipopolysacchariden (LPS) erheblich. Diese Modulationen waren wahrscheinlich verantwortlich für den verbesserten Lipidstoffwechsel und die verstärkte Darmschleimhautbarriere, was darauf hindeutet, dass Mikroalgenöl ein überlegenes Nahrungsergänzungsmittel zur Linderung von Fettleibigkeitwar.
Trotz der Fortschritte bei der Verbindung der Dysbiose der Darmmikrobiota mit der Entwicklung von MASLD sind die spezifischen Zusammenhänge zwischen mikrobieller Zusammensetzung, mikrobiellen Stoffwechselfunktionen und hepatischer Lipidstoffwechsel weiterhin unvollständig verstanden. Insbesondere sind die kausalen Zusammenhänge zwischen Veränderungen der Mikrobiota und dem Krankheitsverlauf weiterhin unklar, und ob diätäre Maßnahmen wie DHA-reiches Mikroalgenöl mit koordinierten Veränderungen in den Darmmikroorganismen und Stoffwechselprofilen des Wirts verbunden sind, wurde nicht systematisch untersucht. DHA-reiches Mikroalgenöl ist eine nachhaltige und effiziente Quelle für Omega-3-Fettsäuren mit einem DHA-reichen Mikroalgenölgehalt, der mit fischbasierten Nahrungsergänzungsmitteln vergleichbar ist. Frühere Studien haben nahegelegt, dass die Supplementierung von DHA-reichem Mikroalgenöl die Lebersteatose und die Stoffwechselparameterverbessern kann 18,19. Seine Zusammenhänge mit der Zusammensetzung der Darmmikrobiota und der mikrobiellen Stoffwechselfunktion im Zusammenhang mit MASLD bleiben jedoch unklar.
Daher wurde in dieser Studie ein fettreiches, von der Diät induziertes Mausmodell verwendet, um die Auswirkungen der DHA-reichen Mikroalgenöl-Supplementierung auf Stoffwechselparameter, Darmmikrobiota-Zusammensetzung und hepatische Metabolomprofile zu bewerten. Es wurde vermutet, dass die Supplementierung mit DHA-reichem Mikroalgenöl mit Verbesserungen des Leberlipidstoffwechsels und gleichzeitigen Veränderungen der Zusammensetzung der Darmmikrobiota und der mikrobiellen Stoffwechselwege in Verbindung stehen würde.
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Details zu allen Tieren, Futtermitteln, Reagenzien, Kits, Instrumenten, Software und Dienstleistern, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle. Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des National Institutes of Health (NIH) für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt und erhielten die Zustimmung des Experimental Animals Committee des Shandong Provincial Hospital (ethische Genehmigung Nr. 2022–007, genehmigt am 24. Januar 2022).
VORSICHT: Tierblut, Stuhlproben und Gewebe sollten als potenziell biologisch gefährliche Materialien behandelt werden. Alle Verfahren mit lebenden Tieren, biologischen Proben, scharfen Gegenständen, organischen Lösungsmitteln und chemischen Testreagenzien sollten gemäß den institutionellen Vorschriften zur Biosicherheit, Tierpflege und chemischer Sicherheit durchgeführt werden. Tierkadaver, Gewebe, blutkontaminierte Materialien und Kotproben sollten in ausgewiesenen Biohazard-Abfallbehältern gesammelt und über die institutionelle Tiereinrichtung oder das Biosicherheitsamt entsorgt werden. Nadeln, Gavage-Nadeln, Kapillarröhren und andere scharfe Gegenstände sollten sofort nach Verwendung in zugelassenen Schatzbehältern entsorgt werden. Organische Lösungsmittelabfälle, darunter Methanol, Acetonitril und Ameisensäurehaltige Lösungen, sollten in etikettierten chemischen Abfallbehältern gesammelt und im Rahmen des institutionellen Programms für gefährliche chemische Abfälle entsorgt werden. Abfälle aus biochemischen und oxidativen Stresstests sollten gemäß den Sicherheitsdatenblättern des Herstellers und den institutionellen Chemikaliensicherheitsregeln gesammelt und entsorgt werden.
