Epigenomweite CRISPR-Cas9-basierte Knockout-Screens an chemoresistenten Zellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erzeugung chemoresistenter Zellen mittels eines Dosis-Eskalationsansatzes, gefolgt von einem CRISPR/Cas9-basierten Screening mit einer fokussierten sgRNA-Bibliothek, die epigenetische Modifikatoren anvisiert, um Regulatoren erworbener Chemoresistenz zu identifizieren. Das Protokoll bietet zudem mehrere Optimierungspunkte, die auf chemoresistente Zellmodelle zugeschnitten sind, und bietet so einen robusten Rahmen für Forscher, die Resistenzmechanismen untersuchen.

Zusammenfassung

Chemotherapieresistenz bleibt eine große Herausforderung in der Krebsbehandlung, angetrieben durch die Fähigkeit von Krebszellen, adaptive Eigenschaften zu erwerben, Signalwege neu zu verdrahten und die Chromatinstruktur zu verändern, um medikamenteninduzierte Zytotoxizität zu umgehen. Da diese Prozesse stark auf epigenetischen Mechanismen beruhen, die die Chromatinorganisation und die transkriptionelle Plastizität regulieren, haben sich epigenetische Regulatoren als entscheidende Faktoren für Chemotherapieresistenz etabliert. Um die Resistenz gegen Paclitaxel zu untersuchen, eines der am weitesten verbreiteten Chemotherapeutika bei dreifach-negativem Brustkrebs (TNBC), verwendeten wir eine epigenom-fokussierte Knockout-Bibliothek (EPIKOL), eine auf CRISPR-Cas9 basierende Bibliothek, die systematisch Gene stören soll, die an der Chromatinregulation beteiligt sind. Chemoresistente Zelllinien wurden durch ein schrittweises Dosis-Eskalationsprotokoll erzeugt, das die klinisch relevante Arzneimittelanpassung wiederholt. Diese resistenten Zellen weisen jedoch einen multiarzneimittelresistenten (MDR) Phänotyp auf, was erhebliche Herausforderungen für die effiziente virale Transduktion und die Auswahl stabiler Zellpopulationen darstellt. In dieser Studie beschreiben wir zentrale methodische Schritte zur Erreichung einer hocheffizienten lentiviralen Transduktion und -Selektion, die die erfolgreiche Anwendung von EPIKOL-CRISPR-Screens in chemoresistenten TNBC-Modellen ermöglichen. Nach dem beschriebenen Protokoll wurde ein epigenomweites CRISPR-Screening an chemoresistenten TNBC-Zellen durchgeführt und neuartige epigenetische Regulatoren für Chemoresistenz identifiziert. Dieses Protokoll bietet einen robusten Rahmen zur Identifizierung epigenetischer Regulatoren, die zur erworbenen Paclitaxelresistenz beitragen, mittels eines CRISPR-basierten Funktionsverlust-Ansatzes.

Einleitung

Dreifach-negativer Brustkrebs (TNBC) ist eine Untergruppe von Brustkrebs, die 12–17 % aller Brustkrebserkrankungen ausmacht¹. Sie ist gekennzeichnet durch eine beeinträchtigte Expression des Östrogenrezeptors (ER), des Progesteronrezeptors (PR) und des humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors 2 (HER2), was die Verfügbarkeit gezielter Therapieoptionen stark einschränkt und die konventionelle Chemotherapie als primäre Behandlungsmodalität² belässt. Taxane und Anthracykline werden häufig in der TNBC-Behandlung verwendet; Patienten entwickeln jedoch meist Resistenz ^2,3. Die Erwerbung von Chemoresistenz ist ein komplexer und multidimensionaler Prozess, der sowohl genetische, metabolische, transkriptionelle als auch epigenetische Anpassungen umfasst ^2,4. Epigenetische Veränderungen haben sich als zentrale Regulatoren der zellulären Plastizität etabliert und ermöglichen eine dynamische transkriptionelle Reprogrammierung, die es Krebszellen ermöglicht, die durch Chemotherapie induzierte Toxizität zu tolerieren⁵.

Taxol (Paclitaxel) gehört zur Taxanklasse, das Zelltod verursacht, indem es die Mikrotubulidynamik beeinträchtigt und als antimitotisches Mittel⁶ fungiert. Obwohl TNBC-Patienten zunächst auf die Chemotherapie-Regime einschließlich Taxol ansprechen, entwickelt sich die Resistenz meist im Laufe der Zeit². Die erworbene Taxol-Resistenz ist häufig mit einer Überexpression von ATP-bindenden Kassettentransportern (ABC) verbunden, insbesondere ABCB1 (MDR1, P-Glykoprotein), die den Medikamentenaussatz von Taxol vermitteln und so eine verringerte intrazelluläre Arzneimitteltoxizität⁷ verursachen. Da eine Vielzahl von Chemotherapeutika Substrate dieser ABC-Transporter ist, begrenzt deren Hochregulation die Verwendung anderer Chemotherapeutika und führt zu einem Multi-Resistenz-Phänotyp (MDR)⁸. Die Hemmung von ABC-Transportern hat sich als weitgehend erfolglos als Strategie zur Überwindung der Multimedikamentenresistenz in klinischen Umgebungen erwiesen, hauptsächlich aufgrund ihrer allgegenwärtigen Expression und ihrer wesentlichen Rolle beim Transport einer Vielzahl endogener und exogener Substrate⁹. Obwohl Verapamil, ein ABCB1-Inhibitor der ersten Generation, einen begrenzten oder keinen klinischen Nutzen zeigte und in klinischen Studien^mit signifikanter Toxizität assoziiert war, bleibt es ein wertvolles experimentelles Werkzeug zur Verbesserung der Selektionseffizienz in In-vitro-Modellen von MDR.

Der MDR-Phänotyp ist ein dynamischer und adaptiver Prozess, der meist unter Stressbedingungen^entsteht. Die Expression des ABC-Transporters wird überwiegend durch transkriptionelle und epigenetische Regulationsmechanismen gesteuert, nicht durch mutationale Ereignisse ^5,11. Die Einschränkung, direkt auf ABC-Transporter zu zielen, unterstreicht die Notwendigkeit, die vorgelagerten Regulatoren dieser Proteine als spezifische Verwundbarkeit für die resistenten Zellen zu identifizieren. Daher ist die systematische Untersuchung epigenetischer Faktoren zu einer wichtigen Strategie geworden, um neuartige Regulatoren der Chemotherapieresistenz zu identifizieren und Kombinationstherapien zu entwickeln, die auf diese Schwachstellen abzielen.

CRISPR-Cas9-basierte funktionelle Knockout-Screens ermöglichen unvoreingenommene, systematische genomweite Störungen, um die Auswirkungen von Genverlust bei Krebs auf Genomskala¹² zu untersuchen. Genomweite CRISPR-Bibliotheken bieten jedoch eine begrenzte Repräsentation von Single Guide RNA (sgRNA) pro Gen, was die Sensitivität im Vergleich zu fokussierten^{Bibliotheken 13} reduziert. Wichtig ist, dass ein robustes Screening nicht nur von der Qualität der Störungen abhängt, sondern auch von einem geeigneten Modell und einem optimierten experimentellen Protokoll. In diesem Zusammenhang könnte die Untersuchung eines dynamischen und komplexen Prozesses wie der Arzneimittelresistenz von einer fokussierten Bibliothek mit einem angepassten Protokoll¹³ profitieren. In einer früheren Arbeit haben wir eine epigenom-fokussierte CRISPR-Cas9-Knockout-Bibliothek erstellt, um Chromatinregulatoren¹⁴ gezielt anzusprechen. Im Vergleich zu anderen öffentlich zugänglichen, epigenom-fokussierten CRISPR-Bibliotheken enthält die epigenetische Knockout-Bibliothek (EPIKOL) 779 Gene, bestehend aus Chromatinlesern, Schreibern, Radiergummin und zugehörigen Proteinen, die jeweils mit 10 sgRNAs anvisiert sind, wodurch die Tiefe pro Gen erhöht und die Robustheit sowie Reproduzierbarkeit chromatinfokussierter funktioneller Screens verbessert^{werden können 14}. EPIKOL ist sowohl im LentiGuide-System verfügbar, bei dem Cas9 aus einem anderen Vektor exprimiert wird, als auch im LentiCRISPR-System, das Cas9 einschließt, was je nach Zelllinie Flexibilität bietet. Eine ausreichende Bibliotheksabdeckung, definiert als durchschnittliche Anzahl von Zellen pro sgRNA (z. B. 500×–1000×), ist für EPIKOL im Vergleich zu genomweiten Bibliotheken einfacher und bietet einen Vorteil bei der Untersuchung der langsam wachsenden chemoresistenten Zelllinien.

Während das CRISPR-Screening einen leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung von Chemoresistenzmechanismen bietet, sind Standard-Pooled-Screening-Workflows für chemoresistente Zellen mit aktivem Arzneimittelausfall nicht optimiert. Puromycin, ein häufig verwendetes Selektionsantibiotikum in lentiviralen CRISPR-Systemen, kann durch ABC-Transporter, hauptsächlich ABCB1, aus den resistenten Zellen ausgepumpt werden, wodurch eine erfolgreiche Selektion der transduzierten Zellen^{verhindert wird.} Diese Einschränkung kann zu heterogenen Zellpopulationen führen, zu zunehmendem Hintergrundrauschen und letztlich zu einer Beeinträchtigung der Datenqualität. Um diese Herausforderung zu bewältigen, haben wir den Puromycin-Auswahlschritt optimiert, indem wir den ABC-vermittelten Arzneimittelausfluss mit Verapamil vorübergehend hemmten, wodurch eine effiziente Anreicherung von sgRNA-infizierten Zellen ermöglicht wurde. Mit dieser Strategie identifizierten wir Bromodomain und PHD Finger Containing 1 (BRPF1) als Regulator der ABCB1-Expression und der Taxol-Resistenz in TNBC¹⁷. Die BRPF1-Hemmung, entweder genetisch oder pharmakologisch, stellte die Taxol-Sensitivität in resistenten Zellen wieder her und demonstrierte den Nutzen dieses optimierten Protokolls zur Identifizierung von handlungsfähigen Zielen bei Chemoresistenz¹⁷.

Hier skizzieren wir die wichtigsten Schritte beim negativen CRISPR-Screening bei chemoresistenten Modellen, insbesondere mit Fokus auf die technischen Herausforderungen, die in den meisten Chemoresistenz- oder CRISPR-Screening-Protokollen oft übersehen werden. Das Protokoll demonstriert zunächst eine schrittweise Dosissteigerung zur Bildung chemoresistenter Zellen und optimiert anschließend die Virusabgabe und Selektionsbedingungen, um den ABC-transportervermittelten Arzneimittelausweich zu überwinden. Zusammen sorgen diese Optimierungen für eine effiziente Anreicherung von sgRNA-positiven Zellen während der CRISPR-Screens, während die nicht transduzierten Zellen effektiv eliminiert werden, wodurch eine robuste und effiziente Strategie für Transduktion und Selektion in chemoresistenten TNBC-Zellen bereitgestellt wird. Abschließend hebt das Protokoll die Grundlagen zur Identifizierung von CRISPR-Screening-Treffern durch Next-Generation-Sequenzierung und bioinformatische Analyse hervor.  Zusammen ermöglicht dieses Protokoll eine effektive Umsetzung der EPIKOL-Screening-Plattform, um potenzielle therapeutische Ziele zur Überwindung von Resistenzen zu identifizieren 17,18,19.

