Protokoll zur Differenzierung pluripotenter Stammzellen in primordiale Keimzellen-ähnliche Zellen

Summary

Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Erzeugung primordialer Keimzellen-ähnlicher Zellen aus menscheninduzierten pluripotenten Stammzellen auf robuste Weise mittels einer 2D-Monoschicht-basierten Methode mit Basalmembranextrakt-Überlagerung.

Abstract

Die Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in vitro hat das Verständnis von Linienspezifikationsereignissen, die während der frühen Entwicklung in vivo auftreten, erheblich erweitert – eine Phase, die äußerst schwer zu untersuchen ist. Eine der ersten embryonalen Linien, die im menschlichen Embryo spezifiziert wurden, ist die Keimzelllinie, gekennzeichnet durch die Induktion der primordialen Keimzellen (PGCs). Die PGCs sind die einzige Gründerpopulation der Gameten im späteren Leben, und ihre Spezifizierung ist ein entscheidender erster Schritt zur Fruchtbarkeit des Organismus. Hier wird ein robustes Protokoll zur Erzeugung von PGC-ähnlichen Zellen (PGCLCs) aus menschlich induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) beschrieben, beginnend mit der ersten Bewertung des pluripotenten Zustands und zellulärer Eigenschaften der hiPSCs, um eine effektive PGCLC-Differenzierung sicherzustellen. Dafür werden die Effekte verschiedener Zelldichten, Plattenbeschichtungen und hiPSCs für die PGCLC-Differenzierung diskutiert. Schließlich wird ein Workflow zur Charakterisierung und Quantifizierung von hPGCLCs unter Verwendung von Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie bereitgestellt. Das Differenzierungsprotokoll konzentriert sich auf Bedingungen, die in den meisten Laboren leicht zu etablieren und zu testen sind und bei Bedarf angepasst werden können. Darüber hinaus ist dieses Protokoll schnell und ermöglicht die Feststellung, ob hiPSCs für die PGCLC-Differenzierung geeignet sind. Das Protokoll zielt darauf ab, Konsistenz und Kompatibilität bei hPGCLC-Ergebnissen über verschiedene hiPSC-Linien und Kulturplattformen hinweg zu fördern, um robuste Erträge zu gewährleisten, die eine zuverlässige Charakterisierung und weitere Optimierung der nachgelagerten Differenzierungsschritte für eine erfolgreiche In-vitro-Gametogenese beim Menschen unterstützen.

Introduction

Die Entwicklung der menschlichen Keimbahn ist ein hochkoordinierter Prozess, der früh in der embryonalen Entwicklung beginnt und mit der Spezifikation der primordialen Keimzellen (PGCs) beginnt, der Population, die letztlich Eizellen und^Spermien hervorbringt. In vivo erfolgt die PGC-Spezifikation kurz nach der Implantation ^2,3 als Reaktion auf induktive Signale benachbarter^{Zellen 4,5}. Die Entwicklung von PGCs wurde bei Nagetieren umfassend untersucht, insbesondere durch genetische Studien, die die Beteiligung von Signalwegen wie BMP, WNT und TGFβ 6,7,8,9 nachgewiesen haben. Nach der Spezifikation werden die PGCs epigenetisch umprogrammiert, gekennzeichnet durch genomweite DNA-Demethylierung und Chromatin-Remodellierung, um später die (geschlechtsspezifische) Keimbahnidentität 10,11,12,13,14 zu etablieren.

Bei Säugetieren wird die PGC-Spezifikation durch koordinierte Kreuzgespräche zwischen Signalwegen bestimmt, und einige Aspekte sind evolutionär bei Menschen, nicht-menschlichen Primaten, Schweinen und Mäusen konserviert, einschließlich der Beteiligung von Pluripotenzfaktoren wie POU5F1 und NANOG 9,15,16,17,18 . Trotz gemeinsamer Merkmale begrenzen artspezifische Unterschiede in PGC-Differenzierungsmechanismen und Genregulationsnetzwerken die direkte Übersetzung von Tiermodellen zum Menschen 9,19,20,21.

Um die Gametogenese beim Menschen zu verstehen, sind Studien mit menschlichem Material notwendig, aber sie bleiben aufgrund des begrenzten Zugangs zu frühen menschlichen Embryonen schwierig. Kontinuierliche Fortschritte bei Protokollen, die die in vitro Differenzierung menschlicher primordialer Keimzellähnlicher Zellen (hPGCLCs) aus humanen pluripotenten Stammzellen ermöglichen, wie induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs), haben die Abhängigkeit vom menschlichen Gonadengewebe reduziert und gleichzeitig Upscaling und genetische^{Studien ermöglicht.} Die meisten etablierten Strategien zur hPGCLC-Differenzierung basieren auf dreidimensionalen (3D) Aggregaten oder embryonalen Körpern¹⁸. Mit diesen Plattformen haben mehrere Studien gezeigt, dass hPGCLCs wichtige epigenetische Merkmale früher menschlicher PGCs rekapitulieren, darunter Keimbahn-Transkriptionsprogramme^23,24 und genomweite DNA-Methylierungs-Reprogrammierung²⁵. Zusammen haben diese In-vitro-Plattformen das Wissen über die menschliche PGC-Biologie erheblich erweitert, einschließlich der Linienbindung und epigenetischer Neusetzung. Allerdings bleiben aggregationsbasierte hPGCLC-Differenzierungsprotokolle eine Herausforderung, da sie zeitaufwendig sind und die Gesamterträge von hPGCLCs für robuste epigenetische Charakterisierung, weitere Differenzierungstests oder den Einsatz in Hochdurchsatz-Experimenten weiterhin gering bleibt.

Kürzlich erwies sich eine 2D-monoschichtbasierte Feeder-freie Methode mit verdünntem Basalmembranextrakt (BMEx) in Kombination mit niedrigen BMP4-Werten zur Differenzierung von hiPSCs in hPGCLCs als relativ einfach in Gewebekulturplatten zu skalieren und erzielte innerhalb eines kurzen Differenzierungsfensters (5 ^{Tage) hohe} Effizienzen (~55 %). Im Vergleich zu anderen 2D-Systemen, die vor der Induktion einen zwischenliegenden Activin-A-Priming-Schritt benötigten und höhere BMP4-Konzentrationen (40–50 ng/mL)^27,28 verwendeten, erforderte dieser BMEx-Ansatz keinen Vor-Induktionsschritt und verwendete niedrigere BMP4-Werte (10 ng/mL), während eine vergleichbare Effizienz und verbesserte Skalierbarkeit erhalten blieben.