Versuchstiere
Sechs Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse (n = 4 pro Gruppe) wurden unter spezifischen, pathogenfreien (SPF) Bedingungen mit einem 12-stündigen Hell/Dunkel-Zyklus bei 22 ± 2 °C und 50–60 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten. Die Tiere hatten ad libitum Zugang zu Futter und Wasser, mit maximal fünf Mäusen pro Käfig. Die Kontrollmäuse erhielten eine Standard-Chow-Diät mit 70 % Kohlenhydraten, 20 % Protein und 10 % Fett (kcal). Um das MASLD-Mausmodell zu etablieren, wurden die Mäuse 8 Wochen lang mit einer fettreichen Ernährung gefüttert, die 20 % Kohlenhydrate, 20 % Protein und 60 % Fett (kcal) enthielt. Alle Diäten wurden bei 4 °C gelagert und zweimal pro Woche nachgefüllt. Mäuse wurden mit einem Zufallszahlengenerator zufällig in experimentelle Gruppen eingeteilt, und die Stichprobengröße (n = 4 pro Gruppe) wurde auf Basis früherer Studien mit ähnlichen, fettreich induzierten Mausmodellen und vorläufigen Experimenten bestimmt. Alle Behandlungen wurden täglich zur gleichen Zeit verabreicht, um zirkadiane Schwankungen zu minimieren.
Mikroalgenöl wurde von der Shandong Academy of Agricultural Sciences gewonnen und gereinigt, mit einer Reinheit von etwa 99%. Das Mikroalgenöl wurde bei −30 °C vor Licht geschützt gelagert. Vor der Verabreichung wurde das Öl mit einem Emulgator vorbereitet und gründlich vermischt, um die Homogenität zu gewährleisten. Konkret wurde DHA-reiches Mikroalgenöl in sterilem 0,5 % Carboxymethylcellulose-Natrium mit 0,5 % Tween-80 in normaler Kochsalzlösung emulgiert. Das Mikroalgenöl und das Emulgator-Vehikel wurden im Verhältnis 1:9 (v/v) gemischt und unmittelbar vor dem Gavage 2 Minuten lang vortexiert, um eine gleichmäßige Aufhängung zu erzielen. Mäuse der mit Mikroalgen ölbehandelten Gruppe erhielten die Zubereitung einmal täglich durch orale Ernährung mit einer sterilen Futternadel bei einer Dosis von 10 μL/g Körpergewicht. Das Gavagevolumen wurde täglich an das Körpergewicht angepasst, um eine Dosiskonsistenz zu gewährleisten. Mäuse in der Kontrollgruppe erhielten unter denselben Bedingungen ein äquivalentes Volumen steriler normaler Kochsalzlösung. Die verwendete Kochsalzlösung war eine Injektion von 0,9 % Natriumchlorid.
Die probiotische Behandlung bestand aus einer zusammengesetzten Formulierung, die Lactobacillus plantarum (DY-1), Lactobacillus acidophilus (KDB-03), Lactobacillus casei (KDB-LC) und Bacillus coagulans (GIM 1.645) enthielt. Die vier Stämme wurden mit einem gleichwertigen Viable-Cell-Verhältnis von 1:1:1:1 gemischt. Jeder Stamm trug 2,5 × 107 CFU /mL zur endgültigen Formulierung bei, was eine Gesamtbakterienkonzentration von 1 × 108CFU /mL ergab. Die probiotische Mischung wurde von der Shandong Academy of Agricultural Sciences synthetisiert und ist nicht kommerziell erhältlich. Die probiotische Behandlung bestand aus einer zusammengesetzten probiotischen Fermentationsbrühe mit Lactobacillus plantarum DY-1, Lactobacillus acidophilus KDB-03, Lactobacillus casei KDB-LC und Bacillus coagulans GIM 1.645. Die bakterielle Konzentration der Formulierung betrug 1 × 108CFU /mL. Die probiotische Gärungsbrühe wurde vor der Verwendung bei 4 °C gelagert. Mäuse in der probiotikabehandelten Gruppe erhielten die probiotische Formulierung einmal täglich oral mit einer Dosis von 0,01 mL/g Körpergewicht während des gesamten Versuchszeitraums.