Protokoll

Alle in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Entstehung von Taxol-resistenten dreifach negativen Brustkrebszelllinien

1. Um die Arzneimittelsensitivität der Zellen zu bestimmen, passen Sie die Zelldichte SUM159PT adhärenten Zellen auf 2 × 10³ Zellen pro Bohrloch in 96-Well-schwarzen klaren Bodenplatten mit Hams F12-Nährstoffmischung an, ergänzt mit 5 % fetalem Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin, 5 μg/mL Insulin, 10 mM HEPES, 1 μL/mL Hydrocortison und inkubieren Sie die Zellen 16 Stunden lang in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C mit 5 %_CO-2.
2. Bereiten Sie Taxol-Aktie vor, gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO). Zur Behandlung von Zellen bereiten Sie serielle Verdünnungen von Taxol in Kulturmedien vor, die von 0,3 nM bis 10 μM reichen (z. B. 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 30 nM, 10 nM, 10 μM, 10 μM), und verwenden Sie DMSO allein als Fahrzeugkontrolle.
3. Behandle Zellen mit 200 μL zunehmender Dosen Taxol (hergestellt in Schritt 1.2) als Dreifache und lasse die Platte 72 Stunden lang in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C mit 5 %_CO2.
4. Nach 72 Stunden medikamentöser Behandlung wird die Zelllebensfähigkeit mit einem lumineszenzbasierten Adenosintriphosphat-(ATP)-Quantifizierungs-Zellviabilitätstest gemessen. Verwenden Sie einen Mikroplattenleser, um die Lumineszenz zu messen und die Werte auf DMSO-Steuerungen zu normalisieren. Berechnen Sie die 10%-Inhibitorkonzentration (IC10) und IC50 durch nichtlineare Regression mit einem logistischen Dosis-Response-Modell mit vier Parametern in einer geeigneten statistischen Software.
5. Um mit der Erzeugung chemoresistenter Zellen zu beginnen, Säen Sie 2 × 10⁵ SUM159PT Zellen pro Brunnen in 6-Well-Platten. Über Nacht bei 37 °C mit 5 %_CO2 inkubieren.
6. Am nächsten Tag behandeln Sie die Zellen mit entweder IC10- oder IC50-Werten von Taxol in 2 ml Kulturmedium für 72 Stunden als Anfangskonzentrationen.
7. Wenn die Zellen die aktuelle Wirkstoffkonzentration tolerieren, teilen Sie sie in zwei Brunnen. Behalten Sie einen Brunnen als Backup-Kontrolle in einem frischen Medium und ersetzen Sie das Medium im zweiten Bohrloch durch ein Medium, das die doppelte Taxol-Konzentration enthält.
   HINWEIS: Wenn Zellen aufgrund stressbedingter morphologischer Veränderungen wie abnormer Zellprojektionen, umfangreicher Abrundung und Ablösung oder deutlicher Verringerung der Proliferation eine Genesung benötigen, bewahren Sie sie in einem medikamentenfreien Medium und warten, bis die Zellen gesund und konfluent sind. Dann wiederhole ich die Schritte ab Schritt 1.7.
8. Während der Erzeugung resistenter Zellen führen Elternzellen mit einem DMSO-haltigen Medium als Kontrolle durch. Passen Sie das DMSO-Volumen so an, dass es zur Menge an DMSO passt, die in der entsprechenden Taxol-Behandlung vorhanden ist.
9. Messen Sie die Zelllebensfähigkeit wie in den Schritten 1,2–1,4 alle 3–4 Wochen und setzen Sie dieses Verfahren fort, bis ein signifikanter Unterschied (p < 0,05 oder 10–50-fach, abhängig vom angewandten Medikament) zwischen den IC50-Werten der elterlichen und resistenten Zelllinien erreicht wird. Das Dosissteigerungsverfahren dauert typischerweise 6–9 Monate, abhängig vom verwendeten Medikament.
10. Nachdem stabile resistente Zellen erhalten sind, halten Sie diese während der Kultivierung in der Erhaltungsdosis (zuletzt angewendete Dosis) des Medikaments aufrecht.
    HINWEIS: Die Erzeugung von chemoresistenten Zellen mit der Dosis-Eskalationsmethode ist ein zeitintensiver Prozess, und die Dauer hängt von mehreren Faktoren ab, darunter die Zelllinie, die intrinsische Wachstumsrate und das verwendete chemotherapeutische Mittel. Es dauert in der Regel 6–9 Monate, abhängig vom klinisch relevanten Widerstandsniveau. Ein alternativer Ansatz zur Bestimmung signifikanter Unterschiede in den Resistenzniveaus besteht darin, die minimale Arzneimittelkonzentration zu bestimmen, bei der resistente Zellen überleben, aber die elterlichen Zellen nicht.
11. Charakterisierung resistenter Zellen: Durchführung von RNA-Sequenzierung, Western Blotting, quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und Zellviabilitätstests mit medikamentöser Behandlung (z. B. Koloniebildungstest) zur Charakterisierung des Phänotyps resistenter Zellen. Achten Sie darauf, den resistenten Phänotyp nach mehreren Durchgängen neu zu bewerten, um zu zeigen, dass der erhöhte IC50-Phänotyp über die Zeit stabil ist.

2. Lentivirus-Produktion

1. Tag 0: Säen HEK293T Zellen als 4 × 10 à⁶ pro 100 mm Gewebekulturschale mit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin, um am nächsten Tag eine 90 % Konfluenz zu erreichen.
2. Tag 1: Polyethylenimin (PEI) und DNA-Mischungen in serumfreiem DMEM (-/-) separat für jedes Virus vorbereiten. Verwenden Sie Tabelle 1 und Tabelle 2 , um Volumen und Konzentrationen von PEI und DNA entsprechend der gewünschten viralen Ausbeute anzupassen.
   HINWEIS: PEI wird viermal der gesamten μg DNA verwendet (z. B. bei einer 100 mm großen Platte, 30 μL PEI für insgesamt 7,5 μg DNA). In diesem Protokoll wird die Virusproduktion in 100-mm-Schüsseln durchgeführt, und Virus, die aus 5–10 100-mm-Schüsseln gewonnen werden, ermöglichen die Durchführung mehrerer Screens. Für Validierungsexperimente oder kleinräumige Infektionen reicht ein einzelner Brunnen einer 6-Well-Platte oder eine 60-mm-Schüssel aus. Da lineares Polyethyleniminhydrochlorid ein toxisches Transfektionsmittel ist, sollte die Zellkonfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion zu 90 % liegen.
   1. Nach gründlichem Mischen gib du die DNA-Mischung in das PEI-Rohr. Gut mischen und PEI-DNA-Komplexe 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehen lassen.
   2. Dann gibt man die 600 μL PEI-DNA-Komplexe tropfweise dem HEK293Ts. Stellen Sie Platten 16 Stunden lang in den Virusinkubator bei 37 °C mit 5 %_CO2.
3. Tag 2: Ersetzen Sie das Medium der infizierten Zellen durch Aspiration des PEI- und virushaltigen Mediums und der Zugabe von 8 ml vollständigen DMEM für jede 100 mm Gewebekulturschale. Inkubieren Sie die Zellen, um die Virusproduktion zu ermöglichen.
4. Tag 3: Die erste Virussammlung durchführen, indem Sie vorsichtig die 8 ml Supernatant in ein passend großes Zentrifugenrohr entnehmen und bei 4 °C lagern. Wenn es mehrere Platten für die Virusproduktion gibt, kombinieren Sie die Supernatantien. Dann geben Sie 8 ml frisches, vollständiges DMEM zu jeder Schale und geben Sie die Platten zurück in den Virusinkubator.
5. Tag 4: Abfangschritte wiederholen und ab Tag 3 mit Supernatanten kombinieren.
   1. Bereite eine 50%ige (w/v) Polyethylenglykol (PEG)-8000-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor, um eine 5× PEG-Fondlösung zu erhalten. Autoklaven zum Auflösen und Sterilisieren.
   2. Zentrifugiere die gesammelten viralen Supernatanten bei 300 x g für 5 Minuten, um die Restzellen zu pelletieren, und dann mit der Filtration fortzufahren.
   3. Filtern Sie 16 ml virales Supernatant mit einem 0,45 μm-Filter (entweder Spritze oder 50 mL Vakuumfilter) in das Rohr mit 4 mL PEG-Lösung, um eine endgültige 1× PEG-Konzentration zu erreichen und verbleibende Rückstände und Zellen zu entfernen.
   4. Decke die Tube ab und mische durch Inversion. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle viralen Präparate. Über Nacht bei 4 °C im Dunkeln lagern, mit optionaler sanfter Rührung.
   5. Am nächsten Tag sollten sichtbare Niederschläge vorhanden sein. Zentrifugieren Sie die Röhren bei 1400 x g für 20 Minuten bei 4 °C.
      HINWEIS: PEG-ausgefällte virale Pellets können bis zu 5 Tage vor der Zentrifugation bei 4 °C gelagert werden; allerdings kann der virale Titer mit längerer Inkubation abnehmen.
   6. Nach der Zentrifugation wird das Überlagerungsmittel vorsichtig entsorgt und ein kleines Volumen (etwa 100 μL) im Rohr gelassen, um das Pellet nicht zu stören.
   7. Zentrifugiere die Röhren 5 Minuten bei 300 x g, um so viel Flüssigkeit wie möglich von den Seiten des Rohrs zu sammeln. Dann entsorgen Sie vorsichtig den restlichen Supernatant.
   8. Um das Virus 100-fach zu konzentrieren, fügen Sie PBS zu 1/100 des ursprünglichen Volumens des viralen Supernatanten an das Pellet und suspendieren Sie das Pellet durch Pipettieren erneut (z. B. wenn Sie mit 16 ml viralem Supernatant beginnen, geben Sie 120–140 μL PBS zum Pellet, um das Endvolumen von 160 μL zu erreichen, was das Pelletvolumen berücksichtigt). Vermeiden Sie intensives Pipetteren; Aliquot das Virus.
      HINWEIS: Der erwartete Titer nach der PEG-Konzentration beträgt >1 × 10⁸ infektiöse Partikel/mL (ip/mL) für das LentiGuide-System und >1 × 10⁷ für das LentiCRISPR-System. Um eine Größenordnung niedrigere Titer können weiterhin akzeptabel sein, sollten aber anhand der Infektivität der Zielzelllinie und des erforderlichen Viralvolumens überprüft werden.
   9. Wenn keine Viruskonzentration erforderlich ist, wird das Virus aliquotiert, um die Frost-Tau-Zyklen zu minimieren. Lagern Sie konzentriertes oder unkonzentriertes Virus bei -80 °C. Bleichmittel und Müllplatten.
      HINWEIS: Für eine detailliertere Beschreibung der Lentiviralproduktion und -handhabung werden die Leser auf die etablierten Protokolle²⁰ verwiesen. Für häufige Probleme, die während der Lentivirusproduktion auftreten, siehe Ergänzende Tabelle 1.