Hier wird ein detaillierter, schrittweiser Leitfaden zum 2D hPGCLC BMEx-Differenzierungsprotokoll bereitgestellt, beginnend mit der ersten Bewertung der hiPSC-Erhaltung, einschließlich Pluripotenz und zellulärer Eigenschaften, gefolgt von Tests der Auswirkungen verschiedener hiPSC-Plattenbeschichtungen und Zelldichten auf die hPGCLC-Differenzierung. Außerdem wird die nachgelagerte Charakterisierung durch Durchflusszytometrieanalyse und Immunfluoreszenz beschrieben. Kritische Handlingspunkte und Hinweise zur Fehlersuche zur Reduzierung von Laborabweichungen werden bereitgestellt, sodass Forscher die hPGCLC-Differenzierung in diesem 2D-Format konsistent reproduzieren können.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien und Vorschriften des Universitätsmedizinischen Zentrums Leiden (LUMC), der LUMC Biobank & Biomaterials (TCBio) und des LUMC Leiden hiPSC Center (unter BB24.037). Alle Materialien und männlichen (XY) HiPSC-Leitungen (M54 und M199), die in diesem Protokoll verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Alle Gewebekulturverfahren wurden in einem speziellen Biosicherheits-Level-2-Gewebekulturraum durchgeführt, der mit einem befeuchteten normoxischen Inkubator (37 °C, 5 %_CO2), einer Mehrzweck-Zentrifuge (Swing-Bucket-Rotor) und einem Biosicherheitsschrank der Klasse II mit Stereomikroskop ausgestattet war.

VORSICHT: Nicht alle hiPSC-Linien lassen sich in hPGCLCs^26,29 unterscheiden. Wenn jedoch andere hiPSCs für die PGCLC-Differenzierung verwendet und PGCLCs beobachtet wurden, ermöglicht die hier beschriebene Methode (Abbildung 1A) eine Skalierung der hPGCLC-Produktion.

1. Beschichtung von Gewebekulturplatten für hiPSC-Kultur

Dieses Protokoll beschreibt die Beschichtung von Gewebekulturplatten sowohl mit verdünntem BMEx als auch mit Vitronectin.

1. Basalmembranextrakt-(BMEx)-Beschichtung
   1. Taue ein Aliquot von BMEx auf Eis auf. Das kann Geltrex, Cultrex oder Matrigel sein.
   2. Verdünnen Sie den Aliquot des Basalmembranextrakts in kaltem DMEM/F12 auf eine Endkonzentration von 1 % (v/v) und lassen Sie es sanft wieder suspendieren.
   3. Schichten Sie die gewünschte Anzahl von Bohrungen einer 6-Bohrloch-Platte mit 1 mL des verdünnten BMEx pro Bohrloch.
   4. Inkubieren Sie die beschichtete Platte mindestens 30 Minuten bei 37 °C.
      HINWEIS: Beschichtete Platten können bis zu einer Woche bei 2–8 °C gelagert werden. Bei Verwendung von beschichteten Platten, die bei 2–8 °C gelagert werden, sollte die Platte mindestens 10 Minuten bei 37 °C inkubiert werden, bevor sie sie weiter verwendet.
2. Vitronektin-Beschichtung
   1. Ein Aliquot Vitronektin bei Raumtemperatur (RT) 10–15 Minuten auftauen.
   2. Verdünne Vitronectin auf eine Endkonzentration von 5 μg/mL in DPBS ohne Kalzium und Magnesium (DPBS -/-) und lasse es vorsichtig wieder suspendieren.
   3. Beschichten Sie die Anzahl der gewünschten Bohrungen einer 6-Well-Platte mit 1 ml des verdünnten Vitronectins pro Bohrloch.
   4. Inkubieren Sie die beschichtete 6-Well-Platte 1 Stunde lang bei RT.

2. Verabschiedung zur Aufrechterhaltung von hiPSCs

1. Bereite Kulturmedium vor: serumfreies Zellkulturmedium mTeSR Plus, ergänzt mit Mycoplasma-Kontaminationspräventionslösung (MycoZap (1:1000)).
2. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Zellen, die bereit zum Durchführen sind.
3. Fügen Sie 0,5 ml menschliches PSC-Selektions- und Passage-Mittel (ReLeSR) zu jedem Bohrloch hinzu und aspirieren Sie dieses innerhalb von 1 Minute. Achte darauf, dass eine sehr dünne Schicht auf den Zellen bleibt.
4. Inkubieren Sie die Zellen 6 Minuten bei 37 °C.
5. Klopfen Sie ein paar Mal auf die Seiten der 6-Well-Platte.
6. Lösen Sie die Zellen vorsichtig mit einem 1-mL-Kulturmedium ab, indem Sie mit einer P1000-Pipette auf und ab pipettieren, und überprüfen Sie regelmäßig die Größe der Koloniefragmente, um ihre Größe zwischen 50–200 μm zu halten.
7. Nehmen Sie die vorbeschichteten 6-Well-Platten und entfernen Sie die Beschichtungslösung (Schritt 1).
8. Füge jedem Brunnen 2 ml Kulturmedium hinzu.
9. Übertragen Sie das Kulturmedium, das die abgetrennten hiPSCs-Koloniefragmente enthält, im gewünschten Verhältnis in den neuen Brunnen.
   HINWEIS: Das ideale Verhältnis zur Aufteilung von hiPSC-Koloniefragmenten beträgt 1:6–1:50, was eine Passaging alle 4–7 Tage ermöglicht.
10. Platzieren Sie die Zellkulturplatte zusammen mit den durchgeführten hiPSC-Koloniefragmenten in einen befeuchteten normoxischen Inkubator (37 °C, 5 % CO2_).
11. Erneuere das Kulturmedium jeden zweiten Tag mit 2 ml Kulturmedium, bis die HiPSCs erneut passierbar sind.
    HINWEIS: Fügen Sie jedem 6-Brunnen 4 ml Kulturmedium statt 2 ml Kultur Medium hinzu, um eine Auffrischung am Wochenende zu vermeiden.
    VORSICHT: Geben Sie keine HiPSCs durch, wenn die Konfluenz zu niedrig ist, und verwerfen Sie die Kultur, wenn die Konfluenz zu hoch ist, um eine gesunde HiPSC-Kultur zu erhalten und spontane Differenzierung zu vermeiden.