Einzelne Stämme wurden unter geeigneten Bedingungen kultiviert und in der mittleren Stockwachstumsphase (OD₆₀₀ ≈ 0,6) geerntet, anschließend im angegebenen Verhältnis kombiniert. Bakterienkulturen wurden zentrifugiert, um das Supernatant zu entfernen, und die Pellets wurden in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wieder suspendiert. Die frisch zubereitete bakterielle Suspension wurde vor der Verabreichung auf Eis gelegt, um die Lebensfähigkeit zu erhalten. Die endgültige Bakterienkonzentration wurde vor der Verabreichung auf 1 × 108 CFU /mL angepasst. Mäuse in der probiotischen Gruppe erhielten die Formulierung durch orale Gavage mit einer Dosis von 0,01 mL/g Körpergewicht einmal täglich während des gesamten Versuchszeitraums. Vor der Verabreichung von Probiotika wurde keine antibiotische Vorbehandlung angewendet. Um experimentelle Verzerrungen zu verringern, wurde die Outcome-Bewertung von verblindeten Forschern, wo angebracht, durchgeführt. MASLD wurde durch eine biochemische Blutanalyse bestätigt.
Blutanalyse
Am Ende des Versuchszeitraums wurden die Mäuse über Nacht (12 Stunden) nütternd und hatten vor der Glukosemessung und der Endblutentnahme freien Zugang zu Wasser. Die Mäuse wurden tief mit Isofluran und einem Anästhesieverdampfer betäubt, bis der Verlust des Pedalreflexes bestätigt wurde. Terminale Blutproben wurden durch retroorbitale Blutungen entnommen. Nach der Blutentnahme wurden die Mäuse durch eine zervikale Verrenkung unter Tiefnarkose eingeschläfert, und der Tod wurde durch Beatmungs- und Herzstillstand bestätigt. Das Blut wurde bei Raumtemperatur gerinnen und anschließend 10 Minuten lang bei 3.000 × g zentrifugiert, um Serum zu erhalten. Serumproben wurden aliquotiert und bis zur Analyse bei −80 °C gelagert. Serumglukose, Gesamtcholesterin (TC), Triglyzeride (TG), Low-Density Lipoprotein-Cholesterin (LDL-c), High-Density Lipoprotein-Cholesterin (HDL-c), Aspartat-Aminotransferase (AST) und Alaninaminotransferase (ALT) wurden mit einem automatischen biochemischen Analysator gemessen, der den Anweisungen des Herstellers folgte. Diese Parameter wurden mittels enzymatischer kolorimetrischer Tests quantifiziert, wobei Standardreagenzien-Kits in das Analysatorsystem integriert wurden. Alle biochemischen Parameter wurden auf das Serumvolumen normalisiert und in den vom Hersteller angegebenen Einheiten ausgedrückt.
Oxidative Stresstests
Biomarker für oxidativen Stress wurden mit Sets gemessen, darunter solche für Malondialdehyd, Superoxiddismutase und Katalase. Die Tests wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt wurden Lebergewebe in einem eiskalten Puffer homogenisiert und zentrifugiert, um Überstandsmittel für die Analyse zu gewinnen. Die Malondialdehydwerte (MDA) wurden mittels eines Thiobarbitursäure-Reaktivstofftests (TBARS) bestimmt; Die Aktivität der Superoxiddismutase (SOD) wurde anhand ihrer Fähigkeit gemessen, superoxidvermittelte Reaktionen zu hemmen; und die Katalase (CAT)-Aktivität wurde durch Überwachung der Zersetzungsrate von Wasserstoffperoxid quantifiziert. Die Messungen wurden mit einem Mikroplattenleser durchgeführt, und die Werte wurden anhand von Standardkurven oder den in den Bausätzen bereitgestellten Formeln berechnet. Die Marker für oxidativen Stress wurden auf das Lebergewebegewicht normalisiert und gemäß den Herstellerspezifikationen ausgedrückt.
16S rRNA-Sequenzierung und Mikrobiomanalyse
Am Ende der Versuchsphase wurden direkt von einzelnen Mäusen unter sterilen Bedingungen entnommen, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei −80 °C bis zur DNA-Extraktion gelagert. Mikrobielle DNA wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers mit einem kommerziellen Kit extrahiert. Die V3–V4-Region des bakteriellen 16S-rRNA-Gens wurde mit den Primern 341F/806R amplifiziert. Die PCR-Amplifikation erfolgte in einem 25-μL-Reaktionssystem, das Template-DNA, 2x PCR-Mastermix und 0,2 μM jedes Primers enthielt. Das Verstärkungsprogramm bestand aus einer anfänglichen Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 25 Zyklen mit 95 °C für 30 Sekunden, 55 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 45 Sekunden, mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 10 Minuten. Amplicon-Bibliotheken wurden auf einer Illumina MiSeq-Plattform mit einer gepaarten 2- × 250-bp-Strategie von einem kommerziellen Sequenzierungsdienstanbieter konstruiert und sequenziert. Die Bibliotheksqualität wurde vor der Sequenzierung bewertet, und Pool-Bibliotheken wurden mit der vom Hersteller empfohlenen Clusterdichte geladen. Minderwertige Lektüren mit mehrdeutigen Basis, unzureichender Länge oder einem durchschnittlichen Qualitätswert unter Q20 wurden vor der nachfolgenden Analyse entfernt.