	1 Brunnen von 6 Brunnenplatten	60 mm Platte	100-mm-Platte	150 mm Platte
PEI-Volumen (Aktienvolumen 1 mg/mL)	6 μL	9 μL	30 μL	60 μL
DMEM (-/-) Volumen	54 μL	100 μL	270 μL	540 μL

Tabelle 1: Erforderliche PEI- und DMEM-Volumina für verschiedene Platten für das PEI-Gemisch.

	1 Brunnen von 6 Brunnenplatten	60 mm Platte	100-mm-Platte	150 mm Platte
VSV-G	75 ng	150 ng	375 ng	750 ng
Gag-Pol	675 ng	1350 ng	3375 ng	6750 ng
Zielvektor	750 ng	1500 ng	3750 ng	7500 ng
DMEM (-/-) passt die Endlautstärke auf	60 μL	100 μL	300 μL	600 μL

Tabelle 2: Benötigte Plasmid- und DMEM-Volumina für verschiedene Platten für die DNA-Mischung.

3. Etablierung einer optimierten Puromycin-Auswahl für MDR-Zellen

HINWEIS: In chemoresistenten Zellen, die eine Überexpression von ABCB1 aufweisen, scheitert die Puromycinselektion aufgrund eines aktiven ABCB1-vermittelten Efflux von Puromycin, was die effektive Selektion von sgRNA-infizierten Zellen verhindert. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird Verapamil zusammen mit Puromycin verabreicht, um den ABCB1-vermittelten Efflux vorübergehend zu hemmen, wodurch intrazelluläre Ansammlung von Puromycin ermöglicht und nicht infizierte Zellen effizient eliminiert werden.

1. Bestimmung der Verapamil-Konzentration, die den ABCB1-vermittelten Arzneimittelausfluss blockiert, ohne die Zellviabilität zu beeinträchtigen. Dafür wird das Chemotherapeutika verwendet, gegen das die Resistenz erworben wurde (in diesem Fall Taxol), in Kombination mit steigenden Dosen von Verapamil.
   1. Samen SUM159PT Taxol-resistente und elterliche Zellen auf 96-Well-schwarze klare Unterplatten mit 2 × 10^{3 Zellen pro} Bohrloch im Dreifach. Cellen über Nacht bei 37 °C mit 5 %_CO2 inkubieren.
   2. Behandeln Sie die Zellen mit seriellen Verdünnungen von Verapamil (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 und 80 μM), wobei eine konstante Konzentration des Taxols (z. B. Erhaltungsdosis) unter allen Bedingungen aufrechterhalten wird.
   3. Nach 72 Stunden Behandlung wird die Zelllebensfähigkeit mit einem lumineszenzbasierten ATP-Quantifizierungs-Zellviabilitätstest bewertet. Bestimmen Sie die Verapamilkonzentration, die die Lebensfähigkeit nicht allein verringert (≥90–95% im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen), aber die Empfindlichkeit in resistenten Zellen wiederherstellt.
2. Um die Puromycinkonzentration zu bestimmen, die in Kombination mit Verapamil verwendet werden soll, werden Taxol-resistente Zellen SUM159PT Zellen in eine 96-Well-Platte mit 2 × 10³Zellen pro Well. Inkubieren Sie die Platte 16 Stunden bei 37 °C mit 5 %_CO2.
   1. Bereite serielle Verdünnungen von Puromycin (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 und 40 μg/mL) im Medium mit der zuvor festgelegten Verapamilkonzentration vor und behandle die Zellen entsprechend.
   2. Nach 72 Stunden wird die Zellviabilität mit einem lumineszenzbasierten ATP-Quantifizierungs-Zellviabilitätstest gemessen und die minimale Puromycinkonzentration bestimmt, die alle Zellen eliminiert (≤5 % Viability) in Anwesenheit von Verapamil. Diese Konzentration wird während des CRISPR-Screenings zur Auswahl verwendet.
      HINWEIS: Diese Schritte zur Optimierung der Arzneimittelkonzentration sind zelllinien- und kontextabhängig. Faktoren wie intrinsische Arzneimittelsensitivität, ABC-Transporter-Expression und Wachstumsrate können die effektiven Konzentrationen beeinflussen. Daher führen Sie diese Optimierung für jedes neue Zelllinien- und Widerstandsmodell durch. (Zum Vergleich: 5 μg/mL Puromycin in Kombination mit 20 μM Verapamil werden für Taxol-resistente Zellen verwendet, die in dieser Studie verwendet wurden.¹⁷). Zur Fehlersuche bei der Auswahl von Puromycin + Verapamil siehe Ergänzende Tabelle 1.

4. Berechnung der viralen Titration und der Multiplizität der Infektion (MOI)

1. Tag -1: Säen SUM159PT Taxol-resistente Zellen als 2 × 10⁵ in jedem Brunnen einer 6-Well-Platte mit vollständiger Ham's F12-Nährstoffmischung.
2. Tag 0: Vier serielle Verdünnungen des Virus in Hams F12-Nährstoffmischung mit Protaminsulfat (PS) bei 8 μg/mL durchführen. (Bei konzentrierten Viren beginnen Sie mit 1 μL und verdünnen Sie bei jeder Verdünnung zehnfach als 1 > ^10-1 > ^10-2 > ^10-3. Bei unkonzentrierten Viren passen die Mengen entsprechend an (z. B. 100 μL > 10 μL > 1 μL > 0,1 μL).
   1. Gib jedem der vier Brunnen 1 ml virushaltiges Medien. Lassen Sie einen Puromycin-Selektionskontrolle und einen weiteren als unbehandelten Kontroll.
3. Tag 1: Ersetzen Sie das virale Medium 16 Stunden nach der Infektion durch 2 ml frisches Medien.
4. Tag 2: Zellinhalte jedes Bohrlochs in eine 100 mm große Zellkulturschale mit Hams F12-Nährstoffmischung mit Puromycin + Verapamil in Konzentrationen aus Schritt 3.2 übertragen. Wenn unselektierte Zellen überkonfluent sind, wird ein definierter Bruchteil (z. B. 1/2) eingesät, was bei den endgültigen Berechnungen berücksichtigt wird.
   HINWEIS: Füllen Sie das Medium bei Bedarf in den folgenden 3-4 Tagen mit frischem Puromycin + Verapamil auf, bis alle Zellen der Kontrollplatte tot sind.
5. Tag 4–5: Wenn die Zellen in der Kontrollplatte tot sind, bestimmen Sie, welche Platten genügend Zellen zum Zählen enthalten. Trypsinisiere die Zellen, zähle und bestimme die Gesamtzahl der Zellen.
6. Nach der Zählung lebensfähiger Zellen berechnen Sie die Transduktionseffizienz und die Multiplizität der Infektion (MOI) wie folgt (verwenden Sie ergänzende Tabelle 2 als Vorlage):
   1. Berechnen Sie die Transduktionsrate (Anteil infizierter Zellen) mit der untenstehenden Formel
      
      
      N_Selektion: Gesamtzahl der Zellen nach Puromycin-Selektion in den infizierten Wells
      N_Kontrolle: Gesamtzahl der Zellen im nicht transduzierten, nicht selektierten Kontrollbrunnen
      p: Transduktionsrate (Anteil infizierter Zellen).
      HINWEIS: Wenn nur ein Bruchteil der unbehandelten Kontrollzellen gesät wurde, berücksichtigen Sie dies bei der Berechnung der_{N Kontrolle}
   2. Berechnen Sie MOI. Während der lentiviralen Transduktion folgen die Infektionsereignisse einer Poisson-Verteilung. Daher wird der Anteil der Zellen, die mit mindestens einem Virus infiziert sind, definiert als:
      p =1- e ^-MOI
      Daher berechnen wir MOI als:
      MOI = - ln(1-p)
   3. Berechnen Sie den lentiviralen Titer (infektiöses Partikel/Milliliter, IP/mL) basierend auf der Anzahl der infizierten Zellen:
      Titer (IP/mL) = (MOI x N_anfangend)/ Virusvolumen
      N_Start: Anzahl der für eine Infektion ausgesäten Zellen
      Virusvolumen: Volumen des pro Brunnen hinzugefügten Virus (in mL)
      HINWEIS: Berechnen Sie den lentiviralen Titer für jede Infektion separat und bestimmen Sie den endgültigen Titer, indem Sie den Durchschnitt der Brunnen mit proportionaler Virusmenge und Titerwert bestimmen. Bohrlöcher, die Sättigung oder Abweichung von der proportionalen Skalierung zeigen, sollten aus Titerberechnungen ausgeschlossen werden.

5. Erzeugung und/oder Validierung einer Cas9-exprimierenden stabilen Zelllinie.

HINWEIS: Dieser Schritt ist bei der Nutzung LentiGuide_EPIKOL erforderlich. Wenn bereits eine validierte Cas9-stabile Leitung verfügbar ist oder LentiCRISPR_v2_EPIKOL verwendet wird, gehen Sie direkt zu Abschnitt 6.

1. Produzieren Sie das Cas9-Lentivirus mit dem LentiCas9_blast Vektor, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
2. Am folgenden Tag Zellen infizieren, mit Ziel eines MOI von 10. Berechnen Sie die Virusmenge gemäß dem vorgesehenen MOI in Abschnitt 4, verwenden Sie die berechnete Menge des Virusvolumens und geben Sie sie direkt den Zellen in der Platte, die ein Kulturmedium mit 8 μg/mL Protaminsulfat (PS) enthält.
3. Ersetzen Sie das virale Medium 16 Stunden nach der Infektion durch frisches Medium
4. Am nächsten Tag wenden Sie die Blastizidin-Auswahl an, indem die Zellen das Kulturmedium mit der zuvor festgelegten Konzentration des Blastizidins (Endkonzentration pro Zelllinie mit einem Zellviabilitätstest wie in Abschnitt 3 beschrieben) gegeben werden, bis die uninfizierten Zellen eliminiert sind (typischerweise 6–7 Tage).
   HINWEIS: Wenn Cas9-exprimierende Zellen über längere Zeiträume vor dem Screening kultiviert werden, wiederholen Sie die Blastizidin-Selektion, um Cas9-negative Zellen zu eliminieren.
5. Cas9-Validierung (empfohlen): Validierung der Cas9-Aktivität mit Kontroll-sgRNAs, die essentielle Gene anvisieren (sgRNA-Sequenzen sind in der EPIKOL-Bibliothek verfügbar; siehe Ergänzende Tabelle 3) oder Reportersystemen wie dem grünen fluoreszierenden Protein (GFP) zur Bewertung der Knockout-Effizienz und -kinetik. Detaillierte Validierungsmethoden finden sich in einer früheren Studie¹⁹.

6. Epigenomweite CRISPR-Beseitigung der lentiviralen Bibliotheksinfektion und Screening

HINWEIS: Um eine genaue Genotyp-zu-Phänotyp-Kartierung sicherzustellen, erfordern gesammelte CRISPR-Screens eine Infektion mit niedrigem MOI und eine ausreichende Bibliotheksabdeckung (typischerweise 500×–1000), abhängig von der experimentellen Strenge und dem Verhalten der Zelllinien. Allgemeine Prinzipien von gepoolten genomweiten CRISPR-Screening-Workflows, einschließlich Bibliotheksdesign und experimenteller Einrichtung, siehe zuvor veröffentlichte Protokolle^21,22. Bei EPIKOL wird dringend empfohlen, während des gesamten Screens >500x Abdeckung einzuhalten, da ein Fallen unter diese Schwelle das Risiko eines stochastischen sgRNA-Ausfalls erhöht, insbesondere im Behandlungsarm des Screens. Die folgenden Berechnungen sind erforderlich, um die Anfangszellanzahl, die Transduktionseffizienz und das virale Volumen zu bestimmen, die für die EPIKOL-Transduktion erforderlich sind, um eine Low-MOI-Infektion durchzuführen, ohne die Bibliothekskomplexität zu beeinträchtigen.