3. hPGCLC-Differenzierung

1. Vorbereitung vor der hPGCLC-Differenzierung (Tag 0).
   1. Erneuere das Kulturmedium der hiPSCs 1 Stunde vor Beginn der hPGCLC-Differenzierung.
   2. Bereite die Beschichtungslösung vor: 1 % BMEx-Lösung, verdünnt v/v in kaltem DMEM/F12.
   3. Schichten Sie die gewünschte Anzahl von Brunnen einer 12-Bohrloch-Platte mit 0,5 mL Beschichtungslösung.
   4. Inkubieren Sie die beschichtete Platte mindestens 30 Minuten bei 37 °C, bevor Sie mit der Differenzierung beginnen.
   5. Bereiten Sie das Beschichtungsmedium vor: 2 % (v/v) BMEx-Lösung in kaltem Kulturmedium und ergänzen Sie dies mit einem Nach-Tau-Wiederherstellungsmedium (RevitaCell) (1:100).
      VORSICHT: Lassen Sie das Beschichtungsmedium während der Vorbereitung und Beschichtung der HiPSCs auf Eis.
2. hiPSCs-Beschichtung für hPGCLC-Differenzierung (Tag 0).
   1. Entfernen Sie das Kulturmedium aus dem 6-Well, das die hiPSCs enthält, um es zur hPGCLC-Differenzierung zu verwenden. Beginnen Sie mit hochwertigen HiPSCs bei 50–80 % Konfluenz, ohne Anzeichen spontaner Differenzierung.
   2. Fügen Sie pro Welle 1 ml Trypsinlösung (TrypLE) hinzu.
   3. HiPSCs 5 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
   4. Stellen Sie eine Einzelzell-Suspension her, indem Sie die hiPSC-Kolonien vorsichtig 2–3 Mal mit einer p1000-Pipette neu suspendieren.
   5. Überprüfen Sie unter einem invertierten Mikroskop, ob eine Einzelzellensuspension erhalten wird. Falls nicht, suspendieren Sie die hiPSC-Kolonien noch einmal 1–2 Mal mit einer p1000-Pipette erneut.
   6. Übertragen Sie die hiPSC-Zellsuspension auf ein 15-ml-Rohr.
   7. Füge dem 15-mL-Rohr 4 mL DMEM-F12 Medium hinzu.
   8. Zentrifugiere die hiPSC-Zellensuspension bei 200 x g für 5 Minuten.
   9. Aspiratieren Sie das Supernatant und suspendieren Sie die hiPSC-Zellen vorsichtig in 0,5–1,0 mL Beschichtungsmedium.
   10. Zählen Sie die Anzahl der hiPSCs mit einem Zellzähler oder Hämozytometer und berechnen Sie die Anzahl der hiPSCs, die pro Bohrloch für die hPGCLC-Differenzierung benötigt werden.
       HINWEIS: Als Ausgangspunkt kann eine Beschichtungsdichte von 40–80K Zellen/cm^² verwendet werden. Für jede Zelllinie und bei jeder Durchgangszahl wird jedoch eine Optimierung der Beschichtungsdichte empfohlen, um einen optimalen Ertrag zu erzielen. Hier wurden hiPSCs mit einer Beschichtungsdichte von 10K bis 100K Zellen/cm^² plattiert.
   11. Setzen Sie sorgfältig die erforderliche Anzahl von HiPSCs im entsprechenden Volumen des Beschichtungsmediums (1 ml pro Bohrloch einer 12-Well-Platte) wieder auf und stellen Sie sicher, dass mit einer p1000-Pipette eine homogene Zellsuspension erhalten wird.
   12. Nimm die beschichtete 12-Well-Platte aus dem Inkubator und entferne die Beschichtungslösung.
   13. Fügen Sie jedem Brunnen einer 12-Well-Platte 1 ml Zellsuspension hinzu.
   14. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig im Brunnen verteilt sind.
   15. Stellen Sie die 12-Well-Platte für 16–24 Stunden in einen befeuchteten, normoxischen Brutkasten (37 °C, 5 % CO2_).
3. hPGCLC-Differenzierung (Tag 1–2)
   1. Bereite RB27-Basalmedium vor: fortgeschrittene RPMI160 mit B-27 (1:100), 1x Aminosäureersatz (Glutamax), 1x MEM-nicht-essentielle Aminosäuren und Mycoplasma-Kontaminationspräventionslösung (1:1000).
   2. Vorbereitung des Differenzierungsmediums: 2% (v/v) BMEx-Lösung in kaltem RB27-Basalmedium und Zugabe von BMP4 zu einer Endkonzentration von 10 ng/mL. Der Basalmembranextrakt ist erforderlich, um die Lumenogenese zu induzieren und die PGCLC-Spezifikation in vivo auszulösen.
      VORSICHT: Halten Sie das Differenzierungsmedium auf Eis oder bei 4 °C. Das Differenzierungsmedium kann für die Tage 1 und 2 des Differenzierungsprotokolls vorbereitet werden.
   3. Am ersten Tag (innerhalb von 16–24 Stunden nach dem Anrichten der hiPSCs) nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und entfernen Sie das Plattenmedium.
   4. Wasche die Brunnen, indem du pro Bohrloch 0,5 ml RB27 Basalmedium hinzufügst.
   5. Aspirieren Sie das RB27-Basalmedium und fügen Sie pro Bohrloch 1 ml Differenzierungsmedium hinzu.
   6. Stellen Sie die Platte mit den Zellen zurück in den befeuchteten normoxischen Inkubator (37 °C, 5 %_CO2).
   7. Am zweiten Tag der Differenzierung werden die Zellen mit 1 ml Differenzierungsmedium pro Brunnen erfrischt.
4. hPGCLC-Differenzierung (Tag 3–5)
   1. Bereite Schaltmedium vor: RB27 Basalmedium, ergänzt mit BMP4 (10 ng/mL), LIF (10 ng/mL), SCF (50 ng/mL) und EGF (50 ng/mL). Switch Medium spiegelt den in vivo Wandel von der hPGC-Spezifikation hin zu Überleben und Proliferation wider. BMEx wird weggelassen, da Lumenogenese nicht mehr notwendig ist.
   2. An Tag 3 und Tag 4 erfrischen Sie jeden Brunnen mit 1 mL Switch Medium.
   3. Am Tag 5 der Differenzierung können die hPGCLCs mittels Immunfluoreszenz oder Flusszytometrie charakterisiert werden.