Roh-Sequenzierungslesungen wurden mit QIIME 2 Version 2019.420 verarbeitet. Kurz gesagt wurden gepaarte Endlesungen mit DADA2 mit Standardparametern demultiplexiert, qualitätsgefiltert, entrauscht, zusammengeführt und chimäre-gefiltert. Nicht-Einzelton-Amplikon-Sequenzvarianten (ASVs) wurden für die nachgelagerte Analyse beibehalten. Die taxonomische Zuweisung erfolgte mit der Greengenes-Datenbank Version 13_8, implementiert in QIIME221. Angesichts der inhärenten Auflösungsbeschränkungen der 16S-rRNA-Gensequenzierung, insbesondere bei Verwendung der Greengenes-Datenbank, wurden taxonomische Annotationen ausschließlich auf Gattungsebene interpretiert. Die Klassifikation auf Artebene galt nicht als zuverlässig und wurde daher weder in nachgelagerten Analysen, statistischen Vergleichen noch biologischen Interpretationen verwendet. Alle mikrobiellen Merkmale wurden vor der Visualisierung und Analyse auf Gattungsebene kollabiert.
Alpha-Diversitätsmetriken (Chao1, Beobachtete Arten, Shannon, Simpson, Faiths PD und Pielous Gleichheit) wurden verwendet. Statistische Vergleiche der Alpha-Diversität zwischen Gruppen wurden mit geeigneten nichtparametrischen Tests (z. B. Kruskal–Wallis-Test) durchgeführt. Die Jaccard-Distanz und die Bray-Curtis-Unterschiede wurden als Beta-Diversitätsmetriken verwendet. Principal Coordinate Analysis (PCoA)-Plots, nicht-metrische multidimensionale Skalierung (NMDS) und lineare Diskriminantenanalyse-Effektgröße (LEfSe) wurden verwendet, um Veränderungen in Mikrobiom-Gemeinschaften mit einem LDA-Schwellenwert von 2,0 zu illustrieren. Permutationale multivariate Varianzanalyse (PERMANOVA) wurde verwendet, um die statistische Signifikanz der Beta-Diversität zu bewerten. Datenvisualisierung und statistische Analysen wurden mit der GenesCloud-Plattform (https://www.genescloud.cn) durchgeführt.
Mikrobielle funktionelle Profile wurden aus 16S-rRNA-Sequenzierungsdaten abgeleitet, anstatt direkt durch Shotgun-Metagenom- oder Transkriptomsequenzierung gemessen zu werden. Basierend auf der normalisierten Signalweg- oder funktionalen Gruppen-Häufigkeitstabelle wurden vorhergesagte funktionale Einheiten in häufig verwendete Datenbanken wie KEGG, MetaCyc und COG abgebildet. Die Häufigkeit der KEGG-Signalwege wurde anhand seiner hierarchischen funktionalen Kategorien zusammengefasst, wobei Level-2-Pfadklassifikationen für den nachgelagerten Vergleich verwendet wurden. Die durchschnittliche Häufigkeit jeder Pfadkategorie wurde mit R-Software berechnet.
Untargeted Metabolomics-Analyse von Leberproben
Lebergewebe wurden unmittelbar nach der Todesbestätigung schnell entfernt, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und vor der Analyse bei −80 °C gelagert. Ungefähr 50 mg gefrorenes Lebergewebe wurden in eiskalten Methanol homogenisiert: Wasser (4:1, v/v) ergänzt mit internen Standards. Das Gewebe-zu-Extraktionslösungsmittel-Verhältnis betrug 1:10 (w/v). Die Proben wurden für 1 Minute vortexiert, 10 Minuten auf Eis soniziert und dann 30 Minuten bei −20 °C inkubiert, um die Proteinausschlagzeit zu verbessern. Die Homogenate wurden gründlich vermischt, auf Eis Sonikation unterzogen und bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Die Supernatanten wurden sorgfältig gesammelt, unter einem milden Stickstofffluss verdampft und zu 50 % Methanol für die spätere Analyse rekonstituiert.