1. Tag -1: Säe eine Gesamtmenge an Zellen, wie unten berechnet, in 100 mm oder 150 mm Zellkulturschalen mit einer entsprechenden Anzahl von Zellen pro Platte.
   1. Berechnen Sie die Anzahl der erfolgreich infizierten Zellen, um die gewünschte Bibliotheksabdeckung zu erreichen (verwenden Sie ergänzende Tabelle 2 als Vorlage):
      N_infizierte = (Anzahl der sgRNAs) × (Zielabdeckung)
   2. Berechnen Sie die Startzellzahl pro Replikat, um den Anteil uninfizierter Zellen bei einer Infektion mit niedrigem MOI (0,3–0,4) auszugleichen:
      N_Anfang = N_infiziert/p
      wobei p die Transduktionsrate (Anteil infizierter Zellen) ist, die anhand der Poisson-Verteilung bestimmt wird (siehe Schritt 4.6).
      HINWEIS: Diese Anpassung stellt sicher, dass bei einer Low-MOI-Infektion genügend einzelne sgRNA-infizierte Zellen im Pool vorhanden sind, um die gewünschte Bibliotheksabdeckung zu erreichen.
2. Tag 0 – Transduktion
   1. Berechnen Sie das erforderliche Viralvolumen pro Replikat
      Erforderliches virales Volumen = (N_beginnend × MOI) / (Viraler Titer (zuvor bestimmt ip/mL))
      HINWEIS: Die Transduktionseffizienz im Ziel-MOI-Bereich von 0,3–0,4 entspricht ungefähr
      26 %–33 % puromycinresistente Zellen vor der Selektion.
   2. Infizieren Sie Zellen mit dem berechneten Virusvolumen im vollständigen Kulturmedium, das 8 μg/mL Protaminsulfat (PS) enthält. Reduzieren Sie das Medienvolumen, um den Kontakt zwischen Viruszellen und Viruszellen während der Infektion zu erhöhen (z. B. 8 ml statt 10 ml für eine 100 mm Platte)
   3. Bereiten Sie unabhängige Infektionsmischungen für jede biologische Replikation vor.
      HINWEIS: Mindestens zwei biologische Replikate werden empfohlen; Drei werden bevorzugt. Biologische Replikate müssen separat transduziert, ausgewählt und gepflegt werden (einschließlich Medienwechsel und Passaging) und dürfen zu keiner Phase vor der Sequenzierung zusammengefasst werden.
3. Tag 1 – Viralmedien nach 16 Stunden durch frische Medien ersetzen und bei 37 °C mit 5 %_CO2 inkubieren
4. Tag 2 – Selektion transduzierter Zellen: Anwendung der Puromycin-Auswahl in Anwesenheit von Verapamil (Konzentrationen bestimmt in Schritt 3.2) zur Anreicherung von sgRNA-infizierten Zellen in SUM159PT Taxol-resistenten Zellen. Selektion wird fortgesetzt, bis alle Zellen in der nicht infizierten Kontrollplatte eliminiert sind (typischerweise ~3 Tage).
5. Tag 5 - T₀ Referenzprobenahme: Nach Abschluss der Puromycin-+Verapamil-Auswahl wird die Zellen trypsinisiert und von jeder biologischen Replikat, die dem während der Transduktion festgelegten Abdeckungslevel entspricht, ein initiales Zeitpunkt-Null-Pellet (T₀) gesammelt. Da sie als Referenz für die anfängliche Bibliotheksverteilung dient, sollten Sie Zellpellets sofort nach Abschluss der Auswahl sammeln, bevor ein Zellverlust eintritt. Säen Sie immer genügend Zellzahlen aus, um die Abdeckung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Nach der Auswahl von Puromycin + Verapamil variiert die Anzahl der überlebenden transduzierten Zellen je nach Verdopplungszeit der Zelllinie und der erreichten Transduktionseffizienz. Die überlebende Population erholt sich typischerweise nach Abschluss der Selektion auf die anfängliche Aussaatdichte und kann diese in schneller wachsenden Zelllinien übertreffen. Wenn die erhaltene Zellnummer es zulässt, sammeln Sie mehrere_T-0-Pellets und frieren Sie Ersatzproben bei -80 °C ein. Zusätzlich können EPIKOL-infizierte Zellen in flüssigem Stickstoff kryokonserviert werden, während die Abdeckung erhalten bleibt. Diese Backup-Bestände können im Falle eines unerwarteten Screen-Ausfalls oder für zukünftige alternative experimentelle Ansätze (z. B. Tests zusätzlicher Medikamentenbehandlungen) aufgetaut werden. Überprüfen Sie die Transduktionseffizienz mit einer nicht infizierten Steuerplatte, um sicherzustellen, dass die beabsichtigte Transduktionseffizienz erreicht wurde (siehe Abschnitt 4). Wenn die beobachtete Transduktionseffizienz höher als erwartet ist, wird das Experiment neu gestartet, um sicherzustellen, dass die Transduktion bei niedrigem MOI durchgeführt wird und so mehrere sgRNA-Integration pro Zelle verhindert wird.
6. Screen-Durchführung: Nach Abschluss der Cas9-vermittelten Genom-Editierung werden die Zellen für die in Abschnitt 5 bestimmte Dauer in Behandlungsgruppen aufgeteilt.
   HINWEIS: Dies dauert typischerweise 7–9 Tage nach der Transduktion, da die maximale Knockout-Effizienz etwa am Tag 7–²³ nach der Transduktion erreicht wird. Für epigenetische Ziele erlaubt das 9-tägige Zeitfenster auch Veränderungen auf Chromatinniveau vor Beginn der Arzneimittelauswahl.
   1. Zellen werden in experimentelle Arme aufgeteilt, wobei die Abdeckung erhalten bleibt: Eine ist die Kontrollgruppe, die eine Basiserkrankung mit DMSO erhält, und die andere ist die Behandlungsgruppe, die Taxol erhält.
   2. Kulturen für 14–16 Populationsverdoppelungen erhalten. Das Bevölkerungsverdopplungsniveau (PDL) wird berechnet wie folgt:
      PDL = PDL_s + 3,322 (Log C_f – log C_i)
      PDL_s = Anfangs-Populationsverdopplungsniveau
      C_i = initiale Zellnummer, die gesät wird
      C_{, f} = Gesamtzahl der Zellen am Ende einer Wachstumsperiode
   3. Überwachen Sie an jedem Durchgang die Lebensfähigkeit und Wachstumskinetik und vermeiden Sie Engpässe, indem Sie eine ausreichende Zellzahl aufrechterhalten. Passen Sie die Behandlungsintensität an, falls es zu übermäßigem Zelltod kommt.
      HINWEIS: Versuchen Sie, Backup-Zellpellets an jedem Durchgang zu sammeln, wöchentlich oder an bestimmten PDLs während des Bildschirms. Diese Backup-Proben können als alternative Zeitpunkte für die Sequenzierung oder als Optimierungsproben für den genomischen DNA-Extraktionsprozess dienen. Kryoservieren Sie Zellen periodisch, um unerwarteten Zellverlust zu vermeiden.
7. _T-Endprobe: Nach Erreichen des gewünschten PDL sammeln Sie für jede Replikation und jeden Zustand die finalen Zeitpunkt-Pellets (_T-final) durch Aufrechterhaltung der Bibliotheksabdeckung pro Pellet. Lagert die Pellets bei -80 °C bis zur nachgeschalteten GDNA-Extraktion.
   HINWEIS: Streben Sie an, den Bildschirm bei vergleichbaren PDLs zwischen den Armen zu beenden, auch wenn die Kulturdauer je nach Zustand unterschiedlich ist.

7. Genomische DNA-Extraktion

1. Extraktion von genomischer DNA (gDNA) mit einer validierten Methode (z. B. MN NucleoSpin Tissue Kit) mit geringfügigen Protokollanpassungen, um die Lysierungseffizienz aus großen, zusammengepoolten Zellpellets zu verbessern.
   1. Folgen Sie dem Gewebeprotokoll statt dem Zellprotokoll aufgrund der großen Pelletgröße. Erwägen Sie, das Reagenzvolumen zu erhöhen und mehrere Spin-Säulen pro Zellpellet zu verwenden (nicht mehr als 5 × 10 bis⁶ Zellen pro Säule), um eine effiziente Lyse zu gewährleisten.
      HINWEIS: Vor der Lyse kann das Wiederaufhängen des Pellets mit einer minimalen Menge PBS (~50 μL) die Lyseeffizienz verbessern. Eine unvollständige Lyse des Pellets kann die Spinsäule verstopfen, was zu einer verminderten DNA-Erträge führt.
   2. Befolgen Sie die Empfehlungen für Hochleistungs- und Hochkonzentrations-Elution. Eliutieren Sie gDNA in einem reduzierten Volumen des Elutionspuffers (etwa 2/3 des empfohlenen Volumens) pro Spalte, insbesondere wenn Zellpellets in mehrere Spalten unterteilt wurden.
2. Messe die Qualität und Menge der gDNA (z. B. Nanodrop).