4. Charakterisierung von hPGCLCs mittels Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

1. Charakterisierung mittels Immunfluoreszenz.
   1. Bereite Permeabilisierungslösung vor: 0,3 % Triton X-100, verdünnt in PBS.
   2. Waschlösung vorbereiten: 0,05 % Tween 20 in PBS (PBST)
   3. Bereite Blockierungslösung vor: 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBST.
   4. Entfernen Sie das Schaltmedium aus den für die hPGCLC-Differenzierung verwendeten Brunnen.
   5. Waschen Sie die Zellen mit 1 mL pro Brunnen DPBS (-/-).
   6. Cellen mit 1 ml pro Brunnen 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 Minuten bei RT fixieren.
   7. Wasche die Zellen dreimal für 5 Minuten mit PBS und verwende 1 ml pro Brunnen.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können Platten bei 4 °C vor Beginn der Immunfluoreszenz gelagert werden.
   8. Permeabilisieren Sie die Zellen mit Permeabilisierungslösung für 15 Minuten bei RT, wobei 1 ml pro Bohrloch verwendet wird.
   9. Wasche die Zellen 3 Mal für 5 Minuten mit Waschlösung, verwende 1 ml pro Brunnen.
   10. Blocke Zellen mit Blocklösung für 1 Stunde bei RT, verwende 1 ml pro Bohrloch.
   11. Primäre Antikörperlösung vorbereiten: Primäre Antikörper von Interesse in der Blocklösung verdünnen.
       HINWEIS: Hier wurden folgende zwei Antikörperkombinationen für PGC-Marker verwendet: Ziegen-Anti-SOX17 und Kaninchen-Anti-TFAP2C sowie Ziegen-Anti-SOX17 und Maus-Anti-POU5F1 (Materialtabelle).
   12. Entfernen Sie die Blockierungslösung, fügen Sie pro Bohrloch 0,4 ml primäre Antikörperlösung hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C.
       HINWEIS: Es ist wichtig, negative Kontrollen einzubeziehen, um die unspezifische Antikörperbindung zu beurteilen. Dafür sollte man einen Brunnen über Nacht in Blocklösung aufbewahren, dabei die primären Antikörper weglassen, aber diesen Brunnen anschließend mit der sekundären Antikörperlösung färben.
   13. Am nächsten Tag entferne ich die primäre Antikörperlösung und wasche die Zellen dreimal für 5 Minuten mit PBST.
   14. Sekundäre Antikörperlösung vorbereiten: Sekundärantikörper von Interesse verdünnen (Materialtabelle) und DAPI (1:500) in Blocklösung.
       HINWEIS: Die sekundäre Antikörperlösung ist lichtempfindlich und sollte im Dunkeln aufbewahrt werden.
   15. Entfernen Sie PBST und fügen Sie 0,4 ml sekundäre Antikörperlösung pro Bohrloch für 1 Stunde bei RT im Dunkeln hinzu.
   16. Wasche die Zellen dreimal für 5 Minuten mit PBS und verwende 1 ml pro Brunnen.
   17. Mach Bildgebung der Zellen (20-fache Objektivlinse).
       HINWEIS: Immunfluoreszenzbilder wurden mit einem 20-fachen Objektiv am Airyscan-Mikroskop aufgenommen, während Hellfeldaufnahmen mit einem 4-fachen Objektiv sowie einem 10-fachen Objektiv am EVOS-Mikroskop aufgenommen wurden.
2. Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie
   1. Bereite einen FACS-Puffer vor: 0,5 % BSA in DPBS (-/-)
   2. Entfernen Sie das Switch-Medium aus den Bohrungen mit den hPGCLCs.
   3. Waschen Sie die Zellen mit 1 mL DPBS (-/-).
   4. Fügen Sie pro Brunnen 0,5 ml vorgewärmtes Accutase hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 °C. Für Dissoziation wird Accutase der Trypsinlösung vorgezogen, da die hPGCLCs sehr empfindlich auf Dissoziation reagieren.
   5. Stellen Sie eine Einzelzellsuspension her, indem Sie die Zellen vorsichtig 2–3 Mal mit einem p1000 resuspendieren.
   6. Überprüfen Sie unter einem invertierten Mikroskop, ob eine Einzelzellensuspension erhalten wird. Falls nicht, suspendieren Sie die Zellen noch einmal 1–2 Mal mit einer p1000-Pipette.
   7. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40-μm-Sieb in ein 15-mL-Rohr.
   8. Waschen Sie das 40-μm-Sieb mit einem 5-mL FACS-Puffer.
   9. Zentrifugiere die Zellsuspension bei 300 x g für 5 Minuten.
   10. Entferne das Überwasser.
   11. Setzen Sie das Zellpellet in einen 0,3-mL FACS-Puffer in einem 1,5-mL-Rohr wieder auf.
       HINWEIS: Es ist optional, Zellen mit einem Zellzähler oder einem Hämozytometer zu zählen. Wenn die Zellen gezählt werden, ist mit etwa 1 Million Zellen pro Brunnen einer 12-Well-Platte zu rechnen.
   12. Bereite ausreichende Kontrollproben für die Durchflusszytometrie vor (ungefärbte und Einzelfärbungskontrollen). Dafür werden 15–30 μL der Zellsuspension in 1,5 mL Röhren übertragen und mit FACS-Puffer auf 100 μL gefüllt.
       HINWEIS: Für diese Studie wurden 3 Einzelfärbungen vorbereitet: EPCAM-PEcy7 (1:200), ITGA6-BV421 (1:200) und 7AAD (1:200). Die Lösungen mit konjugierten Antikörpern und 7AAD sind lichtempfindlich und sollten im Dunkeln aufbewahrt werden.
   13. Fügen Sie die konjugierten Antikörper von Interesse direkt zur Zellsuspension hinzu, um eine ausreichende Verdünnung zu erreichen. Hier wurden folgende konjugierte Antikörper für PGC-Marker zusammen verwendet: EPCAM-PEcy7 (1:200) und ITGA6-BV421 (1:200) (Materialtabelle).
   14. Inkubiere die Zellen mit den konjugierten Antikörpern 30 Minuten lang auf Eis im Dunkeln.
   15. Fügen Sie den Proben 1 ml FACS-Puffer hinzu, unverfärbte Kontrolle und Einzel-Antikörper-Kontrollen und zentrifugieren Sie mit 300 x g für 5 Minuten.
   16. Entferne das Überwasser.
   17. Suspendieren Sie die Proben in 0,5 mL und die Kontrollproben in 0,2 ml des FACS-Puffers mit 1 mM EDTA. Dies verhindert, dass Zellen verklumpen.
   18. Gib die Proben und Kontrollen in ein 5-mL FACS-Rohr mit einer Zell-Siebkappe und führe sie dann durch das Sieb.
   19. Fügen Sie jeder Probe mehrere Minuten vor der Messung im Durchflusszytometer direkt 7AAD hinzu.
   20. Messen Sie Proben mit einem Durchflusszytometer. Hier wurde der fluoreszenzbasierte Zellanalysator zur Messung der Proben verwendet, die Daten wurden mit der FACSDiva-Software (v9.0) erhoben, und die FlowJo-Software (v10.10.0) wurde zur Analyse der Daten eingesetzt.
   21. Verwenden Sie die Kontrollproben (ungefärbte und Einzelantikörper-Kontrollen), um die Gating-Strategie einzurichten und gegebenenfalls eine Kompensation durchzuführen.
   22. Vortex die Proben, bevor du sie in die Maschine legst.
   23. Extrahieren Sie die Zellpopulation aus allen Ereignissen, indem Sie zunächst ein Gate basierend auf der Fläche [Vorwärtsstreufläche (FSC-A) und Seitenstreufläche (SSC-A)] setzen.
   24. Aus dieser Zellpopulation werden Einzelzellen basierend auf Größe [FSC-Breite (FSC-W) und FSC-Höhe (FSC-H)] und Granularität [SSC-W und SSC-H] extrahiert.
   25. Schließen Sie tote Zellen von der weiteren Analyse aus, indem Sie ein Gate für 7AAD-negative Zellen setzen.
   26. Verwenden Sie die Probe, um zu überprüfen, ob die Gatter richtig eingestellt sind, und passen Sie sie gegebenenfalls ein.
   27. Analysieren Sie die interessanten Marker dieser lebenden Zellpopulation. Hier entsprachen die für EPCAM und ITGA6 positiven Gated Cells mit hPGCLCs.