Qualitätskontrollproben (QC) wurden durch das Poolen gleicher Mengen jeder Probe erzeugt und während des gesamten Laufs intermittierend analysiert, um die analytische Stabilität und Reproduzierbarkeit zu bewerten. Die ungezielte Metabolomik-Analyse wurde mit einem ultra-leistungsstarken Flüssigkeitschromatographiesystem durchgeführt, das mit hochauflösender Massenspektrometrie gekoppelt wurde und von einem kommerziellen Dienstleister betrieben wurde. Die Metaboliten wurden in einer Umkehrphasen-C18-Säule mit einem binären Lösungsmittelsystem getrennt, das aus Wasser mit 0,1 % Ameisensäure und Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure bestand. Das Einspritzvolumen betrug 2 μL, die Säulentemperatur wurde bei 40 °C gehalten und der Durchfluss auf 0,30 mL/min eingestellt. Ein Gradienten-Elutionsprogramm wurde verwendet, um eine breite Metabolitentrennung zu erreichen. Die massenspektrometrische Detektion erfolgte sowohl im positiven als auch im negativen Elektrospray-Ionisationsmodus über einen m/z-Bereich von 70–1.000, um eine breite Metabolitenabdeckung zu erreichen. Die Ionensprühspannung wurde im positiven Modus auf 3,5 kV und im negativen Modus −2,5 kV eingestellt. Die Kapillartemperatur wurde bei 320 °C gehalten, und die Daten wurden im Full-Scan-MS-Modus mit datenabhängiger MS/MS-Erfassung für die Metabolitenannotation erhoben. Rohdaten wurden mit spezieller Metabolomik-Software (MassLynx v4.1) für Merkmalserkennung, Ausrichtung und Normalisierung verarbeitet. Die Identifikation von Metaboliten erfolgte auf Grundlage genauer Masse, Retentionszeit und MS/MS-Fragmentierungsmustern im Vergleich mit öffentlichen Datenbanken, darunter die Human Metabolome Database (HMDB) und die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (v2023), wo zutreffend.
Multivariate und Weganalyse
Verarbeitete Metabolomik-Daten wurden multivariaten statistischen Analysen unterzogen, darunter Hauptkomponentenanalyse (PCA) und partielle Kleinste-Quadrat-Diskriminantenanalyse (PLS-DA), um metabolische Unterschiede zwischen experimentellen Gruppen zu visualisieren. Differenzielle Metaboliten wurden anhand einer Kombination aus variabler Bedeutung in der Projektion (VIP) (>1,0) und statistischer Signifikanz (S. < 0,05) identifiziert. Identifizierte Metaboliten wurden mithilfe der KEGG-Anreicherungsanalyse weiter auf metabolische Signalwege abgebildet, um biologische Prozesse zu klären, die mit der Supplementierung von DHA-reichem Mikroalgenöl verbunden sind.
Statistische Analyse
Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM präsentiert und mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, gefolgt vom Tukey-Mehrfachvergleichstest. Die statistische Signifikanz wurde als p < 0,05 definiert. Die Anreicherungsanalyse der Lebermetaboliten wurde mit R (Version 4.4.1) durchgeführt. Paarweise Assoziationen zwischen mikrobiellen Gattungen und Lebermetaboliten wurden anhand von Spearman-Rangkorrelationen analysiert. Nur signifikante Korrelationen (Falschentdeckungsrate, FDR < 0,05) mit |ρ| ≥ 0,6 wurden in die integrativen Netzwerkanalysen einbezogen. Die Datenverarbeitung von Mikrobiom und Metabolomik erfolgte wie oben beschrieben, einschließlich der Nutzung der GenesCloud-Plattform und der Qualitätskontrollverfahren.
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DHA-reiches Mikroalgenöl verbessert den Lipidstoffwechsel, Leberschäden und den hepatischen oxidativen Stress bei HFD-induzierten MASLD-Mäusen
Um die Wirkung von Nahrungsergänzungsmitteln auf die Glukose- und Lipidhomöostase zu bewerten, wurden biochemische Parameter in fünf Gruppen bewertet: reguläres Chow (RC), fettreiche Diät (HFD), DHA-reiches Mikroalgenöl-supplementiertes, probiotika-supplementiertes und kombiniertes DHA-reiches Mikroalge...