8. EPIKOL-Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung aus genomischer DNA

1. Verwenden Sie ein dediziertes PCR-Gehäuse, um alle Bibliotheks-PCR-Schritte durchzuführen und so eine Plasmidkontamination während der gDNA-PCRs zu verhindern, da die Plasmid-Templates effizienter als genomische DNA amplifizieren und die sgRNA-Verteilung verzerren können.
   1. Reinigen Sie den Arbeitsplatz, die Mikropipetten und die Racks mit 10 % Bleichmittel bzw. 70 % Ethanol.
   2. Aliquot alle Reagenzien (insbesondere Grundierungen) vor der Verwendung in Einmalmengen, um das Risiko von Kreuzkontamination und Gefrier-Tau-Zyklen zu verringern.
   3. Lagere Reagenzien bei -20 °C und lasse sie während der PCR-Einrichtung auf Eis.
2. Optimieren Sie das Start-gDNA-Eingabevolumen, indem Sie eine Abdeckung von 200×–500× pro sgRNA anstreben, um eine angemessene Bibliothekskomplexität zu erhalten. Beispiel: Für die EPIKOL-Bibliothek werden gDNAs vorzugsweise aus Zellpellets extrahiert, die mit einer Abdeckung von 1000 × gesammelt werden, und die Endabdeckung von 250 × wird für die gDNA-Amplifikation verwendet.
   1. Berechnen Sie die erforderliche gDNA-Eingabe für die gewünschte Abdeckung wie folgt.
      gDNA-Menge = (Anzahl der sgRNAs) × Abdeckung × (66pg DNA/Kern)
      Beispiel: 8000 gRNA × (250× Abdeckung) × (6,6 pg DNA/Kern) = 13,2 μg gDNA/Probe sollten amplifiziert werden.
   2. Führen Sie eine Test-PCR mit externen und internen PCR-Reaktionsbedingungen in Tabelle 3, Tabelle 4, Tabelle 5 und Tabelle 6 mit zunehmenden Mengen an gDNA pro Reaktion durch (z. B. 1 μg, 3 μg, 6 μg), um die optimale gDNA-Menge pro Röhre zu bestimmen.
      HINWEIS: Unzureichende gDNA-Eingabe oder übermäßiges PCR-Cycling kann eine Amplifikationsverzerrung verursachen und die sgRNA-Abdeckung verzerren.
   3. Verwenden Sie ein 2%iges Agarosegel, um interne PCR-Produkte zu analysieren. Stellen Sie sicher, dass ein helles Band von etwa 350 bp beobachtet wird.
   4. Basierend auf der optimalen gDNA-Menge pro Röhrchen bestimmen Sie die Gesamtzahl der PCR-Reaktionen, die pro Probe erforderlich ist, um die gewünschte Bibliotheksabdeckung zu erreichen, wobei übermäßige Mengen an gDNA pro Einzelreaktion vermieden werden.
      HINWEIS: Wenn 13,2 μg Gesamt-gDNA benötigt werden und 3,3 μg gDNA pro Reaktion eine optimale Amplifikation ergibt, bereiten Sie vier parallele PCR-Reaktionen mit 3,3 μg gDNA in einem Reaktionsvolumen von 100 μL vor. In diesem Zusammenhang sollte das Volumen an gDNA 10 % des Reaktionsvolumens nicht überschreiten, um eine PCR-Hemmung durch übermäßigen Template-Input zu vermeiden.
3. Amplifizieren Sie sgRNA-Kassetten aus der gDNA-Vorlage (Erstes/Externes PCR)
   1. Amplifizieren Sie genomische Regionen, die die stabil integrierte lentivirale sgRNA-Kassette enthalten, mithilfe der in ergänzenden Tabelle 2 aufgeführten Primer. Führen Sie PCR-Reaktionen mit der in Schritt 8.2 bestimmten Menge an gDNA durch (siehe Tabelle 3) unter Verwendung der PCR-Reaktionsbedingungen in Tabelle 4. Bereiten Sie eine PCR-Kontrollröhre ohne DNA-Vorlage vor, um auf mögliche Kontamination zu prüfen, und lassen Sie die Röhren jederzeit auf Eis.
   2. Fügen Sie zuletzt DNA-Polymerase hinzu, mischen Sie gut durch Anklopfen oder Pipettieren und drehen Sie die PCR-Röhrchen kurz durch, bevor Sie sie in den Wärmezyklus geben. Führen Sie einen Hotstart durch, um eine unspezifische Verstärkung zu verhindern.
   3. Nach Abschluss der externen PCR werden alle PCR-Reaktionen in einem Mikrozentrifugenröhrchen zusammengeführt. Eine PCR-Reinigung oder Gel-Visualisierung nach externer PCR ist nicht erforderlich. Verwenden Sie das Pooled PCR-Produkt direkt als Vorlage im zweiten (internen) PCR. Lagere PCR-Produkte bei -20 °C.

Reagenz	Volumen pro Reaktion
dNTP (jeweils 10 mM)	2 μL
Phusion-Polymerase	1 μL
6' GC-Puffer	20 μL
Vorwärtszünder (10 μM)	5 μL
Rückwärtszünder (10 μM)	5 μL
gDNA	X μL
Nukleasefreies Wasser	bis zu 100 μL (67–X μL)
Gesamt	100 μL

Tabelle 3: Benötigte Reagenzien für das erste/externe PCR.

Zyklusnummer	Denaturierung	Glühen	Erweiterung
1	95 °C, 3 Min.
2–19	95 °C, 25 °C	65 °C, 20 S	72 °C 15 s
20			72 °C 3 min

Tabelle 4: PCR-Bedingungen für die erste/externe PCR.

4. Führen Sie Index-Barcoding (zweite/interne PCR) und Gelextraktion durch
   1. Während der zweiten (internen) PCR wird ein Reverse-Index-Primer verwendet, um die Proben als Barcode zu markieren; Daher werden für jede Probe unterschiedliche Indexprimer verwendet.
      HINWEIS: Für Bibliotheken, die mit dem pLentiCrispr v2-Backbone generiert werden, verwenden Sie Reverse-Index-Primer, die mit CT-Basen enden, beschriftet als lenticrisprv2_rev(Index X) (siehe Ergänzende Tabelle 2).
   2. Für Bibliotheken, die mit dem pLentiGuide-Backbone generiert wurden, verwenden Sie Indizes, die mit GT-Basen enden und in Supplementary Table 2 als rev_index_X gekennzeichnet sind.
   3. Bereiten Sie eine nach vorne versetzte Primermischung vor, indem Sie jeweils 2 μL aus jedem der neun versetzten Primer (Standard 100 μM) kombinieren und 162 μL nukleasefreies Wasser in ein steriles Mikrozentrifugenrohr geben. Die Endkonzentration des Primer-Gemisch beträgt 10 μM.
   4. Verwenden Sie das gepoolte externe PCR-Produkt als Eingabe und führen Sie pro Probe zwei parallele interne PCR-Reaktionen von 100 μL durch, indem Sie die Anweisungen in Tabelle 5 und Tabelle 6 verwenden. Bereiten Sie eine PCR-Kontrollreaktion mit der 'No template DNA'-Kontrolle von externem PCR (Schritt 7.3) als Eingabe vor, um potenzielle Kontaminationen zu überwachen.
   5. Gib zuletzt DNA-Polymerase hinzu, mische gut durch Anklopfen oder Pipetten, schleudere kurz die PCR-Röhren durch, bevor du sie in den Thermozyklus gibst. Führen Sie einen Hotstart durch, um unspezifische Verstärkungen zu verhindern.
   6. Kombiniert und führt man interne PCR-Reaktionen in 2% Agarose-Gel durch, um das Zielamplikon zu trennen.
      HINWEIS: In den PCR-Steuerungen ohne Vorlage sollten keine Bänder erkannt werden. Ein deutliches Band von etwa 337 bp für LentiCrispr_V2 und 357 bp für LentiGuide-Bibliotheken sollte beachtet werden. Ein oberes, unspezifisches Band von etwa 500 bp kann ebenfalls vorhanden sein und sollte von der nachgelagerten Verarbeitung ausgeschlossen werden.
   7. Laden Sie 12 μL (10 μL PCR-Produkt + 2 μL Ladefarbstoff) des internen PCR-Produkts auf, um die Bänder zu visualisieren, und laden Sie den Rest des PCR-Produkts in zusammengeführte oder benachbarte Brunnen, die für die Gelextraktion vorgesehen sind. Minimieren Sie die Agarose-Dicke, um die DNA-Rückgewinnung zu maximieren. Vermeiden Sie es, die Gel-Extraktionswege beim Visualisieren zu überbelichten, um den durch UV verursachten DNA-Schaden während der Gel-Exzision zu minimieren.
   8. Reinigen Sie PCR-Produkte aus Agarose-Gel mit einem speziellen Gel-Extraktionsset (z. B. NucleoSpin Gel und PCR Clean-up) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Missen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektrophotometer. Lagere PCR-Produkte bei -20 °C.
      HINWEIS: Eine Mindestkonzentration von >20 ng/μL nach der Gelextraktion ist für eine korrekte Sequenzierung erforderlich. Wenn die erforderliche Ausbeute selbst mit drei parallelen internen PCR-Reaktionen nicht erreicht werden kann, isolieren Sie neue gDNA und wiederholen Sie den Prozess.

Reagenz	Volumen pro Reaktion
dNTP (jeweils 10 mM)	2 μL
Phusion-Polymerase	1 μL
6' GC-Puffer	20 μL
Forward Stagger Mix Primer (10 μM)	5 μL
Umgekehrter Indexprimer (10 μM)	5 μL
Externe PCR	5 μL
Nukleasefreies Wasser	62 μL
Gesamt	100 μL

Tabelle 5: Erforderliche Reagenzien für die zweite/interne PCR.

Zyklusnummer	Denaturierung	Glühen	Erweiterung
1	95 °C, 3 Min.
2–25	95 °C, 25 °C	65 °C, 20 S	72 °C 15 s
26			72 °C 3 min

Tabelle 6: PCR-Bedingungen für die zweite/interne PCR.

9. Sequenzierung

1. Bestimmen Sie die erforderliche Anzahl der zugeordneten Lesungen basierend auf der Bibliotheksabdeckung, die am Anfang des Bildschirms definiert ist. Bei der Annahme einer Mapping-Effizienz von 60–70 % wird eine höhere Gesamtzahl der Leseaufgaben angefordert, um den Leseverlust auszugleichen. Für eine Abdeckung von 1000× der EPIKOL-Bibliothek sind ~8 Millionen abgebildete Lesungen erforderlich, was insgesamt 10–12 Millionen Lesungen entspricht.
2. Führen Sie vor der Sequenzierung eine Qualitätskontrolle der Sequenzierungsbibliotheken mit Tapestation oder Bioanalyzer durch, um die Bibliotheksgröße und -integrität zu bestätigen.
3. Pool-Sequenzierungsbibliotheken aus verschiedenen Proben vor der Sequenzierung, da diese eindeutig mit Indexprimern barcodeisiert sind.
4. Bestätige die Lesestruktur (R1/R2-Orientierung) und Demultiplexing-Anforderungen mit der Sequenzierungseinrichtung. 2× 150 bp gepaarte Sequenzierung wird in Illumina HiSeq, Novaseq oder einer äquivalenten Illumina-kompatiblen Sequenzierungsplattform vorgeschlagen. Erwägen Sie, mindestens 5 % PhiX-Spike-in zu beantragen, um die Sequenzenvielfalt zu verbessern.

10. Überblick über die Sequenzierungsanalyse von EPIKOL

1. Verwenden Sie die MAGeCK-Analysepipeline, um gepaarte FASTQ-Dateien zu analysieren²⁴. Organisieren Sie jede biologische Replikation als individuelle Eingabedatei.
2. Verwenden Sie die sgRNA-Eingabedatei von EPIKOL, die mit MAGeCK kompatibel ist, als Referenzbibliothek (bereitgestellt in ergänzender Tabelle 4) und wenden Sie die Zählfunktion an, um sgRNA-Lesungen aus einzelnen FASTQ-Dateien zu quantifizieren, um für jede Replikation und jeden Zustand Rohzähldateien zu erstellen.
   1. Normalisieren Sie jede Zähldatei mit Reads pro Million (RPM)-Normalisierung, um die Qualität und Verteilung jeder Probe zu überprüfen, indem Sie die normalisierten sgRNA-Zählgraphen¹⁴ visualisieren.
3. Führen Sie eine zweite -Zähl-Funktion aus, um Zählungen mit Standardeinstellungen in einer einzigen Datei zu einer einzigen Datei zusammenzuführen.
4. Führe die -test-Funktion aus, um genbezogene Änderungen mithilfe von zusammengeführten Rohzähldateien zu identifizieren. Um die Screen-Leistung zu bewerten, vergleichen Sie_T-Endproben mit den_T-0-Proben und überprüfen Sie die Verteilung der nicht-zielgerichteten Kontroll- und essentiellen gen-zielorientierten sgRNAs.
   HINWEIS: Es ist entscheidend, die Erschöpfung positiver Kontrollgene in jedem Screen-Arm zu bewerten, um die Screen-Leistung zu bewerten. Es wird erwartet, dass es biologische Unterschiede zwischen Replikaten im medikamentenbehandelten Screen-Arm gibt, da die Medikamentenexposition stochastische Unterschiede in der zellulären Antwort verursachen kann. Diese Variabilität ist chemoresistenztesten Screenings innewohnend und bedeutet nicht zwangsläufig eine schlechte Screenqualität. Daher müssen während des Hit-Callings mindestens drei biologische Wiederholungen zusammen analysiert werden, und Treffer sollten als die Gene bestimmt werden, die mindestens 6 von 10 wirksamen sgRNAs besitzen.
5. Um medikamentinduzierte Veränderungen in sgRNA-Häufigkeiten und Gen-Effekten zu identifizieren, vergleichen Sie T-final-Taxol-behandelte Proben mit T_final-DMSO, wobei die DMSO-Gruppe als Kontrollgruppe verwendet wird.
6. Wenden Sie eine FDR-Grenze von FDR < 0,05 an, um deplezierte Gene in der Behandlungsgruppe zu identifizieren und so die Gene zu enthüllen, die zur Fitness oder Resistenz der Taxol-resistenten Zellen beitragen.