Results

Die Qualität und der stabile Zustand der hiPSCs sind für die weitere Differenzierung wichtig
hiPSCs wurden in 6-Well-Platten für mindestens 3 Durchgänge (in den verschiedenen Beschichtungen) vor Differenzierungsexperimenten und -analysen gehalten. hiPSCs wurden durchquert, wenn Zellkolonien einen Konfluenz von 70–80 % erreichten (Abbildung 1B), was auch die optimale hiPSC-Konfluenz ist, um die hPGCLC-Differenzierung einzuleiten. Gesunde hiPSC-Kulturen zeigten eine einheitliche Koloniemorphologie ohne dunkle oder differenzierte Bereiche, sichtbar in hellen Feldbildern (Abbildung 1B). Die Qualität der HiPSCs wurde jedoch beeinträchtigt, wenn Zellkolonien nicht an ihrer optimalen Konfluenz gehalten wurden oder Anzeichen von Differenzierung zeigten (Abbildung 1B). Bei niedriger Konfluenz vermehrte sich hiPSC weiter, und es wurde mehr Zeit für die Koloniebildung benötigt, bis die Zusammenfluss für Passaging oder Differenzierungsexperimente geeignet war. Bei hoher Konfluenz wuchsen die HiPSCs übereinander, während differenzierte Regionen auftraten. Der Pluripotenzzustand der hiPSCs wurde durch die Expression von SOX2 oder POU5F1 bestätigt, beidem Transkriptionsfaktoren, die für die Aufrechterhaltung der Puripotenz und Selbsterneuerung bei hiPSCs³⁰ essentiell sind, und vor allem wird SOX2 nicht durch hPGCLCs³¹ exprimiert. Die Phalloidin-Färbung wurde verwendet, um die zytoskelettale Organisation und Koloniemorphologie zu beurteilen, was auf die Qualität der hiPSCs hinweist. Beachten Sie, dass Unterschiede in der Zellmorphologie mit der Reduktion von SOX2 oder POU5F1 verbunden sind (Abbildung 1B).

Auswirkung des hiPSC-Erhaltungssubstrats auf die hPGCLC-Differenzierung
Um zu beurteilen, ob die Erhaltung von hiPSCs auf verschiedenen Beschichtungssubstraten die Differenzierung zu hPGCLCs beeinflusst, wurden die hiPSCs auf verschiedenen Substraten kultiviert (Geltrex, Matrigel, Cultrex und Vitronectin) (Abbildung 2). Auf allen Substraten zeigten hiPSCs robuste und einheitliche nukleare SOX2- oder POU5F1-Werte, was auf ihren pluripotenten Zustand hinweist. hiPSC-Kolonien, die auf Geltrex, Matrigel und Cultrex gehalten wurden, hatten eine vergleichbare Morphologie, einschließlich klar definierter Koloniengrenzen und unregelmäßiger Gesamtformen der Kolonien, im Vergleich zu den runden Kolonien auf Vitronectin (Abbildung 2). hiPSCs, die eine Konfluenz von 70–80 % erreichten, wurden mit einer Dichte von 40K Zellen/cm^² plattiert und auf Geltrex²⁶ zu hPGCLCs differenziert. Am 5. Tag zeigten Brightfield-Bilder charakteristische hPGCLC-Kolonien unter allen Bedingungen (Abbildung 3). Darüber hinaus wurden dreifach-positive SOX17/TFAP2C/PDPN oder doppel-positive SOX17/POUF51 hPGCLCs in allen Erkrankungen identifiziert (Abbildung 3). Dies deutete darauf hin, dass das Differenzierungsprotokoll mit hiPSCs angewendet werden könnte, die unter unterschiedlichen Bedingungen kultiviert wurden.