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In den letzten Jahren haben mehrere Studien Veränderungen im mit MASLD verbundenen Mikrobiom untersucht. Die meisten dieser Studien konzentrieren sich jedoch darauf, gesunde Personen mit MASLD-Patienten zu vergleichen oder verschiedene Steatose-Grade24 zu untersuchen. Daher gibt es weiterhin begrenzte Belege für die spezifischen Veränderungen der Darmmikrobiota, die mit Leberfibrose bei MASLD in Verbindung stehen, obwohl Fibrose der wichtigste Faktor bei der Vorhe...
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Diese Forschung wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Technologie ("National Key R&D Program of China" Nr. 2021YFA0702100, 2022YFE0132200) und dem Modern Agricultural Technology Industry System der Provinz Shandong, China (Fördernummer: SDAIT-26), finanziert.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2x PCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japan | RR902A | Verwendet für die 16S rRNA-PCR-Amplifikation |
| Acetonitril | Merck, Deutschland | 100030 | Lösungsmittel, das für die UHPLC-Mobilphase verwendet wird |
| Anästhesie-Verdampfer | RWD Life Science | R580 | Wird verwendet, um Isoflurananästhesie an Mäuse zu verabreichen. |
| Automatischer biochemischer Analysator | Jian Cheng Institut für Biologische Ingenieurwesen, Nanjing, China | A110-1 & A111-1 | Misst Serumparameter (Glukose, TC, TG, LDL-c, HDL-c, AST, ALT) und Leberlipidwerte |
| Bacillus coagulans (GIM 1,645) | Guangdong Mikrobielle Kultursammlungszentrum, China | GIM 1.645 | Bestandteil der probiotischen Formulierung |
| Carboxymethylcellulose-Natrium (CMC-Na) | Sigma-Aldrich, USA | C4888 | Verwendet als Emulgator-Komponente für die Herstellung von DHA-reichem Mikroalgenöl |
| Catalase (CAT) Testkit | Nanjing Construction Ltd. | A007-1-1 | Erkennt CAT-Aktivität (ein Indikator für die antioxidative Kapazität) im Lebergewebe |
| DADA2-Softwarepaket | DADA2-Entwicklungsteam | Enthalten in QIIME 2 v2019.4 | Verwendet zum Denoisieren und Chimärenfiltern von Sequenzlesungen |
| DHA-reiches Mikroalgenöl (Schizochytrium sp.-abgeleitet) | - | - | Reich an Dokosahexaensäure (DHA); täglich durch Gavage bei 10&Micro verabreicht; L/g als experimentelle Intervention |
| Versuchstiere (männliche C57BL/6J-Mäuse) | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | - | 6 Wochen alt, n = 4 pro Gruppe; verwendet zur Etablierung des MASLD-Modells mittels HFD-Zuführung |
| Ameisensäure | Sigma-Aldrich, USA | F0507 | Mobilphasenadditiv für die Analyse der Metabolomik |
| Greengenes-Datenbank | Greengenes | Version 13_8 | Verwendung für mikrobielle taxonomische Zuweisungen |
| Fettreiche Diät (HFD) | Research Diets Inc., USA | D12492 | Bestehend aus 20 % Kohlenhydraten, 20 % Eiweiß, 60 % Fett (kcal); Er wurde 8 Wochen lang gefüttert, um MASLD einzuleiten, |
| Hochauflösendes Massenspektrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | Q Exaktiver Orbitrap | Verwendet zur Metabolitendetektion in positiven und negativen Ionenmodi |
| Humane Metabolom-Datenbank (HMDB) | Universität von Alberta, Kanada | Veröffentlichung 2024 | Öffentliche Datenbank zur Metabolitenannotation |
| Illumina MiSeq-Plattform | Illumina, Inc., USA | MiSeq-System | Verwendet für paarweise 2 &-Zeiten; 250-bp-Sequenzierung |
| Isoflurane | Merck, Deutschland | PHR2874 | Verwendet zur Inhalationsanästhesie bei Mäusen |
| Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome (KEGG) | Kanehisa Laboratories, Japan | Version 2023 | Datenbank, die für die Anreicherung von Signalwegen und zur Annotation von Metaboliten verwendet wird |