Ergebnisse

Zur Untersuchung epigenetischer Regulatoren der Chemoresistenz bei TNBC ist das Gesamtprotokoll mit der SUM159PT Zelllinie in Abbildung 1 dargestellt. Zunächst wurden die IC₁₀ - und_IC-50-Werte von Taxol in SUM159PT Zellen durch Behandlung der Zellen mit erhöhten Taxolkonzentrationen bestimmt (Abbildung 2A). Eine schrittweise Dosissteigerungsmethode wurde verwendet, um Taxol-resistente SUM159PT Zellen zu erzeugen. Nach einigen Monaten zeigt eine Verschiebung der IC50-Werte die erfolgreiche Etablierung eines resistenten Phänotyps mit diesem Protokoll im Vergleich zu Kontrollzellen, die parallel ohne Taxol-Exposition durchgeführt wurden (Abbildung 2B).

Abbildung 1: Schaltplan des EPIKOL-Screens in Taxol-resistenten SUM159PT Zellen. Gesamtablauf des EPIKOL-Screenings in den erzeugten Taxol-resistenten SUM159PT Zellen. Die Figur wurde mit BioRender.com erstellt Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur anzusehen.

Nachdem die resistenten Zellen etabliert waren, wurden mehrere Experimente durchgeführt, um ihre phänotypischen und molekularen Veränderungen zu charakterisieren. Die Proliferationskapazitäten resistenter Zellen unter Taxol-Behandlung wurden mit einem Koloniebildungstest im Vergleich zu elterlichen Zellen bewertet. Wie in Abbildung 2C,D zu sehen ist, behalten resistente Zellen ihre Proliferationskapazität unter Taxol-Behandlung, während die elterlichen Zellen nicht überleben können. Dieser Test ist einer der wichtigen Schritte bei der Charakterisierung resistenter Zellen und zeigt, wie die Proliferationskapazität unter medikamentöser Behandlung zwischen elterlichen und resistenten Zellen bewertet werden kann.

Im Rahmen der Charakterisierung der resistenten Zellen wurde RNA-Sequenzierung an elterlichen und resistenten Zellen durchgeführt, um die transkriptomischen Veränderungen im Zusammenhang mit Chemoresistenz zu analysieren (Abbildung 2E). Eines der am stärksten hochregulierten Gene in resistenten Zellen war ABCB1, gefolgt von einigen weiteren ABC-Transportern, darunter ABCB4 und ABCA5. Die Hochregulierung der ABCB1-Expression wurde mit der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) validiert, was zeigt, wie Veränderungen der Kandidatengenexpression mit qPCR validiert werden können (Abbildung 2F).

Abbildung 2: Entstehung resistenter Zellen und ihre Charakterisierung. (A) Schema, das die Entstehung von Taxol-resistenten SUM159PT Zellen mit der Dosissteigerungsmethode zeigt. (B) Dosis-Antwortkurve, die die Differenz zwischen den IC50-Werten der elterlichen und erzeugten resistenten Zellen zeigt. Elterlicher IC50 = 6 nM und Taxol-resistenter IC50 = 355,4 nM. (C) Koloniebildungstest in Anwesenheit von Taxol. (D) Quantifizierung von Kolonieflächen in (C.) Die zweiseitige Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukeys Post-hoc-Test wurde mit Prism 8 (GraphPad Software) angewendet. Die Signifikanzniveaus wurden als *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 festgelegt. (E) Vulkandiagramme zeigen unterschiedlich exprimierte Gene in Taxol-Res-Zellen im Vergleich zu Elternzellen, mit einem LFC>2- und p<0,001-Cutoff. (F) qPCR-Validierung der ABCB1-mRNA-Expression in Eltern- und Taxol-Res-Zellen. P-Werte, die durch den zweiseitigen Schüler-t-Test im Vergleich zur Kontrollgruppe bestimmt werden; **P < 0,01. Panel A wurde mit BioRender.com erstellt. Die Abbildung E wurde mit Genehmigung von Yedier-Bayram et ^al.17 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Nachdem eine Überexpression von ABCB1 und anderen ABC-Transportern in Taxol-resistenten Zellen gezeigt und das breite Substratspektrum von ABCB1 berücksichtigt wurde, wurde das Vorhandensein des MDR-Phänotyps bewertet. Zu diesem Zweck wurden Taxol-resistente Zellen mit mehreren Medikamenten behandelt, die als Substrate des ABCB1-Transporters bekannt sind und unterschiedliche Wirkmechanismen besitzen, und ihre Arzneimittelsensitivität wurde bewertet (Abbildung 3A, B). Im Einklang mit dem beobachteten ABC-Transporterexpressionsprofil zeigten Taxol-resistente Zellen auch Resistenz gegen Doxorubicin und Vincristin, was das Vorhandensein eines MDR-Profils bestätigte und veranschaulichte, wie der Phänotyp der Multiarzneimittelresistenz funktional bewertet werden kann.

Der MDR-Phänotyp stellt eine Herausforderung für den CRISPR-basierten Screening-Ansatz EPIKOL dar, da die Bibliothek die Auswahl von Puromycin zur Anreicherung transduzierter Zellen benötigt. Da Puromycin durch ABCB1-vermittelten Arzneimittelefflux aus den Zellen ausgepumpt werden kann, ist die Puromycin-Selektion in resistenten Zellen möglicherweise nicht effizient (Abbildung 3C). Daher können nicht-transduzierte Zellen die Selektion überleben und die Screen-Ergebnisse stören.

Um diese Einschränkung zu beheben, wurde der Auswahlprozess von chemoresistenten Zellen mit MDR-Profil vor dem EPIKOL-Screening optimiert. Verapamil, ein ABCB1-Inhibitor der ersten Generation, wurde verwendet, um den ABC-Transporter-vermittelten Medikamenten-Efflux zu blockieren und so die intrazelluläre Ansammlung von Chemotherapeutika oder Puromycin zu ermöglichen (Abbildung 3D). Obwohl Verapamil allein die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinflusste, stellte es in Kombination mit Chemotherapeutika die Arzneimittelsensitivität wieder her (Abbildung 3E,F). Ähnlich zeigten Puromycin-Kill-Kurven in Kombination mit nicht-toxischen Verapamil-Dosen, dass die ABCB1-Hemmung die Puromycin-Sensitivität wiederherstellt (Abbildung 3G, H). Dies stellt sicher, dass die Zellen, die die Selektion überleben, diejenigen sind, die erfolgreich transduziert werden, und nicht Zellen, die durch ABCB1-gesteuerte Medikamentenauswirkungen der Selektion entkommen. Die Etablierung eines effektiven Selektionsablaufs in chemoresistenten Zellen ist entscheidend für zuverlässige EPIKOL-Screen-Ergebnisse.

Abbildung 3: Phänotyp der Multiarzneimittelresistenz und Wirkung von Verapamil auf resistente Zellen. Dosis-Antwort-Kurven, die den Unterschied zwischen IC50-Werten der elterlichen und erzeugten resistenten Zellen mit (A) Doxorubicin, (B) Vincristin und (C) Puromycin zeigen. (D) Schaltplan, der die Auswahl von Taxol-resistenten SUM159PT Zellen mit und ohne Verapamil zeigt. Die Figur wurde mit BioRender.com geschaffen. (E) Zellviabilitätstest mit Taxol-Res-Zellen, um die optimale Verapamilkonzentration mit Taxol zu bestimmen. (F) Verapamil resensibilisiert Taxol-resistente Zellen gegenüber Taxol. (G) Verapamil verändert die Reaktion der elterlichen Zellen auf Puromycin nicht. (H) Verapamil stellt die Puromycin-Sensitivität in Taxol-Res-Zellen wieder her. Die Tafeln A, B und F wurden mit Genehmigung von Yedier-Bayram et ^al.17 wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Um neuartige Regulatoren für Chemoresistenz bei TNBC zu finden, wurde ein EPIKOL-Screening mit Taxol-resistenten SUM159PT Zellen durchgeführt, wie in Abbildung 4A dargestellt. Da resistente Zellen langsamer wachsen als Elternzellen¹⁷, wurden die Populationsverdoppelungswerte während des gesamten Screenings sowohl in Taxol- als auch in DMSO-behandelten Gruppen überwacht, um die benötigte Zeit für 16 Populationsverdopplungen zu bestimmen (Abbildung 4B). Dementsprechend wurde das EPIKOL-Screening für die mit DMSO behandelte Gruppe etwa am 35. Tag abgeschlossen, während die mit Taxol behandelte Gruppe weitere 15 Tage kultiviert wurde, um das gleiche Populationsverdoppelungsniveau zu erreichen.

Nach der Sequenzierung wurde die MAGeCK-Analysepipeline verwendet, um die Wirkung von sgRNAs, die dasselbe Gen anvisieren, zu kombinieren und die Gen-Level-Veränderungen beim Knockout²⁴ offenzulegen. Die EPIKOL-Bibliothek enthält sgRNAs, die essentielle Gene als positive Kontrollgruppen anvisieren; der erste Qualitätskontrollschritt bestand darin, zu prüfen, ob diese sgRNAs wie erwartet erschöpft waren. Wasserfalldiagramme veranschaulichen die Log2-Falten-Veränderungen essentieller Gene über verschiedene Vergleiche hinweg (Abbildung 4C–E). Wenn die letzten Zeitpunktproben aus DMSO- oder Taxol-behandelten Erkrankungen mit dem ursprünglichen Zeitpunkt verglichen wurden, waren fast alle essentiellen Gene beim Knockout erschöpft, was auf eine effektive Screen-Leistung hinweist (Abbildung 4C,D). Diese Erschöpfung wird jedoch nicht klar beobachtet, wenn die beiden Endpunktproben (DMSO-behandelt und Taxol-behandelt) miteinander verglichen werden, wie erwartet, da essentielle Gene für das Zellüberleben unter beiden Bedingungen erforderlich sind (Abbildung 4E).