Auswirkung der anfänglichen hiPSC-Zelldichte auf die hPGCLC-Differenzierung
Es ist wichtig, die optimale Aussetzdichte für eine optimale hPGCLC-Differenzierung (bei Geltrex) zu überprüfen, da verschiedene hiPSCs unterschiedliche Proliferationsraten aufweisen. Darüber hinaus wird empfohlen, falls die Effizienz der hPGCLC-Differenzierung abnimmt, während hiPSCs kontinuierlich durchgeführt werden, die Dichte der hiPSC-Seedingzellen anzupassen. Um die Auswirkung der Seeding-Zelldichte auf die Effizienz der hPGCLC-Differenzierung zu bewerten, wurden hiPSCs mit unterschiedlichen Dichten von 10K bis 100K Zellen/cm^² (Abbildung 4A) ausgesät. Am 5. Tag wurde der Prozentsatz der hPGCLCs mittels Durchflusszytometrie mit zwei verschiedenen konjugierten Antikörpern für humane PGC-Marker, EPCAM und Integrin α6 (ITGA6)³², bewertet. Die Flowzytometrie-Analyse folgte einer standardmäßigen sequentiellen Gating-Strategie, die für M199-hiPSCs mit 40.000 Zellen/cm^² gezeigt wurde (Abbildung 4B). Kurz gesagt wurde die gesamte Zellpopulation (alle Ereignisse) so gegart, dass Schmutz (Partikelfläche) ausgeschlossen wurden, dann wurden einzelne Zellen basierend auf Größe (FSC) und Granularität (SSC) ausgewählt, und schließlich wurden tote Zellen anhand der 7AAD-Färbung ausgeschlossen. Anschließend wurde das Gate zur Quantifizierung von Zellen, die EPCAM-cy7 und ITGA6-BV421 exprimieren, mittels gefärbter und ungefärbter Proben gesetzt (Abbildung 4B).

Der Vergleich der hPGCLC-Differenzierungseffizienz unter Verwendung unterschiedlicher Dichten der Saatzellen und der Verwendung von hiPSC, die auf verschiedenen Substraten kultiviert wurde, zeigte einen dichteabhängigen Trend (Abbildung 4C). Bei einer Aussaatdichte von 20–40K Zellen/cm^² zeigten M54 und M199 hiPSCs den höchsten Anteil an EPCAM+/ITGA6+ doppelt positiven hPGCLCs, erzielt durch hiPSCs, die auf Geltrex und Cultrex gehalten wurden. Interessanterweise führten höhere Dichten zu einer geringeren Differenzierungseffizienz. Immunfluoreszenzergebnisse unter Verwendung der PGC-Marker SOX17/TFAP2C/PDPN oder SOX17/POUF51 auf den hPGCLCs validierten die Flowzytometrieergebnisse (Abbildung 4D). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Anpassung der Aussaatdichte an die spezifischen hiPSCs wichtig ist, um eine optimale Differenzierungseffizienz zu erzielen. Die Kombination von Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie erhöht die Robustheit des hPGCLC-Differenzierungsassays.