| Lactobacillus acidophilus (KDB-03) | Shandong Akademie für Agrarwissenschaften, China | - | Bestandteil der probiotischen Formulierung |
| Lactobacillus casei (KDB-LC) | Shandong Akademie für Agrarwissenschaften, China | - | Bestandteil der probiotischen Formulierung |
| Lactobacillus plantarum (DY-1) | Shandong Akademie für Agrarwissenschaften, China | - | Bestandteil der probiotischen Formulierung |
| Flüssiger Stickstoff | Air Liquide | - | Verwendet zum Schnelleinfrieren und zur Konservierung von Stuhl- und Leberproben |
| Malondialdehyd (MDA) Testkit | Nanjing Construction Ltd. | A003-1 | Erkennt MDA (ein Marker für Lipidperoxidation/oxidative Schädigung) im Lebergewebe |
| MassLynx-Software | Waters Corporation, USA | Version 4.1 | Verwendet für Metabolomics-Rohdatenverarbeitung, Merkmalsextraktion und Normalisierung |
| Methanol | Merck, Deutschland | 106035 | Lösungsmittel zur Metabolitextraktion verwendet |
| Mikrobiom-Datenanalyseplattform | Genescloud | V1 | Online-Plattform: https://www.genescloud.cn/home; verwendet für PCoA-, NMDS-, LEfSe- und andere Mikrobiom-Visualisierungsanalysen |
| OMEGA Boden-DNA-Kit | Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) | (M5635-02) | DNA-Isolierung |
| OTUs referenzfolgen | Genescloud | Zitiert aus McDonald et al. 2012; verwendet für die taxonomische Zuweisung von Amplicon-Sequenz-Varianten (ASVs) | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA | 10010023 | Verwendet zur Wiederaufsetzung von bakteriellen Pellets |
| Primer 341F/806R | Tsingke Biotechnology Co., Ltd., China | - | Zur Amplifikation der 16S rRNA V3 verwendet; V4-Region. 341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′; 806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′ |
| Probiotika | - | - | Spezifische Stämme, die nicht explizit genannt werden; Verwendet als vergleichende Intervention (verbessert hauptsächlich die Glukosehomöostase) |
| QIIME 2 Software | - | 2019.4 | Verwendet für die bioinformatische Analyse des Mikrobioms (ASV-Verarbeitung, Berechnung der Alpha/Beta-Diversität) |
| R-Software | - | 4.4.1 | Verwendet für die Analyse der Lebermetabolitenanreicherung und die Spearman-Korrelationsanalyse mikrobieller Metaboliten-Assoziationen |
| Gekühlte Zentrifuge | Eppendorf, Deutschland | 5810R | Verwendet für die Zentrifugation von Serum- und Metabolomikproben |
| Umgekehrte Phase C18-Spalte | Waters Corporation, USA | 186002350 | Verwendet zur chromatographischen Trennung von Metaboliten |
| Kochsalzlösung | Shijiazhuang Nr. 4 Pharma | 2211112304 | Täglich per Gavage an die Kontrollgruppe verabreicht (im Gegensatz zur Behandlung mit Mikroalgenöl) |
| Standard-Chow-Diät | Keao Xieli Feed Ltd., China | 1016706714625204224 | Bestehend aus 70 % Kohlenhydraten, 20 % Eiweiß, 10 % Fett (kcal); an die Kontrollgruppe (RC) weitergegeben |
| Sterile Futternadel | Instech Laboratories, USA | FTP-20-38 | Verwendung zur oralen Gavage-Verabreichung |
| Superoxiddismutase (SOD) Testkit | Nanjing Construction Ltd. | A001-3 | Erkennt SOD-Aktivität (ein Indikator für die antioxidative Kapazität) im Lebergewebe |
| Tween-80 | Sigma-Aldrich, USA | P4780 | Verwendet als Emulgator-Komponente für die Herstellung von DHA-reichem Mikroalgenöl |
| Ultraschallhomogenisator | Scientz Biotechnologie, China | JY92-IIN | Verwendet zur Lebergewebe-Sonikation während der Extraktion des Metaboliten. |
| Ungezielte hepatische Metabolomik | Metabo-Profile Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | Projektcode: P035Y23A13_SFMU_MJWang_SH | |
| Vortex-Mixer | Thermo Fisher Scientific, USA | LP Vortex Mixer | Verwendet zur Probenhomogenisierung und Emulgierung |
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