Eine alternative Visualisierung der Bildschirmergebnisse ist das Vulkandiagramm, das die Log2-Faltungsänderungen zusammen mit der statistischen Signifikanz (den p-Wert oder FDR-Werten) darstellt. Im EPIKOL-Screen, das in Taxol-resistenten Zellen durchgeführt wurde, wurden mehrere positive Kontrollgene als signifikant depleziert identifiziert, was die Zuverlässigkeit des Screens weiter unterstützt, da die Erschöpfung von sgRNAs, die positive Kontrollgene anvisieren, eine typische Qualitätskontrolle eines erfolgreichen Screens demonstriert (Abbildung 4F). Neben wesentlichen Genkontrollen enthält die EPIKOL-Bibliothek kontextspezifische positive Kontroll-sgRNAs, die mehrere ABC-Transportergene anvisieren. Wie erwartet zeigten normalisierte Zählungen von ABCB1-sgRNAs in verschiedenen Gruppen die signifikante Abnahme von ABCB1-zielgerichteten sgRNAs speziell in der mit Taxol behandelten Gruppe (Abbildung 4G). Insgesamt zeigt dies, wie Veränderungen auf sgRNA-Ebene interpretiert werden können, um Kandidatengene zu identifizieren, die mit der Arzneimittelantwort assoziiert sind.

Abbildung 4: EPIKOL-Screening ergibt Taxol-resistente Zellen und Beispielgraphen. (A) Schaltplan des EPIKOL-Screen-Protokolls. (b) Population Doublebling Level (PDL) von Taxol-Res-Zellen. (C–E) Wasserfalldiagramme, die Ergebnisse des EPIKOL-Screenings an Taxol-Res-Zellen zeigen und essentielle Gene hervorheben, DMSO-behandelte Gruppe im Vergleich zum ursprünglichen Zeitpunkt im Panel C, Taxol-behandelte Gruppe im Vergleich zum Anfangszeitpunkt im Panel D, Taxol-behandelte Gruppe im Vergleich zur DMSO-behandelten Gruppe im Panel E. (F) Vulkandiagramm, das Log2Fold-Veränderungen der Gene in Taxol-behandelten Proben im Vergleich zum ursprünglichen Zeitpunkt zeigt. Gene, die p<0,05 enthalten, wurden gefärbt und beschriftet. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung geändert:¹⁷. (G) Lese pro Million (rpm) Zählungen von 10 verschiedenen ABCB1 sgRNA-Graphen aus EPIKOL. Panel A wurde mit BioRender.com erstellt. Panel E wurde mit Genehmigung von Yedier-Bayram et ^al.17 wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Tabelle 1: Fehlerbehebungstabelle.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Berechnung des viralen Titers und MOI.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: sgRNA-Liste der EPIKOL-Bibliothek.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 4: Primer, die bei der Erstellung von EPIKOL-Sequenzbibliotheken verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

CRISPR-Cas9-basierte Pooling-Screening-Ansätze sind in verschiedenen zellulären Kontexten gut etabliert. Allerdings stellt das Screening in chemoresistenten Zellen deutliche Herausforderungen dar und erfordert zusätzliche Optimierung. Da chemoresistente Zellen als wertvolle Modelle zur Untersuchung der Verwundbarkeiten chemoresistenter Tumore dienen, ist es wichtig, diese Einschränkungen bei Screening-Strategien zur zuverlässigen Identifizierung genetischer oder epigenetischer Regulatoren der Chemoresistenz anzugehen.

Die Bildung chemoresistenter Zelllinien selbst kann umständlich sein und hängt stark vom verwendeten Chemotherapeutika ab. Während sich Zellen leicht an bestimmte Medikamente anpassen können, sind sie für andere sehr anfällig²⁵. Daher ist es wichtig, zelllinienspezifische IC50-Werte vor dem Protokoll zur Erzeugung resistenter Zelllinien zu bestimmen. In Fällen, in denen Zellen die IC50-Substanzexposition über mehrere Durchgänge nicht vertragen, ist es möglich, mit einer niedrigeren Arzneimittelkonzentration (z. B. IC10-20) zu beginnen (siehe Protokollabschnitt 1)¹⁷. Da die Erwerbung von Resistenz ein stochastisches Ereignis ist, könnten mehrere Zellbrunnen/Platten gleichzeitig behandelt werden, um die Wahrscheinlichkeit der Aufnahme resistenter Zellen zu erhöhen. Es ist entscheidend, die erhaltene arzneimittelresistente Zellpopulation umfassend zu charakterisieren, um transkriptionelle und phänotypische Veränderungen während des Dosis-Eskalationsverfahrens im Vergleich zu ihrem naiven Zustand zu beschreiben. Globale Profilierungsmethoden wie RNA-seq können verwendet werden, um differenziell exprimierte Gene relativ zur Elternlinie zu identifizieren. Funktional sollte die erworbene Arzneimittelresistenz mit Zellviabilitäts- und Proliferationstests validiert werden, um zu zeigen, dass resistente Zellen unter medikamentösen Behandlungsbedingungen, die für die Elternzellen zytotoxisch sind, das Überleben erhalten. Außerdem sollten potenzielle Veränderungen ihrer Proliferationskapazität und Wachstumsrate im Vergleich zur elterlichen Zelllinie gemessen werden, um deren jeweilige PDLs zu berechnen. Da bekannt, dass erworbene Taxol-Resistenz zumindest teilweise durch ABC-vermittelten Arzneimittelefflux vermittelt wird, sollte die Expression wichtiger ABC-Transporter (z. B. ABCB1) auf mRNA- und Proteinebene mittels qPCR und Western Blotting bewertet werden und durch transkriptomische Daten ergänzt werden. Basierend auf dem ABC-Transporterexpressionsprofil sollte das Vorhandensein des MDR-Phänotyps berücksichtigt und die Resistenz gegen andere Chemotherapeutika bewertet werden. In unserer vorherigen Studie charakterisierten wir die Taxol-resistenten Zelllinien und identifizierten ABCB1 als eines der am stärksten regulierten Gene, wobei wir schlussfolgerten, dass ABCB1-vermittelte Multiarzneimittelresistenz zu einem Versagen bei der Puromycin-Selektion¹⁷ führen kann. Daher muss nach der Erzeugung der resistenten Zellen die Expression von ABC-Transportern und des MDR-Phänotyps vor jedem Transfektionsverfahren bewertet werden.

Die Dosis-Eskalationsmethode bietet Vorteile gegenüber Hochdosis-Expositionsprotokollen, da die Zellen in jedem Schritt vor der Dosiserhöhung kryokonserviert werden können, was Flexibilität bietet und vor Kulturverlust schützt. Darüber hinaus ermöglicht eine allmähliche Dosissteigerung den Erwerb von Resistenzphänotypen über die Zeit, was eine adaptive Evolution ermöglicht; im Gegensatz zur akuten Hochdosisbehandlung, die zur Selektion bereits vorhandener resistenter Subpopulationen führt. Ihr schrittweiser Verlauf ermöglicht es Forschern, gezielt das gewünschte Widerstandsniveau zu wählen, bei dem die Selektion gestoppt werden und die Eigenschaften des resultierenden Phänotyps bewertet werden. Außerdem könnten die Zwischenschritte der Dosiserhöhung genutzt werden, um Mechanismen erworbener Resistenz zeitlich zu untersuchen. Gemäß der zugrunde liegenden biologischen Frage könnten verschiedene Resistenzwerte erreicht werden, um entweder frühe adaptive Mechanismen mit niedrigeren Resistenzniveaus oder stabile und vollständig etablierte Resistenzphänotypen in resistenteren Zellen zu untersuchen. Außerdem variieren klinisch relevante Resistenzschwellenwerte erheblich je nach Medikament, Zelllinie und intrinsischer Proliferationsrate; daher kann der Zeitrahmen der Dosiserhöhung entsprechend abweichen (in unserem Fall dauerte die Erzeugung von Taxol-resistenten Zellen etwa 6 Monate). Im Einklang mit dieser Begründung haben wir in unserer vorherigen Studie zwei unterschiedliche Resistenzniveaus bei SUM159PT Zellen festgestellt und deren unterschiedliche und gemeinsame Merkmale verglichen¹⁷. Daher empfehlen wir, dass Forscher den Zielbereich des IC50-Bereichs des interessanten Medikaments entsprechend der klinischen und biologischen Relevanz definieren.

Es ist gut belegt, dass der Rückzug des Medikamentendrucks zum Verlust der Chemoresistenz führen kann, da Zellen ihr Epigenom und Transkriptom²⁵ umverdrahten können. Aus diesem Grund wird empfohlen, die Stabilität des Resistenzphänotyps über mehrere Monate hinweg zu bewerten. Wenn Zellen beim Medikamentenentzug dazu neigen, wieder in einen empfindlichen Zustand zurückzufallen, können resistente Zellen in Anwesenheit der Erhaltungsdosis, die typischerweise der endgültigen Arzneimittelkonzentration während der Resistenzbildung entspricht, kultiviert werden, um ihren Resistenzphänotyp zu erhalten. Während in-vitro-Modelle für chemoresistente Zelllinien praktisch, reproduzierbar und weit verbreitet zur Untersuchung erworbener Chemoresistenz verwendet werden, spiegeln sie möglicherweise nicht vollständig die phänotypische Heterogenität bei Patiententumoren ab und fehlen die Tumormikroumgebung, Immuninteraktionen und räumliche Heterogenität ^3,4,25. Darüber hinaus kann ein längeres Passieren während der Resistenzgeneration genetische und epigenetische Veränderungen verursachen, die von denen in Patientenproben beobachtet abweichen und so die translationale Relevanz identifizierter Treffer einschränken können. Daher sollten durch dieses Protokoll identifizierte Kandidatengene und -mechanismen in klinisch relevanteren experimentellen Systemen wie Kokulturmodellen, patientenabgeleiteten Organoiden oder in vivo-Studien weiter validiert werden. EPIKOL bietet Vorteile durch seine fokussierte Natur, wenn komplementäre Screenings auf diesen Modellen durchgeführt werden sollen, wobei die maximale Anzahl der erhaltenen Zellen von Natur aus begrenzt ist.

Chemoresistente Zellen wachsen oft langsamer als ihre elterlichen Gegenstücke, was für genomweite Screens, die große Zellpopulationen benötigen, eine praktische Herausforderung darstellen kann. Fokussierte Bibliotheken wie EPIKOL bieten den Vorteil, einen Screen mit weniger Ausgangsmaterial durchzuführen und gleichzeitig eine erhöhte sgRNA-Tiefe pro Gen zu bieten, wodurch die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit innerhalb des definierten Zielraums verbessert werden. EPIKOL erfasst jedoch von Natur aus nur epigenetische Resistenzmechanismen und deckt nicht-epigenetische Beitragende zur Chemoresistenz nicht ab. Die Wahl der Bibliothek sollte daher von früheren Experimenten und der spezifischen biologischen Fragestellung geleitet werden. Nutzer dieser Bibliotheken sollten sich der Einschränkungen der fokussierten Bibliotheken bewusst sein und die Ergebnisse im Rahmen der Bibliothek interpretieren.