Abbildung 1: hPGCLC-Differenzierungsworkflow und Qualität der hiPSCs. (A) Schaltplan des in dieser Studie verwendeten Arbeitsablaufs. die hiPSCs wurden (im Kulturmedium) erhalten und erreichten am Tag der Differenzierung eine Konfluenz von 60–80 %. Auf D0 wurden die hiPSCs in einzelne Zellen dissoziiert und in der gewünschten Aussetzdichte (im Beschichtungsmedium) plattiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit einem Differenzierungsmedium (D1–D3) behandelt, gefolgt vom Schaltmedium (D3–D5). Bei D5 wurden hPGCLCs für Immunfluoreszenz oder Durchflusszytometrie verwendet. (B) Brightfield-Bilder (oberste Reihe – 4-fache Vergrößerung); Immunfluoreszenz für SOX2, PHALLOIDIN-Färbung und DAPI-Färbung (mittlere Reihe); und für POU5F1 PHALLOIDIN-Färbung und DAPI-Färbung (untere Reihe) mit HiPSCs mit unterschiedlicher Konfluenz. Skalenbalken = 50 μm. Die Zeichnungen in Abbildung 1A wurden von den Autoren mit grundlegenden Zeichenwerkzeugen in Adobe Illustrator erstellt; Es wurden keine kostenpflichtige Software oder Werkzeuge verwendet. Daher war keine Urheberrechtslizenz erforderlich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Wirkung verschiedener Beschichtungssubstrate während der HiPSC-Kultur. Brightfield-Bilder (oberste Reihe); Immunfluoreszenz für SOX2, PHALLOIDIN-Färbung und DAPI-Färbung (mittlere Reihe); und für POU5F1 PHALLOIDIN-Färbung und DAPI-Färbung (untere Reihe), die HiPSCs zeigen, die auf verschiedenen Beschichtungssubstraten kultiviert wurden. Skalenbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Einfluss verschiedener Beschichtungssubstrate während der hiPSC-Kultur auf die Differenzierung von hPGCLCs. Brightfield-Bilder (oberste Reihe – 10-fache Vergrößerung); Immunfluoreszenz für SOX17, TFAP2C, PDPN und DAPI-Färbung (mittlere Reihe); und für POU5F1, SOX17 und DAPI-Färbung (untere Reihe) der hPGCLC-Differenzierung (mit Geltrex) am Tag 5, beginnend mit hiPSCs, die auf verschiedenen Beschichtungssubstraten kultiviert wurden. Die gelb gestrichelte Linie markiert Regionen mit hPGCLCs. Skalenbalken = 25 μm (oberste Reihe) und 50 μm (mittlere und untere Reihen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Einfluss der hiPSC-Aussaatdichte auf die Differenzierung von hPGCLCs. (A) Brightfield-Bilder an Tag 1 (D1) und D3 der hPGCLC-Differenzierung unter Verwendung verschiedener hiPSC-Seedingdichten (40K Zellen/cm², 60K Zellen/cm2, 80K Zellen/cm²). Skalabalken = 250 μm. 4-fache Vergrößerung. (B) Repräsentative Flusszytometriediagramme, die die Gating Strategie zur Quantifizierung des Prozentsatzes von EPCAM+/ITGA6+ hPGCLCs zeigen. Dafür wurden M199-hiPSCs (auf Geltrex) mit einer Aussetzdichte von 40.000 Zellen/cm^² verwendet. (C) Bar-Plot, das die Prozentsätze von EPCAM+/ITGA6+ hiPGCLCs bei D5 bei Verwendung von hiPSCs (M199 und M54) darstellt, die auf verschiedenen Beschichtungen kultiviert und bei unterschiedlichen Dichten besät wurden. (D) Immunfluoreszenz für SOX17, TFAP2C, PDPN und DAPI-Färbung (linke Panels); und SOX17, POU5F1 und DAPI-Färbung (rechte Panels) bei D5 der hPGCLC-Differenzierung mit hiPSCs (M199 und M54, auf Geltrex), die bei 40K und 80K Zellen/cm² ausgesaat wurden. Skalenbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Die In-vitro-Gametogenese stellt eine leistungsstarke experimentelle Plattform zur Untersuchung der menschlichen Keimbahnentwicklung, Fortpflanzungstoxizität und Unfruchtbarkeit unter kontrollierten Kulturbedingungen und patientenspezifisch dar. Obwohl¹⁸ mehrere Protokolle zur Unterscheidung von hPGCLCs von hiPSCs berichtet wurden, wurde der Fortschritt in diesem Bereich durch die begrenzte Verfügbarkeit standardisierter, skalierbarer und reproduzierbarer Ansätze in verschiedenen Laboren behindert. Jüngste Studien haben vereinfachte und effiziente Ansätze zur hPGCLC-Induktion beschrieben, darunter die BMP4-basierte mikrogemusterte Differenzierung²⁷, eine schnelle 2D-Monoschichtplattform, die die hPGCLC-Generierung innerhalb von 3,5 Tagen^{und 28} ermöglicht, sowie ein 3D-Kultursystem, das die Entwicklung der Peri-Implantation und die parakrine Nischensignalisierung^{modelliert 33}. Obwohl diese Protokolle die hPGCLC-Differenzierung effizient unterstützten, fehlt ihnen dennoch die Fähigkeit, als Hochdurchsatzplattformen zu dienen. Damit hPGCLC-basierte Studien breit anwendbar sind, insbesondere für reproduktionstoxikologische Untersuchungen, müssen Protokolle robust, technisch zugänglich und mit nachgelagerten quantitativen Tests kompatibel sein. Hier wird eine Schritt-für-Schritt-Analyse des BMEx-Differenzierungsprotokolls des hPGCLC präsentiert, wobei kritische technische Parameter betont werden, die Reproduzierbarkeit und Leistung bestimmen.

Ein wesentlicher Faktor für eine erfolgreiche Differenzierung ist der anfängliche Pluripotenzzustand der hiPSCs. Passagenzahl, zelluläre Gesundheit, linienspezifische Merkmale und Prä-Differenzierungskulturbedingungen können die Ergebnisse der hPGCLC-Differenzierung beeinflussen. Anfangs kann während der hiPSC-Wartung die Aufmerksamkeit auf das Beschichtungssubstrat, die Dichte der Samenzelle und das Kulturplattenformat gerichtet werden, die zusammen die Koloniearchitektur und Signalumgebungen zu Beginn der hPGCLC-Differenzierung definieren. Die vorliegende Studie zeigt den Effekt der Verwendung von hiPSCs, die auf verschiedene Beschichtungen kultiviert wurden, sowie unterschiedlichen Samendichten auf die Differenzierung von hPGCLCs (auf Geltrex). Beide hier getesteten hiPSC-Linien zeigten eine maximale Differenzierungseffizienz bei 20.000–40.000 Zellen/cm^² Aussaatdichte. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, optimale Saatdichten beim Einführen neuer Zelllinien, nach längerer Durchlaufzeit oder bei der Änderung von experimentellen Layouts oder Kulturplattenformaten zu bestimmen. Selbst scheinbar geringe Veränderungen im Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis oder der Wachstumskinetik müssen möglicherweise optimiert werden, um eine hohe Differenzierungseffizienz zu erhalten. Dementsprechend wird empfohlen, dass Nutzer kleinmaßstäbige Pilotexperimente durchführen, um zunächst optimale Bedingungen für die hPGCLC-Differenzierung zu bestimmen.

Trotz ihrer Robustheit hat die Methode Einschränkungen, die anerkannt werden sollten. Obwohl sie mit mehreren Beschichtungen und Dichten kompatibel ist, bleibt die Differenzierungseffizienz empfindlich gegenüber hiPSC-intrinsischen Eigenschaften, einschließlich epigenetischer Zustand und Passagehistorie, die nicht vollständig kontrollierbar sind. Mehrere getestete hiPSCs schienen sich nicht in hPGCLCs²⁶ unterscheiden zu können. Am wichtigsten ist, dass BMEx im Gegensatz zu vitronectin, das ein vollständig definiertes Produkt ist, ein tierisch abgeleitetes Produkt ist, das von Charge zu Charge unterschiedlich ist, was die Reproduzierbarkeit beeinträchtigen kann. Obwohl zuvor verschiedene Chargen von Matrigel, Cultrex und Geltrex getestet wurden und konsistente^Ergebnisse erzielten, bleibt dies ein Anliegen, und vollständig definierte Alternativen zu BMEx sollten in Betracht gezogen werden, um zukünftige Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit zu gewährleisten. Hier wurden zwei männliche (XY) HiPSC-Linien verwendet, aber dieses Protokoll wurde sowohl mit weiblichen (XX) als auch männlichen (XY)^{Linien 26} getestet. Schließlich führte das Protokoll zwar zu hPGCLCs, die nachweislich transkriptionell den hPGCs ähneln und für weitere Entwicklung^{kompetent sind 26,34}, aber die weitere Reifung in spätere Keimzellstadien wurde hier nicht behandelt. Obwohl Skalierbarkeit für Screening-Anwendungen demonstriert wurde, werden automatisierungsbasierte Anpassungen und interlaborative Validierung über ein breiteres Spektrum von hiPSC-Linien hinweg den translationalen Nutzen weiter stärken.

Im Vergleich zu bestehenden hPGCLC-Differenzierungsstrategien bietet dieses Protokoll mehrere Vorteile. Im Gegensatz zu hochspezialisierten oder matrixbeschränkten Ansätzen nimmt es häufig verwendete hiPSC-Wartungssubstrate und Kulturplattenformate auf, wodurch technische Hürden gesenkt werden. Der Schwerpunkt auf Dichteoptimierung und Qualitätskontrolle in der frühen Phase verbessert die Reproduzierbarkeit weiter, eine anhaltende Herausforderung im Bereich der In-vitro-Gametogenese .

Der hier beschriebene methodische Rahmen ist besonders relevant für Reproduktionstoxikologie, Unfruchtbarkeitsmodellierung und Entwicklungsbiologie. Seine Kompatibilität mit skalierbaren Formaten ermöglicht mittel- bis hochdurchsatzbasierte Compound-Screening, während seine Reproduzierbarkeit Cross-Study-Vergleiche und kollaborative Konsortienbemühungen unterstützt. Insgesamt wird die systematische Standardisierung der hPGCLC-Induktionsprotokolle in verschiedenen Laboren, bei der Charakterisierung und funktionelle Endpunkte^18,35 verglichen werden, unerlässlich sein, um die In-vitro-Gametogenese hin zu prädiktiven, menschenrelevanten Plattformen voranzutreiben.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7AAD Viability Staining Solution	BioLegend	420403	Verdünnung 1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
Advanced RPMI 1640 Medium	Gibco	12633012
Alexa Flour 488 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A21202	Verdünnung 1:500
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21207	Verdünnung 1:500
Alexa Flour 647 donkey anti-goat IgG	Invitrogen	A21447	Verdünnung 1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	Verdünnung 1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	Verdünnung 1:400
Antibody anti-CD49f (ITGA6), Brilliant Violet 421	Biolegend	313624	Verdünnung 1:200
Antibody anti-CD326 (EPCAM1), PE/Cyanine7	Biolegend	324222	Verdünnung 1:200
Antibody anti-SOX2, rabbit polyclonal	Merck	ab5603	Verdünnung 1:200
Antibody anti-SOX17, goat polyclonal	R&D Systems	AF1924	Verdünnung 1:500
Antibody anti-OCT3/4 (POU5F1), mouse monoclonal	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	Verdünnung 1:200
Antibody anti-Podoplanin (PDPN), mouse monoclonal	Abcam	ab256561	Verdünnung 1:200
Antibody anti-AP-2γ (TFAP2C), rabbit polyclonal	Cell Signaling Technology	2320S	Verdünnung 1:300
B-27 Supplement, serum free	Gibco	17504044	Diltuion 1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		Equipment für die Durchflusszytometrie
BD FACSDiva software version 9.0	BD Biosciences		Software
Bovine Serum Albumin (BSA), fractie V	Roche	10735086001	In PBST lösen
CELLSTAR 12 Well Cell Culture Plate	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL Tube	Greiner	188271
CELLSTAR 6 Well Cell Culture Plate	Greiner	657160
Corning 40 µm Cell Strainers	Corning	431750
Cultrex Stem Cell Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	R&D systems	3434-101-02	In kaltem DMEM-F12 verdünnen
DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindole)	Invitrogen	D3571	Verdünnung 1:500
DMEM:F12, GlutaMAX supplement	Gibco	31331028
DPBS, kein Calcium, kein Magnesium	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		Equipment für die Bildgebung
EVOS M5000 software version 1.3.660.548	Invitrogen		Software
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, mit Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	In kaltem DMEM-F12 verdünnen
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Verdünnung 1:100
FlowJo software version 10.10.0	BD Biosciences		Software
Geltrex Reduced-Growth Factor Basement-Membrane Matrix, LDEV-Free, stem-cell qualified	Gibco	A1413302	In kaltem DMEM-F12 verdünnen
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Verdünnung 1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0054iCTRL03	hiPSCs können bei Anfrage mit MTA verteilt werden
hiPSCs M199	LUMC hiPSC Core Facility	LUMC0199iCTRL01	hiPSCs können bei Anfrage mit MTA verteilt werden
LUNA-II Automated Cell Counter	Logos Biosystems		Equipment für die Zellzählung
LUNA-II software version 2.3.5	Logos Biosystems		Software
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free	Corning	354277	In kaltem DMEM-F12 verdünnen
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050	Verdünnung 1:100
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2011	Verdünnung 1:1000
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich	1040051000	Zunächst zu 8% PFA in Wasser lösen; und dann auf 4% (1:1) mit 0,2 M Phosphatpuffer verdünnen
PIPETMAN P1000, 100–1000 µL, Metall-Auswerfer	Gilson	F144059M
PIPETMAN P200, 20–200 µL, Metall-Auswerfer	Gilson	F144058M
PIPETMAN P10, 1–10 µL, Metall-Auswerfer	Gilson	F144055M
Recombinant Human BMP4, CF	R&D Systems	314-BP-050	Stammkonzentration von 100 µg/mL in 4 mM HCL mit 0,1% BSA
Recombinant Human EGF, CF	R&D Systems	236-EG-200	Stammkonzentration von 50 µg/mL in PBS
Recombinant human LIF	Gibco	300-05	Stammkonzentration von 100 µg/mL in 0,1% BSA
Recombinant Human SCF, CF	R&D Systems	11010-SC-100	Stammkonzentration von 100