Ein großes Hindernis beim CRISPR-Screening chemoresistenter Modelle ist das Entstehen des MDR-Phänotyps, angetrieben durch die ABC-Transporter-Upregulation ^9,10. Verschiedene ABC-Transporter vermitteln den Ausfluss verschiedener Substrate. Sobald eine medikamentenresistente Zelllinie gebildet wurde, ist es wichtig zu prüfen, ob sich die Resistenz auch auf andere Chemotherapeutika ausdehnt. Die Puromycinresistenz wird hauptsächlich durch eine Überexpression von ABCB1 verursacht, was den Selektionsprozess der gepoolten CRISPR-Screening-Ansätze beeinflusst, da die meisten dieser Bibliotheken Puromycin-Selektionskassetten zur Anreicherung transduzierter Zellen enthalten. Hier verwendeten wir Verapamil, einen ABCB1-Inhibitor der ersten Generation, um die intrazelluläre Ansammlung von Puromycin zu erleichtern und gezielt die nicht transduzierten resistenten Zellen zu eliminieren, die sonst der Selektion durch ABCB1-vermittelten Arzneimittelausfall entgehen würden. Da Verapamil reversibel an ABCB1 bindet, wird die ABCB1-Funktion innerhalb weniger Stunden nach der Entfernung von Verapamil wiederhergestellt. Daher verleiht Verapamil während der anschließenden medikamentösen Behandlungsphase des Screenings keine zusätzliche Verwundbarkeit gegenüber resistenten Zellen. Allerdings sollten mehrere Einschränkungen von Verapamil anerkannt werden. Da Verapamil ein Inhibitor von Kalziumkanälen und anderen Transportern ist, kann es die zelluläre Physiologie über die ABCB1-Hemmung¹⁰ hinaus beeinflussen. Zusätzlich variiert die effektive Verapamilkonzentration zwischen Zelllinien und MDR-Modellen, abhängig vom Grad der ABCB1-Expression und der Aktivität anderer Transporter. Daher sollte die Verapamilkonzentration für jede Zelllinie optimiert werden, und eine neue Generation von ABCB1-Inhibitoren, die spezifischer für ABCB1 sind, kann in Betracht gezogen werden, wenn Off-Target-Effekte ein Problem darstellen. Als weiterer entscheidender Schritt sollte die virale Titerung an der resistenten Zelle selbst statt an den elterlichen Gegenstücken durchgeführt werden, da Infektivität und Selektierbarkeit bei resistenten Zellen oft unterschiedlich sind.

Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Bestimmung der angemessenen Dauer des Screenings, da chemoresistente Zellen oft langsamer wachsen als ihre übereinanderfolgenden Eltern²⁶. Um diesen Unterschied auszugleichen, verwendeten wir Populationsverdopplungsberechnungen (Protokollabschnitt 6), um zu bestimmen, wann die Kontroll- und Behandlungsgruppen den gewünschten PDL-Schwellenwert erreichten. Screenings können daher an verschiedenen Tagen abgebrochen werden, was vergleichbare Populationsverdopplungen ermöglicht und eine sicherere Interpretation der sgRNA-Effekte in der Behandlungsgruppe ermöglicht.

Bibliotheksvorbereitungs-PCRs sind für die Genauigkeit der nachgelagerten Trefferidentifikation von erheblicher Bedeutung. Eine durch niedrige gDNA-Eingabe und erhöhte PCR-Zyklen eingeführte Verzerrung kann zur Amplifikation bestimmter sgRNA-Sequenzen führen, was zu falsch-positiven Anreicherungen oder Depletionen führt. Um dem entgegenzuwirken, empfehlen wir, so viel gDNA wie möglich zu verwenden, die von diesem Protokoll angebotenen PCR-Zykluszahlen einzuhalten und vor der Sequenzierung parallele Reaktionen zum Pool durchzuführen. Wenn möglich, sollte die Bibliotheksabdeckung nicht unter die empfohlenen Schwellenwerte (>300× Abdeckung) fallen, um eine zuverlässige Detektion erschöpfter sgRNAs zu gewährleisten, anstatt einen stochastischen Ausfall von sgRNAs mit geringer Häufigkeit aufgrund geringer Abdeckung.

Nach der Sequenzierung verwendeten wir das MAGeCK-Analyse-Framework und führten mehrere nachgelagerte Qualitätskontrollanalysen sowie Dateninterpretationsschritte^durch. Zunächst wurde die Hauptkomponentenanalyse (PCA) verwendet, um die Verteilung und Reproduzierbarkeit biologischer Replikate zu bewerten (Daten nicht gezeigt, MAGeCK-Ausgabe). Replizierte Clusterbildung in PCA wird innerhalb jedes Arms erwartet; Eine höhere Variabilität im medikamentenbehandelten Arm ist jedoch ein häufiges Merkmal von Chemoresistenzscreens, da das Medikament stochastische Veränderungen auslösen kann. Wenn sich die positiven und negativen Kontrollen in jedem Arm wie erwartet verhalten, verhindert diese Variabilität nicht, dass echte positive Treffer identifiziert werden. Anschließend wurden Reads pro Million (RPM) Normalisierung der sgRNA-Zählungen zu den ersten und finalen Zeitpunkten angewendet, um zu bewerten, ob sgRNAs, die essentielle Gene anvisieren, wie erwartet^{erschöpft waren 14}. Anschließend wurde mediane Normalisierung verwendet, um sgRNA-Effekte zu aggregieren, was die Identifizierung von Gen-Level-Depletionen^{ermöglichte 24}. Genniveau-Depletionswerte wurden mithilfe von Wasserfalldiagrammen visualisiert, die Gene von den am stärksten erschöpften bis zu den angereicherten Gene einordnen. Kopiennummernänderungen und Polyploidie, die durch längere Medikamentenexposition entstehen, können die Screeningergebnisse durch ineffiziente oder übermäßige Cas9-Schnitte²⁷ beeinträchtigen. Obwohl EPIKOL Chromatinregulatoren anspricht, die in der Regel nicht Taxol-gesteuerten Amplifikationen unterliegen, empfehlen wir, vor dem Screening den Ploidiestatus und Veränderungen der Kopienzahl der resistenten Zellen zu bewerten. Wenn Änderungen der Kopienzahl vermutet werden, können während der MAGeCK-Analyse rechnergestützte Korrekturwerkzeuge wie CRISPRcleanR oder CERES eingesetzt werden.

Bei Screens mit zwei experimentellen Armen, Kontroll- und Behandlungsgruppen, sind unterschiedliche Vergleiche erforderlich, um die Screen-Leistung und biologische Abhängigkeiten richtig zu interpretieren¹⁷. Erst-zu-End-Vergleiche eignen sich, um die Screen-Performance zu bewerten, einschließlich des erwarteten Verhaltens essentieller Gene und nicht-zielgerichteter Kontrollgruppen. Der Vergleich des Endpunkts der Kontrollgruppe (DMSO) mit dem Anfangszeitpunkt ermöglicht die Identifikation der Gene, die für das Wachstum und die Fitness resistenter Zellen ohne Arzneimitteldruck erforderlich sind. Im Gegensatz dazu zeigt der Vergleich zweier Endpunktproben, medikamentenbehandelt (Taxol) und Kontrolle (DMSO), die spezifischen Gene, die für die Resistenz gegen das Medikament und nicht für die allgemeine Fitness erforderlich waren. Es sollte beachtet werden, dass der direkte Vergleich der beiden Endpunktproben zu einer verzerrten Verteilung der essentiellen Genkontrollen führt, da diese für das Überleben in beiden Gruppen erforderlich sind. Eine alternative Visualisierungsmethode könnte das Vulkandiagramm sein, das log2-fache Veränderungen zusammen mit Signifikanzwerten darstellt und so die Identifikation signifikant deplezierter Gene ermöglicht. Sobald die Kandidatengene identifiziert sind, sind normalisierte sgRNA-Zählungen und Visualisierungsdiagramme nützlich, um die leistungsfähigsten sgRNAs für nachgelagerte Validierungstests zu bestimmen. Für den EPIKOL-Screening empfehlen wir, Kandidatengene zu priorisieren, die durch das konkordante Verhalten von mindestens 6 von 10 sgRNAs unterstützt werden, da dies mehr Vertrauen in genbezogene Effekte bietet.

Hier bieten wir ein optimiertes Protokoll für die Durchführung des EPIKOL-Screenings an Taxol-resistenten Zelllinien, die ABCB1 hochreguliert und den MDR-Phänotyp aufweisen. Dieses Protokoll ist breit anwendbar auf jedes chemoresistente Modell, das eine Kreuzresistenz gegen Puromycin oder andere Selektionsantibiotika zeigt und so CRISPR-Screening in diesen Zellen ermöglicht. Praktische Leitlinien für die häufigsten technischen Herausforderungen, die in allen Protokollschritten auftreten, finden sich in ergänzender Tabelle 1.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100 mm Platte	Corning	353003	Zellkultur
45 µm Filter	Sigma-Aldrich	SLHVM33RS	Zellkultur
6-Well-Platte	Corning	3506	Zellkultur
96-Well schwarze Platten mit klarem Boden	Sigma-Aldrich	CLS356259	Für CellTiter-Glo Lumineszierende Zelllebensfähigkeitsanalyse
Blasticidin	Thermo Fisher	A1113903	Für Selektion
CellTiter-Glo Lumineszenz-Zelllebensfähigkeitsanalyse	CellTiter-Glo, Promega	G7570	Für CellTiter-Glo Lumineszierende Zelllebensfähigkeitsanalyse
DMEM	Gibco		Zellkultur
DMSO	PanReac AppliChem	A3672,0050	Zellkultur
FBS	Gibco	16140071	Zellkultur
Ham’s F12 Nährstoffgemisch	Gibco	11765054	Zellkultur
HEK293T-Zellen			Freundliche Geschenke von Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).
HEPES	Thermo Fisher	15630080	Zellkultur
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H4001-1G	Zellkultur
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278-5ML	Zellkultur
LentiCas9-blast	Addgene	#52962	Für die Erzeugung einer Cas9-stabilen Zelllinie
LentiGuide-Puro	Addgene	#52963	Backbone für gRNA-Klonierung
MN NucleoSpin Gewebe-Kit	Macherey-Nagel	740952.5	Für die genomische DNA-Extraktion
PBS	Gibco	10010023	Zellkultur
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Zellkultur
pLentiCRISPR v2	Addgene	#52961	Backbone für gRNA-Klonierung
Polyethylenglykol (PEG)-8000	Sigma-Aldrich	P2139-500G	Für die Konzentration von Lentiviren
Polyethylenimin, linear (PEI)	Sigma-Aldrich	765090-1G	Für die Lentivirenproduktion
Protaminsulfat (PS)	Sigma-Aldrich	P4380-25G	Für die Lentivireninfektion
psPAX2	Addgene	# 12260	Für die Lentivirenproduktion
Puromycin	Thermo Fisher	A1113803	Für Selektion
SUM159PT adhärente Zellen			Freundliche Geschenke von Robert Weinberg (MIT, Boston, USA).
Taxol	Paclitaxel, Sigma	PHR1803-200MG	Für die Erzeugung und Aufrechterhaltung von RES-Zellen
Trypsin-EDTA (0,05%)	Gibco	25300054	Zellkultur
Verapamil	Selleck Chemicals	S4202	Für Selektion
VSV-G	Addgene	# 8454	Für die Lentivirenproduktion